用于检测致病鲍特杆菌的寡核苷酸组合、方法及试剂盒与流程

本发明属于分子学生物检测领域，更具体的，属于鲍特杆菌鉴定领域。
背景技术：
：鲍特杆菌为革兰阴性球杆菌，无芽胞，某些菌株有鞭毛，光滑型菌株有荚膜，是专性需氧型细菌，最适生长温度为35～37℃，最适ph6.8～7.0，营养要求比较高。鲍特杆菌包括7个菌种，分别为百日咳鲍特杆菌(b.pertussis)、副百日咳鲍特杆菌(b.parapertussis)、支气管败血鲍特杆菌(b.branchiseptica)、鸟鲍特杆菌(b.avium)、欣氏鲍特杆菌(b.hinzii)、霍氏鲍特杆菌(b.holmesii)和创口鲍特杆菌(b.trematum)。百日咳鲍特杆菌能引起的一种严重急性呼吸道传染病百日咳(pertussis)，传染性较强，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿多见，是严重威胁人类健康的主要传染病之一；副百日咳鲍特杆菌是与百日咳鲍特杆菌引起的症状类似，只是相对较轻；霍氏鲍特杆菌是一种能够引起败血症、心肌炎、呼吸道疾病，尤其对于免疫缺陷的患者更易感染(例如：免疫功能不全者、艾滋病患者)。而支气管败血鲍特杆菌在一般情况下感染动物，但少数情况也能感染人，感染之后引起败血症、脑膜炎、肺炎等，而其易与其它细菌感染的症状混淆，因此，临床上容易遗漏支气管败血鲍特杆菌的检测。目前，主要利用细菌学、血清学检测以及pcr技术来对鲍特杆菌进行检测。细菌学检测实验周期太长，灵敏度低，只有15％～30％，方法也不易标准化；因此，其仅适合病程早期的诊断，远不能满足临床需要。血清学检测灵敏度不高，存在一定的假阳性且操作比较繁琐，对操作人员要求较高。pcr检测，特别是荧光定量pcr检测是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，其特异性好，灵敏度高，且实验周期短。中国专利公开cn109153699a披露了一种检测鲍特杆菌的方法，通过三对引物实现了对百日咳鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌和霍氏鲍特杆菌的检测。由于需要使用三对引物，检测的操作更加复杂且不可避免地增加了检测成本。另外，美国专利公开us2010/0221715a1也披露了一种检测鲍特杆菌的组合物，其包括两对引物，能够检测百日咳鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌和霍氏鲍特杆菌，但无法检测出其他鲍特杆菌，如支气管败血鲍特杆菌，的存在。因此，现有技术存在对用尽量少的引物检测尽量多的鲍特杆菌的高灵敏度试剂的强烈需求。技术实现要素：有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种寡核苷酸组合在制备检测鲍特杆菌的试剂盒中的用途，所述鲍特杆菌为选自百日咳鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌、霍氏鲍特杆菌和支气管败血鲍特杆菌中的一种或更多种，所述寡核苷酸组合包括：第一上游引物、第一下游引物、第一探针、第二上游引物、第二下游引物、和第二探针。在一个实施方式中，第一上游引物具有seqidno:1所示的序列，第一下游引物具有seqidno:2所示的序列，第一探针具有seqidno:3所示的序列，第二上游引物具有seqidno:4所示的序列，第二下游引物具有seqidno:5所示的序列，第二探针具有seqidno:6所示的序列。在另一个实施方式中，第一上游引物具有seqidno:10所示的序列，第一下游引物具有seqidno:11所示的序列，第一探针具有seqidno:12所示的序列，第二上游引物具有seqidno:4所示的序列，第二下游引物具有seqidno:13所示的序列，第二探针具有seqidno:6所示的序列。使用该寡核苷酸组合，可以同时检测出样品中所存在的百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌、霍氏鲍特杆菌中的一种或更多种，从而判断受试者是否感染有百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌或霍氏鲍特杆菌，以及是否存在复合感染。百日咳鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌与支气管败血鲍特杆菌是公认的鲍特菌属中被认为对人类有较大危害的3种菌；另外，近期发表的文献表明：霍氏鲍特菌会造成与百日咳鲍特菌相似的症状。因此，如果能同时对上述4种鲍特杆菌进行检测，则覆盖范围将更广，不容易造成漏检；同时还意味着全面地检测了感染人类的常见鲍特杆菌。另一方面，本发明的用于检测的寡核苷酸组合可以仅包括两套引物和探针组，因而操作更加容易并节约了成本。在优选的实施方式中，所述本发明中的寡核苷酸组合还包括：用作内标检测的寡核苷酸组合。具体地，用作内标检测的寡核苷酸组合可包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针。在一个实施方式中，内标上游引物具有seqidno:7所示的序列，内标下游引物具有seqidno:8所示的序列，内标探针具有seqidno:9所示的序列。