一种特异性检测苯硫酚的近红外荧光探针的制作方法

本发明提供了一种检测苯硫酚的荧光探针，属于荧光探针技术领域。

技术背景

苯硫酚的主要来源包括石油和煤炭精炼厂，塑料和橡胶工业以及废物填埋场。苯硫酚极易挥发，对生物体有很高的毒性，是一种严重的环境污染物。如果人体长时间暴露在含有苯硫酚的空气中，可能会导致头痛、恶心、气短、气喘、喉炎、咳嗽等症状，严重者有可能导致死亡。因此，对苯硫酚进行实时、快速的检测具有非常重要的意义。传统检测苯硫酚的方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、紫外分光光度法和荧光探针分析法等，其中荧光探针分析法由于具有高灵敏度、高选择性和操作的简单、快速及破坏性小等优点而受到关注。

目前对苯硫酚的检测主要是利用其强亲核性，而环境或生物样品中的小分子疏基物质如硫化氢、半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽等都与苯硫酚具有相似的化学反应位点和类似的化学结构，往往会造成干扰；再者，苯硫酚是一种易挥发性的物质，其浓度的变化受环境因素或测试条件影响较大，这就要求探针能够快速、高灵敏和高选择性的检测生物体内以及环境中的苯硫酚同时还要保证检测具有高时效性。

综合分析当前检测苯硫酚的荧光探针,不足之处是绝大多数探针的发射波长都是在短波长区域。例如，专利cn105985769a中所提供的荧光探针其发射波长仅为530nm，既不能避免背景光的干扰也不能实现深层组织、细胞成像。因此设计和构建具有长波长、高选择性和快速响应等综合性能的荧光探针具有极其重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明所述的一种检测苯硫酚的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构式所示：

上述检测苯硫酚的荧光探针以如下方法制备：

化合物i的合成

（1）在氮气保护、冰浴条件下，将0.12克化合物ii溶于无水二氯甲烷中，然后加入0.14克2,4-二硝基苯磺酰氯，再将0.2毫升的三乙胺滴加至上述反应体系中。室温下搅拌过夜，得到粗产物，经柱层层析提纯得到化合物i，产率85%。

根据本发明，优选的，步骤（1）全程在氮气保护下进行。

本发明所述的荧光探针可用于水溶液中的苯硫酚的检测。

进一步优选的，所述荧光探针可对体积比为1：9的dmso和pbs缓冲溶液（20mm,ph7.4）中的苯硫酚的快速检测。该探针的检测限为9.13×10^-8mol/l。

本发明所述荧光探针在体积比为1：9的dmso和pbs缓冲溶液（20mm,ph7.4）中对苯硫酚具有专一性响应性能。本发明通过实验验证，在体积比为1：9的dmso和pbs缓冲溶液（20mm,ph7.4）中，所述荧光探针以560nm波长的光源作为激发光，探针溶液几乎不发光。随着苯硫酚的加入，在560nm的光激发时，探针溶液在645nm处表现出显著的红色荧光。然而，其它种类小分子巯基化合物的加入，即使在高浓度下，也不会引起探针荧光和颜色的显著变化。因此，本发明的荧光探针可以检测苯硫酚。

本发明的荧光探针化合物在体积比为1：9的dmso和pbs缓冲溶液（20mm,ph7.4）中，在645nm处的荧光强度与苯硫酚的浓度（0-100μm）呈良好的线性关系，因此，可以定量检测溶液中苯硫酚的含量。

本发明所述的荧光探针在细胞中检测苯硫酚的应用研究。

本发明所述荧光探针可以实现细胞内苯硫酚的检测。具体检测方法为：在37℃下，将hela细胞与化合物i（10μm）孵育30分钟，细胞基本没有什么荧光。第二组实验中，在37℃下，hela细胞与化合物i（10μm）预处理30分钟后，经pbs洗涤三次除去过量的化合物i。更换培养基，再由苯硫酚溶液（100μm）孵育30分钟后，细胞表现出强烈的红色荧光。实验结果表明，化合物i对细胞内的苯硫酚具有良好的成像作用。这些结果表明，本发明所述荧光探针可用于细胞内苯硫酚的检测。

本发明的有益效果：

本发明所涉及的一种检测苯硫酚的荧光探针，具有以下优势：1）该探针可以选择性检测苯硫酚，具有较高的选择性和灵敏度；2）该探针的发射波长位于近红外（600-900nm）区域，所以具有更低的背景荧光、更少散射、对生物样品的损害更小的优点，因而更适合在生物成像中应用。3）该探针还成功地应用于hela细胞中苯硫酚的可视化，具有较低的细胞毒性和良好的细胞膜通透性。4）用于水体中苯硫酚的定量检测。

附图说明

图1是化合物i的核磁氢谱图。

图2是化合物i的选择性光谱图。

图3是化合物i随苯硫酚浓度变化荧光光谱图。

图4是化合物i加入苯硫酚的响应时间光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。实施例中的各种原料均来自于市场购买。

实施例1化合物i的合成

（1）在氮气保护、冰浴条件下，将化合物ii溶于无水二氯甲烷中，然后加入2,4-二硝基苯磺酰氯，再将三乙胺滴加至上述反应体系中。室温下搅拌过夜，得到粗产物，经柱层层析提纯得到红色化合物i。图1为该探针的核磁图。

实施例2探针化合物i选择性分析

在体积比为1：9的dmso和pbs混合液（20mm,ph7.4）中加入化合物i（5μm），再向其中分别加入各种大过量的干扰离子。检测结果如图2所示，当激发光波长为560nm时，探针化合物i在645nm处表现出强烈的红色荧光，而且探针化合物i对其他小分子巯基化合物几乎没有什么明显荧光变化，说明探针化合物i对苯硫酚具有优异的选择性。

实施例3探针化合物i对苯硫酚浓度变化响应分析

在含有不同浓度苯硫酚（0-100μm）的体积比为1：9的dmso和pbs混合液（20mm,ph7.4）中加入探针化合物i（5μm），探针的荧光响应强度随加入苯硫酚浓度的增加而逐渐增强，检测结果如图3所示，实验结果表明探针化合物i对苯硫酚浓度检测范围较广。

实施例4化合物i对苯硫酚响应时间分析

在体积比为1：9的dmso和pbs混合液（20mm,ph7.4）中开展化合物i（5μm）对苯硫酚的响应时间。检测结果如图4所示，在加入苯硫酚40分钟左右，化合物i对苯硫酚的荧光响应强度随时间的增加而逐渐增强，化合物i的荧光强度在40分钟内就能达到饱和。因此，化合物i对苯硫酚的响应速度较快，可对苯硫酚进行快速检测。

实施例5化合物i在细胞检测中的应用

在37℃下，将hela细胞与化合物i（5μm）预处理30分钟，洗涤后再与苯硫酚培养，hela细胞表现出强烈的红色荧光。实验结果表明，探针化合物i成功地应用于活hela细胞中苯硫酚的可视化，在生物医学等方面具有重要的潜在应用前景。

实施例5化合物i对水体中苯硫酚的检测

将化合物i与苯硫酚加入到体积比为1：9的dmso和pbs混合液（20mm,ph7.4）中，化合物i的浓度为5μm，苯硫酚的浓度分别为5，10，20，40μm，测试溶液的荧光强度，对照工作曲线，检测的准确度都在96%以上。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，所述领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。