用于检测高致病性H7N9禽流感病毒的荧光RT-PCR引物、探针及方法与流程

本发明涉及一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr引物、探针及方法。

背景技术：

甲型h7n9流感病毒是禽流感病毒的一个亚型，原本属于低致病性流感病毒，仅在禽鸟中发现和传播。该病毒对禽鸟类的致死率低，经基因交换后具备了感染人类的能力，人感染h7n9病例的病发期短、重症率与死亡率均相对于sars略高。

2013年3月底人类感染h7n9禽流感病毒病例在上海和安徽两地首次出现。该h7n9流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。该病毒的血凝素蛋白(ha)基因在遗传学上不同于其他h7亚型病毒的ha基因，其6条内部基因片段来源于循环在东亚鸟类中的甲型h9n2流感病毒。神经氨酸酶蛋白(na)基因与前些年在鸟类中发现的甲型h11n9病毒的na基因片段相似。冬春之际反复出现的h7n9禽流感此前一直被认为是低致病性禽流感(lowpathogenich7n9influenzavirus,lp-h7n9)，农业部将它划为二类动物疫病。2013年11月，人感染h7n9禽流感被国家卫计委疾病预防控制局纳入法定乙类传染病，是出入境卫生检疫和进出境动物检疫的重要疫病之一。

2017年春爆发的第五波人感染h7n9流感疫情，呈现出与往年不同的特征与趋势：感染病例增多、分布地区广、散发程度高等特点。2017年2月，广东省疾病预防控制中心报道该中心1月份对两例人感染h7n9病例分离到的病毒分别进行基因测序分析，发现在该两株病毒的血凝素(ha)裂解位点发生基因插入性突变，提示该病毒已突变为对禽高致病性的h7n9病毒(hightlypathogenich7n9influenzavirus,hp-h7n9)。农业部门的实验室也从广东的4份禽标本中发现类似变异的病毒。

h7n9变异株成为高致病性病毒后，将对家禽生产带来非常严重的影响。致病性的增高意味着该病毒可造成禽只的大量死亡，蛋鸡的生产性能也将受到严重影响。而高致病性禽流感作为全世界高度关注的一类动物疫病，它对国内和国际动物贸易、社会经济生活等将产生深远影响。

现有技术中已有针对2013年以来发生的人感染h7n9禽流感病毒(经典h7n9毒株)的检测方法，如cn105200161a、cn103740863a、cn105861758a，及文献《h7n9禽流感病毒实时荧光rt-pcr检测方法的建立与评价》、《逆转录环介导等温扩增技术检测h7n9禽流感病毒基因》。但是，这些方法只能检测到经典的h7n9病毒，但不能识别对家禽更具威胁的高致病性h7n9毒株。

建立了一种快速、特异、高通量、低成本的新型诊断方法对主动应对h7n9禽流感病毒的基因变异，为新发高致病性h7n9禽流感病毒(hp-h7n9)的快速准确诊断做好准备具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr引物、探针及方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr引物，其核苷酸序列如下所示：

75f：5’-gaatgttcctgaggttccaaaga-3’(seqidno：1)；

75r：5’-ttttcaatgaaacccgctatagc-3’(seqidno：2)。

一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr探针，其核苷酸序列如下所示：

75p：5’-aaaacggactgcgagaggcctatttgg-3’(seqidno：3)。

进一步地，所述探针序列5’端标记的荧光基团为fam、hex、vic、cy5、tet中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为eclipse、tamra、mgb、bhq中一种。

一种用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr试剂盒，含有上述的引物。

进一步地，试剂盒中还含有上述的探针。

一种检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr方法，包括以下步骤：

1)从样品中提取病毒核酸；

2)以提取的核酸为模板，用上述的引物对75f、75r，及上述探针75p进行荧光pcr扩增反应，获得扩增产物；

3)对扩增产物进行分析，确定样品中是否含有高致病性h7n9禽流感病毒。

进一步地，步骤2)中的pcr扩增反应体系为：

进一步地，步骤2)中pcr扩增反应程序为：

进一步地，步骤3)中对扩增产物分析的方法为：ct值≤35.0的样品判为阳性，表示样品中存在高致病性h7n9禽流感病毒；无ct值且无扩增曲线的样品判为阴性，表示样品中无高致病性h7n9禽流感病毒；ct值在35～40之间的样品须重做，重做结果无ct值者为阴性，否则为阳性。

