一种利用多重PCR技术检测三种马铃薯病原菌的方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用多重pcr技术检测三种马铃薯病原菌的方法。

背景技术：

马铃薯(solanumtuberosuml.)是粮、菜、饲、加工兼用型作物，其具有生产周期短、适应范围广、产量高和营养丰富等特点，因而在世界范围内被广泛种植。我国是世界上最大的马铃薯生产国，主要的种植区分布在华北、东北、西南和南方等地区。马铃薯的块茎含有丰富的淀粉、蛋白质、抗氧化物和维生素，具有粮食、蔬菜、饲料兼用的特点，加工方式多种多样，在增加食品营养源、保障粮食安全和促进经济发展方面具有重要的保障作用。在农业资源过度开发、耕地地力下降、水资源更为紧缺的背景下，我国正启动马铃薯主粮化战略，推进把马铃薯加工成馒头、面条、米粉等主食，此举开辟了保障国家粮食安全的新途径，也有利于缓解资源环境压力，实现农业可持续发展。因此，国家高度重视马铃薯产业发展，不断加大政策扶持力度，科技投入也不断增加，促进中国马铃薯产业持续、稳定、健康地发展。然而，随着种植面积的不断扩大，病害成为限制马铃薯高产丰收的主要原因，严重影响了马铃薯的收益。马铃薯易受晚疫病、早疫病、黑痣病、青枯病和炭疽病等多种病害的危害，导致马铃薯的产量减少和质量下降。

马铃薯晚疫病是致病疫霉(phytophthorainfestans)引起的，是一种能造成马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂从而导致马铃薯减产的毁灭性病害，病情较轻时减产10%-20%，病情严重流行时可达到50%-70%。马铃薯晚疫病自20世纪50年代初在我国广泛大流行以来已经成为危害马铃薯的主要病害和主要减产因素。马铃薯早疫病是由茄链格孢(alternariasolani)引起的仅次于晚疫病的第二大病害。近年来，早疫病在许多马铃薯产区频繁发生并有上升趋势，一般年份可造成马铃薯减产5%-10%，病害严重年份产量减产可达50%以上。马铃薯黑痣病是由立枯丝核菌（rhizoctoniasolanikühn）引起的以带病种薯和土壤传播的病害，一般田块黑痣病的发病率在5％-10％，而重症田块可达到70%-80％。根据同工酶谱、致病性、dna碱基同源性和培养性状等特性，可将立枯丝核菌划分为14个融合群，分别命名为ag1-ag13和ag-bi，侵染马铃薯的主要为ag3融合群。

目前防治这些马铃薯病害的策略主要包括抗病品种和化学防治。抗病育种虽然取得了一定的防治效果，但抗性很容易被病原菌克服，因此之前推广的一些品种已不具抗病性。化学防治同样存在问题，不但对环境造成了污染，而且病原菌容易对药剂产生抗药性，导致防治效果明显降低。因此，采取一些措施来防止病害的发生就显得尤为重要，比如在马铃薯播种前对种薯或者土壤进行病原菌的检测。此外，当病害发生以后，准确、快速地鉴定和检测病原菌是进行病害诊断以及有效的病害防治的重要基础。综上所述，发展快速、灵敏、特异、安全的检测马铃薯病原菌的方法对马铃薯的安全生产具有重要意义。

传统的病原菌检测方法因需要借助显微镜、分离培养、生物测定、血清学等技术这些手段而具有步骤繁琐、耗时长以及检测结果不准确等缺点。此外，在田间，病害往往是由多种病原菌混合侵染导致的，这增加了检测的复杂度，此时常规的分离鉴定方法更加不能满足检测需求。分子生物学的飞速发展，为病原菌的快速、准确鉴定提供了可靠的技术支持。

目前最常用的植物病原菌检测技术是聚合酶链式反应（pcr）。pcr具有快速、高效、灵敏和特异等优点，被广泛应用于检测各种病原菌，如真菌、细菌和病毒。pcr方法建立以后，衍生出了多种以pcr为基础的检测技术，包括多重pcr、real-timepcr、rt-pcr、巢式pcr、固相pcr等。多重pcr是在一个反应体系中同时扩增多个目的基因片段的pcr技术。多重pc技术具有节省时间、降低成本和提高效率的优势，已经成为生命科学各个领域中的重要的研究手段。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺点与不足，提供一种利用多重pcr技术检测三种马铃薯病原菌的方法。该方法快速、灵敏、准确、操作简便。

本发明的目的，通过下述技术方案实现：

一种利用多重pcr技术检测三种马铃薯病原菌的方法，其特征在于，采用多重pcr一次性同时扩增致病疫霉（phytophthorainfestans）、茄链格孢菌（alternariasolani）和立枯丝核菌（rhizoctoniasolani）ag3融合群三种病原菌的特异基因，再通过琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。

