猫疱疹病毒FHV-1的RAA恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法。
背景技术：
：猫疱疹病毒i型(felineherpesvirus1，fhv-1)又叫猫鼻气管炎病毒(felinerhinotracheitisvirus)，属疱疹病毒科，为具有囊膜的双链dna病毒，能在猫胚肾、肺以及睾丸细胞培养物内良好的增殖和传代。该病毒能够诱发猫鼻气管炎病，由该病毒所引发的猫鼻气管炎发病率可达100％，死亡率可达50％。该病毒可以在病猫的鼻、咽喉、气管和支气管以及舌、结膜等的部位增殖，并通过直接接触传播。该病最早从美国发现，随后在拿大、英国、荷兰、瑞士、匈牙利、越南等地发现和流行，我国已多次发现可疑病例，并分离到病毒。现有的猫疱疹病毒i型(fhv-1)的检测方法主要包括血清学检测方法，分子生物学技术，限制性核酸内切酶分析等，其中，分子生物学技术因具有特异性强、灵敏度高等优点而越来越被人们重视。然而，分子生物学技术对精密设备高度依赖，尤其是荧光定量pcr仪，这使得病毒的检测主要集中在实验室内，操作复杂且耗时较长，同时结果的判读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。因此，亟需要建立了一种快速方便、准确可靠的猫疱疹病毒fhv-1的检测方法。技术实现要素：基于上述背景介绍，本发明的目的是提供一种猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法。作为本发明的第一方面，本发明提供一种猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组。作为优选，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如seqidno.7所示，反向引物核苷酸序列如seqidno.8所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如seqidno.9，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。作为优选，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texasred或lcred460中的一种，荧光淬灭基因选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种。作为本发明的第二方面，本发明提供一种猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测试剂盒。作为优选，所述试剂盒包括猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组，其中，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如seqidno.7所示，反向引物核苷酸序列如seqidno.8所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如seqidno.9，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。作为优选，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texasred或lcred460中的一种，荧光淬灭基因选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种。作为优选，所述试剂盒还包括abuffer、bbuffer、raa干粉试剂、猫疱疹病毒fhv-1标准品和ddh2o中至少一种。作为优选，所述abuffer为20％peg，bbuffer为280mmmgac。作为优选，所述的raa干粉试剂的成分如下：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶，100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶、exo核酸外切酶。作为优选，所述猫疱疹病毒fhv-1标准品为含有猫疱疹病毒fhv-1保守区基因部分序列的阳性质粒。作为优选，所述含有猫疱疹病毒fhv-1保守区基因部分序列的阳性质粒如seqidno.13所示。作为本发明的第三方面，本发明提供一种猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测方法。作为优选，所述检测方法包括如下步骤：提取待测样本的dna，以待测样本的dna为模板，采用本发明所述的试剂盒进行实时荧光raa反应，根据实时荧光raa扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否含有猫疱疹病毒fhv-1。具体如下：提取待测样品的dna，以待测样品的dna为模板，在猫疱疹病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及raa干粉试剂、abuffer、bbuffer和ddh2o存在下进行实时荧光raa反应，根据实时荧光raa扩增曲线分析待测样品；其中所述猫疱疹病毒正向引物核苷酸序列如seqidno.7所示、所述猫疱疹病毒反向引物核苷酸序列如seqidno.8所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如seqidno.9所示，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。作为优选，所述实时荧光raa反应程序为：39℃，1min；39℃，30s，共计40个循环。本发明所述检测方法需要实时荧光raa反应结束后，利用实时荧光raa仪分析软件，根据实时荧光raa的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本fam通道扩增曲线呈“s”型且ct值≤35，判断为猫疱疹病毒阳性结果；当待测样本无明显扩增曲线且ct值≥40，判断为对猫疱疹病毒阴性结果；当待测样本fam通道扩增曲线呈“s”型且35＜ct值＜40，判为可疑，需要排除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若样本的结果仍然为35＜ct值＜40，以阴性对照作为参照标准，检测阴性对照的ct值，若阴性对照ct值≥40，则该待测样本判为阳性。作为本发明的第四方面，本发明提供了本发明所述的引物探针组、试剂盒在用于检测猫疱疹病毒fhv-1中的应用。本发明的有益效果为：(1)快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；(2)操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链dna的变性等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和，整个反应简单快速，特别适合在有大量样品的非实验室检测场所进行；(3)高特异性：本发明与单纯疱疹病毒ⅰ型(hsv-1)、犬疱疹病毒(chv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猫细小病毒(fpv)均无交叉反应；(4)高灵敏度：检测灵敏度可达到10copies/μl；(5)鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合poct现场检测。