本发明的有益效果是：

根据genebank中公布的hp-h7n9的ha基因序列，设计特异性引物和taqman探针，构建hp-h7n9重组克隆质粒为阳性对照，经反应条件的优化和特异性、敏感性和重复性试验，建立高致病性h7n9流感病毒荧光rt-pcr检测方法。实验表明，本发明建立的hp-h7n9荧光rt-pcr检测方法，可特异性的检测hp-h7n9，而与低致病性h7n9流感病毒(lp-h7n9)、h7n3流感病毒、h3n2流感病毒、h5n1禽流感病毒、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h9亚型禽流感病毒、甲型h1n1流感病毒(h1n1)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)、新城疫病毒(ndv)等不发生交叉反应；可检测到最低浓度为7.09copies/μl的阳性质粒；重复性试验的变异系数(cv)值在1.97％～4.89％之间，表明该方法具有很好的重复性。本发明建立的hp-h7n9荧光rt-pcr方法具有特异、敏感、快速、重复性好的特点，是hp-h7n9快速检测的良好方法。

本发明中的方法为hp-h7n9的口岸检疫、风险预警和疫情防控等提供强有力的技术支持，对于保护国内家禽养殖业生产安全、保障公共卫生安全也具有重要的现实意义。

附图说明

图1为hp-h7n9荧光rt-pcr检测结果；

图2为hp-h7n9荧光rt-pcr标准曲线图；

图3为hp-h7n9荧光rt-pcr特异性试验；

图4为hp-h7n9荧光rt-pcr敏感性试验；

图5为hp-h7n9荧光rt-pcr敏感性试验2。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

以下实施例中使用的灭活的高致病性h7n9禽流感病毒(攻毒鸡胚尿囊液，毒株编号为a/chicken/guangdong/q39/2017(h7n9))，低致病性h7n9病毒核酸(lp-h7n9)、h7n3流感病毒核酸(h7n3)、h3n2流感病毒核酸(h3n2)、h5n1禽流感病毒核酸(h5n1)、h9亚型禽流感病毒核酸(h9)、新城疫病毒(ndv)核酸、甲型h1n1流感病毒(h1n1)核酸、传染性法氏囊病病毒(ibdv)核酸、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)核酸由华南农大兽医学院禽病研究室惠赠，h5亚型(re-6疫苗株)、h5亚型(re-8疫苗株)禽流感病毒血凝抑制试验抗原来自哈尔滨维科生物技术开发公司。

puc57-simple克隆载体为华大基因公司产品。

onestepprimescript^tmrt-pcrkit(perfectrealtime)为宝生物工程(大连)有限公司产品。

rnaisoplus为宝生物工程(大连)有限公司产品。

rnase-freewater为宝生物工程(大连)有限公司产品。

dnamarkerdl2000为宝生物工程(大连)有限公司产品。电泳级琼脂糖为西班牙biowest公司产品。乙醇、氯仿等化学试剂均为国产分析纯产品。

以下实施例中阳性对照和阴性对照分别的制备方法如下：

阳性对照的制备：将目的片段提交华大基因进行基因合成，制作重组质粒whc183644-75作为阳性对照，目的片段序列如下所示：

ctatcaacttaaattgttggttggtttttgctataagccggtttaatttccctgttatttgattaattgccgattgagtgcttttgtaatctgcagcagttccctctccctgtgcattctggtgtctgaaaccataccaaccatcaattaggccttcccatccattttcaatgaaacccgctatagcaccaaataggcctctcgcagtccgttttccctttggaacctcaggaacattcttcatccctgttgccagcagaagactcctttgcttaacatatctcggacattttccaactgccctgctatctatgttctgaaatggcaagt(seqidno：4)。

