一种用于脓毒症标志物的lncRNA及其应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及一种非编码rna及其应用，尤其涉及一种用于脓毒症标志物的lncrna及其应用。
背景技术：
：脓毒症是一种典型的复杂疾病，是表现病人对感染反应的严重临床状态。脓毒症具有高发病率、高死亡率和高治疗费用的现状。早期诊断是降低脓毒症病死率的最佳策率。临床现行的脓毒症诊断标准仍主要依赖临床症状，而系统性炎症的临床症状可能与非感染临界情况(如创伤、烧伤、胰腺炎、自身免疫病和移植排斥反应)部分重叠，微生物培养也因前期或伴随的抗生素疗法而时常显示为阴性，导致大量的诊断延误。随着转录组学和基因组学技术的不断发展，非编码rna(non-codingrnas,ncrnas)成为研究热点。众多研究证实，ncrnas在细胞分化和成长中起到重要的调控角色。长链非编码rnas(longnon-codingrnas,lncrnas)是一类转录本长度超过200nt，不编码蛋白质的开放性阅读框。近年来研究发现，lncrna可以在表观遗传、转录和转录后水平上调控基因的表达，与人类疾病的发生发展与治疗均存在密切关系，多数lncrna的研究主要集中在肿瘤或神经性疾病等领域，鲜有与脓毒症有关的lncrna的报道。cn109022570a公开了loc105372511可作为脓毒症的诊断标志物。研究表明loc105372511在脓毒症患者的血液中含量比正常人显著升高。因此loc105372511可以作为诊断脓毒症的分子标志物。cn109112212a公开了脓毒症诊断相关分子。本发明通过测序筛选在脓毒症患者和健康对照人群中存在差异表达的分子，研究表明linc01871在脓毒症患者血液中的含量比健康人低。据此可将linc01871作为诊断脓毒症的生物标志物。cn109022571a公开了loc105369645在制备诊断产品中的应用。该诊断产品可用于脓毒症的诊断。通过检测loc105369645的水平可以判断受试者将来患有脓毒症的风险或者确诊脓毒症的状态。cn109055535a公开了loc101927627作为诊断脓毒症的分子标志物的用途。研究表明loc101927627在脓毒症患者血液中和在健康对照人群中的表达存在显著差异，据此认为loc101927627可以作为诊断脓毒症的分子标志物。因此，提供一种用于脓毒症标志物的lncrna辅助临床诊断脓毒症、研究发病机制具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种用于脓毒症标志物的lncrna及其应用，通过检测lncrnaenst00000490593.1在样本中的表达，进一步丰富了脓毒症发病机制的研究，对脓毒症早期诊断具有重要意义。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种用于脓毒症标志物的lncrna，所述lncrna为lncrnaenst00000490593.1，其核苷酸序列如seqidno.1所示。lncrnaenst00000490593.1的具体序列如seqidno.1所示:cagcacttgggatgtgcaccaacagttcttatgggggcccggcctcctcatcactccagttctggatgaagtaagtgttcccacagagatacactagagatctctgcatctgtatctgctgccctgcaaactcctctctgcttcttattccaaactcacttctgacatctgtgactgagtcagccttgaagagagtgtgctaggttttgagaagctagacatctggtaactacacatttttctttctagaatttcttttttctcttgatcaagttcccaaccagtttagaagcatctactggaaactctagagttacaagttatgttaggttgttcttgcattgctatacagaaattcctgacactgagtgatttacaaagaaaagagatttcattggctcacagttctgaaagctttacaagaagcatgatgctggtatctgtgcagcttctagggaggcctcaggaagcttacagtcatggaggaaggtgaagaggagcagcgatgtcatatagcaaaagcaggaacaagacggggtggggggagttgccacacacttttttttttttttttttttgagatggagtctcactctgtcacccaggctggagtgcagtggcacaatcccagctcactgcaacctccaactcctgggttcacatgattctcctgcctcagcctcctgagtagctggggttacaggcacctgccaccaagctcggctaattttgtattttttgtagagacggggtttcatgttagccaggctggtctcaaactgctgacctcagatgatccacctgcctcagcctccaaagtgctgagattacaggtgtgagtcaccgcgcttggccgccacacacttttaaacaaccaaatcttacaagaattcactcactatcaccaggacagaaccaagggaatggtgtaaaccattcatgagaaatctgccctcatcatccagtcagctccctccaggccccacctccaacactggggattacatttcaacatgagatttgggcagacaaacatccaaactatatcaagagtggtcctatttgttgttggattctcatagcagatcctgacttgctccatgacgtagaaacaggatggagcagtgacccaacactcactctaaagtcaggctgatcgggatgtgattgttgtctctgccactttgagcctgtgtgatcaggggtgactattgtgctggcttctcatctgcagaggggtaatactactactactaaaaataatggtacccaccatttgggaatgttgggaaaattaaatgaggtaatcatgtaaagctggaatgtttgtcaccacacatgttttattattattttatgattattattattcctaatgtggctacgtttgggatttctctctgggttgccaagttacagtttctattatttgtattagaggagaagcagaagaaaggcataatagcagggcattcctgccctctctgtgtatgattaagaaattccctagagaataaaaagaaatccattttatttccctcaggggacactacatttttttaatttcagggtgcagagaaagtgatggcatatgtgcctgatgctgtctggtatgactacgagactgtaagtagctttgacttttcttctactccttaagactgtagctgcagctgcatagacaagctacctttctggagagagaaacatccatctacatgctgaggagtagtttttagtgttttctgtaatttcatagcagaacctgggtaaagttaacctaaaccgttaacatcagtcatgatgaaatgtgaaaaaataccttcatatactttatttagcaataagataggctgacatagtatctcataaattaatattggaggaactgatgga.本发明中，发明人通过实验验证表明，lncrnaenst00000490593.1与脓毒症的发生相关，在脓毒症患者中的表达量显著上调，通过检测所述lncrna可以辅助判断脓毒症早期发生以及后期发展，为临床诊断提供帮助。lncrnaenst00000490593.1的具体信息记录于网站ensemblgenomebrowser(http://grch37.ensembl.org/homo_sapiens/transcript/summary？db＝core；g＝ensg00000257335；r＝7:141738346-141740241；t＝enst00000490593)，是mgam基因转录而来。第二方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成第一方面所述的lncrna。本发明中，提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸能被人细胞转录成第一方面所述的lncrna，所述多核苷酸的结构典型但不局限地为seq正-x-seq反，其中seq正为在人细胞中转录成所述lncrna的核苷酸序列，seq反与seq正互补配对，x为seq反与seq正之间的间隔序列，所述间隔序列不会与seq反与seq正互补，也不会形成自身互补配对，所述分离的多核苷酸转入人细胞后形成茎环结构。第三方面，本发明提供一种载体，所述载体含有如第一方面所述的lncrna，或第二方面所述的多核苷酸。第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的lncrna、第二方面所述的多核苷酸或第三方面所述的载体在制备脓毒症筛选或诊断的药物、芯片、试剂盒或高通量测序平台中的应用。本发明中，根据lncrnaenst00000490593.1与脓毒症的正相关关系，可以应用于各种诊断脓毒症的产品中，例如为药物、芯片、试剂盒或高通量测序平台。优选地，所述应用为检测样本中第一方面所述的lncrna的表达。本发明中，通过检测lncrnaenst00000490593.1的表达量判断对应样本是否患有脓毒症，若表达量显著上调则判定结果为阳性。检测所述lncrnaenst00000490593.1的表达量的方法例如可以是高通量测序、qpcr等方法。优选地，所述检测样本为血液。第五方面，本发明提供一种lncrna芯片，所述lncrna芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于第一方面中seqidno.1所示的部分或全部序列。本发明中，根据lncrnaenst00000490593.1的核苷酸序列，设计适合的特异性探针，固定在固相载体上，形成寡核苷酸阵列。所述固相载体可采用基因芯片领域的常用材料，例如可以是尼龙膜、玻片或塑料片等。芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片常规操作方法，本发明不做特殊限定。第六方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括针对如第一方面所述lncrna的特异性引物对或探针。优选地，所述特异性引物对的序列如seqidno.2-3所示。seqidno.2:aaacatccatctacatgctgag.seqidno.3:ctttacccaggttctgctatga.优选地，所述特异性引物对适用于sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针或复合探针技术的检测。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明提供lncrnaenst00000490593.1用于脓毒症标志物的用途，通过基因芯片和qpcr双重验证，证实所述lncrna在脓毒症患者细胞内存在转录差异；(2)本发明提供一种lncrnaenst00000490593.1在制备诊断脓毒症的产品中的应用，为脓毒症发病机制的研究奠定基础，同时辅助临床诊断，提升患者预后；(3)本发明提供一种基因芯片，可进行高通量检测lncrnaenst00000490593.1的表达谱，进一步丰富了脓毒症发病机制的研究。附图说明图1为本发明实施例2中基因芯片检测结果；图2为本发明实施例3中qpcr检测结果。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1样本rna提取1、样本采集遵循知情同意原则，并在伦理委员会同意的前提下，收集12例健康人血液和10例脓毒症患者血液。