一种干酪乳杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，尤其是一种干酪乳杆菌及其应用。

背景技术：

干酪乳杆菌(l.casei)属于细菌域(bacteria)、厚壁菌门(firmicutes)、芽孢杆菌纲(bacilli)、乳杆菌目(lactobacillales)、乳杆菌科(lactobacillaceae)，是一种短杆状或长杆状的多形性杆菌，长短不一，一般宽度均小于1.5μm。干酪乳杆菌两端平齐呈方形，排列方式多为短链或呈长链。有时亦可见到球形茵；革兰氏染色阳性，无运动性，不产生芽胞。

干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌和双歧杆菌并称为“健康三益菌”。干酪乳杆菌能利用葡萄糖经糖酵解过程产生乳酸和一些功能性物质，在食品发酵和防腐、乳制品、医疗保健等领域又广泛运用；但是由于干酪乳杆菌在高盐环境下适应性较差，存活率较低，所以在酸汤、剁辣椒、酸菜等高盐食品领域运用较少。

贵州苗侗族酸汤是一种以豆清液或米汤、西红柿、辣椒等为原料，添加食盐、水和调味料，利用原料自身附着的微生物或者添加普通普通干酪乳杆菌菌种在厌氧环境中发酵制成；因具有的营养丰富、促进消化的性质而广受消费者喜爱。但是，自然发的酸汤存在安全性和质量不稳定的问题。普通干酪乳杆菌菌种存在耐酸性、耐盐性差的问题，在酸汤中的存活率较低，所制得的酸汤酸度较低。因此，人们将普通干酪乳杆菌与其他耐盐性、耐酸性菌种复合使用来发酵制备酸汤，其他耐盐、耐酸性菌种与普通干酪乳杆菌在发酵过程中会相互影响，这导致酸汤的发酵过程不易控制，所得的酸汤的品质不稳定；而且成本较高。如专利申请号为cn201910160736.8的文件公开的一种纯种发酵豆酸汤制作方法，使用鼠李糖乳杆菌、玉米乳杆菌液、副干酪乳杆菌、克鲁维酵母菌混合而成的混合菌种发酵豆清液，制得酸汤；所得的酸汤酸度在10—13g/l左右，酸度还是较低。又如文献《苗族白酸汤饮料的开发》(四川农业大学，2014)中研究了从酸汤中筛选的三个产酸能力较强的菌株用于酸汤发酵；筛选出的菌株经鉴定为干酪乳杆菌，干酪乳杆菌la用于白酸汤发酵时的最佳接种量为10⁷cfu/ml，在35℃下密封发酵7天其总酸含量可达3.03‰。该文献中所筛选出的干酪乳杆菌la用于白酸汤发酵时虽具有良好的产酸能力，但所得白酸汤的酸度还是较低，而且风味受发酵时间影响。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种通过诱变产生的干酪乳杆菌lhz-st-002，并且将其应用于酸汤、白酸汤等高盐发酵食品中。

本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌lhz-st-002，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.16447，保藏日期为2018年9月10日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为cgmccno.16447，分类命名为干酪乳杆菌。

优选地，所述干酪酸杆菌lhz-st-002具有以下特性：

耐酸性好，将干酪酸杆菌lhz-st-002按10⁶cfu/l接种到酸度为20g/l的豆清发酵液中培养26h，培养期间活菌数保持在10⁶-10^8.15cfu/l之间，如附图4所示；

产酸、耐盐能力强，将干酪酸杆菌lhz-st-002按10⁶cfu/l接种于盐浓度4-8wt％的豆清液中培养48后活菌数保持在10^4.4-10^6.05cfu/l之间；将干酪酸杆菌lhz-st-002按10⁶cfu/l接种于盐浓度0-4wt％的豆清液中培养48h后产酸量可达8.45-8.90g/l；如附图5所示。

本发明提供了一种干酪乳杆菌lhz-st-002的制备方法，具体包括以下过程：

(1)菌种活化：将豆酸汤菌液接种于mrs液体培养基中在37℃培下养，传代2-3次后，置于4℃条件下保存备用；

(2)紫外诱变：从步骤(1)保存的菌液中取对数生长期的菌体，于7000rpm/min离心5min收集菌体，用质量分数为0.85％的无菌生理盐水洗涤2次；然后悬浮于生理盐水中制成10⁸cfu/ml的菌体悬浮液，再打开20w的紫外灯预热30min后，取5ml的菌体悬浮液置于培养皿中，然后用20w的紫外灯在距离30cm处照射30s；最后将照射后的菌体悬浮液稀释至合适梯度，取200μl涂布于mrs平板上，迅速用牛皮纸包好，置于37℃厌氧培养箱(co2:10％、n2:90％)中培养48h，获得诱变菌液；

