修饰核苷、核苷酸和修饰核酸聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及核酸药物
技术领域：
，尤其是涉及一种修饰核苷、核苷酸和修饰核酸聚合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：核酸化学修饰是发展核酸药物的关键性技术和瓶颈。与传统的小分子和蛋白药物相比，核酸药物具有设计快速、靶点普遍、特异性高、可在细胞内发挥作用，以及合成和制备相对快速等优点，可突破蛋白靶点难以成药的重大疾病的治疗，特别是在应对特殊病例和新突发传染病等应急研发时，核酸药物的快速设计与制备能力具有独特价值，如tekmira公司在8周内开发出针对西非ebola病毒的sirna药物tkm-ebola-guinea。然而，天然寡核苷酸分子要作为有效的治疗药物，必需克服以下问题：(1)体内稳定性差，天然的磷酸二酯键的寡核苷酸在体内极易被血液和细胞中广泛存在的各种核酶快速降解。(2)与靶基因结合亲和力和特异性低，易发生“脱靶”效应(‘off-target’effects)，产生免疫刺激和毒副作用，特别是肝毒性。(3)生物利用度低，寡核苷酸通常为多价阴离子大分子，因此，难以进入靶器官和组织，且不易透过亲脂性的细胞膜进入细胞内。针对上述问题，自从1970s以来，通过对磷酸骨架、糖基、碱基进行修饰，研究人员发展出许多成功的寡核苷酸结构修饰策略，如硫代磷酸酯，2'位修饰的2'-ome，2'-omoe，2'-f，以及morpholino，pna等，大幅提高了寡核苷酸对核酸酶耐受性，对靶基因的亲和力和特异性，降低免疫刺激和毒副作用，推动着核酸药物的发展，已上市核酸药物大多使用了相应的核酸化学修饰。有鉴于此，为了发展新型的核酸化学修饰结构，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种修饰核苷，该修饰核苷可用于核酸药物等的修饰，有助于改善核酸药物的核酶耐受性。同时还可以对修饰核苷进行改进修饰，得到核苷酸和修饰核酸聚合物，具有良好的核酶耐受性。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种修饰核苷，选自具有以下结构的化合物或其盐：其中，r1选自及各自的盐；n选自1、2、3、4、5和6；r2选自叠氮基、氨基、胺基或酰胺基；w选自h或保护基团；x选自h、α构型的oh、β构型的oh、α构型的f或β构型的f。其中保护基团如4,4’-二甲氧基三苯甲基(dmtr)。本发明的修饰核苷，通过对核苷进行修饰，在4’位引入叠氮基、氨基或胺基等，得到一种新型的修饰核苷结构。可对该修饰核苷进行进一步修饰，得到核苷酸和修饰寡核苷酸等，具有良好的核酶耐受。优选的，所述胺基为-nr3r4，r3和r4各自独立的选自h、碳数为1-6的烷基或荧光基团。r3和r4不同时为h。如r3和r4同时为h时，则为氨基-nh2。如在不同实施方式中，胺基可以为优选的，所述r3和r4各自独立的选自碳数为1-5的烷基。更优选的，所述r3和r4各自独立的选自碳数为1-4的烷基。优选的，所述酰胺基为-nhcor5，r5选自碳数为1-6的烷基或碳数为1-6的卤代烷基。r5可采用-cf3、-chf2、-ch2f、-ch2cf3、-ch2chf2、-ch2ch2f、-c2h4cf3、-c2h4chf2、-c2h4ch2f等等。更优选的，所述酰胺基为-nhcocf3。在本发明中，r2优选选自酰胺基。如在不同实施方式中，荧光基团可以为芘及其衍生物。其中，当x为h时，修饰核苷的结构为：当x为α构型的羟基oh时，修饰核苷的结构为：当x为β构型的羟基oh时，修饰核苷的结构为：当x为α构型的氟f时，修饰核苷的结构为：当x为β构型的氟f时，修饰核苷的结构为：在本发明一些具体的实施方式中，x优选选自α构型的f或β构型的f。2’位修饰有f原子，可在得到修饰的寡核苷酸中与3’端相邻的碱基形成c-h…f-c假氢键，易形成更稳定的双链且能提高亲和力。在本发明一些具体的实施方式中，r1优选为中的任一种，更优选为本发明中的盐是指，可以方便的或合乎需要的制备、纯化和/或处理上述修饰核苷化合物的对应盐，例如，药学上可接受的盐。例如，如果所述修饰核苷化合物是阳离子，或具有可以呈阳离子的官能团(例如，-nh2可以是-nh3+)，那么可以与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子包括但不限于来源于以下无机酸的阴离子：盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸、亚磷酸、氢溴酸、氢碘酸等。合适的有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下有机酸的阴离子：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸等等。还可采用例如来源于羧甲基纤维素钠的聚合物有机阴离子。除非另外指出，本发明中对特定化合物的提及也包括其盐形式。本发明还提供了一种核苷酸，其为上述修饰核苷的3’-亚磷酰胺衍生物或其盐。具体，其结构式可以为或其盐形式，其中w选自h和保护基团，保护基团如4,4’-二甲氧基三苯甲基(dmtr)。优选的，r2选自氨基和胺基。使用标准合成方法可将上述核苷酸化合物嵌入寡核苷酸序列中，可得到修饰的寡核苷酸。如可通过自动合成仪，运用标准亚磷酰胺法将上述核苷酸化合物嵌入寡核苷酸序列中，获得修饰的寡核苷酸。本发明还提供了一种修饰核酸聚合物，其包括至少一个具有以下结构的修饰核苷酸：其中y选自o或s，r3选自芳基、甲基、取代的烷基或链烯基。如芳基可采用苯基、苄基、卤代苯基等等。如取代的烷基可采用乙基、丙基、异丙基、卤代烷基、2-氰基乙基等等。优选的，所述修饰核酸聚合物包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的共聚物。