在另一个实施方式中，内标上游引物具有seqidno:14所示的序列，内标下游引物具有seqidno:15所示的序列，内标探针具有seqidno:16所示的序列。也就是说，本发明的寡核苷酸组合可进一步包括内标引物以及内标探针。其可与本发明的寡核苷酸组合中的其它引物和探针联用且互不影响。内标引物和探针的使用能够判断本次检测是否有效，进一步确保所述寡核苷酸组合的检测准确性。在本发明中，寡核苷酸组合可携带有用于实时荧光pcr检测的荧光报告基团和淬灭基团。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸组合中第一探针和第二探针上的荧光报告基团可互不干涉地选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe。优选地，第一探针和第二探针的荧光报告基团为fam，内标探针的荧光报告基团为hex。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸组合中第一探针和第二探针上的荧光猝灭基团可互不干涉地选自bhq0、bhq1、bhq2、bhq3、mgb-λ、dabcyl-λ、tamra。优选地，第一探针、第二探针和内标探针的荧光猝灭基团为bhq1。在第二方面，本发明还提供了一种寡核苷酸组合，其包括：第一上游引物：5’-tggtgcgctacgagcatca-3’(seqidno:1)，第一下游引物：5’-ggatgtcggtgaaggccac-3’(seqidno:2)，第一探针：5’-accgacgcgataccgttgagggg-3’(seqidno:3)，第二上游引物：5’-ccgctgctgacggtctatgt-3’(seqidno:4)，第二下游引物：5’-gcaagacaagcctggaaccac-3’(seqidno:5)，和第二探针：5’-ctgcgtgacgaactcaaacggctct-3’(seqidno:6)；或者，第一上游引物：5’-ctgctgcacatcgacatcaaga-3’(seqidno:10)，第一下游引物：5’-caacggtatcgcgtcggtt-3’(seqidno:11)，第一探针：5’-ctgggacgtatccagcgccct-3’(seqidno:12)，第二上游引物：5’-ccgctgctgacggtctatgt-3’(seqidno:4)，第二下游引物：5’-ccgcttgatgaccttgatagtg-3’(seqidno:13)，和第二探针：5’-ctgcgtgacgaactcaaacggctct-3’(seqidno:6)。在优选的实施方式中，所述寡核苷酸组合还包括：内标上游引物：5’-gactctctctgcctattggtctatt-3’(seqidno:7)，内标下游引物：5’-cccataacagcatcaggagtg-3’(seqidno:8)，和内标探针：5’-cagatccccaaaggactcaaagaacc-3’(seqidno:9)；或者，内标上游引物：5’-gtcaacggatttggtcgtat-3’(seqidno:14)，内标下游引物：5’-tccattgatgacaagcttcc-3’(seqidno:15)，和内标探针：5’-caccagggctgcttttaactctggtaaagt-3’(seqidno:16)。在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的寡核苷酸组合。进一步地，所述试剂盒还包括提取dna所需试剂，用于实时荧光pcr扩增的其他试剂，如mg2+、dntps、dna聚合酶、pcr缓冲液等中的至少一种。第四方面，本发明还提供了上述试剂盒在检测鲍特杆菌中的用途。在一个实施方式中，所述鲍特杆菌为选自百日咳鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌、霍氏鲍特杆菌和支气管败血鲍特杆菌中的一种或更多种。在第五方面，本发明提供了用于检测鲍特杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取待测样品的dna；2)使用上述本发明的寡核苷酸组合或试剂盒对步骤1)获得的dna进行荧光定量pcr检测；3)分析结果。在本发明中，用于检测样品可以是呼吸道鼻咽拭子样品、咽拭子、痰液样品、肺泡灌洗液等，但不限于此。在一个具体地实施方式中，所述步骤3)中，采用ct值作为判定标准。对于检测通道ct值≤38且内标通道为阳性(ct值≤40)的样品，报告为百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、霍氏鲍特杆菌和副百日咳鲍特杆菌中一种病菌或更多种细菌感染。在具体的实施方式中，所述步骤2)中的寡核苷酸组合具有如下浓度：0.1-1μm的第一上游引物、第一下游引物、第一探针、第二上游引物、第二下游引物和第二探针；0.1-0.5μm的内标引物；0.02-0.2μm的内标探针。优选的，所述步骤2)中的寡核苷酸组合具有如下浓度：0.5μm的第一上游引物、第一下游引物、第一探针、第二上游引物、第二下游引物和第二探针；0.25μm的内标引物；0.1μm的内标探针。