睡莲DNA指纹图谱及其引物与构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及睡莲dna指纹图谱及其引物与构建方法。

背景技术：

睡莲为睡莲科(nymphaeaceae)睡莲属(nymphaeal.)多年生草本宿根花卉。睡莲种质资源是发展睡莲鲜切花、食用生产的物质基础，也是睡莲研究领域尤其是睡莲新品种选育和生物技术研究的基础。目前我国在花卉品种资源生产和经营方面尚不规范，品种引种混乱或品种造假的现象时有发生，因此，开展睡莲品种资源鉴定显得尤为重要。传统的睡莲品种资源鉴定方法主要依靠表型特征，虽然快速便捷，但是表型性状受环境影响较大，鉴别错误率较高，加之睡莲品种资源逐年扩大，品种的相似度也越来越高，导致通过传统的表型鉴定方法越来越难。

睡莲在我国研究虽处于起步阶段，但发展迅猛，现阶段睡莲研究主要集中在引种栽培，生殖繁育、功能活性、生理生化分析以及新品种选育上，对睡莲种质资源遗传多样性和分子图谱的研究则少有报道。

技术实现要素：

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了睡莲dna指纹图谱及其引物与构建方法，开展睡莲种质资源的遗传性状分析和dna指纹图谱构建，为睡莲分类鉴定、杂交育种、功能基因的挖掘和利用、图位克隆等提供技术支持，有利于充分利用睡莲种质资源和发掘、创制出性状优异的睡莲新种质，对睡莲育种研究和创新具有十分重要的意义。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的获取睡莲dna指纹图谱的引物，采用ubc840、ubc841、ubc811、ubc834、ubc835、ubc843、ubc844、ubc845、ubc873、ubc880中的一种或多种。

所述的睡莲dna指纹图谱的构建方法，具体包括以下步骤：

1)睡莲dna提取；

2)issr-pcr扩增反应及电泳检测：采用issr引物对睡莲dna进行扩增，得到的issr-pcr反应产物用1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测；所述issr引物采用ubc840、ubc841、ubc811、ubc834、ubc835、ubc843、ubc844、ubc845、ubc873、ubc880中的一种或多种；

3)dna指纹图谱构建：根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以睡莲种质资源编号为纵列，以每条谱带的位点编号为横行；其中该位点有扩增条带表示为灰色，即该位点0-1矩阵中为“1”，该位点没有扩增条带表示为无色，即该位点在0-1矩阵中为“0”，得到不同睡莲品种的dna指纹图谱表。

作为优选，睡莲dna提取采用完整的、无病虫害、未展开的沉水幼叶；睡莲dna样品浓度为50ng/ul。

作为优选，issr-pcr扩增反应体系为：采用20ul的反应体系，包括2×estaqmastermix(含染料)10ul，睡莲dna及issr引物各1ul，8ul的ddh2o补齐。

作为优选，issr-pcr扩增程序为：(1)94℃预变性1min，(2)94℃变性45s，(3)46-55℃退火45s，(4)72℃延伸2min，(5)72℃延伸5min；其中步骤(2)、(3)、(4)共35个循环，4℃保存。

作为优选，issr-pcr扩增程序中，退火温度根据所选用的issr引物来确定，具体如下：ubc84053℃，ubc84155℃，ubc81155℃，ubc83455℃，ubc83552℃，ubc84346℃，ubc84453℃，ubc84552℃，ubc87346℃，ubc88050。

基于ubc840分子标记构建的24个睡莲原生种及原生变种dna指纹图谱表如图5所示。

基于ubc841分子标记构建的24个睡莲原生种及原生变种dna指纹图谱表如图6所示。

所述获取睡莲dna指纹图谱的引物在获取睡莲dna指纹图谱中的应用。

所述睡莲dna指纹图谱的构建方法所得到的睡莲dna指纹图谱在对睡莲种质资源分类与鉴定中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的获取睡莲dna指纹图谱的专用引物，配合issr-pcr反应体系，所获得的睡莲dna指纹图谱的多态性高、重复性好，便于鉴别。本发明通过开展睡莲种质资源的遗传性状分析和dna指纹图谱构建，为睡莲分类鉴定、杂交育种、功能基因的挖掘和利用、图位克隆等提供技术支持，有利于充分利用睡莲种质资源和发掘、创制出性状优异的睡莲新种质，对睡莲育种研究和创新具有十分重要的意义。

附图说明

图1是46份睡莲种质资源dna的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是ubc840对46份睡莲属种质基因组dna的扩增结果电泳图；

图3是ubc841对46份睡莲属种质基因组dna的扩增结果电泳图；

图4是46份睡莲种质资源基于issr的遗传相似性聚类图；

图5是基于ubc840分子标记构建的睡莲原生种及原生变种的dna指纹图谱；

图6是基于ubc841分子标记构建的睡莲原生种及原生变种的dna指纹图谱。

图1中，m:dl2000bpdnaladdermarker；1-46:表示供试睡莲样本；

图2、图3中，m:dl2000bpdnaladdermarker；1-24,25-46:表示供试睡莲属样本。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例

本实施例以46份睡莲种质为研究材料，其中含有原生种21个，原生变种3个，园艺品种22个。供试样本均种植于广西农业科学院花卉研究所睡莲种质资源圃。采摘完整的、无病虫害、未展开的沉水幼叶1-2片，浸没于装有纯净水的标记袋中4℃冰箱保存，样本顺序及编号见表1。

表146份睡莲种质资源及编号表

1.睡莲dna的提取及检测

dna提取采用tiangen新型植物基因组dna提取试剂盒，在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测dna质量，见图1。用genespec核酸检测仪检测dna纯度和浓度。最后将样品浓度稀释为50ng/ul，-20℃保存。

2.issr-pcr扩增反应

采用20ul的反应体系，包含了2×estaqmastermix(含染料)10ul，供试睡莲模板dna及issr引物各1ul，8ul的ddh2o补齐。pcr扩增程序为：(1)94℃预变性1min；(2)94℃变性45s；(3)不同温度下退火45s；(4)72℃延伸2min；(5)72℃延伸5min。其中步骤(2)、(3)、(4)共35个循环，4℃保存。issr-pcr反应产物用1.8％的琼脂糖凝胶电泳，缓冲液为1×tae。

本实施例所用的10条issr引物根据加拿大哥伦比亚大学设计并公布的issr引物序列，由上海生物工程有限公司合成。退火温度根据所选用的issr引物来确定，具体见表2。

表210条issr引物的扩增结果

^＊注：r＝(a,g)，y＝(c,t)

^＊note:r＝(a,g),y＝(c,t)

如表2所示，10条issr引物在46份睡莲种质资源中共扩增出281条谱带，其中281条都具有多态性，占100％。单条引物扩增出的清晰条带数在23-35条之间，扩增位点数最多引物为ubc835，扩增出35个位点，最少为ubc845，有23个位点，平均多态性条带28.1条。可见issr检测睡莲属种质资源遗传多样性的效率很高，也表明睡莲属种质资源在分子水平上具有极为丰富的遗传多样性。

引物ubc840对46份睡莲种质基因组dna的扩增结果如图2所示，引物ubc841对46份睡莲种质基因组dna的扩增结果如图3所示。

3.睡莲种质资源的issr聚类分析

利用10个引物产生的标记信息，建立供试样本的相似系数矩阵。通过软件ntysys-pc2.10e对46份睡莲种质资源计算遗传相似系数gs(geneticsimilarity)，根据gs值按非加权配对算术平均法(upmga)进行聚类分析，建立遗传关系聚类图(见图4)。

4.睡莲种质资源的dna指纹图谱构建

构建了24份睡莲原生种质资源dna指纹图谱

基于ubc840分子标记构建的睡莲原生种及原生变种的dna指纹图谱，见图5。基于ubc841分子标记构建的睡莲原生种及原生变种的dna指纹图谱，见图6。其中灰色表示该位点有条带，即该位点0-1矩阵中为“1”，无色表示该位点无条带，即该位点在0-1矩阵中为“0”。所构建的指纹图谱可用于24份睡莲原生种质资源的分类与鉴定。

绝大部分睡莲原生种及其变种在未开花前非常相似，很难辨别，如蓝星和白蓝星，其叶型、叶色都极为相似，需开花后才可区分。少部分在开花条件下也很难区分开，如埃及白睡莲及其变种柔毛齿叶白睡莲，花色均为纯白色，锯齿状叶片，单从表观形态上很难区分开来。本发明通过筛选出的10个issr引物对24个睡莲原生种及原生变种构建dna指纹图谱，其中引物ubc840和ubc841均可单独鉴别出24份睡莲原生种质资源，其他引物需多个组合作用鉴别全部的供试原生种质睡莲。本发明基于引物ubc840、ubc841构建了24份供试睡莲原生种质的dna指纹图谱，该图谱可作为相应睡莲原生种质资源鉴定和分类的依据，同时也为新种质和新品种的分类鉴定及知识产权保护提供分子技术水平上的保障。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。