更优选的，所述修饰核酸聚合物为寡核苷酸。所述核酸聚合物可指任何核酸分子，包括而不限于dna、rna和其杂合体，包括而不限于单链和双链等。聚合形成核酸的核苷酸数量为2个、3个及以上，可以为核苷酸数量为20个以下的寡核苷酸，也可以为核苷酸数量为20个以上的聚合物。其中，上述修饰核酸聚合物中的波浪线之间的部分为嵌入在核酸聚合物序列中的结构，波浪线外部分代表核酸聚合物中的其它序列。优选的，所述寡核苷酸选自下述序列中的一种或多种：seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3。seqidno：1为gcgttttttgct，seqidno：2为gcgttgtttgct，seqidno：3为gcgttatttgct。优选的，所述修饰寡核苷酸选自下述序列中的一种或多种：在seqidno：1的5’端第6位进行修饰即gcgttttttgct，在seqidno：1的5’端第6位和第8位进行修饰即gcgttttttgct，在seqidno：1的5’端第4为、第6位和第8位进行修饰即gcgttttttgct，在seqidno：1的5’端第5位、第7位和第9位进行修饰即gcgttttttgct，在seqidno：2的5’端第5位进行修饰即gcgttgtttgct，在seqidno：2的5’端第7位进行修饰即gcgttgtttgct，在seqidno：3的5’端第5位进行修饰即gcgttatttgct，在seqidno：3的5’端第7位进行修饰即gcgttatttgct；其中下划线的碱基为被替换修饰的位点，即t为采用本发明的核苷酸替换修饰的。本发明还提供了一种修饰核苷的制备方法，包括如下步骤：当w为h，r2为叠氮基时，其制备方法包括：化合物ⅰ在催化剂作用下进行碘代反应得到化合物ⅱ；化合物ⅱ在碱性条件下发生消去反应得到化合物ⅲ；化合物ⅲ、2-叠氮基烷基醇、碘通过加成反应得到化合物ⅳ；将化合物ⅳ的3’-oh采用苯甲酰基保护得到化合物ⅴ；采用间氯过氧苯甲酸氧化化合物ⅴ的5’-i，氨解得到化合物ⅵ；当w为保护基团，r2为叠氮基时，其制备方法包括：将通过上述方法得到的化合物ⅵ的5’-oh采用保护基团保护，得到化合物ⅶ；当w为保护基团，r2为氨基时，其制备方法包括：将化合物ⅶ中的叠氮基进行还原反应得到化合物ⅷ；当w为保护基团，r2为胺基时，r3选自h，r4选自碳数为1-6的烷基时，其制备方法包括：化合物ⅷ与r4z2进行亲核取代反应；当w为保护基团，r2为胺基时，r3和r4各自独立的选自碳数为1-6的烷基时，化合物ⅷ与r3z1反应，再与r4z2反应，得到化合物ⅸ，其中z1和z2各自独立的选自电负性离去基团；所述电负性离去基团包括对甲苯磺酸酯基团甲磺酸酯基团三氟甲磺酸酯基团i、br、cl中的任一种；当w为保护基团，r2为酰胺基时，其制备方法包括：化合物ⅷ与r5coor6进行氨解反应得到化合物ⅺ；r6选自碳数为1-6的烷基；其中，各个化合物的结构式如下：在本发明一些具体实施方式中，步骤a中，化合物ⅰ在咪唑、三苯基膦的作用下，与碘单质反应。化合物ⅰ与碘单质的摩尔比优选为1﹕(3-8)，更优选为1﹕(5-7)。在低温如冰浴条件下滴加碘单质的溶液，然后于室温下反应，反应时间可根据tlc实际监测进行调控，优选为3-5h。步骤b中，化合物ⅱ在甲醇钠-甲醇溶液中进行消去反应。其中，甲醇钠与化合物ⅱ的摩尔比优选为1﹕1。步骤b优选在回流条件下进行反应。步骤c中，在化合物ⅲ、碳酸铅、2-叠氮基烷基醇的混合物中，滴加碘单质的溶液。其中，化合物ⅲ和2-叠氮基烷基醇的摩尔比优选为1﹕(3-7)，更优选为1﹕(4-6)，如1﹕5。化合物ⅲ与碘单质的摩尔比优选为1﹕(1-2)，优选为1﹕1.5。步骤c的反应优选在冰浴条件下进行。步骤d中，在缚酸剂存在下，将化合物ⅳ与苯甲酰氯室温下反应。化合物ⅳ与苯甲酰氯的摩尔比优选为1﹕(1.1-2)。缚酸剂可采用吡啶等。步骤e中，在二氯甲烷-水体系中，化合物ⅴ与间氯过氧苯甲酸于室温条件下反应4-8h后，除去过量的间氯过氧苯甲酸，采用氨-甲醇溶液进行氨解，得到化合物ⅵ。化合物ⅴ与间氯过氧苯甲酸的摩尔比优选为1﹕(2-4)。当w为保护基团，r为叠氮基时，合成路线如下：步骤f中，在缚酸剂作用下，化合物ⅵ与4,4’-二甲氧基三苯甲基氯室温下反应10-14h。其中，化合物ⅵ与4,4’-二甲氧基三苯甲基氯的摩尔比优选为1﹕(1.1-2)。当w为保护基团，r为氨基时，合成路线如下：步骤g中，在四氢呋喃-水溶液中，化合物ⅶ在三苯基磷作用下，回流反应，得到化合物ⅷ。其中，化合物ⅶ与三苯基磷的摩尔比为1﹕(1.1-2)。当w为保护基团，r为胺基时，合成路线如下：步骤h中，在乙腈溶液中，化合物ⅷ与r3z1和/或r4z2在碱存在下反应，得到化合物ⅸ。其中，当r3选自h，r4选自碳数为1-6的烷基时，化合物ⅷ与r4z2在碱存在下反应，得到当r3和r4各自独立的选自碳数为1-6的烷基且r3和r4不相同时，化合物ⅷ与r3z1反应，再与r4z2反应，得到当r3和r4选自碳数为1-6的烷基且r3和r4相同时，化合物ⅷ与r3z1在碱存在下反应，得到其中，当r3和r4不相同时，各步骤中r4z2或r3z1与化合物ⅷ的摩尔比为(1.1-2)﹕1。当r3和r4相同时，各步骤中r3z1与化合物ⅷ的摩尔比为(1.1-2)﹕1。上述反应可于室温条件下进行。当w为保护基团，r2为酰胺基时，合成路线如下：步骤i中，化合物ⅷ与r5coor6在室温条件下进行氨解反应4-6h。其中，化合物ⅷ与r5coor6的摩尔比为1﹕(2-5)。r5coor6优选为三氟乙酸乙酯。上述各步骤的纯化可采用常规纯化方式，如柱层析等。本发明还提供了一种核苷酸的制备方法，包括如下步骤：在四氮唑的作用下，修饰核苷与磷试剂如2-氰乙基-n,n,n’,n’-四异丙基亚磷酰二胺反应，得到亚磷酰胺单体。其合成路线如下：其中，修饰核苷与磷试剂的摩尔比优选为1﹕(1.1-2)，优选为1﹕1.5。反应温度可采用室温。