本发明涉及分子生物学
技术领域：
。具体地说是一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物、筛选方法和鉴别方法。
背景技术：
：西伯利亚杏(amaniacasibirica(l.)lam)为蔷薇科(rosacesae)李属(aemeniacamill.)植物，是一种集生态价值和经济价值于一身的优良生态兼经济树种。其抗寒性强，冬季可耐-50℃的低温，抗旱，怕涝。在中国，其资源主要分布在内蒙古大青山、宁夏的贺兰山区、甘肃的腾格里沙漠边缘地区及辽松平原的西侧，有良好的固沙作用。西伯利亚的特点：种仁小、饱满、果仁中脂肪、蛋白质及苦杏仁苷含量丰富，杏仁可以入药，也可以榨油或加工成食品与饮料，是中国传统的出口物资之一。西伯利亚杏在内蒙地区4月初到4月中下旬开花，开花早，单花花期2～5d，整株花期8～11d，花期短，结果早。因此，早春的风和低温会影响蜜蜂的活动，从而影响授粉，霜冻也可以减少芽、花和幼果的数量。因此，杏的晚花性状可以作为确保产量的重要育种目标。亟待开发一种早期检测西伯利亚杏花期的分子标记，可为西伯利亚杏在分子鉴定和辅助育种等方面提供有力的技术支持。前期，在内蒙古自治区和林格尔县的良种繁育中心，经过2012-今的连续7年筛选，得到花期稳定，连年晚于普通西伯利亚杏盛花期7-15d的45株晚花西伯利亚杏，其45株晚花西伯利亚杏近3年花期情况如下表。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物、筛选方法和鉴别方法。为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物，鉴别引物为一对；正向引物f的核苷酸序列为gtagtcaaggtcgctaaggc，反向引物r的核苷酸序列为agtgattccgtgttcttcgc。一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的筛选方法，预测方法包括如下步骤：(1-1)以西伯利亚杏f106基因组数据为模板，做全基因组关联分析，得到与西伯利亚杏花期早-晚花花期相关的候选区域，使用primer3在线预测鉴别引物对；引物对的pcr扩增产物长度为958bp；(1-2)鉴别引物的核苷酸序列为：正向引物f的序列为gtagtcaaggtcgctaaggc，反向引物r的序列为agtgattccgtgttcttcgc；(1-3)引物对的设计，在chr6染色体上，存在与西伯利亚杏早-晚花花期相关的序列：在pcr扩增序列的371-377位置出现accatag的缺失，595位置和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏；若在pcr扩增序列的371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏。上述西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的筛选方法，实验方法包括如下步骤：(2-1)提取基因组dna：以8份已知纯合基因型的西伯利亚杏材料为检测样品，提取基因组dna；8份已知纯合基因型的西伯利亚杏材料分别为察尔森25-1、敖汉旗15-1、科左后旗01-1、扎鲁特33-1、w31、w5、w8和w6；(2-2)pcr扩增：以步骤(2-1)的8个已知纯合基因型的西伯利亚杏dna为模板，利用权利要求1所述的引物对进行pcr产物扩增，得到扩增产物：(2-3)pcr产物回收：使用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收pcr产物，并进行一代测序；(2-4)测序结果比对：将测序得到的序列与预测序列进行比对，得到在pcr扩增序列的371-377位置出现accatag的缺失，595位置和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏；若在pcr扩增序列的371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏。上述西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的筛选方法，在步骤(2-2)中，包括：(2-2-1)pcr扩增的反应体系为25μl：在一0.2ml的eppendorf管中加入以下各种组分建立pcr反应体系：12.5μl的2×taqpcrmix，0.5μl的dna，0.5μl的正向引物f，正向引物f的浓度为10μmol/l，0.5μl的反向引物r，反向引物r的浓度为10μmol/l，11μl的dnase/rnase-freewater；(2-2-2)反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃总延伸6min；最后于4℃保存；(2-2-3)结束后瞬时离心，取2μl进行1.0％琼脂糖1×tae电泳检测是否扩增出目的片段；(2-2-4)pcr产物的凝胶电泳图显示，均获得958bp的与目标片段长度一致的产物。一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的鉴别方法，包括如下步骤：(1)提取待测西伯利亚杏样品的基因组dna，获得基因组dna溶液；(2)以步骤(1)制得的基因组dna为模板，利用权利要求1所述的鉴别引物对基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；(3)将步骤(2)制得的pcr扩增产物经凝胶电泳后，获得958bp的核苷酸序列，将得到的pcr产物回收进行一代测序，得到的一代测序的序列与参考序列进行比对，若在371-377位置出现accatag的缺失，595和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏，若在371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏。上述西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的鉴别方法，在步骤(2)中，pcr扩增的反应体系为，总体系为25μl，包括12.5μl的2×taqpcrmix，0.5μl的dna，0.5μl的正向引物f，0.5μl的反向引物r，11μl的dnase/rnase-freewater；正向引物f的浓度为10μmol/l，反向引物r的浓度为10μmol/l。上述西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的鉴别方法，在步骤(3)中，94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃总延伸6min；最后于4℃保存。本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：利用鉴别引物对待测西伯利亚杏进行基因组dna扩增，将得到的pcr产物回收进行一代测序，将得到的一代序列结构与参考序列进行比对，若在371-377位置出现accatag的缺失，595和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏，若在371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏，可成功的鉴别西伯利亚杏的花期，准确率可达100％，为西伯利亚杏在分子鉴定和辅助育种方面提供有力的技术支持。附图说明本发明无附图。具体实施方式一、一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物，鉴别引物为：正向引物f的序列为gtagtcaaggtcgctaaggc，反向引物r的序列为agtgattccgtgttcttcgc。二、西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的筛选方法为：预测鉴别引物：(1)以西伯利亚杏f106基因组数据为模板，做全基因组关联分析，得到与西伯利亚杏花期早-晚花花期相关的候选区域，使用primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3)在线预测鉴别引物对；鉴别引物的pcr产物预计长度为958bp。(2)鉴别引物为：正向引物f的序列为gtagtcaaggtcgctaaggc，反向引物r的序列为agtgattccgtgttcttcgc。(3)鉴别引物对的设计基于与西伯利亚杏早晚花花期相关2个单核苷酸多态性和1个插入缺失的分子标记。其基本位置见表1和表2所示。在chr6染色体上，存在与西伯利亚杏早-晚花花期相关的序列：在pcr扩增序列的371-377位置出现accatag的缺失，595位置和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏；若在pcr扩增序列的371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏。表1snp染色体基因型检测区域在染色体上的位置snps位于该区域的位置chr6:20602769chr6gg/aachr6:20602174-20603132595chr6:20602787chr6gg/aachr6:20602174-20603132613表2实验对比(2-1)提取基因组dna：以8份已知纯合基因型的西伯利亚杏材料为检测样品，提取基因组dna；8份已知纯合基因型的西伯利亚杏材料分别为察尔森25-1、敖汉旗15-1、科左后旗01-1、扎鲁特33-1、w31、w5、w8和w6；(2-2)pcr扩增：以步骤(2-1)的8个已知纯合基因型的西伯利亚杏dna为模板，利用步骤(1-2)的引物对进行pcr产物扩增，得到扩增产物：(2-2-1)pcr扩增的反应体系为25μl：在一0.2ml的eppendorf管中加入以下各种组分建立pcr反应体系：12.5μl的2×taqpcrmix，0.5μl的dna，0.5μl的正向引物f，正向引物f的浓度为10μmol/l，0.5μl的反向引物r，反向引物r的浓度为10μmol/l，11μl的dnase/rnase-freewater；(2-2-2)反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃总延伸6min；最后于4℃保存；(2-2-3)结束后瞬时离心，取2μl进行1.0％琼脂糖1×tae电泳检测是否扩增出目的片段；(2-2-4)pcr产物的凝胶电泳图显示，均获得958bp的与目标片段长度一致的产物。(2-3)pcr产物回收：使用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收pcr产物，并进行一代测序；(2-4)测序结果比对：将测序得到的序列与预测序列进行比对，得到结果如表3所示，得到的一代测序的序列与参考序列进行比对，若在371-377位置出现accatag的缺失，595和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏，若在371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏。表3三、一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物的鉴别方法，鉴定分子标记与形状的相关性：chr6:20602544位点的插入缺失和chr6:20602769与chr6:20602787位点的基因型与早-晚花花期的相关性。1.鉴定西伯利亚杏品种的开花时间为了验证标记分子的可靠性，对23份西伯利亚杏品种进行开花时间的调查，田间试验于2015-2018年内蒙古自治区林木良种繁育中心西伯利亚杏种质资源库进行，西伯利亚杏树龄10年。如表4所示。表42.