(3)菌种筛选：将诱变后的菌液在7000rpm/min、5min下离心洗涤2次后取菌体沉淀，稀释至合适梯度，每个梯度取200μl涂布于加碳酸钙、5％nacl的mrs平板上，置于37℃厌氧培养箱中培养48h后，挑出溶钙圈较大的菌落置于mrs液体培养基中12h，获得lhz-st-002菌株。

本发明的另一目的是提供一种干酪酸杆菌lhz-st-002在制备高盐发酵食品中的应用。

优选地，所述高盐发酵食品包括但不限于酸汤。

优选地，所述干酪酸杆菌lhz-st-002用于酸汤的发酵。

本发明还提供了一种干酪乳杆菌lhz-st-002制备红酸汤的方法，包括以下过程：先将干酪酸杆菌lhz-st-002接种于灭过菌的新鲜豆清液中，在32℃-36℃下发酵20-24h，得干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液；然后将制备酸汤的原料、调味料经处理、混合制成发酵原液；最后将干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液接种于发酵原液中，在32℃-36℃下发酵10-15天，可得酸度13.95g/l及以上的红酸汤。

一种干酪乳杆菌lhz-st-002制备白酸汤的方法，包括以下过程：先将干酪酸杆菌lhz-st-002接种于灭过菌的新鲜豆清液中，在32℃-36℃下发酵20-24h，得干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液；然后将米面通过糊化、液化得到米汤，摊凉，备用；最后将干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液接种于米汤中，在32℃-36℃下发酵10-15天，可得酸度为9.42-10.01g/l的白酸汤。

优选地，所述干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液的活菌数为9.1×10⁸cfu/ml。

优选地，所述干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液的接种量为发酵原液或米汤体积的3％。

本发明的有益效果在于：本发明所述的干酪酸杆菌lhz-st-002，是从酸度较高的豆酸汤(酸度≥20g/l)中提取经紫外诱变、耐盐筛选(nacl添加量为5％)获得，具有耐酸性好、产酸及耐盐能力强的特性；干酪酸杆菌lhz-st-002用于高盐发酵食品的制备时能在发酵过程中保持较高的活菌数，所制得的产品活菌含量高，营养更健康；干酪酸杆菌lhz-st-002发酵制得的酸汤其酸度是普通干酪酸杆菌发酵酸汤的1.20-1.90倍；干酪酸杆菌lhz-st-002是由我国传统豆酸汤经紫外诱变、筛选获得，工艺简单，成本低廉。

附图说明

图1为本发明干酪酸杆菌lhz-st-002的菌落照片。

图2为本发明干酪酸杆菌lhz-st-002的镜检照片。

图3为本发明利用mega5.0软件构建的干酪酸杆菌lhz-st-002的系统发育树。

图4为本发明干酪酸杆菌lhz-st-002在酸度为20g/l豆清发酵液中的生长曲线图。

图5为本发明干酪酸杆菌lhz-st-002、普通干酪酸杆菌在不同含盐量的豆清液中的生长曲线图及产酸情况的柱状图；其中为干酪酸杆菌lhz-st-002的产酸量，为普通干酪酸杆菌的产酸量，为干酪酸杆菌lhz-st-002的活菌数；为普通干酪酸杆菌的活菌数。

具体实施方式

下面结核具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1菌种的制备及鉴定

菌种的制备：

(1)菌种活化

取实验室保存的豆酸汤菌液接种于mrs液体培养基中37℃培养，传代2-3次后，于4℃条件下保存备用；

(2)紫外诱变

从(1)保存的菌液中取对数生长期的菌体，于7000rpm/min离心5min收集菌体，用质量分数为0.85％(w/w)的无菌生理盐水洗涤2次，然后悬浮于生理盐水中制成108cfu/ml的细胞悬浮液。照射前，将紫外灯打开进行预热30min。分别取等量5ml的上述菌悬液置于7个培养皿中，在功率为20w的紫外灯下，距离30cm，照射30s(开启培养皿盖开始计时，计时完成后立即盖上培养皿盖)。取经紫外线照射的菌株和未经紫外线照射的菌株，梯度稀释至10^-6倍，取200μl涂布于mrs平板上，迅速用牛皮纸包好，置于37℃厌氧培养箱(co2:10％、n2:90％)中培养48h，即得诱变菌液。

