一种鉴定小茶尺蠖的引物、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定小茶尺蠖的引物、试剂盒及方法。

背景技术：

小茶尺蠖ectropisobliquaprout和灰茶尺蛾ectropisgrisescenswarren(即灰茶尺蠖)是茶树重要的食叶性近缘种害虫，因其形态极为相似，不容易区分，统称“茶尺蠖”。化学防治在短期内对茶尺蠖幼虫具有一定的控制效果，但是大量使用则会带来茶叶农药残留和环境污染问题，同时也会导致害虫抗药性的产生。近年来，随着整个产业以及消费者对于农药残留问题越来越重视，喝上“放心茶”的呼声与日俱增。茶尺蠖核型多角体病毒(ectropisobliquanucleopolyhedrovirus，eonpv)是茶尺蠖的主要病原性天敌，对茶尺蠖具有较强的致病能力，以此开发出的病毒制剂已逐步应用于茶尺蠖的防治中。另外，虽然通过昆虫性信息素进行田间种群监测和大量诱杀也可以控制茶尺蠖为害，但是在实际应用中发现，以病毒制剂为主的生物防治仅对小茶尺蠖有用，性引诱对两种茶尺蠖的防治效果存在差异，又因为二者形态相近，因此，需要有效的分子鉴定手段区分两种昆虫，再进行针对性防治。

本发明利用小茶尺蠖低覆盖度的基因组测序数据，发现小茶尺蠖特异性基因序列，以小茶尺蠖基因组dna为模板，采用特异性引物经pcr扩增后，与小茶尺蠖特异性基因序列进行比对即可鉴定茶尺蠖的品种。

技术实现要素：

本发明提供一种鉴定小茶尺蠖的引物，该引物可特异性的用于鉴定小茶尺蠖。本发明还提供了鉴定小茶尺蠖的试剂盒以及鉴定小茶尺蠖的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种鉴定小茶尺蠖的引物，其特征在于，所述鉴定小茶尺蠖的引物包含3对引物，分别为引物对xch1、引物对xch2、引物对xch3；所述引物对xch1序列如seqidno:1-2所示，所述引物对xch2序列如seqidno:3-4所示，所述引物对xch3序列如seqidno:5-6所示；

所述引物对xch1获得的小茶尺蠖的特异性识别序列为s137625，其序列如seqidno.7所示；所述引物对xch2获得的小茶尺蠖的特异性识别序列为s336287，其序列如seqidno.8所示；所述引物对xch3获得的小茶尺蠖的特异性识别序列为s779467，其序列如seqidno.9所示；

一种鉴定小茶尺蠖的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述引物对xch1、引物对xch2、引物对xch3，以及小茶尺蠖的特异性识别序列。

本发明还提供了上述鉴定小茶尺蠖的引物在鉴定小茶尺蠖中的应用。

本发明还提供了上述鉴定小茶尺蠖的试剂盒在鉴定小茶尺蠖中的应用。

本发明还提供了一种鉴定小茶尺蠖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待测样品进行dna提取；

(2)使用权利要求1所述的引物对xch1、引物对xch2、引物对xch3，以提取的dna为模板，进行pcr扩增；

(3)pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳检测是否存在预期大小条带，再对照上述小茶尺蠖的特异性识别序列，鉴定出待测样品的品种；

优选地，所述步骤(2)中pcr扩增的体系为50μl，其中包括2×premixextaq(takara)25μl，dna模板1μl，10μm浓度的上下游引物各2μl，余量为灭菌蒸馏水；

优选地，所述步骤(2)中pcr扩增的程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，32个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

有益效果：

采用本发明的引物或试剂盒可以快速、方便、高效的鉴定小茶尺蠖，准确度高、成本低，可产品化应用。

附图说明

图1本发明的引物用于鉴定小茶尺蠖的pcr扩增效果图。

1、4、7为小茶尺蠖，2、5、8为灰茶尺蛾，3、6、9为家蚕，m1、m2为maker。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、本发明用于鉴定小茶尺蠖的引物详见表1。

表1鉴定小茶尺蠖的引物序列

二、实验方法

(1)收集单头小茶尺蠖、灰茶尺蛾、家蚕4龄幼虫，利用qiagen基因组dna提取试剂盒提取dna，并通过紫外分光光度计确定浓度；

(2)以小茶尺蠖dna作为模板，灰茶尺蛾dna为对照，家蚕dna作为阴性对照，在美国abiverititm96孔基因扩增仪上进行pcr扩增反应，pcr扩增的体系为50μl，其中包括2×premixextaq(takara)25μl，dna模板1μl，10μm浓度的上下游引物各2μl，余量为灭菌蒸馏水；

其中，扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，32个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

(3)对pcr产物运用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，uvp紫外凝胶成像系统观察结果，并拍照保存(见图1)，其中1、4、7为小茶尺蠖，2、5、8为灰茶尺蛾，3、6、9为家蚕，m1、m2为marker。

检测结果显示，1、4、7的pcr结果显示检测到与特异性识别序列s137625、s336287、s779467大小一致的条带，且条带单一，经测序后，1、4、7的pcr产物的序列与特异性识别序列s137625、s336287、s779467一致，可确定该检测样品为小茶尺蠖。

2、5、8的pcr结果显示检测到与特异性识别序列s137625、s779467大小接近的条带，但条带不单一，缺失特异性识别序列s336287。经测序后，2、8的pcr产物的序列与特异性识别序列s137625、s779467不一致，可确定该检测样品不是小茶尺蠖。

3、6、9的pcr结果显示无条带，可直接确定该检测样品不是小茶尺蠖。

因此，本发明引物可快速、准确的鉴定小茶尺蠖，具有产品化价值。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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<110>浙江大学

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