一种检测氰根离子的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光探针领域，尤其是涉及一种检测氰根离子的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

阴离子广泛存在于自然界和生物体中，在环境科学、临床医学、化学、生物学等领域具有重要的作用。在众多阴离子当中，氰根离子对人体具有极高的毒性，其中毒机理为氰根离子可通过与细胞色素氧化酶的三价铁离子络合，导致三价铁丧失传递电子能力，使呼吸链中断，最终导致人体缺氧而死亡。此外氰根离子在合成纤维，皮革制品，冶金工业和电镀技术中也起着非常重要的作用，但是氰化物在工业生产中的大量使用必然会造成生物体的危害以及环境的污染。因此，发展选择性好，灵敏度高，成本低廉的检测氰根离子的方法具有重大意义。

近年来，阴离子荧光探针由于其方法的选择识别性好、检测灵敏度高、抗干扰能力强和操作简单得到非常广泛的应用。荧光探针检测阴离子的主要原理是借助于荧光光谱仪器，通过观察阴离子与荧光探针分子之间发生的特异性反应，从而导致荧光分子结构上发生变化，最终通过这种荧光信号的改变来实现对阴离子的定量及定性分析。目前人们已经设计、合成了很多具有潜在应用价值的阴离子荧光探针，但是大部分的探针合成复杂，成本高，不可重复识别，并且很难实现在水溶液中识别阴离子。因此，开发出一类灵敏度高、可循环识别阴离子，并可在水溶液中检测氰根离子的荧光探针具有重要意义。

氟硼二吡咯衍生物是一种优秀的荧光团，由于其具有在可见光到近红外光谱区域的高强度吸收，高荧光量子产率，相当长的激发单重态寿命以及良好的化学稳定性等优点。因此，可应用其作为一种潜在的荧光团来设计阴离子荧光探针，同时氟硼二吡咯染料也被广泛应用于生物探针、荧光开关和光捕获阵列等研究领域，成为当前化学研究者的重大研究目标。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种检测氰根离子的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种检测氰根离子的荧光探针，其化学名称为3-溴-5-芳基乙腈-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省(bodipy1)，其结构式如下：

一种检测氰根离子的荧光探针的制备方法，以吡咯和苯甲醛为原料，通过缩合、溴化、氧化、氟硼化，再与苯乙腈通过亲核取代反应所得，反应流程如下：

具体制备工艺步骤为：

(1)5-(4-甲基苯基)二吡咯甲烷的合成：

在氮气氛围中，将苯甲醛、吡咯和无水ch2cl2混合，然后加入三氟乙酸，室温下搅拌反应，反应结束后洗涤、干燥、收集滤液、浓缩、纯化后，得到黄色固体5-(4-甲基苯基)二吡咯甲烷；

(2)溴化产物中间体的合成：

将步骤(1)制备得到的5-(4-甲基苯基)二吡咯甲烷溶于无水四氢呋喃，并用氮气置换，降温冷却，随后将n-溴代琥珀酰亚胺分两批加入，搅拌后，再将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌溶于四氢呋喃后，加入上述反应体系；待反应完全后，恢复至室温，减压蒸馏，经柱层析后收集得到溴化产物中间体；

(3)3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省的合成：

将步骤(2)制备得到的溴化产物中间体溶于甲苯中，加入三乙胺，15min后加入三氟化硼乙醚，回流反应，反应完全后洗涤、萃取、合并有机相、干燥、浓缩、分离纯化后得到红色固体3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省；

(4)3-溴-5-芳基乙腈-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省的合成：

氮气氛围下，将无水四氢呋喃和钠氢混合后，加入苯乙腈，搅拌反应，将含有3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省的无水四氢呋喃加入反应体系内，室温搅拌反应，反应结束后调节ph、萃取、干燥、除去溶剂，分离纯化得到红色固体3-溴-5-芳基乙腈-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省。

优选的，步骤(1)中：苯甲醛、吡咯、无水ch2cl2和三氟乙酸的添加量之比为5.00g:20ml:250ml:200mg。

优选的，步骤(1)中：待反应完全后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，收集滤液，浓缩，硅胶柱层析纯化，石油醚：乙酸乙酯＝2:1。