(3)菌种筛选

将诱变菌液于7000rpm/min，5min离心洗涤两次后取菌体沉淀，分别稀释至10^-6倍，每个梯度取200μl涂布于加碳酸钙、5％nacl的mrs平板中，并设对照组，于37℃厌氧培养箱中培养48h，观察挑出溶钙圈较大的菌落，置于mrs液体培养基中培养12h，获得得lhz-st-002菌株。

所述mrs液体培养基的配制：蛋白胨10g，牛肉粉10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温801g，蒸馏水定容至1l，调节ph值为6.2～6.4，于115℃高温灭菌15min后备用。

菌种的鉴定：将获得lhz-st-002菌株进行形态学、分子生物学鉴定:

1、鉴定指标

形态学鉴定：革兰氏染色，细胞形态，有无芽孢

分子生物学鉴定:16srrna序列分析

2、鉴定结果

lhz-st-002菌株的形态特征：经菌落、菌体形态观察，其菌落形态为圆形黄色菌落，表面光滑扁平，透明，边缘整齐，有明显的溶钙圈，菌体形态为菌体为革兰氏阳性杆菌，不运动，不形成芽孢，呈网状排列。

16srrna基因测序鉴定：检测lhz-st-002菌株的16srrna基因序列为：caccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgt

由上述检测的16srrna基因序列可知，菌株lhz-st-002的序列长度为1377bp；然后将lhz-st-002菌株的6srrna基因序列输入ncbi中进行序列比对及同源性分析，结果如表1所示：

表1菌株kjy11在cnbi上的序列比对结果

从表1可知，lhz-st-002菌株与lactobacillusparacaseistraincg2(ku315090.1)等菌株的核苷酸序列同源性为100％；根据表1的比对结果，利用mega5.0软件构建系统发育树，结构如附图3所示，从表中可知，lhz-st-002菌株与lactobacillusparacaseistraincg2(ku315090.1)在一个分支上，因此将lhz-st-002菌株鉴定为干酪乳杆菌(lactobacillusparacaseistrain2-1)。

实施例2干酪乳杆菌lhz-st-002的性质研究耐酸性研究

研究方法：将干酪乳杆菌lhz-st-002按10⁶cfu/l接种于酸度为20g/l的豆清发酵液中培养26h，每2h检测一次豆清发酵液中干酪乳杆菌lhz-st-002的活菌数，并将检测结果绘制成取线图，如附图4所示。

结果分析：从附图4中可知，在前16h内，随着培养时间的增加，豆清发酵液中的干酪乳杆菌2-1的活菌数量有增加的趋势，在第16h活菌数达到最高10^8.15cfu/l；在16-26h这一段时间内，醉着时间的增加，干酪乳杆菌lhz-st-002的活菌数量有降低的趋势，变化不显著；整个培养期间活菌数保持在10⁶-10^8.15cfu/l；因此，本发明所述的干酪乳杆菌lhz-st-002具有良好的耐酸性能。

1、产酸、耐盐能力研究

研究方法：在体积相同、nacl添加量为0、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％的灭菌豆清液中分别接种相同量的干酪乳杆菌lhz-st-002、普通干酪乳杆菌，接种量为10⁶cfu/l左右，在相同的环境下培养48h后，检测豆清液中干酪乳杆菌lhz-st-002、普通干酪乳杆菌的产酸量和活菌数，并将检测结果绘制成图表，结果如附图5所示。

结果分析：从附图5中可知，随着的豆清液中nacl含量的增加，普通干酪乳杆菌的产酸量、活菌数是明显降低的，在nacl含量增加到8wt％时，普通干酪乳杆菌已基本不产酸，活菌数、产酸量已基本变为0。豆清液中的nacl含量从0增加到4wt％l时，干酪乳杆菌lhz-st-002的产酸量、活菌数变化不大，活菌数保持在10⁶-10^6.1cfu/l之间，是普通干酪乳杆菌活菌数的10^0.2-10²倍左右，产酸量保持在8.45-8.9g/l之间，是普通干酪乳杆菌产酸量的2-5倍左右；而后随着nacl含量的继续增加，干酪乳杆菌lhz-st-002的产酸量、活菌数有降低的趋势，但在nacl含量增加到8wt％时，干酪乳杆菌lhz-st-002也具有一定的产酸量、活菌数，活菌数为10^4.4cfu/l，产酸量为4.12g/l。在nacl含量相同的豆清液中，干酪乳杆菌lhz-st-002的产酸量、活菌数均显著高于普通干酪乳杆菌。因此，本发明提供的干酪乳杆菌lhz-st-002产酸、耐盐能力明显优于普通干酪乳杆菌，具有请较强的产酸、耐盐能力，可用于高盐食品的发酵。

