一种一体化核酸检测器件及应用的制作方法

本发明属于核酸检测器件技术领域，具体的涉及一种一体化核酸检测器件及应用方法。

背景技术：

常规的微生物核酸检测过程包括样本前处理(核酸提取)、核酸扩增、核酸检测三个步骤。核酸提取；核酸检测首先要进行样本核酸提取；常见方法有乙醇沉淀法、硅胶柱法、玻璃珠法、磁珠法；所有方法基本原理都是裂解样本、结合、清洗、洗脱等四个步骤。单个样本整个过程约40分钟到数小时，有时会接触到有毒物质。核酸扩增；常用方法有变温扩增(如pcr)和等温扩增(如lamp)，都是一种核酸体外扩增技术；pcr扩增是指在dna聚合酶催化下，以母链dna为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板dna互补的子链dna的过程；等温扩增反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。核酸检测；琼脂糖凝胶/聚丙烯酰胺凝胶电泳方式，包括制胶、加样和电泳、检测等过程；通过测序和表达方式来检测；通过荧光染料或浊度变化来对扩增产物定性或定量检测；其操作步骤都是耗时耗力，成本高。

完成一个从原始样本到最终检测的所有试验环节，整个过程需要5～8小时，甚至更长，在每个试验环节都需要标记试管以免弄错样本，费事费力；操作人员容易接触有毒试剂，频繁开闭试剂管容易被环境污染，同时试剂盒和产物也会污染环境；因此，需要配置相关配套设施，保证纯净的实验环境。此外，多个指标检测其工作量更大。

针对上述复杂试验过程，每个步骤市场上有一些仪器替代人工操作，如核酸提取仪、核酸扩增仪、实时荧光定量仪、环介导等温扩增仪等；目前，移液工作站是自动化程度较高，包括核酸前处理、反应配置、温度控制、混匀等，将所需的配套试剂放置于工作站台上，设置好程序，可以完成核酸提取和核酸扩增全过程。由于移液工作站为开放平台，在整个多不试验操作过程中，操作者需要不定期进行96孔板封膜、开模或不定期进行大量的管盖开闭工作，虽然一部分工作由工作站来完成，但整个仍需要人工大量介入，无法实现整个过程的无人值守。

经检索，相关的自动化核酸检测器件已得到公开，如中国专利申请号为201620190468.6，公开日期为2016.08.10的申请案公开了一种全自动的核酸检测器件，包括以上下次序相互连接的上盖和下盖，所述上盖的上侧和下盖的下侧分别设置有固定机构；所述下盖内设置有开口向上的加样器，上盖上相对于该加样器设置有从上到下贯穿上盖的插孔；所述上盖的固定机构为上盖上表面中心位置设置的三角槽，所述下盖的固定机构为下盖侧壁下端位置设置的卡槽。该装置在使用时通过三角槽跟转轴进行上盖1的固定，然后取出针头瓶内预置的针头，并装入相应规格的外部组件中。下盖中可装上装有核酸提取和pcr所需的各种加样器。试剂管的管口处有硅胶塞，在生产过程中，试剂管中加入试剂后盖上硅胶塞，然后整个试剂管可按一定的次序插入下盖预留的圆孔中固定。上盖、下盖相合后，将上盖旋与下盖相合的轨道中。通过操纵下盖的转动，使得所需加样器到达针头下方，再通过外部组件完成对各类试剂的取排工作。该装置虽然能够在可一定程度消除操作中的人为误差，提高反应结果的准确性，减少操作人员的工作强度及危险性，然而该装置并未在检测速度上有所提高。

基于现有技术中存在的缺陷，亟需发明一种构造简单，检测速度快，成本低，能够实现一体化检测的器件。

技术实现要素：

1.要解决的技术问题

针对现有技术中的核酸检测存在的设备复杂、检测成本高、容易交叉污染的缺陷，本发明提供用于简单易操作的一种一体化核酸检测装置及方法，结合配套的控制系统，可实现核酸检测的包括提取、扩增、检测的全自动化，检测成本低，检测速度快，样品不易污染。

2.技术方案

本发明提供了一种一体化核酸检测器件，包括壳体、试剂存储单元、移液单元、导轨、旋转盘和设在壳体上的探测孔，所述导轨沿壳体轴向贯穿，所述试剂存储单元和旋转盘位于导轨的下方，所述移液单元通过沿导轨运动在试剂存储单元和旋转盘之间转移液体。

所述导轨的位置与试剂存储单元和旋转盘的设置位置相互对应，保证移液单元能够与准确对应于试剂存储单元和旋转盘内设置的液体存放孔道。

本发明的装置首先通过移液单元沿导轨运动以及在竖直方向上下运动，吸取并转移试剂存储单元内预装的试剂，在试剂存储单元内使待测核酸样本与预装试剂进行一系列反应；然后，通过与旋转盘转动的配合，移液单元将反应后溶液分装至旋转盘内部的孔道，反应后溶液和旋转盘内预装的试剂反应，完成pcr扩增及检测反应，再配合旋转盘转动使待测溶液与探测孔依次对应，利用检测器进行检测。