2、rna样品制备分离单核细胞(mncs)后使用rnaiso(takara,dalian,china)试剂盒提取总rna。具体为：细胞加入1mlrna提取液，每管中加入200ul氯仿(相当于trizol1/5体积)震荡混匀15s，室温静置5min，4℃12000rpm离心15min。离心后可见管内液体分为3层，rna全部溶解在上层水相中。用1ml移液枪小心吸取上层水相至新1.5mlep管中，加等量异丙醇混匀，冰上静置10min，再次4℃12000r/min离心10min，弃上清。每管加入1ml75％的乙醇，温和震荡，4℃8000r/min离心5min，尽量弃上清。将ep管倒置在吸水纸上室温晾干，可见管内沉淀由白色转为透明，加入depc水10-20ul，使之充分溶解，总rna提取完毕。3、rna样品质检样品总rna利用nanodropnd-2000(thermoscientific)定量并经agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies)检测rna完整性。实施例2基因芯片检测1、样本rna的逆转录和标记实施例1中rna质检合格后，rna反转录成双链cdna，再进一步合成crna，接着对crna进行第二轮反转录合成cdna，片段化并与生物素标记。2、杂交基因芯片采用欧易生物-affymetrixhumanoelncrnaarray，按芯片使用说明书的步骤进行杂交，洗脱和染色后利用affymetrixscanner3000(affymetrix)扫描得到原始图像。3、数据处理原始图像采用affymetrixgenechipcommandconsole软件(version4.0,affymetrix)处理提取原始数据，接着利用expressionconsole软件(version1.3.1,affymetrix)对芯片进行genelevel和exonlevel的标准化，标准化算法为rma。然后进行基因表达分析，分析使用的软件为genespring软件(version13.1,agilenttechnologies)。差异基因利用t检验的p值和倍数变化值进行筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>＝2.0且p值<＝0.05。基因芯片检测结果如图1所示，可知，enst00000490593.1在脓毒症患者中的表达水平显著高于健康人。实施例3qpcr检测1、rna逆转录采用实施例1所得rna样本，通过紫外分光光度计检测rna浓度，测量样品的od260与od280.以od260/od280的比值确定rna的完整度及纯度，并根据od260的值，计算rna含量，并适当稀释调整总rna浓度约1ug/ul。随后进行反转录得到cdna，使用oligo-dt和鼠乳腺瘤病毒反转录酶进行rna反转录，fermentas反转录试剂盒(promega公司)，oligo-dt(金维智公司)；1)建立a体系，将体系a加入200ul离心管中混匀，掌上离心机离心，放至梯度pcr仪中，设定70℃温育5min，转入4℃10min，体系a的组成见表1；表1组分体积oligo-dt8uldepc水2ul总rna2ul总体积12ul2)建立b体系，将体系b加入体系a中，充分混匀，离心后重新放入梯度pcr仪中，设定37℃温育60min，95℃5min，转为4℃，即得到cdna，b体系的组成见表2。表2组分体积rna反转录缓冲液5uldntp混合物1.3uldepc水5ulrnasin核糖核酸酶抑制剂0.7ulrna反转录酶1ul总体积13ul2、qpcr反应引物设计后使用sybrgreenmastermix进行qpcr实验，采用管家基因β-actin作为内参基因，引物具体序列如seqidno.2-5所示。enst00000490593.1的引物序列为：正向引物(seqidno.2)：5’-aaacatccatctacatgctgag-3’；反向引物(seqidno.3)：5’-ctttacccaggttctgctatga-3’.管家基因β-actin的引物序列为：正向引物(seqidno.4)：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’；反向引物(seqidno.5)：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’.反应程序：按照表3配置反应体系，按上述反应体系加样，每个样品做三个复孔，然后将样品置于荧光定量仪上，根据设定好的程序进行反应，反应条件为:95℃,10min；95℃,15s,60℃,15s,72℃,30s,72℃收集荧光，共40个循环；循环结束后做相应的溶解曲线。运用lightcyler480自带的软件进行实时数据收集和定量分析。表3反应体系组分体积sybrgreenmastermix10ul正向引物1ul反向引物1ul去离子水7ulcdna1ul总体积20ul3、统计学分析基因表达水平以β-actin进行标准化，使用2-δδct方法计算基因的相对表达量。使用mann–whitneyutest对脓毒症组与健康对照组之间基因表达量进行比较。统计分析使用graphpadprism软件(graphpadsoftwareinc.)。双侧p值小于0.05认为具有统计显著性，结果见图2。由图2可知，enst00000490593.1在脓毒症患者中的表达水平显著高于健康人，差异具有统计学意义(p<0.01)，与芯片结果一致。实施例4试剂盒的组装rna提取液：苯酚，异硫氰酸胍，β-巯基乙醇，8-羟基喹啉；rna反转录酶：莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(m-mlv)；正向引物(seqidno.2)：5’-aaacatccatctacatgctgag-3’；反向引物(seqidno.3)：5’-ctttacccaggttctgctatga-3’.