实施例3干酪乳杆菌lhz-st-002在西红柿红酸汤中的应用

将本发明得到的干酪乳杆菌lhz-st-002接种于灭过菌的新鲜豆清液中，置32℃-36℃温度下发酵20-24h，得干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液，其活菌数为9.1×10⁸cfu/m。将新鲜西红柿洗净后切成西红柿块，备用；使用胶体磨将西红柿磨碎成泥状，备用；接种，将上述准备好的干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液添加3％至粉碎好的西红柿中混合均匀；发酵，将上述混料置于32℃-36℃温度下发酵10-15天，得到的西红柿酸汤酸度为13.95-15.76g/l，高于市场常用干酪乳杆菌发酵西红柿酸汤(6.20g/l)1.25-1.54倍。

实施例4干酪乳杆菌lhz-st-002在辣椒红酸汤中的应用

将本发明得到的干酪乳杆菌lhz-st-002接种于灭过菌的新鲜豆清液中，置32℃-36℃温度下发酵20-24h，得干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液，其活菌数为9.1×10⁸cfu/m。将新鲜辣椒洗净后剁碎，备用；按相关比例准备好食盐、姜、蒜、米酒，备用；将上述辣椒、姜、蒜使用胶体磨粉碎成泥状；混料，将准备好的辣椒、姜、蒜、食盐、米酒混合均匀；接种，将上述准备好的干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液添加3％至接种于混合液中；发酵，将上述混料置于32℃-36℃温度下发酵15天，得到红辣椒酸汤酸度为24.30-26.12g/l，高于市场常用干酪乳杆菌发酵红辣椒酸汤(9.00g/l)1.7-1.90倍。

实施例5干酪乳杆菌lhz-st-002在白酸汤中的应用

将本发明得到的干酪乳杆菌lhz-st-002接种于灭过菌的新鲜豆清液中，通过置于32℃-36℃温度下发酵20-24h，得干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液，其活菌数为9.1×10⁸cfu/ml。将新鲜大米高速粉碎得米面；米面通过糊化、液化得到米汤，摊凉，备用；米汤中米面的的质量浓度为1.4％左右；接种，将上述准备好的干酪乳杆菌lhz-st-002发酵液添加3％接种于准备好的米汤中；发酵，将上述混料置于32℃-36℃温度下发酵10-15天，得到米酸汤酸度为9.24-10.01g/l，高于市场常用干酪乳杆菌发酵米酸汤(4.20g/l)1.20-1.38倍。

对比例1

根据文献《苗族白酸汤饮料的开发》(四川农业大学，2014)中所提供菌株筛选方法从白酸汤中筛选出产酸能力较强的菌株干酪乳杆菌la。将筛选出的干酪乳杆菌德la接种于灭过菌的新鲜豆清液中，通过置于32℃-36℃温度下发酵20-24h，制得干酪乳杆菌la发酵液。取实施例5中制备好的米汤，将上述准备好的干酪乳杆菌la发酵液添加3％接种于准备好的米汤中；发酵，将上述混料置于32℃-36℃温度下发酵10-15天，到米酸汤酸度为5.06-6.12g/l。其酸度低于实施例5中干酪乳杆菌lhz-st-002发酵所制成的米酸汤，有显著的差异性。

实验例1

取实施例5和对比例1所制备好的米酸汤(白酸汤)样品，将样品随机编号，请10位具有相关食品评定技术培训的人员对米酸汤色泽、口感、质地等进行评价。评价标准见表2，评价结果如表3所示：

表2白酸汤感官评价标准

表3感官评价结果

从表中可知，对比例1与实施例5所制的米酸汤在色泽、质地方面无明显差异；但实施例5所制备的米酸汤，其口感、香味优于对比例1所制成的米酸汤。

在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

序列表

序列表sequencelisting

<110>贵州亮欢寨生物科技有限公司

<120>一种干酪乳杆菌及其应用

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