阴性对照的制备：无菌采取spf鸡胚尿囊液，经检测通用a型流感病毒、ibdv、ibv和ndv等病毒核酸，结果均为阴性，作为阴性对照。

实施例1引物和探针

经过对所设计的大量引物、探针进行筛选后，发现引物75f、75r和探针75p在rt-pcr法检测hp-h7n9中效果最好，其碱基序列如下所示。

表1高致病性h7n9禽流感病毒荧光rt-pcr引物、探针

实施例2病毒rna提取

(1)取n个灭菌的1.5mleppendorf管编号，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)。

(2)每管加入600μl裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μl，再加入200μl氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。

(3)取与步骤(1)相同数量灭菌的1.5mleppendorf管，加入400μl异丙醇(-20℃预冷)，做标记。吸取本标准步骤(2)各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μl，不能吸出中间层，颠倒混匀。

(4)于4℃、12000r/min离心15min(eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600μl75％乙醇，颠倒洗涤。

(5)于4℃、12000r/min离心10min(eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

(6)4000r/min离心10s(eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5～10min。

(7)加入11μldepc水，溶解管壁上的rna，2000r/min离心5s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70℃冰箱。

实施例3荧光rt-pcr反应体系的建立与优化

(1)引物和探针浓度的优化

使荧光rt-pcr反应体系中的引物和探针终浓度从0.1μmol/l至1μmol/l以0.1μmol/l递增，采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其它条件完全一致。

实验结果显示，上下游引物浓度为20μm、探针浓度为10μm，引物和探针用量分别为1μl、0.5μl时，可得到良好的扩增效果。

(2)最佳退火温度和和循环数的确定

为了提高荧光rt-pcr反应的灵敏度和特异性，分别设置退火温度为51℃、51.5℃、52℃、……60℃进行扩增，筛选合适的退火温度。

实验结果显示60℃作为退火温度较为合适，扩增循环数40个循环即可达到检测的极限。

经优化确定高致病性h7n9禽流感病毒荧光rt-pcr的最佳反应体系及反应参数，反应体系总体积25μl，各组分及浓度见表2，反应参数见表3。

表2荧光rt-pcr反应液组份及浓度

表3实时荧光rt-pcr反应参数

荧光素设定：

reportdye设定为fam；

quenchdye均设定为eclipse。

质控标准：阴性对照无ct值且无扩增曲线，阳性对照的ct值≤30.0并出现典型扩增曲线时(图1)。

结果表述及判定：ct值≤35.0的样品判为阳性，表示样品中存在高致病性h7n9禽流感病毒；无ct值且无扩增曲线的样品判为阴性，表示样品中无高致病性h7n9禽流感病毒；ct值在35～40之间的样品须重做，重做结果无ct值者为阴性，否则为阳性。

核酸提取需要60min左右(自动核酸提取仪只需30min)，一步法实时荧光rt-pcr需要70min左右，因此从收到样品到得到检验结果的时间仅为2.5～3h，大大节省了检测时间。

由于本实施例所用的onestepprimescript^tmrt-pcrkit(perfectrealtime)包含了dntp、mg²⁺、反转录酶(amv)、tag酶，只需在反应预混液中加入适量的探针和引物即可完成一步法荧光rt-pcr反应。本实施例采用一步法反转录闭管检测荧光技术，避免了普通pcr需开盖电泳而产生污染的风险或导致假阳性的缺陷，并可防止病毒扩散污染环境，减少溴化乙锭对试验人员的危害。

商品化hp-h7n9实时荧光rt-pcr试剂盒价格较高。除荧光pcr仪的成本外，每份样品检测的试剂成本就高达100元人民币左右，难以适应中国国情在全国普及和推广。本实施例所使用的takara公司onestepprimescript^tmrt-pcrkit(perfectrealtime)目前的价格约为20元/头份，每份样品探针、引物的费用约为5元，因此本试剂盒每份样品检测的试剂成本仅为25元人民币左右，粗略估算本方法的试剂成本仅为商品化的荧光rt-pcr试剂盒的1/3左右，检测成本低廉，可大幅度节省检测费用，非常适合大批量检测。

