一种长穗偃麦草Ee基因组特异分子标记及其应用的制作方法

本发明属于作物遗传育种
技术领域：
，具体涉及一种长穗偃麦草ee基因组特异分子标记及其应用。
背景技术：
：小麦(triticumaestivuml.)是世界上种植面积最大、总产量仅次于玉米的粮食作物(葛江燕，2012)，对人类的发展有着举足轻重的作用。但是近年来随着耕作制度的变化及育种中少数亲本的反复使用(张璐璐，2016)，导致小麦的遗传多样性降低。小麦近缘物种中蕴藏着丰富的优良基因，目前主要通过远缘杂交的方式将其优良基因导入到普通小麦，从而来丰富小麦的遗传多样性。长穗偃麦草(elytrigiaelongata(host)nevski)是小麦近缘物种，属禾本科小麦族偃麦草属，目前公认的有3种倍性：二倍体(2n＝2x＝14)、四倍体(2n＝4x＝28)和十倍体(2n＝10x＝70)。该物种生长繁茂、多花多实，抗寒、抗旱、耐盐碱、抗多种小麦病害(赤霉病、锈病、白粉病、黄矮病等)，是小麦遗传改良不可多得的优异外源基因供体，将其优良基因导入到普通小麦，对于普通小麦的遗传改良具有重要的作用。四倍体长穗偃麦草也同样具有上述特点，由四倍体长穗偃麦草和硬粒小麦杂交回交形成的六倍体小偃麦8801、8802、8803均高抗赤霉病，8802,8803高抗杆锈菌小种ug99(guo等，2015)。由8801和六倍体小黑麦t182杂交形成的小麦-黑麦-长穗偃麦草三属杂种杂交后代对赤霉病、叶锈病、杆锈菌小种ug99均表现出优越的抵抗力(dai等，2017b)。开发长穗偃麦草分子标记可以快速准确的检测在小麦-长穗偃麦草衍生后代的长穗偃麦草染色质，目前基于各种分子标记技术已经开发了许多长穗偃麦草的分子标记，具体如下：(1)利用rapd分子标记技术，找到了1e和3e染色体上两个特异的rapd分子标记(刘树兵等，1998)；(2)利用小麦微卫星引物建立了偃麦草ee染色体组ssr分子标记(尤明山等，2002)；(3)利用分子标记技术还建立了偃麦草e染色体组特异rapd和scar标记(尤明山等，2003)；(4)利用rgap分子标记技术，构建了一套完整的长穗偃麦草1e-7e染色体的特异rgap标记(陈国跃等，2007)；(4)建立了小麦中国春背景下长穗偃麦草ee染色体组特异aflp及sts标记(张丽等，2008)；(5)基于ssh技术开发了36个长穗偃麦草e染色体特异分子标记(葛江燕等，2012)；(6)基于slaf-seq技术开发了20个长穗偃麦草1e染色体和89个7e染色体特异分子标记(陈士强等，2013；chen等，2013)；(7)基于trap技术开发了长穗偃麦草scar标记(秦树文等，2014)；(8)基于slaf-seq技术开发了二倍体长穗偃麦草1e-7e染色体特异分子标记(dai等，2017a)。以上分子标记的开发主要来自于在二倍体长穗偃麦草和十倍体长穗偃麦草，而四倍体长穗偃麦草的分子标记较少，这阻碍了四倍体长穗偃麦草基因资源的开发和应用。gbs(genotypingbysequencing)是简化基因组测序的一种，其基本原理是利用限制性内切酶将一段完整dna切成很多的dna片段，然后选取300-500bp的片段，在该片段的两端测序，得到相应的序列片段，用这样的方法来达到简化测序的目的。该技术具有测序量低、价格便宜、数据利用率高、性价比高、参考基因组不依赖性等特点。目前gbs技术已经广泛应用于分子标记的开发、构建遗传图谱、qtl定位、gwas关联分析等。上述开发的长穗偃麦草的分子标记主要集中在二倍体长穗偃麦草和十倍体长穗偃麦草，本发明从四倍体长穗偃麦草入手，通过简化基因组测序(gbs)首先获得四倍体长穗偃麦草3ee染色体特异的序列，从这些序列中开发出来1对长穗偃麦草ee基因组特异的分子标记。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种长穗偃麦草ee基因组特异分子标记，它可用于二倍体、四倍体、十倍体长穗偃麦草ee基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含ee基因组物种的染色体或染色体片段鉴定，且能准确鉴定区分ee和eb基因组，这为小麦系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了基础。本发明具体通过以下技术方案实现：一种长穗偃麦草ee基因组特异分子标记，所述的分子标记是以四倍体长穗偃麦草的基因组dna为模板，采用序列1所示的单链分子和序列2所示的单链分子组成的引物对扩增得到的dna分子。在本发明的另一方面，提供了一种用于检测长穗偃麦草ee基因组的引物组合物，所述的引物组合物由序列1所示的单链分子和序列2所示的单链分子组成。所述的引物组合物中的各条引物的摩尔量比是1:1。在本发明的另一方面，提供了用于检测长穗偃麦草ee基因组的pcr试剂。本发明提供用于检测长穗偃麦草ee基因组的pcr试剂包括上述引物对。上述试剂中，每个所述引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为10um。