本发明的修饰寡核苷酸以上述修饰核苷的3’-亚磷酰胺衍生物或其盐为原料，在dna自动合成仪上运用标准亚磷酰胺法，将原料嵌入寡核苷酸序列中。实际操作中，根据反应实际需求，可调整反应时间，或者加入活化剂等，提高反应速率等。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的修饰核苷，通过对核苷进行修饰，在4’位引入叠氮基、氨基或胺基等，得到一种新型的修饰核苷结构。可对该修饰核苷进行进一步修饰，得到核苷酸和寡核苷酸，可以得到具有良好的核酶耐受性的寡核苷酸等核酸聚合物，为发展核酸药物、核算引物、核酸诊断探针等提供了更稳定的修饰结构。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例提供的寡核苷酸on1-3与互补ssrna杂交时的二级构象；图2为本发明实施例提供的寡核苷酸on5-8与互补ssrna杂交时的二级构象；图3为本发明实施例提供的寡核苷酸5'-d(tttttttttt)-3'即on4的蛇毒磷酸二酯酶(svpde)水解耐受性；图4为本发明实施例提供的寡核苷酸5'-d(tttttttttt)-3'即on13的蛇毒磷酸二酯酶(svpde)水解耐受性。具体实施方式下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明中所涉及的“核苷酸”包含“碱基”(或者“核碱基”或“含氮碱基”)、“糖”(具体为5碳糖，例如核糖或2-脱氧核糖)和一个或多个磷酸基(例如分别由1、2、3、4或更多个连接的磷酸组成的一磷酸、二磷酸、三磷酸、四磷酸等)的“磷酸部分”。在没有磷酸部分的情况下，核碱基和糖构成“核苷”。核苷酸含有嘌呤(例如在核苷酸腺嘌呤和鸟嘌呤中)或嘧啶碱基(例如在核苷酸胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中)。一些核苷酸含有非天然碱基。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中糖为脱氧核糖的核苷酸。本发明中所涉及的“核酸聚合物”可指任何核酸分子，包括而不限于dna、rna和其杂合体，包括而不限于单链和双链等。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基a、c、g、t和u及其衍生物。本发明的修饰核苷的结构可包括如下结构式中的任一种：等等。其中，5’-oh可替换为保护基团-odmtr。2’-f可替换为α构型的氟原子f，α-构型的羟基oh，β-构型的羟基oh。本发明的核苷酸的结构可包括在上述修饰核苷的基础上对3’-oh进行磷化处理，得到3’-亚磷酰胺单体。本发明的修饰寡核苷酸的结构，其包括将上述至少一个核苷酸嵌入修饰于寡核苷酸序列中。实施例1本实施例的修饰核苷的合成路线如下：具体的制备方法包括如下步骤：(a)化合物ⅱ1的合成将化合物ⅰ1(6.5g,26.4mmol)，咪唑(3.6g,52.8mmol)，三苯基磷(10.4g,39.6mmol)，四氢呋喃(100ml)依次加入三口烧瓶中，冰浴下滴加用100ml四氢呋喃溶解的碘单质(10.08g,39.6mmol)，滴加完之后室温反应4h。向反应液中加入无水亚硫酸钠溶液至颜色变浅，加入部分水，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，快速柱层析(流动相：二氯甲烷/甲醇＝10/1梯度洗脱)，得化合物灰黑色粉末状化合物ⅱ18g，收率78％；1hnmr(400mhz,methanol-d4)δ7.72(dd,j＝8.1,1.7hz,1h,h-4),6.23(dd,j＝19.9,3.4hz,1h,h-5),5.71(d,j＝8.2hz,1h,h-1’),5.07-5.06(m,1h,h-4’),4.31-4.27(m,1h,h-2’),3.91-3.90(m,1h,h-3’),3.76-3.74(m,2h,h-5’)；esi-ms(m/z)357.1[m+h]+,379.1[m+na]+。(b)化合物ⅲ1的合成向三口烧瓶中加入化合物ⅱ1(7.3g，20.5mmol)，甲醇钠(4.43g，20.5mmol)与100ml甲醇的混合物，油浴加热至65℃回流，3h。用冰醋酸中和至ph＝7，浓缩，快速柱层析得黄色粉末状化合物ⅲ13.9g，收率：85％；1hnmr(400mhz,methanol-d4)7.48(dd,j＝8.4,2.0hz,1h,h-6),6.52(dd,j＝19.6,3.2hz,1h,h-10),5.72(d,j＝8.0hz,1h,h-5),5.10-4.96(m,1h,h-2’),4.67(d,j＝10.0,2.8hz,2h,h-5’),4.46(d,j＝2.4hz,1h,3’-oh)；esi-ms(m/z)229.2[m+h]+。(c)化合物ⅳ1的合成冰浴下，向化合物ⅲ1(5.0g,22mmol)，2-叠氮基乙醇(8.4ml,110mmol)，碳酸铅(8.8g,33mmol)的50ml的四氢呋喃中，滴加碘单质(8.35g,33mmol)的60ml四氢呋喃，1h后tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝15/1)有新产物生成并且反应完全，向其中加入无水亚硫酸钠溶液，有白色固体析出，用硅藻土过滤，滤液用乙酸乙酯萃取至水层无产物，饱和亚硫酸钠洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后过滤，浓缩，有固体析出，直接过滤，用甲醇洗，晾干后得到3.05g白色固体产物ⅳ1，收率31％。