一种利用多重pcr技术检测三种马铃薯病原菌的方法，包括以下步骤：

（1）模板的准备：分别提取致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌ag3融合群三种马铃薯病原菌的dna。

（2）设计扩增引物：根据genbank中已经发表的三种马铃薯病原菌的特异基因序列，分别设计并合成用于扩增三种马铃薯病原菌特异基因的引物。

（3）多重pcr反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行多重pcr反应。

（4）琼脂糖凝胶电泳检测：对多重pcr反应的产物进行电泳，根据电泳图中目的条带的有无和目的条带的大小来判断样品中是否含有一种或多种病原菌。

步骤（2）中所述马铃薯病原菌特异基因序列优选为致病疫霉的inf1基因、茄链格孢菌的histoneh3基因和立枯丝核菌（ag3融合群）的rsendo1基因。

所述步骤（2）中三种病原菌特异基因的引物分别为：

设计合成的致病疫霉的inf1基因的引物为pi-f和pi-r，其核苷酸序列为：

上游引物pi-f:5’-ttgtgaaggcgtcattcc-3’；

下游引物pi-r:5’-ccgagaggatgcttacga-3’；

该引物扩增获得的目的基因产物为401bp；

设计合成的茄链格孢菌的histoneh3基因的引物为as-f和as-r，其核苷酸序列为：

上游引物as-f：5’-tcacctcactctgcgatg-3’；

下游引物as-r：5’-gaagactggaagcggaga-3’；

该引物扩增获得的目的基因产物为209bp；

设计合成的立枯丝核菌（ag3融合群）rsendo1基因的引物为rs-f和rs-r，其核苷酸序列为：

上游引物rs-f：5’-tcagcaggagaacacagt-3’；

下游引物rs-r：5’-cttcacaagaccgaacca-3’；

该引物扩增获得的目的基因产物为307bp；

步骤（3）中所述多重pcr反应的体系包含：三种病原菌模板dna、致病疫霉上下游引物、茄链格孢菌上下游引物、立枯丝核菌（ag3融合群）上下游引物、聚合酶、聚合酶缓冲液、dntps和ddh2o；所述的三种病原菌模板dna为致病疫霉dna、茄链格孢菌dna和立枯丝核菌（ag3融合群）dna；所述的致病疫霉上下游引物的终浓度为160nm；所述的茄链格孢菌上下游引物的终浓度为240nm；所述的立枯丝核菌（ag3融合群）上下游引物的终浓度为240nm。

步骤（3）所述多重pcr反应的条件优选为：三种病原菌的模板dna各1ng/μl、致病疫霉上下游引物（pi-f和pi-r）各160nm，茄链格孢菌上下游引物（as-f和as-r）各240nm、立枯丝核菌（ag3融合群）上下游引物（rs-f和rs-r）各240nm、聚合酶0.5u、1×聚合酶缓冲液（tris-hcl10mm，kcl50mm，mgcl21.5mm）、dntps0.2mm（每种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.2mm），ddh2o补充至25μl；

步骤（3）所述多重pcr反应的反应程序为：95℃反应3min；95℃反应30s，53℃反应30s，72℃反应30s，共反应35个循环；最后72℃反应10min。

本发明所建立的利用多重pcr技术检测三种马铃薯病原菌的方法，在马铃薯生产种薯质量监控和病害诊断中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）多重pcr技术特异性高，不易出现假阳性结果；

（2）检测速度快，灵敏度高；

（3）同时检测三种病原菌，效率高，成本低；

（4）本发明没有溴化已锭、同位素等有害物质的使用，没有安全隐患，使用安全。

附图说明

图1多重pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。m：2kmarker；c：空白对照；1-3：多重pcr反应产物。

图2多重pcr检测方法的灵敏度结果。m：2kmarker；1：1ng/μl；2：100pg/μl；3：10pg/μl；4：1pg/μl；5：0.1pg/μl；c：空白对照。

图3多重pcr检测方法的特异性结果。m：2kmarker；1：以致病疫霉、茄链格孢菌、立枯丝核菌（ag3融合群）的基因组dna为模板；2：以致病疫霉、茄链格孢菌的基因组dna为模板；3：以致病疫霉、立枯丝核菌（ag3融合群）的基因组dna为模板；4：以茄链格孢菌、立枯丝核菌（ag3融合群）的基因组dna为模板；5：以致病疫霉的基因组dna为模板；6：以立枯丝核菌（ag3融合群）的基因组dna为模板；7：以茄链格孢菌的基因组dna为模板；8：以大豆疫霉的基因组dna为模板；9：以辣椒疫霉的基因组dna为模板；10：以链格孢菌的基因组dna为模板；11：以细极链格孢菌的基因组dna为模板；12：立枯丝核菌（ag1融合群）的基因组dna为模板；13：以立枯丝核菌（ag4融合群）的基因组dna为模板；c：空白对照。

