本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及制剂的制备方法。
背景技术：
哈茨木霉菌作为一种生防菌可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害。其中由镰刀菌侵染马铃薯引起的根腐病、干腐病、枯萎病是世界性的土传真菌病害，马铃薯根腐病在育苗期和大田生长期均可发病，由多种镰刀菌引起的马铃薯镰刀菌根腐病近几年对马铃薯的生产危害严重，一般发病地块减产13％～35％，严重的成片死亡甚至绝产。马铃薯根腐病的防治一般采用化学杀菌剂进行处理，用化学药剂处理时往往存在残留问题，同时生产田中的镰刀菌不能除根，来年易复发等，因此使用哈茨木霉进行生物防治根腐病处理，环保安全有效，可进行长期防治。
目前国外已有10余个商品化的木霉制剂问世，多为木霉孢子制剂，但木霉菌在植物病害防治中仍然存在很多问题，施用后在土壤中受温度、湿度、ph等因素影响，定殖能力不够理想，难以充分发挥药效，并且木霉菌对植物的促生增产作用不够显著。
针对以上不足，国内外进行了多项研究，专利cn201811550295.4公开了一种哈茨木霉菌固体发酵方法、固体发酵产物、哈茨木霉菌剂及其制备方法和应用，能高效地防治葡萄霜霉病和葡萄灰霉病，还能有效促进葡萄生长和提高作物产量。专利cn200810154241.6公开了一种用中草药药渣发酵生防木霉的生产工艺，使用中药厂制药过程中的中药药渣作为培养基成分的一部分进行发酵生产生防木霉，以上两个专利均没有说明其得到的生防木霉活力如何，以及解决木霉发酵过程产量的问题，在生产上效果如何，对相关植物疾病的防治及促进增产作用不明显。
技术实现要素：
基于以上现有技术，本发明的目的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及制剂的制备方法，该方法通过液体发酵可以显著提高哈茨木霉的产量，同时制备的制剂对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。
本发明所用的菌种哈茨木霉菌m-17，保藏编号：cctccno：m2018538，拉丁文名称为trichodermaharzianumm-17，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年8月13日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明采用的技术方案为：一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株m-17菌种接种到pda培养基斜面上进行培养；
步骤二、种子液培养，将步骤一培养好的斜面菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养；
步骤三、液体发酵，将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；
步骤四、制剂制备，将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成液体制剂或固体制剂。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤一中pda培养基制作方法为：
1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；
2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉的液体发酵方法，其特征在于，步骤在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；
3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤一斜面培养条件为黑暗条件下，25～28℃培养5～7d；
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤二中种子培养基为蔗糖15～20g/l，酵母粉3～6g/l，nacl0.01～0.05g/l，feso4·7h2o0.1～0.3g/l，mgso4·7h2o1.2～1.5g/l，kh2po43.5～4.5g/l，nano36.5～7.0g/l；培养基湿热灭菌条件为121℃，25～30min；接种量为1～2cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床25～28℃培养3～6d，摇床转速180～220rpm。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤三中液体发酵培养基为碳源添加量为2％的小麦粉、玉米粉、马铃薯全粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉和麸皮粉中的一种或几种；氮源添加量为2％的黄豆粉、葡萄酒皮渣粉、硝酸铵、尿素、硫酸铵和硝酸钠中的一种或几种；其他微量元素添加量为1.4％的硫酸镁、硝酸钙、硫酸亚铁中的一种或几种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤三中液体发酵培养基灭菌参数为蒸汽湿热灭菌，121～124℃维持25～35min，培养条件为25～28℃培养，通风比1:0.7v/v，开搅拌90～115rpm，培养10～13d。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤四中其制剂的制备方法为：
a哈茨木霉液体制剂制备工艺为：
哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，ph为4.5～5.5，加入灭菌的0.1～0.5‰的甘油和0.05～0.1‰的植物油，灭菌条件为125℃45～60min；混合搅拌均匀后进行无菌灌装，得到液体制剂；