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.51(s,1h,nh),7.68(d,j＝8.4hz,1h,h-6),6.03(dd,j＝21.2,1.4hz,1h,h-1’),5.69(d,j＝8.0hz,1h,h-5),5.45(d,j＝8.4hz,1h,oh),5.31(ddd,j＝54.4,6.4,1.6hz,1h,h-2’),4.56(ddd,j＝21.2,8.0,6.0hz,1h,h-3’),3.80-3.40(m,6h,ch2-5’,n3ch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ162.71,149.69,142.18,103.50,101.81,92.24,90.35,89.51,89.14,71.95,71.78,60.43,49.99,5.03；esi-ms(m/z)463.98[m+na]+。(d)化合物ⅴ1的合成将化合物ⅳ1(3.0g,6.8mmol)加入到20ml干燥的二氯甲烷中，向其中加入干燥的吡啶(1.64ml，20.4mmol)，冰浴冷却后，滴加苯甲酰氯(1.18ml，10.2mmol)，滴加完后室温反应12h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝15/1)反应完全，向反应液中加入少量的甲醇猝灭反应，用二氯甲烷萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，有固体析出，过滤，抽干后得到2.8g白色固体产物ⅴ1，收率76％。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ9.07(brs,1h,nh),8.17-7.46(m,5h,bzh),7.35(d,j＝8.4hz,1h,h-6),5.90(dd,j＝17.2,1.6hz,1h,h-1’),5.85(dd,j＝8.0,2.4hz,1h,h-5),5.76(dd,j＝18.0,6.4hz,1h,h-3’),5.67(ddd,j＝53.6,6.4,1.6hz,1h,h-2’),3.95-3.78(m,2h,ch2-5’),3.64-3.49(m,4h,n3ch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ164.53,163.08,150.01,143.37,133.78,129.57,128.63,128.43,104.01,102.01,91.60,91.21,90.85,88.96,73.40,73.25,60.89,50.24,4.45；esi-ms(m/z)568.00[m+na]+。(e)化合物ⅵ1的合成将化合物ⅴ1(3.0g，5.5mmol)溶于100ml二氯甲烷中，加入10ml水，冰浴冷却下分批加入m-cpba(3.35g,16.5mmol)，室温反应6h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，向反应液中加入亚硫酸钠溶液，用二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠水洗，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后，室温下，向其中加入氨甲醇30ml，室温反应8h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝10/1)反应完成，闪柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得1.52g白色固体产物ⅵ1，收率83％。1h-nmr(400mhz,cd3od)δ7.84(d,j＝8.0hz,1h,h-6),6.14(dd,j＝18.8hz,1h,h-1’),5.69(d,j＝8.0hz,1h,h-5),5.14(dd,j＝53.6,5.6hz,1h,h-2’),4.60(dd,j＝22.8,5.6hz,1h,h-3’),3.94-3.37(m,6h,ch2-5’,n3ch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ166.10,151.84,143.19,180.10,102.86,94.61,92.73,91.55,91.18,71.13,70.96,62.52,60.91,52.22；esi-ms(m/z)354.07[m+na]+。(f)化合物ⅶ1的合成室温下向化合物ⅵ1(1.2g,3.6mmol)的15ml吡啶混合物中，加入4,4’-双甲氧基三苯甲基氯(1.47g,4.4mmol)，室温反应12h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝15/1)反应完全，用甲醇猝灭反应后，减压浓缩，乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，闪柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得1.8g白色固体产物7，收率79％。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ9.10(brs,1h,nh),7.65(d,j＝8.0hz,1h,h-6’),7.40-6.83(m,13h,dmtrh),6.13(d,j＝19.6hz,h-5),5.41(dd,j＝8.4,2.4hz,1h,h-1’),5.06(dd,j＝53.2,6.4hz,h-2’),4.80-4.70(m,h-3’),3.82-3.24(m,12h,och3×2,ch2-5’,n3ch2ch2o),2.86(m,1h,3’-oh),13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ162.90,158.74,158.71,149.63,143.97,140.48,134.76,134.65,130.14,130.03,128.02,127.21,113.32,105.89,102.88,93.24,91.33,89.97,89.61,87.43,71.08,70.91,61.69,60.94,55.22,50.89；esi-ms(m/z)656.20[m+na]+。