图4多重pcr检测方法的重复性验证结果。m：2kmarker；c：空白对照；1-3：多重pcr反应产物。

图5多重pcr检测方法的实际样品检测结果。m：2kmarker；1-5：人工侵染土壤样品；6：阴性土壤样品；7：空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

将本发明的方法应用于致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌（ag3融合群）的检测。实施例中所用试剂购自北京全式金生物技术有限公司、宝生物工程（大连）有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司。

实施例1检测方法的建立

（1）基因组dna的提取：采用hpfungaldnakit分别抽提致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌（ag3融合群）的基因组dna。

（2）引物设计：根据致病疫霉的特异基因inf1基因（genbank:ay830094.1）、茄链格孢菌的特异基因histoneh3基因（genbank:kf308960.1）和立枯丝核菌（ag3融合群）的特异基因rsendo1基因（genbank:km522918.1）的基因序列分别设计引物，依次为pi-f/r、as-f/r和rs-f/r。所用到的引物的核苷酸序列如表1所示：

表1引物核苷酸序列表

（3）多重pcr反应：

25μl的扩增体系如表2：

表2多重pcr体系中各组分浓度

反应程序：95℃反应3min；接着95℃反应30s，53℃反应30s，72℃反应30s，共反应35个循环；最后72℃反应10min。

（4）琼脂糖凝胶电泳检测

取6μlpcr产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳检测（100v稳压，40min），再利用凝胶成像系统拍照得出结果。琼脂糖凝胶电泳检测的结果见图1所示（m为2kmarker，c为空白对照，1-3为多重pcr反应产物），泳道1-3均得到了三条与预期片段大小一致的条带，从上到下依次为401bp、307bp和209bp，说明所建立的多重pcr体系可用于检测这三种马铃薯病原菌。

实施例2病原菌检测灵敏度实验

将三种病原菌的模板dna浓度分别稀释为1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl和0.1pg/μl这五个浓度梯度，按照实施例1所建立的方法所得的检测结果见图2所示（1：1ng/μl；2：100pg/μl；3：10pg/μl；4：1pg/μl；5：0.1pg/μl；c：空白对照），由图2知，当模板浓度为10pg/μl时，三种病原菌均能被检测出；当模板浓度为1pg/μl时，除了致病疫霉，其他两种病原菌能被检测出。当模板浓度为0.1pg/μl时，三种病原菌都不能被检测出。因此，致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌（ag3融合群）的检测限依次为10pg/μl、1pg/μl和1pg/μl，因此可以判断本发明所建立的多重pcr检测方法灵敏度高。

实施例3病原菌检测特异性实验

按照实施例1所建立的方法，以三种马铃薯病原菌基因组dna为模版的阳性对照，无菌去离子水为模板作为阴性对照，在最佳反应条件下，3对引物分别对致病疫霉、茄链格孢菌、立枯丝核菌（ag3融合群）、大豆疫霉、辣椒疫霉、链格孢菌、细极链格孢菌、立枯丝核菌（ag1融合群）和立枯丝核菌（ag4融合群）的基因组dna进行pcr扩增。检测结果见图3，当加入一、二或者三种本发明所要检测的菌的dna模板时，pcr产物的电泳结果相应地也只有出现加入的菌的目的条带(1-7泳道)，而加入其他菌的dna模板的多重pcr产物的电泳结果都没有条带(8-13泳道)，因此说明本发明所建立的多重pcr检测方法具有良好的特异性。

实施例4病原菌检测重复性实验

按照实施例1所建立的方法，设置三组平行实验，即多重pcr体系中的模板以及各组分浓度都一样，且反应条件也一样。检测结果如图4所示，三组平行实验（1-3泳道，c为对照）的结果一致，条带位置一致，各条带的亮度也一样，因此可以认为本发明所建立的多重pcr检测方法具有良好的重复性。

实施例5实际样品检测

在种植马铃薯的田块里采集土壤样品，将致病疫霉、茄链格孢菌和立枯丝核菌（ag3融合群）按任意比例混合后加入土壤中，得到人工侵染土壤样品。采用土壤dna提取试剂盒（dneasypowersoilprokit，qiagen）提取人工侵染土壤样品中的dna，再按照实施例1所建立的方法进行检测。结果如图5（泳道1-5为人工侵染土壤样品，泳道6为阴性土壤样品，泳道7为空白对照）所示，人工侵染土壤样品中均有检测到三种菌所对应的条带，呈阳性，阴性样品和空白对照中没有条带。因此，本发明所建立的多重pcr检测方法具有较高的应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种利用多重pcr技术检测三种马铃薯病原菌的方法

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