菌浓检测方法为：取10g发酵液进行离心，3000rpm离心10min后弃去上清液，剩余物除以发酵液重量10g，取百分数，即得菌浓，为相对菌体浓度。
b哈茨木霉固体制剂制备工艺为：
哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，ph为4.5～5.5，进行板框过滤，过滤后菌丝体在35～45℃风干后制成固体颗粒剂，加入浓度为0.1～1％w/v的淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素常用粘结剂中的一种或几种的组合，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的1～3％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入中药粉、米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，其中中药粉为液体发酵时使用中药浸出液后剩余的的中药渣干燥粉碎物，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的10～90％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得哈茨木霉颗粒剂。
为了更好的实现本发明，进一步的，液体发酵为碳源添加量为2％的玉米粉和麸皮粉中的一种；氮源添加量为2％的黄豆粉和葡萄酒皮渣粉中的一种；微量元素添加量为1.4％的硫酸镁、硝酸钙、硫酸亚铁中的一种或几种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。
为了更好的实现本发明，进一步的，甘草和板蓝根浸出液制备方法为：称取甘草和板蓝根后，加入三倍重量的水进行煎煮，煮沸25～40min后进行过滤，得到的滤液即为中药浸出液。
有益效果
本发明的有益效果如下：
1、液体发酵中使用中药浸提物作为培养基原料之一，提高了哈茨木霉孢子产量及其对镰刀菌的抗性；
2、制备的液体制剂，工艺简单可靠，活菌及其产物最大限度的保留，使用时效果较佳；
3、制备的固体制剂，使用中药渣作为载体，弥补了菌丝体干燥过程中受到的损失，丰富了液体发酵哈茨木霉的制剂类型，增加了产品的适应性；制备的颗粒剂，使用方便，效果好，施用后在土壤中不受温度、湿度、ph等因素影响，能够充分发挥药效，可以稳定的生产，生产条件简单，成本低廉，容易实现；
4、制备的固体制剂，使用中药渣作为载体，变废为宝，解决了中药药渣的回收再利用问题，减少了中药渣的环境污染，配方独特，环保安全高效；同时又对于加快哈茨木霉作为马铃薯根腐病生防治疗的推广应用和农业可持续发展有较大助益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
pda培养基制作方法为：
1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；
2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；
3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。
实施例1
本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及其制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株m-17菌种接种到pda培养基斜面上，黑暗条件下，25℃培养7d；
步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖15g/l，酵母粉3g/l，nacl0.01g/l，feso4·7h2o0.1g/l，mgso4·7h2o1.2g/l，kh2po43.5g/l，nano36.5g/l；培养基湿热灭菌条件为121℃，25min；接种量为1cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床25℃培养6d，摇床转速180rpm；
步骤三、液体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；液体发酵培养基组分为：碳源添加量为2％的玉米粉，氮源添加量为2％的黄豆粉，微量元素添加量为0.5％的硫酸镁和0.9％的硝酸钙，生长促进剂为浓度为30％的甘草浸出液；灭菌条件为蒸汽湿热灭菌，121～124℃维持25～35min；接种量为10％的种子液；培养条件为25℃培养，通风比1:0.7v/v，开搅拌90rpm，培养13d，得到哈茨木霉发酵液；
其中甘草和板蓝根浸出液制备方法为：称取甘草和板蓝根后，加入三倍重量的水进行煎煮，煮沸25～40min后进行过滤，得到的滤液即为中药浸出液；
步骤四、制剂制备，将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成液体制剂，制备工艺为：
哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，ph为4.5～5.5，加入灭菌的0.2‰的甘油和0.1‰的植物油，灭菌条件为125℃60min；混合搅拌均匀后进行无菌灌装，得到液体制剂；
菌浓检测方法为：取10g发酵液进行离心，3000rpm离心10min后弃去上清液，剩余物除以发酵液重量10g，取百分数，即得菌浓，为相对菌体浓度。
实施例2
本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及其制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株m-17菌种接种到pda培养基斜面上，黑暗条件下，2℃培养6d；