(g)化合物ⅷ1的合成室温下，向化合物ⅶ1(1.6g,2.53mmol)的15ml四氢呋喃溶液中加入5ml水，再加入三苯基磷(1.0g,3.79mmol)，回流反应24h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝10/1)反应完全，停止反应，减压浓缩后闪柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝6/1)，得1.4g白色固体产物8，收率91％。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.78(d,j＝8.4hz,1h,h-6),7.40-7.21(m,13h,dmtrh),6.00(d,j＝20.8hz,1h,h-1’),5.37(d,j＝8.0hz,1h,h-5),5.26(dd,j＝54.4,6.0hz,1h,h-2’),4.96(brs,2h,nh2),4.70(dd,j＝25.2,6.0hz,h-3’),3.74(s,6h,och3×2),3.48-2.54(m,6h,ch2-5’,nch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ163.34,158.17,150.15,144.51,141.85,135.08,135.05,129.80,127.94,127.75,126.84,113.26,105.36,101.70,93.14,91.28,89.66,89.30,86.05,70.58,70.41,63.96,61.47,55.05,54.95,41.61；esi-ms(m/z)630.23[m+na]+。(i)化合物ⅺ1的合成向化合物ⅷ1(1.0g，1.65mmol)的15ml四氢呋喃溶液中加入三氟乙酸乙酯(0.9ml，7.6mmol)，室温反应5h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝10/1)反应完全，停止反应，减压浓缩后闪柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得1.0g白色固体产物ⅺ1，收率86％。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.95(brs,1h,nh),7.68(d,j＝8.4hz,1h,h-6),7.38-6.83(m,14h,dmtrh,nh),6.02(d,j＝18.0hz,1h,h-1’),8.34(dd,j＝8.0,2.0hz,1h,h-5),5.07(dd,j＝53.6,5.6hz,1h,h-2’),4.79(m,1h,h-3’),3.79(s,6h,och3×2),3.73-3.40(m,6h,ch2-5’,nch2ch2o),3.10(d,j＝11.5hz,1h,3’-oh)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ163.05,158.77,158.73,149.68,143.85,140.25,134.62,134.51,130.11,130.02,129.09,128.08,127.98,127.28,113.35,113.11,105.84,102.88,93.78,91.89,89.50,89.14,87.56,70.88,70.72,60.74,60.46,55.22,39.38；esi-ms(m/z)726.21[m+na]+。实施例2本实施例的核苷酸的合成路线如下：具体的制备方法包括如下步骤：氮气保护下，向化合物ⅺ1(1.0g，1.42mmol)，1h-四氮唑(100mg,1.42mmol)的10ml二氯甲烷溶液中，加入2-氰乙基-n,n,n',n'-四异丙基亚磷酰二胺(640mg,2.13mmol)的10ml二氯甲烷溶液，室温反应5h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝10/1)反应完全，向反应液中加入饱和的碳酸氢钠水溶液，二氯甲烷萃取，饱和的食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，闪柱纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺＝10/1/0.1)，得1.1g白色固体产物，收率86％。31p-nmr(162mhz,cdcl3)δ152.84,152.78,152,12,152.07；19f-nmr(376mhz,cdcl3)δ-75.80,-75.83,-193.01(m,cf3),-193.44(m,cf3)；esi-hrms(m/z)904.3294[m+h]-,926.3109[m+na]+。实施例3本实施例的修饰核苷的合成路线如下：具体的制备方法参考实施例1的制备方法，区别主要在于，将实施例1中的原料化合物ⅰ1换成了化合物ⅰ2。本实施例步骤(c)制备得到的化合物ⅳ2的产率为32％，结构表征数据如下：1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ9.17(brs,1h,nh),7.47(dd,j＝8.0,2.4hz,1h,h-6),6.47(dd,j＝8.0,4.0hz,1h,h-1’),5.80(d,j＝8.0hz,1h,h-5),5.18(ddd,j＝52.0,3.6,2.4hz,1h,h-2’),4.62(ddd,j＝20.0,6.4,2.0hz,1h,h-3’),3.92-3.84(m,2h,5’-ch2),3.55-5.50(m,4h,n3ch2ch2o),3.00(brs,1h,3’-oh)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ163.00,150.03,140.70,140.66,102.49,102.39,102.34,95.89,93.98,82.88,82.71,78.94,78.66,61.65,50.38,2.65；esi-ms(m/z)442.04[m+h]+。