进一步地，所述步骤2)中还包括以下组分和浓度：在具体的实施方式中，步骤2)中的荧光定量pcr反应如下所示：本发明的有益效果在于：仅用两个引物和探针的组合就能够同时检测百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌、霍氏鲍特杆菌四种菌，其操作更方便，成本更低；于此同时，本发明灵敏度高、且不与非靶标菌的核酸发生交叉反应。除此之外，疑似鲍特杆菌感染者通常会有咳嗽，白细胞升高的症状，因此常常在检测之前就接受了抗生素治疗，而本发明的寡核苷酸组合不受样品中抗生素的影响，能够准确地进行检测。附图说明图1为使用表1中的寡核苷酸组合扩增待测样品的结果；图2为检测结果为阳性的样品的序列比对图；图3为使用表1中的寡核苷酸组合扩增样品的灵敏度结果；图4为使用表1中的寡核苷酸组合扩增样品的特异性结果；图5为使用表1中的寡核苷酸组合的抗干扰实验对照图(无干扰物添加)；图6为使用表1中的寡核苷酸组合的抗干扰实验图(添加干扰物)；图7为使用表9中的一部分寡核苷酸代替表1中的寡核苷酸的对照实验结果；图8为使用表2中的寡核苷酸组合扩增待测样品的结果；图9为使用表2中的寡核苷酸组合扩增样品的特异性结果；图10为使用表2中的寡核苷酸组合扩增样品的灵敏度结果；图11为使用表2中的寡核苷酸组合的抗干扰实验图(添加干扰物)；图12为使用表2中的寡核苷酸组合的抗干扰实验对照图(无干扰物添加)。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。实施例1、本发明所使用的引物及探针针对百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌和霍氏鲍特杆菌的特异基因序列(重复插入序列is481与is1001)设计引物和荧光探针，引物和探针的具体序列如下表1和表2所示。表1表2其中，f和r为扩增引物的正向和反向引物对，ic-f和ic-r为内标引物对，p为检测探针。实施例2、检测过程1、试剂准备：1.1、取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；1.2、根据待测样品、阴性对照、阳性对照、定量参考品的数量，按比例(pcr反应液38μl/人份+酶混合液2μl/人份)取相应量的pcr反应液、酶混合液，充分混匀成pcr混合液，2000rpm离心10秒，4℃避光待用。2、样品、质控品、定量参考品处理与加样(在样品处理区进行)2.1、样品、质控品预处理2.1.1、待测样品：往样品收集管中加入1ml无菌生理盐水，充分振荡混匀，然后把全部液体(样品洗脱液)倒入1.5ml灭菌离心管中(棉拭子靠离心管壁挤干后丢弃)，瞬时离心后吸取20～50μl至另一1.5ml灭菌离心管中，加入20～50μl核酸释放剂，充分混匀后作为待测样品备用。2.1.2、阴性对照、阳性对照分别取20～50μl与20～50μl核酸释放剂混匀待用。2.2、加样(阴性对照、阳性对照与待测样品同步处理)2.2.1、每个pcr反应管中加入上述处理后的待测样品、阴性对照、阳性对照各4～10μl。2.2.2、室温静置10分钟，各待测样品、阴性对照、阳性对照、定量参考品的反应管中分别加入40μl上述已配制好的pcr-mix。3、荧光pcr反应(在荧光定量pcr扩增仪上进行)1)将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样品名称及定量参考品浓度。2)荧光检测通道选择：选择fam通道(reportere:fam，quencher：none)检测检测百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、霍氏鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌dna；选择hex或vic通道(reporter:vic，quencher：none)检测内标；参比荧光(passivereference)设置为rox。3)荧光定量pcr反应条件为：实施例3、实验结果分析pcr扩增反应结束后，仪器自动保存结果，实验一共测试了24个样品，其中有14个样品呈阳性，使用表1中所示的引物扩增的实验结果如图1所示，使用表2中所示的引物扩增的实验结果如图8所示。为了验证结果的准确性，将阳性样品送去测序，测序最终得到14条序列的测序结果均为阳性，与本发明检测方法检测的阳性结果一致，而测序结果如图2所示(其中，第一条为参比序列，后十四条为阳性样品的测序结果)，可以看出所有检测呈阳性的样品，其测序结果均为阳性，而检测呈阴性的样品，测序结果也表明为阴性。可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样品ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为ct(即cyclethreshold，指pcr反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；对于测定通道famct值≤38的样品，报告为百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、霍氏鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌中一种病菌或多种细菌感染；对于测定通道famct值>38或无显示同时，内标检测为阳性(ct值≤40)，报告为鲍特杆菌dna阴性。