优选的，步骤(2)中：5-(4-甲基苯基)二吡咯甲烷、n-溴代琥珀酰亚胺和2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌的添加量之比为2.22g:3.60g:2.27g。

优选的，步骤(2)中：冷却降温的温度为-78℃。

优选的，步骤(2)中：待反应完全后，将反应混合物温度升至室温，减压蒸去溶剂，使用二氯甲烷对粗产物进行快速柱层析。

优选的，步骤(3)中：溴化产物中间体、甲苯、三乙胺和三氟化硼乙醚的添加量之比为3.36g:100ml:9ml:10ml。

优选的，步骤(3)中：回流反应2h，反应完全后，加入饱和nahco3洗涤，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，浓缩，硅胶柱层析分离纯化(石油醚：二氯甲烷＝2:1)。

优选的，步骤(4)中：无水四氢呋喃、钠氢、苯乙腈和3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省的添加量之比为30ml:12mmol:4.88mmol:1.22mmol。

优选的，步骤(4)中：含3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省的无水四氢呋喃通过注射器加入。

优选的，步骤(4)中：反应结束后加入饱和柠檬酸调至酸性，并用乙酸乙酯萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)。

一种检测氰根离子的荧光探针在检测水溶液中氰根离子的应用。

优选的，采用紫外吸收和荧光发射光谱法检测时，荧光探针溶解在乙腈和水3:7混合溶液中，对氰根离子进行测试。

优选的，制备检测试纸，具体步骤如下：

在处理过的滤纸上滴加荧光探针的乙腈溶液，使荧光探针均匀吸附在滤纸上，自然晾干，制备得到cn^-检测试纸。

本发明的荧光探针是以氟化硼二吡咯为荧光团，芳基乙腈中碳氢为识别位点，在乙腈和水(v/v＝3:7)作为溶剂的条件下，在357nm，514nm处有紫外吸收峰，加入cn^-后，357nm和514nm处吸收峰出现降低。而加入其它阴离子，该荧光探针的紫外吸收光谱没有明显变化。在荧光光谱中，以388nm作为激发波长，该荧光探针的最大发射波长为533nm，具有很强的绿色荧光，加入cn^-后，533nm处的荧光强度明显降低，而加入其它阴离子，荧光强度没有明显变化。在紫外灯365nm照射下，观察到加入cn^-后出现荧光淬灭，而其它阴离子没有变化。

与现有技术相比，本发明的探针分子合成路线简单，原料易得，灵敏度较高，对氰根离子识别能力强，响应速度较快，最低检测限可达148nm；同时在含水溶液检测中，同样具有较高选择性和灵敏度；并且该探针具有循环性、可逆性，可多次检测氰根离子，在氰根离子的检测中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的荧光探针(20μmol·l^-1)的乙腈和水(v/v＝3/7)溶液中加入不同阴离子(20μmol·l^-1)时的紫外吸收谱图；

图2为本发明的荧光探针(20μmol·l^-1)的乙腈和水(v/v＝3/7)溶液中加入不同阴离子(480μmol·l^-1)时的荧光发射谱图(λex＝388nm)；

图3为本发明的荧光探针(20μmol·l^-1)的乙腈和水(v/v＝3/7)溶液中加入不同阴离子(480μmol·l^-1)时在手提紫外灯365nm照射下图片；

图4为本发明的荧光探针(20μmol·l^-1)的乙腈和水(v/v＝3/7)溶液中在不同cn^-浓度(0-480μmol·l^-1)下紫外吸收光谱；

图5为a514nm与cn^-浓度关系曲线；

图6为本发明的荧光探针(20μmol·l^-1)的乙腈和水(v/v＝3/7)溶液中在不同cn^-浓度(0-480μmol·l^-1)下荧光发射光谱；

图7为i533nm与cn^-浓度关系曲线；

图8为本发明的荧光探针在乙腈和水(v/v＝3/7)溶液中可逆循环性实验；

图9为本发明的荧光探针在乙腈和水(v/v＝3/7)溶液中荧光检测限计算图；

图10为本发明的荧光探针(20μmol·l^-1)在与其它阴离子(480μmol·l^-1)共存时对cn^-(480μmol·l^-1)响应时i/i0的变化柱状图；

