MINDY1在宫颈病变疾病中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及mindy1在宫颈病变疾病中的应用，具体的所述疾病为宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌。

背景技术：

宫颈癌是妇科最常见恶性肿瘤之一，居女性癌症患者死亡原因的第4位。宫颈鳞癌在宫颈癌中所占比例为75％～80％。宫颈癌的发生演进是多因素共同作用的结果，其中hpv特别是高危型别的持续感染是宫颈癌发生及发展的主要病原学因素(lin,franceschis,howell-jonesr,snijderspj,cliffordgm.humanpapillomavirustypedistributionin30,848invasivecervicalcancersworldwide:variationbygeographicalregion,histologicaltypeandyearofpublication.internationaljournalofcancer.2011，128(4):927-935.)。随着宫颈癌筛查的普及和人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)疫苗的应用，宫颈癌的发病率及死亡率有所下降(seoudm,tjalmaronssev.cervicaladenocarcinoma:movingtowardsbetterpreventionvaccine-2011.291491:9148-9158)，但是肿瘤的发生及发展是多因素共同作用的结果。在多数情况下，hpv感染可以被免疫系统清除，仅有少部分hpv持续感染者进展为宫颈癌(wheelercm,huntwc,cuzickj,langsfelde,robertsonm,castlepe.theinfluenceoftype-specifichumanpapillomavirusinfectionsonthedetectionofcervicalprecancercancer:apopulation-basedstudyofopportunisticcervicalscreeningintheunitedstates.andintjcancer.2013,doi:10.1002.)，表明除hpv感染外，宿主与细胞生长分化相关的基因表达异常在宫颈癌的发病机制中同样具有重要作用。

正常的宫颈上皮发展为宫颈上皮内瘤变，进展至宫颈癌，需要经历多个不同的病理阶段，其中涉及多种分子事件，宫颈癌的发生发展应是宿主遗传因素和hpv共同作用的结果。因此，对与宫颈鳞癌生长分化相关的基因及信号通路进行研究，可为宫颈癌的筛查，诊断和预后提供新的策略。

基因功能及结构研究的基础和出发点为转录组的研究，rna测序(rna-seq)是利用深度测序技术对细胞或组织进行转录组测序(ramskoldd,luos,wangyc,lir,dengq,faridanior,daniesga,khrebtukovailoringjf,laurentlc,schrothgp,sandbergr.full-lengthmrna-seqfromsingle-celllevelsofrnaandindividualcirculatingtumorcells.natbiotechnol.2012,30(8):777-782)。与传统的芯片杂交平台相比，rna-seq在检测新基因，肿瘤组织的转录本分析，肿瘤组织与正常组织的差异基因等方面具有显著的优势。本发明通过对疾病患者的样本进行高通量测序，寻找差异表达的基因，从而为宫颈癌的早期诊断和治疗提供分子靶标以及理论依据。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与宫颈疾病：宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌发生发展相关的基因标志物。

本发明的目的之二在于提供生物标志物在宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌临床诊断治疗中的应用。

本发明的目的之三在于提供生物标志物在宫颈鳞癌临床治疗中的应用。

本发明的目的之四在于提供宫颈鳞癌的生物标志物在筛选治疗宫颈鳞癌的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测mindy1基因或其表达产物的水平。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别mindy1基因的探针；或

特异性扩增mindy1基因的引物；或

特异性结合mindy1基因编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，特异性扩增mindy1的引物序列如seqidno.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第四方面提供了一种核酸膜条，所述核酸膜条包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第五方面提供了一种组合物，所述组合物包括mindy1的促进剂，和/或药学上可接受的载体。所述促进剂包括提高mindy1基因或其表达产物稳定性、上调mindy1基因或其表达产物的表达水平、增加mindy1基因或其表达产物有效作用时间的物质；所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂；所述药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂等添加剂。

进一步，所述促进剂为含有mindy1的载体。

本发明的第六方面提供了一种筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有mindy1基因或其编码的蛋白的培养体系；和

检测所述体系中mindy1基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述待筛选物质可以促进mindy1基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗宫颈鳞癌的候选药物。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗宫颈鳞癌的药物。