本实施例步骤(d)制备得到的化合物ⅴ2的产率为81％，结构表征数据如下：1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.79(s,1h,nh),8.10(d,j＝7.2hz,2h,bzh),7.70(dd,j＝8.0,2.0hz,1h,h-6’),7.66-7.47(m,3h,bzh),6.57(dd,j＝15.6,4.4hz,1h,h-1’),5.97(dd,j＝24.8,2.8hz,1h,h-3’),5.86(dd,j＝8.4,2.0hz,1h,h-5),5.56(ddd,j＝53.2,4.4,3.2hz,1h,h-2’),3.89-3.38(m,6h,ch2-5’,n3ch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ165.69,163.04,150.33,141.11,141.08,134.19,130.38,128.87,128.57,102.94,102.14,102.07,94.68,92.73,82.07,81.89,79.47,79.18,61.70,50.69,3.62；esi-ms(m/z)546.01[m+h]+,568.00[m+na]+。本实施例步骤(e)制备得到的化合物ⅵ2的产率为64％，结构表征数据如下：1h-nmr(400mhz,methanol-d3)δ7.85(dd,j＝8.0,1.2hz,1h,h-6’),6.45(t,j＝6.4hz,1h,h-1’),5.72(d,j＝8.0hz,1h,h-5),5.34(dt,j＝55.2,6.4hz,1h,h-2’),4.56(dd,j＝24.4,6.0hz,1h,h-3’),3.93-3.34(m,6h,ch2-5’,n3ch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,methanol-d3)δ165.89,151.99,142.51,105.88,105.77,102.46,97.58,95.65,82.36,82.20,75.38,75.14,62.75,60.11,51.91；esi-ms(m/z)354.07[m+na]+。本实施例步骤(f)制备得到的化合物ⅶ2的产率为82％，结构表征数据如下：1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ9.17(brs,1h,nh),7.55(dd,j＝8.4,1.6hz,1h,h-6),7.41-6.85(m,13h,dmtrh),6.47(dd,j＝12.0,5.2hz,1h,h-1’),5.52(dd,j＝8.0,1.2hz,1h,h-5),5.25(dt,j＝53.6,4.8hz,1h,h-2’),4.79(ddd,j＝21.6,8.0,3.6hz,1h,h-3’),3.80(s,6h,och3×2),3.78-2.85(m,6h,ch2-5’,n3ch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ163.10,159.02,150.33,144.11,140.74,134.94,130.32,130.26,128.36,128.22,127.54,113.61,103.74,103.66,102.64,96.19,94.25,87.52,81.93,81.76,76.65,62.26,61.05,55.51,50.87；esi-ms(m/z)656.20[m+na]+。本实施例步骤(g)制备得到的化合物ⅷ2的产率为87％，结构表征数据如下：1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.77(d,j＝8.4hz,1h,h-6),7.38-6.91(m,13h,dmtrh),6.34(t,j＝6.0hz,1h,h-1’),5.47(dt,j＝55.2,6.4hz,1h,h-2’),4.62(dd,j＝24.8,6.8hz,1h,h-3’),3.74(s,6h,och3×2),3.45-2.59(m,6h,ch2-5’,n3ch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ162.84,158.27,150.21,144.31,134.90,134.72,129.84,128.06,127.73,127.02,113.38,103.26,103.13,101.44,95.80,93.89,86.45,80.12,79.96,74.68,74.44,63.90,61.04,55.10,41.13；esi-ms(m/z)630.24[m+na]+。