利用鉴别引物对，检测上述23份西伯利亚杏chr6:20602544位点的插入缺失和chr6:20602769与chr6:20602787位点的基因型，得到的一代测序的序列与参考序列进行比对，若在371-377位置出现accatag的缺失，595和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏，若在371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏，结果如表5。表53.总结：利用鉴别引物对待测西伯利亚杏进行基因组dna扩增，将得到的pcr产物回收进行一代测序，若得到一代序列与下面的参考序列进行比对，若在371-377位置出现accatag的缺失，595和613位置为g，则为晚花型西伯利亚杏，若在371-377位置accatag不缺失，595和613位置为a，则为早花型西伯利亚杏。晚花型西伯利亚杏参考序列为：agtagtcaaggtcgctaaggcaccttacatgttctgttgacctaatgcgtattacaagccatgtgctgtaaagtagaaagaatcaaaatgtttgatcaaaacacactcagactcaattcaattcaattcatattccaatgacttggagccaaagcaaatatattcacctcctgacatcgtactagtagtatcaaaaacatttcttttctctctccaagacaccgaaacaatgtcatgaagaaaacaacacacacataatgacttgcgttgtgttgttgacagcagaaaaaaagacaccaataatacaaaccctaagctacgtgcgagagagattcttaattgtactctattattctgggattccgtcgacc()actgtgtatggctttcgctgcttaacatgtgtagcccttgatctggccccacgtttcaccgtacaagctctgcctgggcgccatgtgtcgacatctgatacttgtctctgggaaaaggctagactatgctagttgatgatgaataaaaaagggatgcttgggcacacgagtggtgtctggggtggaacacaacatcgtgcgtggctattgtccctat【g】ggagacacacaggccag【g】gcctatgtgtttctccatcggacacgtcggttctgatgccatttagggatccgtaaatgtttcttgttgtgtccacggcagacacgtcggttcttctgcttaatccttgtaagcgagatcgttatttacgaagctgtttatttatgggtcgaaatagtaaagttgattcaataatgaaaaagatcttgattaattaggttatattgattgttgttatgatgattcacgagttaaatcaaatacagtgacgatgattcatcgaaaaaataacagacatgcatgcagacattgttaagaaagaaagacaataaaagcatagatttaggcgaagaacacggaatcact早花型西伯利亚杏参考序列agtagtcaaggtcgctaaggcaccttacatgttctgttgacctaatgcgtattacaagccatgtgctgtaaagtagaaagaatcaaaatgtttgatcaaaacacactcagactcaattcaattcaattcatattccaatgacttggagccaaagcaaatatattcacctcctgacatcgtactagtagtatcaaaaacatttcttttctctctccaagacaccgaaacaatgtcatgaagaaaacaacacacacataatgacttgcgttgtgttgttgacagcagaaaaaaagacaccaataatacaaaccctaagctacgtgcgagagagattcttaattgtactctattattctgggattccgtcgacc(accatag)actgtgtatggctttcgctgcttaacatgtgtagcccttgatctggccccacgtttcaccgtacaagctctgcctgggcgccatgtgtcgacatctgatacttgtctctgggaaaaggctagactatgctagttgatgatgaataaaaaagggatgcttgggcacacgagtggtgtctggggtggaacacaacatcgtgcgtggctattgtccctat【a】ggagacacacaggccag【a】gcctatgtgtttctccatcggacacgtcggttctgatgccatttagggatccgtaaatgtttcttgttgtgtccacggcagacacgtcggttcttctgcttaatccttgtaagcgagatcgttatttacgaagctgtttatttatgggtcgaaatagtaaagttgattcaataatgaaaaagatcttgattaattaggttatattgattgttgttatgatgattcacgagttaaatcaaatacagtgacgatgattcatcgaaaaaataacagacatgcatgcagacattgttaagaaagaaagacaataaaagcatagatttaggcgaagaacacggaatcact在371-377位置用小括号表示；在595和613位置均以中括号表示。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。序列表<110>国家林业和草原局泡桐研究开发中心<120>一种西伯利亚杏早晚花花期的早期鉴别引物、筛选方法和鉴别方法<141>2019-05-10<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtagtcaaggtcgctaaggc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agtgattccgtgttcttcgc20当前第1页12