附图说明图1为本发明中涉及的4对引物raa扩增曲线图。图2为raa检测方法对fhv的灵敏度实验图，从左到右依次为105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl5个的阳性标准品的扩增结果。图3为raa检测方法对fhv的特异性实验图。具体实施方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若无特别指明，实施例中采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。实施例1：猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组的设计本研究参考genbank上已公布的猫疱疹病毒fhv-1基因序列，使用dnaman6.0软件对多序列进行比对，选择特异性高、较为保守的fhv-1tk基因作为目的基因。大量实验表明，不同的引物对恒温扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对猫疱疹病毒tk基因初步设计了四组引物探针：fhv-1-1、fhv-1-2、fhv-1-3和fhv-1-4(引物序列如表1所示)，这些序列可以和猫疱疹病毒tk基因的相应序列特异性结合，其中，上述四组引物扩增目的片段的大小分别为187bp、225bp、218bp和221bp，阳性样本扩增曲线如图1所示。表1fhv-1-1、fhv-1-2、fhv-1-3和fhv-1-4由图1结果可见，fhv-1-3的扩增曲线最优，出峰最早，荧光强度最高(纵坐标值)并且有明显的指数期和平台期。其它引物探针曲线上升峰高较低，出峰时间较晚，相较于fhv-1-3表现较差。说明fhv-1-3引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。实施例2：猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测试剂盒及检测方法fhv-1的raa恒温荧光检测试剂盒，包括引物混合液、特异性荧光探针、abuffer(20％peg)、bbuffer(280mmmgac)、raa干粉试剂、猫疱疹病毒标准品和ddh2o。raa干粉试剂的成分如下：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶，100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶、exo核酸外切酶。本发明所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如seqidno.7所示，所述反向引物的碱基序列seqidno.8所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为1:1。本发明提供的猫疱疹病毒的特异性探针碱基序列如seqidno.9所示，探针的5′端标记有fam荧光报告基团，3′端标记有bhq1荧光淬灭基团。本发明提供的猫疱疹病毒标准品包含有猫疱疹病毒tk基因保守区序列的阳性质粒，该质粒的碱基序列如下：atggcgagtggaaccatccccgttcagaatgaagagattattaaatcacaggtgaatactgtccgcatttacatagatggtgcctatggaataggtaagagtttaacggcgaagtacctggtcagagcggatgaaaatcgaccgggatatacttactacttcccagaaccaatgctatactggcgtagtctctttgaaactgatgttgtcggtggtatctatgccgtccaggaccggaaacgacgtggtgaattatcagctgaagatgctgcctatatcaccgcccactatcaagcaagatttgccgcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaaagttgtatgtgaggaacaccccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctctctggtctgtttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtacttagtctaatggcaacacttccacgagaacctcctggtggaaatctagttgtaacaaccttgaatatcgaggaacatttgaagcgtctcaggggacgctcaagaaccggagaacagatagacatgaagctaattcacgcactacgcaatgtatatatgatgttggtacatactaagaaatttttaacaaaaaatactagttggcgtgatgggtgggggaagcttaaaattttctcccactatgaacggaataggctcgtggaaactacaatagtttccgattcgacggagtcagatttatgtgacacattattcagtgttttcaaagcccgggagctctccgaccaaaatggagatctacttgacatgcatgcatgggtcctcgatggacttatggaaaccctccaaaatttacagatctttactttaaatctggaaggaacccctgatgaatgtgccgccgccttgggagcactgagacaagatatggatatgacatttatagccgcatgtgatatgcaccgtataagtgaagccttgacgatataccattaaa(seqidno.13)。应用本实施例的试剂盒对样本中的猫疱疹病毒fhv-1的检测：1、样品核酸的提取1.1、核酸提取：采用天根血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒，按照说明步骤提取待测样本基因组dna。2、raa反应体系的配置：每个检测样品对应一个raa反应干粉管，每个raa反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。表2反应体系配置表:raa反应体系组分体积(μl)abuffer12.5bbuffer2.5引物混合液4.0特异性荧光探针0.6ddh2o28.4dna模板2总体积503、将配置好反应体系的raa反应管放置于abi7500扩增仪中，按照下列程序进行raa扩增：39℃，1min；39℃，30s，共计40个循环。每个循环收集fam通道的荧光。4、扩增结束后根据荧光曲线判断和ct值判定猫疱疹病毒阳性或阴性结果。判定结果：待测样本fam通道扩增曲线呈“s”型且ct值≤35，判断为对猫疱疹病毒阳性结果；当待测样本无明显扩增曲线且ct值≥40，判断为对猫疱疹病毒阴性结果；当待测样本fam通道扩增曲线呈“s”型且35＜ct值＜40，判为可疑，需要排除除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若结果仍然35＜ct值＜40，应参照阴性对照ct值，若阴性对照ct值≥40，则该待测样本为阳性。实施例3：应用本发明的试剂盒进行实际样本检测为验证本发明所述引物、探针、试剂在实际情况下能正常使用，于是模拟实际情况，使用本发明的引物、探针、试剂对实际样本进行检测。