本实施例步骤(i)制备得到的化合物ⅺ2的产率为95％，结构表征数据如下：1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(t,j＝4.8hz,1h,nh),7.62(dd,j＝8.0,1.2hz,1h,h-6),7.39-6.82(m,13h,dmtrh),6.37(dd,j＝11.6,5.2hz,1h,h-1’),5.48(d,j＝8.4hz,1h,h-5),5.30(dt,j＝53.2,4.8hz,1h,h-2’),4.66(dd,j＝22.0,3.2hz,1h,h-3’),3.79(s,6h,och3×2),3.69-3.36(m,6h,ch2-5’,nch2ch2o)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ163.25,158.71,150.25,143.91,140.70,134.69,130.03,130.00,129.08,128.05,127.94,127.21,113.31,113.09,103.56,103.49,102.26,95.90,93.97,87.17,81.54,81.38,76.34,76.10,62.26,61.17,60.65,55.20,45.72,39.60；esi-ms(m/z)726.24[m+na]+。实施例4本实施例的核苷酸的合成路线如下：具体的制备方法包括如下步骤：氮气保护下，向化合物ⅺ2(1.0g,1.42mmol)，1h-四氮唑(100mg,1.42mmol)的10ml二氯甲烷溶液中，加入2-氰乙基-n,n,n',n'-四异丙基亚磷酰二胺(640mg,2.13mmol)的10ml二氯甲烷溶液，室温反应5h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝10/1)反应完全，向反应液中加入饱和的碳酸氢钠水溶液，二氯甲烷萃取，饱和的食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，闪柱纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺＝10/1/0.1)，得1.06g白色固体产物，收率83％。31p-nmr(162mhz,cdcl3)δ153.46,153.43,152.22,152.19；19f-nmr(376mhz,cdcl3)δ-75.60,-75.65,-197.82--198.05(m,cf3),-198.41--198.61(m,cf3)；esi-hrms(m/z)904.3298[m+h]-,926.3120[m+na]+。实施例5本实施例的修饰核苷的合成路线如下：具体的制备方法参考实施例1的制备方法，区别在于步骤(h)：(h)化合物ⅸ1的合成室温下，向化合物ⅷ1(100mg,0.165mmol)的5ml乙腈溶液中，依次加入三乙胺(46μl,0.33mmol)及对甲苯磺酸甲酯(37mg,1.2mmol)，反应6h，tlc检测(二氯甲烷/甲醇＝10/3)反应完全，停止反应，将反应液缓慢倒入50ml水中，有白色固体析出，静置，过滤，晾干后用闪柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/4)，收集产物，浓缩后得到30mg白色固体产物ⅸ1，收率29％。esi-ms(m/z)658.24[m+na]+,684.23[m+k]+。实施例61、本实施例参考实施例1的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为2、本实施例参考实施例3的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为实施例71、本实施例参考实施例1的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为2、本实施例参考实施例3的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为实施例81、本实施例参考实施例1的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为2、本实施例参考实施例3的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为实施例91、本实施例参考实施例1的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为2、本实施例参考实施例3的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为实施例10本实施例参考实施例1的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为实施例11本实施例参考实施例1的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为实施例12本实施例参考实施例1的制备方法，区别在于：将原料化合物ⅰ1替换为实施例13以实施例2和4的磷酰胺单体为原料，在dna自动合成以上运用标准亚磷酰胺法将上述各实施例得到的亚磷酰胺单体嵌入至相应的寡核苷酸序列中，获得了下述寡核苷酸on1-14，具体见表1。表1不同修饰的寡核苷酸序列及相应质谱on亚磷酰胺单体序列(5’-3’)calculatedmsfoundmson1化合物ⅺ1gcgttttttgct3696.43698.9on2化合物ⅺ1gcgttttttgct3759.43762.9on3化合物ⅺ1gcgttttttgct3822.53824.2on4化合物ⅺ1tttttttttt3043.03043.3on5化合物ⅺ2gcgttttttgct3696.43695.5on6化合物ⅺ2gcgttttttgct3759.43758.6on7化合物ⅺ2gcgttttttgct3822.53821.7on8化合物ⅺ2gcgttttttgct3822.53821.7on9化合物ⅺ2gcgttgtttgct3721.43720.6on10化合物ⅺ2gcgttgtttgct3721.43720.8on11化合物ⅺ2gcgttatttgct3705.43704.7on12化合物ⅺ2gcgttatttgct3705.43704.5on13化合物ⅺ2tttttttttt3043.03042.5on14化合物ⅰ1gcgttttttgct3637.33637.4on15化合物ⅰ2gcgttttttgct3637.33637.2实验例1为了对比说明本发明不同实施例得到的修饰核苷、核苷酸的性能，将得到的不同修饰寡核苷酸的性能进行测试。