若内标ct值>38或无显示，则该样品的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样品进行重复试验。对于测定ct值>38的样品，同时，内标检测为阳性(ct值≤40)，报告为低于检测下限。若内标ct值>40或无显示，则该样品的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样品进行重复试验。并且每次实验应满足如下质量控制中的要求，实验结果才可靠。质量控制：1)阴性对照：fam检测通道无荧光信号增长，且无明显s型扩增曲线；2)阳性对照：fam、hex检测通道有明显s型扩增曲线，且检测ct值小于35；3)以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。实施例4、灵敏度检测及分析选取上述实施例3中检测为阳性的9个样品dna，分别将其稀释至100、200、400、4000、40000拷贝/ml，每个梯度取5μl作为扩增模板，使用实施例1中表1所述的寡核苷酸组合按照如实施例2所述进行扩增并再进行检测，每个梯度进行三批次的实验，结果如表3-1所示，并对400拷贝/ml重复检测20次，验证本试剂盒的最低检测限如图3所示；表2所述的寡核苷酸组合按照如实施例2所述进行扩增并再进行检测，每个梯度进行三批次的实验，结果如表3-2所示，并对400拷贝/ml重复检测20次，验证本试剂盒的最低检测限结果如图9所示。结果表明本发明的方法灵敏度高，检测浓度可低至400拷贝/ml。表3-1浓度(拷贝/ml)三批次检出情况检出率4.00e+049/9100％4.00e+039/9100％4.00e+029/9100％2.00e+023/933.33％1.00e+024/944.44％表3-2浓度(拷贝/ml)三批次检出情况检出率4.00e+049/9100％4.00e+039/9100％4.00e+029/9100％2.00e+024/944.44％1.00e+022/922.22％实施例5、特异性检测及分析选取呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的dna为模板，采用实施例1的表1和表2的寡核苷酸组合，按照如实施例3所示的扩增过程对选取的dna分别进行扩增，并再进行检测，结果如图4和图10所示，采用实施例1的寡核苷酸组合并不能扩增出条带，证明实施例1的寡核苷酸组合能特异性的扩增出对应的分枝杆菌。实施例6、抗生素干扰检测在样品中加入如下表4所示浓度的阿奇霉素、青霉素钠、克拉霉素、盐酸头孢甲肟、红霉素、复方磺胺甲噁唑片，再使用实施例1中表1所述的寡核苷酸组合进行扩增检测，其结果如表6和图6所示，同时将没有加入上述药物的同样的样品在同样的条件下进行扩增检测，以用于比较，其结果如表5和图5所示，实验结果表明扩增曲线和ct值两者均无显著差别，表明上述药品不能对本发明的寡核苷酸组合造成影响。表4编号干扰物质浓度1阿奇霉素50mg/l2青霉素钠250mg/l3克拉霉素40μg/ml4盐酸头孢甲肟250mg/l5红霉素40μg/ml6复方磺胺甲噁唑片250mg/l试剂在同一台仪器对对照样品进行检测，重复检测24次，统计检测结果ct值，计算95％置信区间(mean±1.96sd)，检测结果统计如下表5所示：表5、无添加干扰物质样品检测结果使用同一台slan96p仪器上对干扰样品进行检测，每个样品重复检测3次，统计平均值，计算与对照样品的ct值差值，检测结果统计如下表6所示：表6在样品中加入如上述表4所示浓度的阿奇霉素、青霉素钠、克拉霉素、盐酸头孢甲肟、红霉素、复方磺胺甲噁唑片，再使用实施例1中表2所述的寡核苷酸组合进行扩增检测，其结果如表8和图11所示，同时将没有加入上述药物的同样的样品在同样的条件下进行扩增检测，以用于比较，其结果如表7和图12所示，实验结果表明扩增曲线和ct值两者均无显著差别，表明上述药品不能对本发明的寡核苷酸组合造成影响。试剂在同一台仪器对对照样品进行检测，重复检测24次，统计检测结果ct值，计算95％置信区间(mean±1.96sd)，检测结果统计如下表7所示：表7、无添加干扰物质样品检测结果使用同一台abi7500仪器上对干扰样品进行检测，每个样品重复检测3次，统计平均值，计算与对照样品的ct值差值，检测结果统计如下表8所示：表8对比例1实际上，为了同时实现对百日咳鲍特杆菌、支气管败血鲍特杆菌、副百日咳鲍特杆菌和霍氏鲍特杆菌四种鲍特杆菌的有效检测，在本发明的研发过程中设计了大量的引物和探针，表9示例性地列出了其中的一部分。