实际样本由青岛农业大学动物健康检测与评价中心，患病猫眼鼻分泌物及患病猫血清，共12份。检测结果与已知pcr检测结果一致，符合率100％。本发明具有在具备温控功能的荧光检测仪器中，在体温条件下(37℃-39℃)对猫疱疹病毒进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测的优点。实施例4：本发明的试剂盒灵敏度试验使用猫疱疹病毒标准品质粒，提取阳性质粒，并用nanodrop测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、100copies/μl6个浓度梯度进行灵敏度试验。检测结果如图2所示，从左到右依次为105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的raa荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达101copies/μl，表明本发明的raa恒温荧光检测试剂盒和检测方法对fhv的诊断具有高度的灵敏性。实施例5：本发明的试剂盒的特异性试验为了检测本发明试剂盒的特异性，分别对病毒样本进行检测，分析本试剂盒对fhv-1和近源病毒的检测情况。检测结果表明：仅fhv-1样品出现正常扩增，阴性对照(ddh2o)及单纯疱疹病毒ⅰ型(hsv-1)、犬疱疹病毒(chv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猫细小病毒(fpv)样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明raa恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出fhv中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。序列表<110>南宁众册生物科技有限公司山东省农业科学院畜牧兽医研究所<120>猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtccaggaccggaaacgacgtggtgaattatc32<210>2<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gagggtgtctatctatgattagggtcacgtc31<210>3<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cagactatccacaataacaggatatcagaaagtatgtgaggaacacc47<210>4<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gatgctgcctatatcaccgcccactatcaagc32<210>5<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cattagactaagtacagacccaagagtcatatc33<210>6<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cagactatccacaataacaggatatcagaaagtatgtgaggaacacc47<210>7<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gtccaggaccggaaacgacgtggtgaattatc32<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cttgcgagtgggaaacagaccagagaggcg30<210>9<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cagactatccacaataacaggatatcagaaagtatgtgaggaacacc47<210>10<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ctatcaagcaagatttgccgcaccataccttc32<210>11<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gttctcgtggaagtgttgccattagactaag31<210>12<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cagactatccacaataacaggatatcagaaagtatgtgaggaacacc47<210>13<211>1033<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13atggcgagtggaaccatccccgttcagaatgaagagattattaaatcacaggtgaatact60gtccgcatttacatagatggtgcctatggaataggtaagagtttaacggcgaagtacctg120gtcagagcggatgaaaatcgaccgggatatacttactacttcccagaaccaatgctatac180tggcgtagtctctttgaaactgatgttgtcggtggtatctatgccgtccaggaccggaaa240cgacgtggtgaattatcagctgaagatgctgcctatatcaccgcccactatcaagcaaga300tttgccgcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaaa360gttgtatgtgaggaacaccccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctct420ctggtctgtttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtactt480agtctaatggcaacacttccacgagaacctcctggtggaaatctagttgtaacaaccttg540aatatcgaggaacatttgaagcgtctcaggggacgctcaagaaccggagaacagatagac600atgaagctaattcacgcactacgcaatgtatatatgatgttggtacatactaagaaattt660ttaacaaaaaatactagttggcgtgatgggtgggggaagcttaaaattttctcccactat720gaacggaataggctcgtggaaactacaatagtttccgattcgacggagtcagatttatgt780gacacattattcagtgttttcaaagcccgggagctctccgaccaaaatggagatctactt840gacatgcatgcatgggtcctcgatggacttatggaaaccctccaaaatttacagatcttt900actttaaatctggaaggaacccctgatgaatgtgccgccgccttgggagcactgagacaa960gatatggatatgacatttatagccgcatgtgatatgcaccgtataagtgaagccttgacg1020atataccattaaa1033当前第1页12