将rna提取液、rna反转录酶、rna反转录缓冲液、oligo-dt、sybrgreenmastermix、引物(正向和反向)、去离子水、阳性对照、阴性对照以及说明书包装进试剂盒。综上，本发明提供一种用于脓毒症标志物的lncrna，并首次发现lncrnaenst00000490593.1与脓毒症的关系，丰富了脓毒症发病机制的研究，为临床诊断提供一定依据。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>方芳<120>一种用于脓毒症标志物的lncrna及其应用<130>2019<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>1896<212>dna<213>人工合成序列<400>1cagcacttgggatgtgcaccaacagttcttatgggggcccggcctcctcatcactccagt60tctggatgaagtaagtgttcccacagagatacactagagatctctgcatctgtatctgct120gccctgcaaactcctctctgcttcttattccaaactcacttctgacatctgtgactgagt180cagccttgaagagagtgtgctaggttttgagaagctagacatctggtaactacacatttt240tctttctagaatttcttttttctcttgatcaagttcccaaccagtttagaagcatctact300ggaaactctagagttacaagttatgttaggttgttcttgcattgctatacagaaattcct360gacactgagtgatttacaaagaaaagagatttcattggctcacagttctgaaagctttac420aagaagcatgatgctggtatctgtgcagcttctagggaggcctcaggaagcttacagtca480tggaggaaggtgaagaggagcagcgatgtcatatagcaaaagcaggaacaagacggggtg540gggggagttgccacacacttttttttttttttttttttgagatggagtctcactctgtca600cccaggctggagtgcagtggcacaatcccagctcactgcaacctccaactcctgggttca660catgattctcctgcctcagcctcctgagtagctggggttacaggcacctgccaccaagct720cggctaattttgtattttttgtagagacggggtttcatgttagccaggctggtctcaaac780tgctgacctcagatgatccacctgcctcagcctccaaagtgctgagattacaggtgtgag840tcaccgcgcttggccgccacacacttttaaacaaccaaatcttacaagaattcactcact900atcaccaggacagaaccaagggaatggtgtaaaccattcatgagaaatctgccctcatca960tccagtcagctccctccaggccccacctccaacactggggattacatttcaacatgagat1020ttgggcagacaaacatccaaactatatcaagagtggtcctatttgttgttggattctcat1080agcagatcctgacttgctccatgacgtagaaacaggatggagcagtgacccaacactcac1140tctaaagtcaggctgatcgggatgtgattgttgtctctgccactttgagcctgtgtgatc1200aggggtgactattgtgctggcttctcatctgcagaggggtaatactactactactaaaaa1260taatggtacccaccatttgggaatgttgggaaaattaaatgaggtaatcatgtaaagctg1320gaatgtttgtcaccacacatgttttattattattttatgattattattattcctaatgtg1380gctacgtttgggatttctctctgggttgccaagttacagtttctattatttgtattagag1440gagaagcagaagaaaggcataatagcagggcattcctgccctctctgtgtatgattaaga1500aattccctagagaataaaaagaaatccattttatttccctcaggggacactacatttttt1560taatttcagggtgcagagaaagtgatggcatatgtgcctgatgctgtctggtatgactac1620gagactgtaagtagctttgacttttcttctactccttaagactgtagctgcagctgcata1680gacaagctacctttctggagagagaaacatccatctacatgctgaggagtagtttttagt1740gttttctgtaatttcatagcagaacctgggtaaagttaacctaaaccgttaacatcagtc1800atgatgaaatgtgaaaaaataccttcatatactttatttagcaataagataggctgacat1860agtatctcataaattaatattggaggaactgatgga1896<210>2<211>22<212>dna<213>人工合成序列<400>2aaacatccatctacatgctgag22<210>3<211>22<212>dna<213>人工合成序列<400>3ctttacccaggttctgctatga22<210>4<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>4catgtacgttgctatccaggc21<210>5<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>5ctccttaatgtcacgcacgat21当前第1页12