步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖16g/l，酵母粉4g/l，nacl0.02g/l，feso4·7h2o0.2g/l，mgso4·7h2o1.3g/l，kh2po43.8g/l，nano36.6g/l；培养基湿热灭菌条件为121℃，28min；接种量为1cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床25℃培养5d，摇床转速190rpm；
步骤三、液体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；液体发酵培养基组分为：碳源添加量为2％的麸皮粉，氮源添加量为2％的葡萄酒皮渣粉，微量元素添加量为0.5％的硫酸镁、0.15％的硫酸亚铁；生长促进剂为浓度为50％的板蓝根浸出液；培养条件为25℃培养，通风比1:0.7v/v，开搅拌115rpm，培养12d，得到哈茨木霉发酵液；
其中甘草和板蓝根浸出液制备方法为：称取甘草和板蓝根后，加入三倍重量的水进行煎煮，煮沸25～40min后进行过滤，得到的滤液即为中药浸出液；
步骤四、将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成液体制剂，制备工艺为：哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，ph为4.5～5.5，加入灭菌的0.5‰的甘油和0.1‰的植物油，灭菌条件为125℃45min；混合搅拌均匀后进行无菌灌装，得到液体制剂；
菌浓检测方法为：取10g发酵液进行离心，3000rpm离心10min后弃去上清液，剩余物除以发酵液重量10g，取百分数，即得菌浓，为相对菌体浓度。
实施例3
本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及其制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株m-17菌种接种到pda培养基斜面上，黑暗条件下，27℃培养6d；
步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖20g/l，酵母粉4g/l，nacl0.03g/l，feso4·7h2o0.2g/l，mgso4·7h2o1.4g/l，kh2po44.0g/l，nano36.7g/l；培养基湿热灭菌条件为121℃，30min；接种量为1.5cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床27℃培养4d，摇床转速200rpm；
步骤三、液体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；液体发酵培养基组分为：碳源添加量为2％的玉米粉，氮源添加量为2％的黄豆粉，微量元素添加量为0.9％的硝酸钙、0.15％的硫酸亚铁；生长促进剂为浓度为70％的板蓝根浸出液；培养条件为26℃培养，通风比1:0.7v/v，开搅拌100rpm，培养12d，得到哈茨木霉发酵液；
其中甘草和板蓝根浸出液制备方法为：称取甘草和板蓝根后，加入三倍重量的水进行煎煮，煮沸25～40min后进行过滤，得到的滤液即为中药浸出液；
步骤四、将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成固体制剂，制备工艺为：
哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，ph为4.5～5.5，进行板框过滤，过滤后菌丝体在35～45℃风干后制成固体颗粒剂，加入浓度为0.3％w/v的羧甲基纤维素钠、常用粘结剂，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的1％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入中药粉、米糠粉其中中药粉为液体发酵时使用中药浸出液后剩余的的中药渣干燥粉碎物，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的10％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得哈茨木霉颗粒剂。
实施例4
本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及其制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株m-17菌种接种到pda培养基斜面上，黑暗条件下，28℃培养5d；
步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖18g/l，酵母粉5g/l，nacl0.04g/l，feso4·7h2o0.3g/l，mgso4·7h2o1.4g/l，kh2po44.2g/l，nano36.8g/l；培养基湿热灭菌条件为121℃，25min；接种量为1.5cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床28℃培养3d，摇床转速200rpm；
步骤三、液体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；液体发酵培养基组分为：碳源添加量为2％的麸皮粉，氮源添加量为2％的葡萄酒皮渣粉，微量元素添加量为1.4％的硫酸镁；生长促进剂为浓度为50％的甘草浸出液；培养条件为28℃培养，通风比1:0.7v/v，开搅拌90rpm，培养11d，得到哈茨木霉发酵液；
其中甘草和板蓝根浸出液制备方法为：称取甘草和板蓝根后，加入三倍重量的水进行煎煮，煮沸25～40min后进行过滤，得到的滤液即为中药浸出液；