图11为本发明的荧光探针与本发明的荧光探针加入cn^-在ph值1-14体系中533nm处荧光强度；

图12为本发明的荧光探针试纸滴加不同浓度cn^-时在手提紫外灯365nm照射下图片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明各实施例中所用的各种原料的名称、规格及生产厂家的信息见表1。

表1

本发明的各实施例中所用的硅胶柱的型号及生产厂家为长45cm，直径45mm，北京联华玻璃仪器有限公司生产的硅胶柱。

实施例1

一、检测氰根离子的荧光探针bodipy1分子的合成

本发明检测氰根离子的荧光探针分子的合成，是以吡咯和苯甲醛为原料，通过缩合、溴化、氧化、氟硼化，再与苯乙腈通过亲核取代反应所得。

(1)5-(4-甲基苯基)二吡咯甲烷的合成：

将苯甲醛(5.00g，47.20mmol)，吡咯(20ml，289mmol)和无水ch2cl2(250ml)加入到500ml圆底烧瓶中，该烧瓶内置换成氮气体系，随后向混合物中加入三氟乙酸(200mg，2.60mmol)，将反应在室温下搅拌2h。待反应完全后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，收集滤液，浓缩，硅胶柱层析纯化，石油醚：乙酸乙酯＝2:1，得黄色固体(6.81g，65％)。

上述所得的淡黄色固体粉末产品通过核磁共振仪器(brukeravanceiii500mhz)进行测定，数据如下所示：

¹hnmr(500mhz,dmso),δ7.86(s,2h),7.35(t,j＝7.5hz,2h),7.29(t,j＝7.0hz,1h),7.24(d,j＝7.0hz,2h),6.69(d,j＝1.0hz,2h),6.20(d,j＝2.5hz,2h),5.94(s,2h),5.47(s,1h)；¹³c-nmr(125mhz,cdcl3),δ142.26,132.72,128.76,128.56,127.10,117.48,108.49,107.45,44.01.

通过上述所得的淡黄色固体粉末产品的核磁共振谱数据分析，结果表明，上述所得的黄色固体粉末产品为5-(4-甲基苯基)二吡咯甲烷。

(2)3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省的合成：

250ml三口烧瓶中，将5-(4-甲基苯基)二吡咯甲烷(2.22g，10mmol)溶于无水四氢呋喃，并氮气置换三次，冷却至-78℃，随后n-溴代琥珀酰亚胺(3.60g，20.2mmol)分两批加入三口烧瓶中，低温搅拌2h，再将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(2.27g，10mmol)溶于四氢呋喃中，缓慢滴加至三口烧瓶中。待反应完全后，将反应混合物温热至室温，减压蒸去溶剂，使用二氯甲烷对粗产物进行快速柱层析，收集溴化产物中间体。将上述所得溴化产物中间体3.36g溶于100ml甲苯中，加入et3n(9ml)，15分钟后加入bf3·et2o(10ml)，缓慢升温至回流状态，回流2h。反应完全后，加入饱和nahco3洗涤，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，浓缩，硅胶柱层析分离纯化(石油醚：二氯甲烷＝2:1)得红色固体(2.4g，56％)。

上述所得的淡黄色固体粉末产品通过核磁共振仪器(brukeravanceiii500mhz)进行测定，数据如下所示：

¹hnmr(500mhz,dmso),δ7.59(t,j＝7.0hz,1h),7.51(t,j＝7.5hz,2h),7.47(dd,j＝8.0,1.1hz,2h),6.79(d,j＝4.0hz,2h),6.53(d,j＝4.0hz,2h)；¹³c-nmr(125mhz,cdcl3),δ143.25,135.50,132.61,132.33,131.82,130.96,130.39,128.62,122.77.