本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备早期诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品中的应用；

b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品中的应用；

c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品中的应用；

d.本发明第四方面所述的核酸膜条在制备诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品中的应用；

e.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗宫颈鳞癌的药物中的应用；

f.本发明第六方面所述的方法在筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物中的应用；

g.mindy1在筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物中的应用；

h.mindy1在制备治疗宫颈鳞癌的药物中的应用。

附图说明

图1是利用qpcr检测mindy1基因在宫颈鳞癌患者中的表达情况；

图2是mindy1基因表达水平图；

图3是cck-8法检测mindy1对细胞增殖活性的影响图；

图4是利用transwell小室检测mindy1基因对细胞迁移侵袭的影响图，其中图a是对细胞迁移的影响图；图b是对细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明通过高通量测序技术以及进行高通量测序分析，检测宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌患者组织中的基因表达水平，发现其中表达具有明显差异的基因，探讨其与宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的发生之间的关系，从而为宫颈鳞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了mindy1在宫颈鳞癌患者中表达下调，并通过基因过表达技术进一步验证了mindy1参与宫颈癌细胞的增殖、侵袭过程，提示mindy1可作为宫颈鳞癌的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。

mindy1基因

本发明中的mindy1的基因id为55793，在本发明中，mindy1包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道，在进行测序分析时，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的mindy1可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上的mindy1(基因id：55793)即可。目前已经公开的mindy1有六个转录本，序列分别如nm_001040217.2、nm_001163258.1、nm_001163259.1、nm_001163260.1、nm_001319998.1、nm_018379.4所示。在本发明中，一种代表性的mindy1基因序列如nm_001040217.2所示。

本发明的mindy1核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平或翻译水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的基因和蛋白使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。其中，pcr需要在扩增前将rna逆转录成dna(rt-pcr)，tma和nasba直接扩增rna。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。

本发明的蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心elisa，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(ria)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(elisa)、酶免疫测定(eia)、荧光免疫测定(fia)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

检测mindy1蛋白的试剂为mindy1蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质mindy1的受体、结合蛋白质mindy1的凝集素、针对蛋白质mindy1的抗体、针对蛋白质mindy1的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为mindy1特异性抗体。

本发明提供了检测mindy1的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、核酸膜条。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于mindy1所示的部分或全部序列，所述抗体特异性的结合mindy1蛋白。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测mindy1基因或蛋白的试剂。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测。

在某些实施方案中，本文提供的是用于检测一种或多种生物标志物的蛋白质水平的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含用识别蛋白质生物标志物的抗体包被的试纸条、洗涤溶液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

本发明提供了一种核酸膜条，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

促进剂和药物组合物

本发明提供了一种药物(组合物)，它含有有效量的所述的mindy1的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗宫颈鳞癌。

作为本发明的一种优选方式，所述的mindy1的促进剂是一种mindy1的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本发明所述药物组合物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗宫颈鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将mindy1的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带mindy1的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与宫颈鳞癌相关的基因标志物

1、样本收集

收集32例宫颈鳞癌(cesc)组织和18正常组织(n)，24例宫颈上皮内瘤样病变(cin)组织，所有病例术前未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取4例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部病例标本中进行验证实验。

2、rna样品的制备

利用qiagen的组织rna提取试剂盒提取各组组织中的总rna，具体步骤参考说明书。

3、rna样品的质量分析

将上述提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

4、cdna文库的构建

利用illuminatruseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、测序

使用illuminax-ten测序平台对cdna文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，采用metama包分析，meta分析中p值合并所用方法为inversenormalmethod，差异表达基因的筛选标准是fdr<0.05。

7、结果

rna-seq结果显示，与正常对照相比，mindy1基因在宫颈鳞癌组织、以及在宫颈上皮内瘤样病变组织中的表达量显著下调，其中宫颈鳞癌组织中的表达量与宫颈上皮内瘤样病变组织相比，表达量也显著下调，差异具有统计学意义，因此对mindy1进行进一步的大样本验证。

实施例2qpcr测序验证mindy1基因的差异表达

1、对mindy1基因差异表达进行大样本qpcr验证。

2、rna提取

利用qiagen的组织rna提取试剂盒提取各组组织中的总rna，具体步骤参考说明书。

3、qpcr

1)逆转录反应

采用fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min.

将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据genebank中mindy1基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

mindy1基因：

正向引物为5’-tccgaaacaaccactttag-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-cttgctcctcctgtagaa-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

3)qpcr扩增检验

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。

4)cdna模板浓度的筛选

将各样本cdna混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cdna的进行10倍稀释时，pcr的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品realtimepcr检测

将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

结果如图1所示，与正常组织相比，宫颈鳞癌组织和宫颈上皮内瘤样病变组织中的mindy1表达量显著下调，其中宫颈上皮内瘤样病变组织与正常组织相比，呈现显著性下调，宫颈鳞癌组织与宫颈上皮内瘤样病变组织相比，呈现显著性下调，差异均具有统计学意义(p<0.05)。