在本发明的另一方面，提供了所述的分子标记或所述的引物组合物或所述的pcr试剂在下面(1)～(10)任一种的应用：1)检测长穗偃麦草ee基因组；2)检测含有长穗偃麦草ee基因组的产品；3)追踪长穗偃麦草ee基因组；4)追踪含有长穗偃麦草ee基因组的产品；5)准确鉴别ee和eb基因组；6)准确鉴别含有ee和eb基因组的产品；7)分子标记辅助选择育种；8)制备分子标记辅助选择育种的产品；9)小麦分子育种；10)制备小麦分子育种的产品。在本发明的另一方面，提供了检测待测植物中是否含有长穗偃麦草ee基因组的方法，包括以下步骤：用上述引物对待测植物进行扩增，若实现成功扩增，则表示待测植物中含有长穗偃麦草ee基因组。上述方法中，所述成功扩增是指扩增得到特异性条带。本发明的有益效果：本发明利用简化基因组测序技术(gbs)对二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草、硬粒小麦-四倍体长穗偃麦双二倍体8801和普通小麦-四倍体长穗偃麦草1ee-7ee染色体代换系进行测序，利用计算机软件进行序列比对，获得了四倍体长穗偃麦草3ee染色体特异序列，以这些序列为基础，开发了长穗偃麦草3ee染色体的特异分子标记，并在小麦及其近缘属物种中进行了验证。本发明开发的特异分子标记不仅可用于二倍体、四倍体、十倍体长穗偃麦草ee基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含ee基因组物种的染色体或染色体片段鉴定，且能准确鉴定区分ee和eb基因组，这为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了基础。附图说明图1长穗偃麦草ee基因组特异分子标记primer3e-219在普通小麦、长穗偃麦草、小麦-四倍体长穗偃麦草1e-7e染色体代换系中的扩增；m:marker(500bp)；1:cs；2:川农16；3:蜀麦482；4:th.elongatum(2x)；5:th.elongatum(4x)；6:8801；7:1ee/1d代换系；8:2ee/2a代换系；9:3ee/3d代换系；10:4ee/4d代换系；11:5ee/5d代换系；12:6ee/6d代换系；13:7ee/7d代换系；图2长穗偃麦草ee基因组特异分子标记primer3e-219在小麦族近缘二倍体及两个包含ee基因组的多倍体物种中的扩增；m:marker(500bp)；1:cs；2:8801；3:3ee/3d代换系；4:th.elongatum(2x)；5:th.elongatum(4x)；6:th.ponticum(10x)；7:th.bessarabicum；8:pseudoroegnerialibanotica；9:dasypyrumvillosum；10:hordeumbogdanii；11:agropyroncristatum；12:secalecereale；13:psathyrostachyshuashanica；14:trichopyrumcaespitosum；15:psammopyrumathericum。具体实施方式下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实验材料：普通小麦中国春(cs，triticumaestivum，2n＝6x＝42)、川农16(triticumaestivum，2n＝6x＝42)、蜀麦482(triticumaestivum，2n＝6x＝42)、二倍体长穗偃麦草(th.elongatum，eeee，2n＝2x＝14)、四倍体长穗偃麦草(th.elongatum，2n＝4x＝28,)、十倍体长穗偃麦草(th.ponticum，2n＝10x＝70)、硬粒小麦langdon-四倍体长穗偃麦草双二倍体8801(2n＝6x＝42，aabbeeee)、普通小麦-四倍体长穗偃麦草1ee-7ee染色体代换系(由8801和西南地区小麦品种川农16、蜀麦482等杂交、回交创制获得)、百萨偃麦草(th.bessarabicum，ebeb，2n＝2x＝14)、拟鹅观草(pseudoroegnerialibanotica，stst，2n＝2x＝14)、簇毛麦(dasypyrumvillosum，vv，2n＝2x＝14)、大麦(hordeumbogdanii，hh，2n＝2x＝14)、冰草(agropyroncristatum，pp，2n＝2x＝14)、黑麦(secalecereale，rr，2n＝2x＝14)、华山新麦草(psathyrostachyshuashanica，nsns，2n＝2x＝14)以及两个包含e基因的多倍体物种trichopyrumcaespitosum(ststeeee，2n＝4x＝28)和psammopyrumathericum(ststeeeepp，2n＝6x＝42)。实施例1基于gbs技术获得四倍体长穗偃麦草3ee染色体特异片段待二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗草、亲本8801和普通小麦-四倍体长穗偃麦草1-7ee染色体代换系等材料生长至苗期时，取其叶片送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行gbs测序，通过gbs测序获得各样品的有效序列。将获得的小麦-四倍体长穗偃麦草3ee/3d代换系的序列首先与已知的中国春的序列进行比对，剔除与小麦相似度在22.85％(23％)以上的序列，剩下的序列再与8801和四倍体长穗偃麦草的序列进行比对，获得相似度大于22.85％(23％)的序列，剩余的序列再与二倍体长穗偃麦草及其他代换系的序列进行比较，去除相似度大于90％的序列，即四倍体长穗偃麦草3ee染色体的特异序列。实施例2长穗偃麦草ee基因组特异分子标记的开发对于上述获得特异序列进行引物设计，pcr引物设计用的是在线软件primer3plus，所有的引物均在成都擎科伟业生物技术有限公司合成。pcr体系如下：pcr反应的总体积是25ul，dna模板(浓度需要稀释到100ng/ul左右)加1ul，上下引物各1ul(10um)，2×taqmastermix(p114)12.5ul，ddh2o9.5ul。pcr程序为：94℃5h；94℃30min，50～60℃30min，72℃1h，35个循环；72℃10h；12℃。实施例3琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物用3％的琼脂糖凝胶电泳检测，设计的引物在二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草、亲本8801、3ee/3d代换系中能扩增出特异条带，在cs、蜀麦482、川农16、1ee/1d代换系、2ee/2a代换系、4ee/4d代换系、5ee/5d代换系、6ee/6d代换系、7ee/7d代换系中均没有条带，我们认为这种引物可能是长穗偃麦草3ee染色体特异的引物，即长穗偃麦草3ee染色体特异的分子标记。通过pcr产物回收、测序验证后，其中特异分子标记primer3e-219在以上材料中的扩增情况如附图1所示：只在二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草、8801和3ee/3d代换系中能扩增出条带，在其他材料中均没有扩增出条带，说明这对标记可能就是长穗偃麦草3ee染色体特异分子标记。primer3e-219的引物序列如表1所示，相应的分子标记的dna序列如表2。表1长穗偃麦草ee基因组特异分子标记表21个长穗偃麦草ee基因组特异分子标记的dna序列标记名称dna序列(5'–3')长度(bp)primer3e-219序列3568实施例4长穗偃麦草3ee染色体特异标记在小麦及近缘物种中的验证对上述获得的特异分子标记，我们进一步在长穗偃麦草近缘的其他小麦族二倍体及两个包含ee基因组的多倍体物种中进行验证，特异标记primer3e-219在以上材料的验证情况如附图2所示，该标记在亲本8801、3ee/3d代换系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草、十倍体长穗偃麦草及两个包含ee基因组的多倍体物种中能扩增出特异条带，在其近缘物种百萨偃麦草(eb)、拟鹅观草(st)、簇毛麦(v)、大麦(h)、冰草(p)、黑麦(r)、华山新麦草(ns)中均没有扩增出条带，说明该分子标记是ee基因组特异且稳定的，在包含ee基因组的材料中均能扩展出特异条带，且可以清楚区分ee和eb两个基因组；该结果也可以进一步说明，ee基因是长穗偃麦草的基本基因组，其一直贯穿在长穗偃麦草从二倍体到多倍体的进化中。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。序列表<110>四川农业大学<120>一种长穗偃麦草ee基因组特异分子标记及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tccgacggtggtaatagaca20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cccaacccagagactttgat20<210>3<211>568<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3taagatctcggcgtcatcatccgacggtggtaatagacatctatttgaatacgagcctat60gaggatggattcgccgctcttggctatctgccagactacccaacaagatcaaagtctctg120ggttggggtggtatccagcagggcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn180nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn240nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn300nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn360nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn420nnnngtatagggcacagtttggccagtagttcgtcaaagactgttttggctcttgcctgg480agttttgtcttcttctcgaatggttcgtaatgagccgaccggtagggatatgagcgtatc540gttcgtcttgattcttcgtgatggatta568当前第1页12