通过上述所得的淡黄色固体粉末产品的核磁共振谱数据分析，结果表明，上述所得的红色固体产品为3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省。

(3)3-溴-5-芳基乙腈-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省(bodipy1)的合成：

将30ml的无水四氢呋喃和钠氢(60％，0.48g，12.00mmol)加入到100ml的三口烧瓶中，氮气置换三次，将苯乙腈(0.57g，4.88mmol)加入到烧瓶内，室温下搅拌30min，将5ml含3,5-二溴-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省(0.52g，1.22mmol)的无水四氢呋喃通过注射器加入到烧瓶内，室温下搅拌8h。反应结束后加入饱和柠檬酸调至酸性，并用乙酸乙酯萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到红色固体(0.25g，45％)。

上述所得的淡黄色固体粉末产品通过核磁共振仪器(brukeravanceiii500mhz)进行测定，数据如下所示：

¹hnmr(500mhz,dmso),δ7.61-7.55(m,3h),7.52(s,4h),7.41(t,j＝7.5hz,2h),7.38-7.33(m,1h),6.88-6.82(m,2h),6.57(d,j＝4.0hz,1h),6.53(d,j＝3.5hz,1h),5.93(s,1h)；¹³c-nmr(125mhz,cdcl3),δ152.92,145.75,135.78,134.66,133.24,133.12,132.66,132.44,132.01,131.09,130.41,129.34,128.73,128.64,127.82,123.02,118.81,117.49,36.08.

通过上述所得的淡黄色固体粉末产品的核磁共振谱数据分析，结果表明，上述所得的红色固体产品为3-溴-5-芳基乙腈-4,4-二氟-8-苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省。

二、检测氰根离子的荧光探针bodipy1对阴离子的识别性能

1、氰根离子的荧光探针的选择性研究

将bodipy1配制成20μmol·l-1的乙腈溶液；分别配制cn^-,f^-,cl^-,br^-,i^-,aco^-,h2po4^-,hso4^-,clo4^-,bf4^-,no3^-,scn^-,s2^-的5000μmol·l^-1乙腈溶液，量取0.4ml的5000μmol·l^-1探针溶液，用乙腈和水混合溶液(v/v＝3/7)定容至100ml，将其分为14组(每组5ml)，第一组为空白实验，向其他各组分别加入24当量的各种阴离子溶液，通过紫外吸收光谱和荧光发射光谱(λex＝388nm)，观察荧光探针bodipy1对各种阴离子的响应。

结果表明，bodipy1在乙腈和水(v/v＝3:7)作为溶剂的条件下，在514nm和357nm处分别有吸收峰，加入cn^-后，514nm和357nm处的吸收峰出现下降，而加入其它阴离子，bodipy1的紫外吸收光谱没有明显变化(图1)。在荧光光谱中，以388nm作为激发波长，bodipy1的最大发射波长为533nm，具有较强荧光，加入cn^-后，533nm处的荧光强度出现明显减弱，而加入其它阴离子，bodipy1的发射波长没有明显变化(图2)，在紫外灯365nm照射下，加入cn^-后出现绿色荧光，而其它阴离子没有变化(图3)。说明该荧光探针可以专一性的检测氰根离子。

2、氰根离子的荧光探针滴定实验

将bodipy1溶于乙腈中配制成5000μmol·l^-1的储备液，在乙腈中配制cn^-储备液，浓度为50000μmol·l^-1。量取100μl的5000μmol·l^-1的探针溶于25ml的容量瓶中，加入17.5ml水后，用乙腈溶液定容至25ml配成25ml20μm的水和乙腈(v/v＝3:7)混合溶剂的探针溶液。滴定实验：将25ml20μm的水和乙腈(v/v＝3:7)混合溶剂的探针溶液倒入100ml的广口锥形瓶中，每次滴加0.2μl50000μmol·l^-1(2.0当量)的cn^-溶液，摇晃均匀后分别检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，重复此操作，直至加入24.0当量的氰根离子溶液。