实施例3mindy1基因的过表达

根据ncbi中mindy1基因序列信息设计特异性引物，进行扩增获得相应基因，将基因片段胶回收后分别与表达载体pegfp-c1进行连接后转化入dh5α感受态细胞中，挑取阳性克隆经pcr和测序鉴定后获得pegfp-c1-mindy1重组质粒。

1、细胞培养

宫颈鳞癌细胞(hela)用含10％胎牛血清和1％p/s的rpim-1640培养基在37℃、5％co2的培养箱中培养，当细胞长至80％～90％时，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染

将实验分为3组，分别为对照组(hela)、空白对照组(转染pegfp-c1)、实验组(转染pegfp-c1-mindy1)，按照invitrogen公司的lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染。步骤如下：

1)对数生长期的细胞消化轻轻吹打成单细胞悬液，用不含抗生素的培养基接种于6孔板，6孔板的细胞密度达2×10⁵个/孔，当细胞融合率达40％-60％进行转染试验；

2)次日转染，取10μllipofectamine2000稀释于200μl不含血清的opti-memi培养基，室温静置5min；

3)取4μg质粒溶于200μl无血清的opti-memi培养基；

4)将上述两种稀释液混合均匀，室温孵育20分钟；质粒和转染试剂的比例为每孔4μg:10μl；

5)将6孔板中细胞更换1.6ml新鲜rpim-1640培养基。将上述混悬液分别加入到6孔板中，每孔培养液终体积为2ml；

6)转染6小时后更换2ml新鲜完全培养液继续培养；

7)72h收集细胞，提取rna，进行qpcr检测。

3、qpcr检测mindy1基因的转录水平

1)细胞总rna的提取

采用qiagen的细胞rna提取试剂盒进行细胞总rna的提取，具体步骤详见试剂盒说明书

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3qpcr扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，过表达mindy1基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比对照组hela和转染空载pegfp-c1，实验组pegfp-c1-mindy1能够显著增加mindy1基因的表达水平，差异具有统计学意义。

实施例4cck-8法检测宫颈鳞癌细胞增殖活性

1、转染6小时后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液(1×10⁴/孔)，接种于96孔培养板中(100μl/孔)，每组各设6个复孔，同时设立无细胞的培养液空白对照。

2、于检测时间点(0h，24h，48h，72h，96h，120h)分别加入细胞增殖检测试剂cck-8，工作浓度为1:10，即100μl培养液加入10μlcck-8；

3、在37℃，5％co2孵育箱中孵育1h后，进行检测，酶标仪读数od450nm。

4、结果判断：转染后0h，24h，48h，72h，96h，120h使用酶标仪观察hela细胞的增殖活性，细胞在波长450nm处的吸光光度值(od值)表示处于增殖状态的细胞数量，以无细胞的培养液组od值为对照。

5、结果

结果如图3所示，转染pegfp-c1-mindy1的实验组的细胞增殖显著减少，提示改变mindy1的表达水平可以改变宫颈鳞癌细胞的增殖能力，说明mindy1与宫颈鳞癌细胞的增殖相关。

实施例5transwell方法检测宫颈鳞癌细胞迁移和侵袭

1、细胞迁移能力检测

1)迁移前一天将完全培养基加入孔板中，放入小室置于培养箱中过夜；

2)将转染48h后的细胞进行饥饿处理，收集细胞计数，用0.2％bsa的无血清培养基制成1×10⁵的悬液。

3)取200μl细胞悬液接种于transwell小室内培养。

4)取出小室，吸干剩余液体后置于70％甲醇固定30min，用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4％结晶紫染色10min，pbs清洗两遍，显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

2、细胞侵袭能力检测

1)侵袭实验前一天在冰上用rpim16401:8稀释基质胶，每个24孔悬挂式小室底部膜上室面加稀释后的基质胶60μl干燥待用。

2)水化基底膜：每孔加入50μl含10g/lbsa的无血清培养液，37℃，30min，吸出培养板中残余液体。

3)将转染48h后的细胞进行饥饿处理，收集细胞计数，用0.2％bsa的无血清培养基制成1×10⁵的悬液。

4)取出小室，吸干剩余液体后置于70％甲醇固定30min，用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4％结晶紫染色10min，pbs清洗两遍，显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

3、数据处理

用spss18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。

4、结果

结果如图4所示，实验组的细胞迁移和侵袭数分别较转染空白质粒的少，说明过表达mindy1基因降低宫颈鳞癌细胞的迁移和侵袭能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>mindy1在宫颈病变疾病中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tccgaaacaaccactttag19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cttgctcctcctgtagaa18

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aatcccatcaccatcttccag21

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagccccagccttctccat19