一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠出血性大肠埃希菌o157:h7检测试剂盒，该试剂盒利用大肠埃希菌o157:h7和大肠埃希菌o55:h7菌株独有的lpf2c基因型，以及两种细菌中lpf2d基序的差异作为分子标记，利用该序列设计两对特异性的引物，通过常规pcr扩增特征性基因片段进行检测。

背景技术：

埃希氏大肠杆菌(escherichiacoli,e.coli)是革兰氏染色阴性，呈杆状的兼性厌氧菌，通常存在于温血动物的胃肠道。其中，血清型o157:h7大肠杆菌是肠出血型大肠杆菌（enterohemorrhagice.coli,ehec）中最重要的一类，在世界范围内引起人类和动物的爆发感染。该菌感染剂量低，侵入人体后，可以引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症等，具有非常重要的公共卫生意义。为了及时、准确地监控可能发生的爆发感染，建立敏感、特异和可靠的技术用于快速而选择性的检测大肠杆菌o157:h7是极其必要的。

实验室对大肠杆菌o157:h7的传统鉴定方法基于选择性培养基，该方法要求分离纯化菌株，然后再选择性培养基上划线培养，全部流程耗时长，人力成本高，同时根据显色反应造成的误判结果也多，不利于对该类细菌的监控快速、准确的要求。近年来，由于分子生物学技术的发展，运用pcr技术检测大肠杆菌o157:h7的方法也有很多被建立，选择志贺毒素stx1和stx2、lee毒力岛eae、菌毛fima、鞭毛flic等基因中的一个或者多个作为分子标记。然而虽然鉴定该类基因可以在一定程度上帮助对o157:h7菌株的预警，但由于大多基因并不是o157:h7菌株所独有，因此其结果也并非100%的可靠。

长极性菌毛（lpf）是大肠杆菌中广泛存在的一类菌毛，根据其在细菌基因组的位置可以分为lpf1型和lpf2型，而对lpf操纵子的基序分析后，可以再将lpf1分为5个基因型，lpf2分为3个基因型。本研究团队根据genbank上已有的o157:h7全基因组数据分析显示，全部o157:h7菌株包含独有的lpf1-3和lpf2-2基因型菌毛的操纵子，说明该操纵子内基因可以作为候选分子标记。但是该两种基因型的菌毛操纵子同时还存在于o157:h7菌株的祖源菌株o55:h7菌株中，并不能直接用于o157:h7菌株的判定。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种快速、简便、特异性强、适合临床使用的特异性pcr检测试剂盒，用于快速鉴别大肠杆菌o157:h7菌株。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：提供一种肠出血性大肠埃希菌o157:h7检测试剂盒，所述试剂盒包括两组引物，第一组引物用于检测o157:h7与o55:h7菌株独有的lpf2c基因，上、下游引物如seqidno:1和seqidno:2所示；第二组引物用于排除o55:h7菌株，上、下游引物如seqidno:3和seqidno:4所示。

优选的，所述试剂盒还包括pcr预混液和dna聚合酶，其中预混液包括：10×pcr缓冲液、dntps、mgcl2。

上述试剂盒的使用方法,其具体步骤为：

（1）提取待测样本核酸，使用第一组引物进行pcr扩增反应；

（2）对步骤（1）扩增阳性的样本核酸，使用第二组引物进行pcr扩增反应；

（3）第一轮pcr反应阳性且第二轮pcr反应阴性的样本为肠出血性大肠埃希菌o157:h7。

本发明公开了大肠杆菌lpf2操纵子的lpf2c和lpf2d基因作为监测、鉴别o157:h7大肠杆菌的分子标记的应用。

与现有技术相比，本发明所述技术方案的优点在于：

1.标记基因为o157:h7和o55:h7所独有的，对于第一步阳性的样品通过第二步pcr，可以区分菌株是o157:h7或是o55:h7菌株，特异性好。

2.用于检测、监测临床样品中o157:h7大肠杆菌，已通过多株o157:h7和o55:h7菌株pcr检测验证，该pcr检测方法得出的结果准确无误，且没有假阳性和相互交叉反应的发生。

2.该检测方法所需的试剂及设备成本较低，设计合成的检测引物-20℃可以长期保存，能多次使用。

附图说明

图1为f1和r1引物特异性快速检测pcr产物电泳图。其中：

m为dl2000分子标记，泳道1为大肠杆菌o157:h7标准株edl933，泳道2为o157:h7标准株nctc12900，泳道3为o157:h7野生株js157-1，泳道4为o157:h7野生株js157-2，泳道5为o157:h7野生株js157-3，泳道6为o157:h7野生株js157-4，泳道7为大肠杆菌o55:h7标准株g58，泳道8为o55:h7野生株js55-1，泳道9为o55:h7野生株js55-2，泳道10为o55:h7野生株js55-3，泳道11为大肠杆菌o55:h6标准株cmcc(b)44336，泳道12为大肠杆菌o26标准株cmcc(b)44389，泳道13为大肠杆菌o45标准株cmcc(b)44407，泳道14为大肠杆菌o113标准株cmcc(b)44474，泳道15为大肠杆菌o121标准株cmcc(b)44717，泳道16为大肠杆菌o145标准株cmcc(b)44740，泳道17为黏附侵袭大肠杆菌标准株lf82，泳道18为k99大肠杆菌标准株c83907，泳道19为空肠弯曲菌标准株atcc33291，泳道20为肺炎克雷伯标准株cmcc(b)46117，泳道21为福氏志贺氏菌标准株cmcc(b)51572，泳道22为鼠伤寒沙门菌标准株atcc14028，泳道23为肠炎沙门菌cmcc(b)50336，泳道24为魏氏梭菌标准株c59。

图2为f2和r2引物特异性快速检测pcr产物电泳图。其中：

m为markidnaladder分子标记，泳道1为大肠杆菌o157:h7标准株edl933，泳道2为o157:h7标准株nctc12900，泳道3为o157:h7野生株js157-1，泳道4为o157:h7野生株js157-2，泳道5为o157:h7野生株js157-3，泳道6为o157:h7野生株js157-4，泳道7为大肠杆菌o55:h7标准株g58，泳道8为o55:h7野生株js55-1，泳道9为o55:h7野生株js55-2，泳道10为o55:h7野生株js55-3。

具体实施方式

本发明的实验基础是：由于lpf2-2操纵子是o157:h7菌株和o55:h7菌株所独有的保守基因序列，根据其中lpf2c基因保守区域设计第一组引物。当待检菌株模板可以特异性扩增预期659bp大小的条带时，说明该待检菌株为o157:h7菌株或o55:h7菌株；当模板不能扩增相应条带，则该待检菌株非o157:h7菌株。

此外，本实验室前期研究通过比对大量lpf基序后还发现，o157:h7菌株的lpf2-2操纵子中lpf2d基因在第74位较o55:h7菌株缺失序列tttgttttaatagtgatggcg。该序列则可以用于对o157:h7菌株和o55:h7菌株的进一步区分。因此设计第二组引物，其中上游引物的3’端包含tttgttttaatagtgatggcg中的部分序列，下游引物在lpf2d保守区。使用第一组引物检测结果为阳性的样品模板，对第二组引物进行pcr扩增，可以特异性扩增预期376bp大小的条带时，说明该待检菌株为大肠杆菌o55:h7菌株；当模板不能扩增相应条带，则该待检菌株是大肠杆菌o157:h7菌株。

实施例1引物设计

根据genbank上发表的大肠杆菌o157:h7sakai株（登录号：nc_002695.2）和o55:h7cb9615株（登录号：cp001846.1）特有的lpf2-2型操纵子基序设计上下游引物f1和r1，其核苷酸序列为seqidno：1和seqidno：2。由该引物扩增大肠杆菌o157:h7获得保守基因片段为659bp，其核苷酸序列为seqidno：5。

再根据o157:h7sakai株的lpf2-2操纵子中的lpf2d基因在第74位较o55:h7cb9615株缺失序列tttgttttaatagtgatggcg的特征设计第二轮引物f2和r2，其核苷酸序列分别为seqidno：3和seqidno：4。由该引物扩增o55:h7cb9615株可得保守基因片段为376bp，其核苷酸序列为seqidno：6。

实施例2本发明所述肠出血性大肠埃希菌o157:h7检测试剂盒特异性试验

采用本发明所述试剂盒分别对大肠杆菌o157:h7标准株edl933和nctc12900，o157:h7野生株js157-1、js157-2、js157-3和js157-4，o55:h7标准株g58，o55:h7野生株js55-1、js55-2和js55-3；o55:h6标准株cmcc(b)44336，o26标准株cmcc(b)44389，o45标准株cmcc(b)44407，o113标准株cmcc(b)44474，o121标准株cmcc(b)44717，o145标准株cmcc(b)44740，黏附侵袭大肠杆菌标准株lf82，k99标准株c83907，以及其他种属肠道细菌即空肠弯曲菌标准株atcc33291，肺炎克雷伯标准株cmcc(b)46117，福氏志贺氏菌标准株cmcc(b)51572，鼠伤寒沙门菌标准株atcc14028，肠炎沙门菌cmcc(b)50336，魏氏梭菌标准株c59进行检测。提取上述菌株核酸分别进行下述两轮pcr验证实验。第一轮pcr反应：参照takarataq^tm说明书配置pcr反应体系（20μl），以上述菌株核酸为模板，采用引物f1和r1进行扩增，pcr反应条件为：95℃预变性5min，94℃15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，25个循环；72℃再延伸5min；扩增产物通过琼脂糖电泳进行检测验证。结果如图1所示：大肠杆菌o157:h7标准株edl933和nctc12900，o157:h7野生株js157-1、js157-2、js157-3和js157-4，o55:h7标准株g58，o55:h7野生株js55-1、js55-2和js55-3均可以扩增出约659bp大小条带。而其他菌株均不能扩增出任何条带。

第二轮pcr反应：参照takarataq^tm说明书配置pcr反应体系（20μl），以第一轮pcr反应阳性结果的菌株核酸为模板，采用引物f2和r2进行扩增，pcr反应条件为：95℃预变性5min，94℃15s，51℃退火15s，72℃30s，25个循环，72℃再延伸5min，扩增pcr产物；扩增产物再次通过琼脂糖电泳进行检测验证。结果如图2所示：只有o55:h7菌株g58、js55-1、js55-2和js55-3可以扩增出约376bp大小条带。而大肠杆菌o157:h7菌株edl933、nctc12900、js157-1、js157-2、js157-3和js157-4扩增后无条带。

综上所述本发明所述试剂盒特异性好，且没有假阳性和相互交叉反应的发生。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>一种肠出血性大肠埃希菌o157:h7检测试剂盒及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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<211>20

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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