结果表明，bodipy1的紫外吸收光谱受氰根离子浓度的影响(图4-5)，随着氰根离子的逐渐加入，bodipy1在514nm和357nm处的吸收峰逐渐降低，直至加入480μmol·l^-1cn^-时达到平衡。接着测其荧光发射光谱(图6-7)，bodipy1的荧光强度在533nm处很强，随着氰根离子的加入，荧光强度逐渐减弱，并最终达到淬灭，直至加入480μmol·l^-1cn^-时达到平衡。

3、bodipy1荧光探针的可逆循环性实验

在测完氰根离子的荧光滴定后，继续滴加tfa测定h⁺(tfa)的滴定谱图，待滴加tfa饱和后，再滴加饱和当量的cn^-，依次重复四组实验，测定其在533nm处的荧光强度的变化，以及使用紫外灯365nm观察荧光颜色的变化。

如图8所示的实验结果表明，探针bodipy1实现了4次的可逆和可重复使用。此外荧光从绿色荧光变为无色荧光，然后回到绿色荧光的反复实现，表明bodipy1的敏感的可逆性。

4、bodipy1荧光探针对氰根离子最低检测限的测定

当cn^-的浓度为0-480μmol·l^-1时f-f0/fmax-f0与氰根离子浓度lg[cn^-]表现出较好的线性关系，拟合得到的线性方程为y＝39086+0.8713*x(r²＝0.9784)，依据“检测限＝3σ/k”可计算bodipy1对cn^-的检测限为148nm，远低于世界卫生组织对饮用水中的氰根离子的最大规定值1.9μmol·l^-1。因此，bodipy1可用于实际水样中氰根离子的测定。(图9)

5、抗干扰能力检测

将25ml20μm的水和乙腈(v/v＝3:7)混合溶剂的探针溶液分别倒入14支15ml的试管中，每支5ml，第一支作空白对照，向其余试管中分别加入48μl50000μmol·l^-1的不同阴离子(cn^-,f^-,cl^-,br^-,i^-,aco^-,h2po4^-,hso4^-,clo4^-,bf4^-,no3^-,scn^-,s2^-)充分摇匀，进行紫外吸收光谱和荧光发射光谱检测，最后向每支试管中加入48μl50000μmol·l^-1的氰根离子，摇匀，再次分别检测其紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

实验表明，在与其他阴离子共存的情况下，cn^-依然可以使bodipy1在514nm处的紫外吸收峰降低，并且可以使bodipy1在533nm处的荧光强度明显淬灭(图10)，因此bodipy1对cn^-检测具有很好的抗干扰能力，而其他阴离子不会对检测结果带来任何干扰。

6、bodipy1在不同ph值体系中对cn^-的检测能力

在15支试管中，分别加入20μl5000μmol·l^-1的探针溶液，再加入1.5ml的乙腈，然后分别加入ph为1到14的水溶液3.5ml，振荡30s，分别检测荧光发射光谱。然后再加入48μl50000μmol·l^-1的氰根离子，再次测出其荧光发射光谱。

如图11所示的实验结果表明，ph在1-12范围内，bodipy1在533nm处的荧光强度很强，基本保持稳定，而加入cn^-后在ph为2-12范围内，荧光出现明显淬灭，从而可以看出bodipy1在ph值2-12范围内可以有效地识别cn^-。

三、bodipy1的cn^-检测试纸及应用

试纸制备：将滤纸剪成长2cm，宽1cm的长条浸泡于1nm的探针bodipy1的乙腈溶液中，过夜后取出晾干。分别向5片试纸上滴加一滴(约0.1ml)的0，0.2，0.5，1.0，5.0mm的cn^-的乙腈溶液，晾干后，日光下以及在紫外灯365nm下观察其荧光颜色变化。

如图12所示，肉眼可以观察到试纸颜色由无色逐渐变为紫红色，而在紫外灯365nm照射下，bodipy1具有很强的绿色荧光，当加入cn^-后，可看到绿色荧光出现减弱，最终变为没有荧光。说明bodipy1可通过试纸检测cn^-。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。