作为本发明更进一步的改进，所述装置还包括移液泵和导气管，所述导气管分别与移液单元和移液泵连接。所述的移液泵为移液单元吸取和释放液体提供动力。

作为本发明更进一步的改进，所述的导轨为滚珠丝杠，导轨上套有密封圈保持密封，所述移液单元套装在导轨上，所述的导轨与电机连接，通过电机驱动丝杠旋转，带动移液单元在导轨上移动。

作为本发明更进一步的改进，所述移液单元包括连接部件和移液部件，所述连接部件具有导轨套装相互配合的结构，所述连接部件与移液部件的一端固定连接，所述移液部件另一端用于转移液体。

该装置需要与核酸检测自动化器件配套使用，实现核酸检测全自动化，所述与装置适配的模块包括温控模块、外部动力模块、混匀模块，所述的温控模块用于使核酸扩增保持一定温度，所述外部动力模块包括带动移液单元在竖直方向上下移动的动力模块。所述外部动力模块通过永久磁铁提供的磁力配合弹簧形变，推动移液单元在竖直方向上下运动。

作为本发明更进一步的改进，所述试剂存储单元内设置多个圆柱体，所述圆柱体内设置有试剂存储孔。所述试剂存储单元为槽体，所述槽体可以为圆形、方形或长方形或其他形状。

作为本发明更进一步的改进，所述装置还包括检测单元，所述检测单元用于旋转盘内液体的检测。

作为本发明更进一步的改进，所述旋转盘包括旋转轴与盘面，所示盘面上设有用于装载溶液的检测孔道，所述旋转轴带动盘面旋转，所述的旋转轴通过电机驱动旋转。所述检测孔道可以直接装载溶液或通过安插反应管来装载溶液。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种核酸检测方法，所述方法应用所述的一体化核酸检测装置进行检测，具体的步骤为：

1)将核酸样品加至试剂存储单元的孔道，所述试剂存储单元其他孔道预装有核酸反应试剂，所述旋转盘的检测孔道内封装有核酸检测试剂；

2)移液单元吸取核酸样品，通过沿导轨移动依次与试剂存储单元内的核酸反应试剂分别混合、反应，配合旋转盘旋转，移液单元将反应后溶液分装至旋转盘的检测孔道内，进行反应，得到待测溶液；

3)通过旋转盘旋转使待测溶液对准探测孔，进行检测。

作为本发明更进一步的改进，步骤1)中试剂存储单元依次预装有结合液、裂解液、清洗液、矿物油，所述步骤2)中将反应后溶液分装至旋转盘的孔道内后，再依次加入矿物油。

作为本发明更进一步的改进，所述核酸样本包括含有细菌、病毒或真菌的微生物样本。

作为本发明更进一步的改进，所述核酸检测试剂包括texasred探针荧光的pcr反应液。

3.有益效果

(1)本发明的一体化核酸检测器件，整体的反应区域位于壳体内部，设置的导轨沿壳体轴向贯穿，试剂存储单元和旋转盘位于导轨的下方，通过控制移液单元在导轨上运动以及竖直方向的上下移动进行液体转移，通过旋转盘的旋转可迅速完成分装，由于分装反应进行的同时可以进行荧光检测，大大缩短了整体的检测时间，整体构造简单，体积小，不需要配套核酸提取仪、移液工作站等仪器，且整个过程无需人员参与即可自动完成核酸扩增中变性、退火、延伸的全过程，省时省力，大大提高了检测的便利性，同时降低了检测成本。

(2)本发明的一体化核酸检测器件，所述试剂存储单元和旋转盘内的孔道均可以利用将反应试管插入其中的方式装载反应溶液，因此在反应完成后将反应试管及时丢弃，无交叉污染的产生。

附图说明

图1是本发明的一种核酸检测器件的俯视图；

图2是本发明的一种核酸检测器件的前视图；

其中：101、导气管；102、移液泵；103、导轨；104、壳体；105、旋转轴；106、探测孔；107、检测器；108、旋转盘；109、检测孔道；110、试剂存储孔；111、移液部件；112、连接部件。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

实施例1：

本实施例提供了一种一体化核酸检测器件，如图1所示，所述器件包括壳体104、试剂存储单元、移液单元、导轨103、旋转盘108和设在壳体104上的探测孔106，所述导轨103沿壳体104轴向贯穿，所述试剂存储单元和旋转盘108位于导轨103的下方，所述移液单元通过沿导轨103运动在试剂存储单元和旋转盘108之间转移液体。

如图2所示，所述导轨103的位置与试剂存储单元和旋转盘108的设置位置相对应，保证移液单元沿导轨移动时，能够与其下部的试剂存储单元和旋转盘108内设置的液体存放孔道相对应。