实施例4样品中核酸定量

阳性质粒测定浓度后，以10倍梯度稀释至10^-11，对梯度稀释的样品进行荧光定量pcr扩增。反应结束后将系列稀释模板的浓度对数与ct值做直线回归得到标准曲线。

得到定量标准曲线见图2，不同稀释度(10^-2～10^-10)阳性质粒标准品的ct值与其浓度的对数存在线性关系，标准曲线的相关系数r²为0.999，线性关系较好，斜率为-3.341，y轴截距为37.524，扩增效率为99.194％。根据未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的核酸拷贝数。

实施例5特异性试验

按实施例2方法，提取hp-h7n9病毒核酸，分别以hp-h7n9、lp-h7n9、h7n3、h3n2、h5n1、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h9、h1n1、ibdv、ibv、ndv等病毒核酸作为模板，按表2、表3的体系和条件进行特异性试验，同时设阳性对照(重组质粒whc183644-75)和阴性对照。

只有hp-h7n9和阳性对照(重组质粒whc183644-75)出现荧光曲线，而lp-h7n9、h7n3、h3n2、h5n1、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h9、h1n1、ibdv、ibv、ndv等模板均未出现荧光扩增曲线，试验结果见图3、表4。

表4特异性实验结果

荧光pcr探针经去羟基化处理，不会在taq酶作用下发生延伸。它只有与待测模板完全匹配结合后，才会在扩增过程中被taq酶的5’-3’外切酶活性酶切降解，发生荧光报告基团与淬灭基团的分离从而产生荧光信号，因此，taqman探针可以很好解决引物的非特异性扩增而导致的假阳性的问题。一般情况下，tagman探针与模板之间的碱基错配超过4个以上就无法匹配结合，而正式pcr循环(收集荧光步骤)较高的退火温度，排除了模板的非特异性扩增，使得本方法具有较好的特异性，可特异性检测hp-h7n9，而不与低致病性h7n9禽流感病毒(lp-h7n9)、h7n3流感病毒、h3n2流感病毒、h5n1禽流感病毒、h5亚型禽流感病毒(re-6疫苗株)、h5亚型禽流感病毒(re-8疫苗株)、h9亚型禽流感病毒、h1n1、ibdv、ibv、ndv等病原核酸产生交叉反应。

实施例6敏感性试验

合成阳性质粒溶解后浓度为50ng/μl，换算成拷贝数浓度为7.09×10¹⁰copies/μl。试验结果表明，本方法最低可检测到阳性质粒的10^-10稀释倍数(模板量为5μl)，换算成拷贝数浓度为7.09copies/μl，结果见图4。

hp-h7n9攻毒鸡胚尿囊液的血凝效价为2⁵。提取倍比稀释的各稀释度尿囊液的病毒核酸，进行hp-h7n9荧光rt-pcr，能检测到hp-h7n9核酸的尿囊液最低稀释度为2^-25，荧光扩增曲线见图5。

荧光pcr仪检测荧光的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度，因此用荧光信号的增长值显示扩增产物的量，能获得较高的检测精度。另外由于本方法在正式pcr循环(收集荧光)之前设置了5个低温(退火温度为45℃)pcr循环(反应参数为92℃10s，45℃30s，72℃60s)，使得模板在较低的退火温度下得到了大量的扩增，因此大大提高了本方法的敏感性。实验表明，检测到阳性质粒的10^-10稀释倍数，换算成拷贝数浓度为7.09copies/μl，具有良好的敏感性。

试验所用的hp-h7n9攻毒鸡胚尿囊液的血凝效价为2⁵，提取倍比稀释的各稀释度尿囊液的病毒核酸，进行hp-h7n9荧光rt-pcr，能检测到hp-h7n9核酸的尿囊液最低稀释度为2^-25，表明本方法的敏感性远高于经典的血清学方法。

实施例7重复性试验

按表3配制反应体系，置-20℃保存。用10^-3～10^-9稀释度的阳性质粒模板分三次实验进行重复性检测。结束后记录各ct值，并将三次结果进行比较分析其变异系数。

用10^-3～10^-9稀释度的阳性质粒模板分别进行三次实验，检测结果见表5。三次检测结果之间的变异系数(cv值)在1.97％～4.89％之间，均小于5％，表明本方法具有良好的重复性和稳定性。

表5hp-h7n9荧光rt-pcr重复性实验

sequencelisting

<110>拱北海关技术中心

<120>用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr引物、探针及方法

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