步骤四、将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成固体制剂，制备工艺为：
哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，ph为4.5～5.5，进行板框过滤，过滤后菌丝体在35～45℃风干后制成固体颗粒剂，加入浓度为0.1％w/v的淀粉浆、0.2％w/v的羧甲基纤维素钠，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的2％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入中药粉、米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，其中中药粉为液体发酵时使用中药浸出液后剩余的的中药渣干燥粉碎物，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的30％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得哈茨木霉颗粒剂。
实施例5
本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及其制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株m-17菌种接种到pda培养基斜面上，黑暗条件下，25℃培养5d；
步骤二、种子液培养：将步骤一活化好的菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养，种子培养基为蔗糖20g/l，酵母粉6g/l，nacl0.05g/l，feso4·7h2o0.3g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，kh2po44.5g/l，nano37.0g/l；培养基湿热灭菌条件为121℃，30min；接种量为2cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床25℃培养6d，摇床转速220rpm；
步骤三、液体发酵：将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；液体发酵培养基组分为：碳源添加量为2％的麸皮粉，氮源添加量为2％的葡萄酒皮渣粉，微量元素添加量为0.5％的硫酸镁、0.8％的硝酸钙、0.15％的硫酸亚铁；生长促进剂为浓度为30％的甘草浸出液和50％的板蓝根浸出液；培养条件为28℃培养，通风比1:0.7v/v，开搅拌115rpm，培养10d，得到哈茨木霉发酵液；
其中甘草和板蓝根浸出液制备方法为：称取甘草和板蓝根后，加入三倍重量的水进行煎煮，煮沸25～40min后进行过滤，得到的滤液即为中药浸出液；
步骤四、制剂制备，将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成固体制剂，制备工艺为：哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，ph为4.5～5.5，进行板框过滤，过滤后菌丝体在35～45℃风干后制成固体颗粒剂，加入浓度为0.2％w/v的淀粉浆、0.1％w/v的羧甲基纤维素钠，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的2％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入中药粉、米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，其中中药粉为液体发酵时使用中药浸出液后剩余的的中药渣干燥粉碎物，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的50％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得哈茨木霉颗粒剂。
上述混合均匀的固体发酵载体中加入中药粉、米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，其中中药粉为液体发酵时使用中药浸出液后剩余的的中药渣干燥粉碎物，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的10～90％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得哈茨木霉颗粒剂。
对上述实施例1至5中制得的哈茨木霉菌制成的液体制剂和固体制剂颗粒剂其有效活菌计数≥1亿/克，进行大田应用，使用方法为1kg菌剂加7kg水混合均匀后进行拌种；每亩大田施用1kg菌剂和100kg土的均匀混合物。
收获时调查各处理马铃薯薯块干腐病的发病级数，计算病情指数和防效。
干腐病病薯分级标准：0级：薯块上无病斑；1级：病斑小，病部面积整个薯块面积5％以下；3级：病斑较小，病部面积占整个薯块面积5～10％；5级：病斑较小或个别较大，病部面积占整个薯块面积11～25％；7级：病斑大小均有分布，病部面积占整个薯块面积26～50％；9级：病斑大小均有分布，病部相连面积占整个薯块面积的50％以上。
病情指数＝σ(各级病薯数×相对级数值)×100/(调查总薯数×9)
相对防效(％)＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％
试验结果如表3所示：
表1各实施例对马铃薯镰刀菌根腐病防效和产量的测定结果
由表1可知，施用本发明得到的哈茨木霉微生物菌剂可不同程度降低马铃薯镰刀菌根腐病的发病率，对马铃薯镰刀菌根腐病具有一定的防治效果，同时可增加马铃薯产量和提高商品薯率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。