本实施例中所述的导轨103为丝杠，导轨103上套有密封圈保持密封，所述移液单元具有套装在导轨103上的配合结构，所述的导轨103与电机连接，通过电机驱动丝杠旋转，带动移液单元在导轨103上移动。

所述移液单元由连接部件112和移液部件111组成，所述连接部件112具有导轨103套装相互配合的结构，所述连接部件112与移液部件111的一端固定连接，所述的连接部件112带动移液部件111在沿着导轨103水平移动。

所述装置还包括导气管101和移液泵102，所述导气管101分别与移液泵102和移液部件111相连通，所述的移液部件111上设置精确刻度，通过移液泵102提供动力来吸取和释放液体，同时还可以对混合后的液体进行吹打混匀。也可以利用外部的混匀模块来操作。

所述的移液单元还能够在竖直方向上下移动，该动力需要外部动力模块配合来提供，所述外部动力模块通过永久磁铁提供的磁力配合弹簧形变，推动移液单元在竖直方向上下运动。

所述试剂存储单元为槽体，所述槽体可以为圆形、方形或长方形或其他形状。所述槽体内设置多个圆柱体，所述圆柱体内设置有试剂存储孔110，可以直接以试剂存储孔110作为反应管，也可以将试管直接插入至试剂存储孔110作为反应管。

所述旋转盘108包括旋转轴105、与旋转轴105连接的电机和外周的检测孔道109，所述检测孔道109用于装载溶液。所述的检测孔道109可以直接装载溶液或插入试管作为反应管。

本发明的器件使用时还需要配合外部温控模块，使反应体系保持一定温度，具体工作过程如下：

a)首先移液单元沿导轨103运动，在试剂存储单元完成一系列反应；

b)移液单元沿导轨103运动与旋转盘108转动相互配合，可以快速的将反应溶液分装至旋转盘108内部的检测孔道109，所述反应溶液和旋转盘108内预装的试剂进行反应，完成pcr扩增及检测反应，得到待测溶液；

c)配合旋转盘108转动使每个检测孔道109内的待测溶液与探测孔106依次对应，利用检测器107(如光电检测器)对准探测孔106，进行检测。

利用本实施例的装置对样本中微生物进行核酸检测。微生物可以是细菌、病毒和真菌等。旋转盘108内包括20个孔道，分别预装sybrgreeni荧光染料的lamp反应液，即可检测20种微生物，检测器107采用反射式光电检测，用于dna或者rna的产物的检测，检测步骤具体为：

1)首先将预处理好的样本通过移液单元加注到试剂存储单元的第1个孔，所述的试剂存储单元从第2个孔开始依次预装了结合液/磁珠、裂解液、清洗液i、清洗液ii、洗脱液、矿物油；

2)然后将器件放置于核酸自动检测仪里面。该检测仪是与该装置配套的设备。在外部设备的驱动下移液单元开始按照预设程序对样本液体进行处理，依次经过结合液、裂解液、清洗液等过程，然后再将提取的核酸均分至旋转盘108的多个检测孔道109，最后将矿物油加入多个检测孔道109；

3)整个检测过程在恒温条件下进行，温度大约在60℃～65℃由外部的温控模块提供。检测器发出470nm波长的蓝光分时聚焦于旋转圆盘108内的检测孔道109的待测溶液，随着lamp反应的进行，激发出检测孔道109内波长为520nm的荧光，最后，光电探测器可以检测到20个峰值信号的变化。通过光电信号的变化来确定样本中是否含有某种微生物。不同的lamp反应液检测不同的微生物。

实施例2

利用实施例1的装置进行微生物核酸检测，微生物可以是细菌、病毒和真菌等。具体步骤如下：

1)首先将预处理好的核酸样本通过移液单元加注到试剂存储单元的第1个孔，所述的试剂存储单元从第2个孔开始依次预装了结合液/磁珠、裂解液、清洗液i、清洗液ii、洗脱液、矿物油；旋转盘108内有20个检测孔道109，分别预装texasred探针荧光的pcr反应液，即可检测20种微生物，检测器采用反射式光电检测，用于dna或者rna的产物的检测。

2)在外部模块的驱动下，所述的移液单元按照预设程序对样本液体进行处理，依次经过结合液、裂解液、清洗液等过程提取核酸，然后配合旋转盘108的旋转将提取的核酸分装至多个旋转盘108的检测孔道109，最后将矿物油加入多个检测孔道109，在检测孔道109内完成核酸扩增中变性、退火、延伸过程，得到待测溶液；

3)整个检测过程三个温度区间循环由外部的温控模块控制。通过旋转盘108旋转，待测反应溶液依次与探测孔106对应，检测器发出565nm波长的绿光分时聚焦于待测液体，随着pcr反应的进行，激发出检测孔道109内波长为625nm的荧光，最后，光电探测器可以检测到20个峰值信号的变化。通过光电信号的变化来确定样本中是否含有某种微生物。不同的pcr反应液检测不同的微生物。

以上描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。