表9引物或探针序列(5'→3')is481-f3(seqidno:17)atgcccgattgaccttcctis481-r3(seqidno:18)agcggcccagccatttis481-p3(seqidno:19)cgtcgactcgaaatggtccagcais481-f4(seqidno:20)gccatgagctgggcatcais481-r4(seqidno:21)ggcatcggctcggtgttis481-p4(seqidno:22)caccgctttacccgaccttaccgis481-f5(seqidno:23)ggcatcaagcaccgctttacis481-r5(seqidno:24)ggctcggtgttgggagttctis481-p5(seqidno:25)cgaccttaccgcccacagaccaais1001-f3(seqidno:4)ccgctgctgacggtctatgtis1001-r3(seqidno:26)gtggttccaggcttgtcttgcis1001-f4(seqidno:4)ccgctgctgacggtctatgtis1001-r4(seqidno:27)cggctattccgctttgctis1001-f5(seqidno:28)gcggagatcgtctatgacttgttis1001-r5(seqidno:26)gtggttccaggcttgtcttgc这些引物和探针中采用了与实施例1类似的设计思路。但上述表9中的引物替换表1和2中的一部分引物之后效果却并不理想，出现了漏检、灵敏度不高、曲线不好等问题。例如，如图7所示，一共8个阳性样品，使用上述表9中的is481-f3/r3/p3、is1001-f3/r3引物替换表1或2中的相应引物之后，仅能检测出5个阳性样品。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。sequencelisting<110>湖南圣湘生物科技有限公司<120>用于检测致病鲍特杆菌的寡核苷酸组合、方法及试剂盒<160>28<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tggtgcgctacgagcatca19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2ggatgtcggtgaaggccac19<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3accgacgcgataccgttgagggg23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ccgctgctgacggtctatgt20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5gcaagacaagcctggaaccac21<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<400>6ctgcgtgacgaactcaaacggctct25<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7gactctctctgcctattggtctatt25<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8cccataacagcatcaggagtg21<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9cagatccccaaaggactcaaagaacc26<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10ctgctgcacatcgacatcaaga22<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11caacggtatcgcgtcggtt19<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列<400>12ctgggacgtatccagcgccct21<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<400>13ccgcttgatgaccttgatagtg22<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gtcaacggatttggtcgtat20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15tccattgatgacaagcttcc20<210>16<211>30<212>dna<213>人工序列<400>16caccagggctgcttttaactctggtaaagt30<210>17<211>19<212>dna<213>人工序列<400>17atgcccgattgaccttcct19<210>18<211>16<212>dna<213>人工序列<400>18agcggcccagccattt16<210>19<211>23<212>dna<213>人工序列<400>19cgtcgactcgaaatggtccagca23<210>20<211>18<212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