实验方法包括：退火缓冲液：10mmna3po4，100mmnacl，ph7.2。退火方法：两条寡核苷酸单链用退火缓冲液稀释，使其终浓度均为2μm，95℃水浴加热5min，缓慢冷却至室温，在4℃冰箱中放置过夜。tm测定方法：在比色皿中加入800μl的待测样品，用热隔离盖子盖牢。选用15℃作为起始测定温度，90℃作为终止温度，温度的上升速率为0.5℃/min，a260读取速率为1次/℃，最后由仪器给出tm值。每个样品重复测定3次，取平均值作为最终结果。热变性实验表2寡核苷酸on1-18与相应互补dna/rna形成双链的解链温度tm值(℃)注：1.on1-3、on5-8、on14-16的互补序列是5'-d(agcaaaaaacgc)-3'或5'-r(agcaaaaaacgc)-3'；on9-10和on17的互补序列是5'-d(agcaaacaacgc)-3'或5'-r(agcaaacaacgc)-3'；on11-12和on18的互补序列是5'-d(agcaaataacgc)-3'或5'-r(agcaaauaacgc)-3'；2.δtm＝tm(修饰)-tm(未修饰)；3.所有的tm值均为三次测量的平均值。从上表2中可知，化合物ⅺ1修饰的on1-3均可以保持与互补rna链的结合亲和力，优于化合物ⅰ1修饰序列on14，同时，与天然dna序列on16相比，单个修饰对δtm/mod<1.05℃，并能提高与ssrna结合选择性，三个修饰的on3对互补rna链的选择性达4.6℃。on5-8与on15的tm值相当，δtm值均少于0.7℃。其中，含tg及ta步序的on9和on11与互补rna链的tm值均高于相应的含gt和at步序on10和on12，2'β构型的f能够与嘌呤的c8-h之间形成假氢键，提高其修饰的寡核苷酸与互补rna的亲和力。经化合物ⅺ2修饰，可增强序列与ssrna结合选择性，并具有序列依赖性，三个修饰的on7和on8对互补rna链的选择性为1.8℃，含tg步序的on9对rna的结合选择性达4.1℃。错配实验表3寡核苷酸on1和on5与单链dna/rna杂交的解链温度tm及错配值δtm(℃)注：1、所有的tm值均为三次测量的平均值；2、δtm＝tm(mismatch)-tm(match)。从上表3中可知，on1和on5具有良好的与互补rna的结合特异性，其中，on5对错配碱基的识别能力与天然序列on16相当。实验例2圆二色谱实验实验方法：取与热变性实验相同的含待测杂交双链的退火缓冲液，使用圆二色谱仪测定，扫描范围200～400nm，扫描速度50nm/min，扫描间隔0.5nm，比色皿光程1mm，测定温度20℃。每个样品连续扫描三次后自动取其平均值，并通过仪器自带的软件进行平滑处理后再做图。测试结果如图1-2所示。从cd图中可知，寡核苷酸on1-3互补rna结合的dna-rna双链均具有典型的a-form构象特点，在～210nm附近有最大负吸收峰(波谷)，在260nm-280nm间有最大正吸收峰(波峰)，且峰信号强。经本发明的核苷酸ⅺ1修饰也不影响反义寡核酸与其互补rna链(ssrna)的双链形成能力。寡核苷酸on5-8，特别是三碱基修饰的on7-8，与互补rna结合的dna-rna双链具有典型的a-form构象特点，在～210nm附近有最大负吸收峰(波谷)，在260nm-280nm间有最大正吸收峰(波峰)。经本发明的ⅺ2修饰的寡核苷酸，与其互补rna链(ssrna)具有良好的杂交能力。实验例3核酸酶稳定性实验方法：缓冲体系：50mmtris-hcl，10mmmgcl2，ph8.0。hplc分析条件：waters型hplc，流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相a：水，流动相b：甲醇；梯度设定为在0-8min内由a:b＝98:2(v/v)到a:b＝92:8(v/v)；紫外检测器波长：260nm。酶稳定性测定：取1μg/μl样品20μl(以分子量～3000计，大约是7nmol)溶于375μl缓冲液中，同时加入0.02μg/μl的svpde5μl或5μl高纯水做空白对照(总体积400μl)，均在37℃孵育。在0min，2min，5min，10min，20min，30min，40min各取出50μl孵育液，150μl甲醇沉淀蛋白，10000rpm离心10min后取150μl上清液，抽干后加入150μl水，用hplc法检测样品的含量。根据测出的未降解的样品的百分含量，做出样品的含量－时间曲线。测试结果如图3-4所示。在实验条件下，化合物ⅺ1修饰可显著增强寡核苷酸on4对核酸酶的耐受性，40min时，on4仅降解不到20％，而其对应的天然寡核苷酸on19(天然dna-dt，tttttttttt)已全部降解。其中on20代表3'-硫代磷酸酯-t(ts)。在实验条件下，化合物ⅺ2修饰可显著增强寡核苷酸on13对核酸酶的耐受性，40min时on13仍剩下60％多为降解，而其对应的天然寡核苷酸on19(天然dna-dt，tttttttttt)已全部降解。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>修饰核苷、核苷酸和修饰核酸聚合物及其制备方法和应用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>12<212>dna<213>人工序列<400>1gcgttttttgct12<210>2<211>12<212>dna<213>人工序列<400>2gcgttgtttgct12<210>3<211>12<212>dna<213>人工序列<400>3gcgttatttgct12当前第1页12