一组用于鉴别紫灵芝和赤灵芝菌种的特异性分子标记及鉴别方法和应用与流程

本发明属于灵芝菌种分子鉴定
技术领域：
，具体涉及一组用于鉴别紫灵芝和赤灵芝菌种的特异性分子标记及鉴别方法和应用。
背景技术：
：灵芝在分类地位上隶属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、灵芝科、灵芝属，广泛分布在热带和亚热带地区。我国灵芝种质资源丰富，广泛分布于吉林、河北、山西、河南、浙江、云南、贵州、广东和广西等省份。灵芝是我国传统中药材，有“九大仙草”之一的美称，性微温，气味特殊，味微苦涩。灵芝在《中华人民共和国药典(2015版)》中以灵芝属真菌赤灵芝(ganodermalucidum)或紫灵芝(ganodermasinense)的干燥子实体入药，其化学成分较为复杂，主要含有三萜类、多糖类、氨基酸多肽类、核苷类、呋喃类、生物碱类、油脂类及其微量元素类等，具有多种生理活性和药理活性，如调节免疫、预防心血管系统疾病、抗肿瘤、抗病毒、降血糖和抗氧化等。但赤灵芝性温而紫灵芝性平；赤灵芝适合入药，紫灵芝适合日常保健和调理。而且相对于赤灵芝，紫灵芝更昂贵。随着人民生活水平的提高，对高品质灵芝的需求越来越大，所以现在越来越多的灵芝都是仿野生栽培，这也促进了灵芝优良品种的菌种培育、保藏和生产。当前有部分商家为获取暴利未按《食用菌菌种管理办法》进行生产和销售，再加上灵芝的长期栽培以及杂交育种等导致灵芝分类混乱，菌种名称不统一，很大程度上阻碍了灵芝产业的健康发展。作为灵芝产业中主要的两个种，紫灵芝和赤灵芝在子实体阶段通过外形容易区分，但是在菌种时期，两者几乎完全一样，因此需要利用分子手段进行区分，从而保障灵芝产业的健康有序发展。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的是为了规范灵芝菌种培育、保藏和生产，提供一组用于鉴别紫灵芝和赤灵芝菌种的分子标记及鉴别方法和应用。本发明通过以下技术方案加以实现：一组用于鉴别紫灵芝和赤灵芝菌种的特异性分子标记，该特异性分子标记的引物为glmi001、glmi002和glmi003，各引物核苷酸序列如下：上游引物glmi001-f：5’-acccggtgaaacaaca-3’，如seqidno.1所示；下游引物glmi001-r：5’-gcagtgagtttggcttat-3’，如seqidno.2所示；上游引物glmi002-f：5’-cggacagcgaacagacg-3’，如seqidno.3所示；下游引物glmi002-r：5’-ggcagcaatgaggacacc-3’，如seqidno.4所示；上游引物glmi003-f：5’-agcgacgccgtcaactc-3’，如seqidno.5所示；下游引物glmi003-r：5’-aagcagccacagccaact-3’，如seqidno.6所示。上述三对特异性分子标记引物(glmi001-f/r、glmi002-f/r和glmi003-f/r)是通过利用scot随机引物，对紫灵芝和赤灵芝菌种样品dna进行普通pcr扩增，对扩增产物进行电泳，筛选紫灵芝菌种特异性条带进行测序，然后对测序获得的紫灵芝菌种特异条带序列进行比对分析，并以此设计特异性引物，再次验证是否可以获得紫灵芝特异性条带。因此，这三对引物对具有极高的专一性，用它们对紫灵芝和赤灵芝菌种样品dna进行pcr扩增，只有紫灵芝菌种能获得187bp、365bp和168bp的dna条带，而赤灵芝菌种没有；紫灵芝菌种扩增得到的特异片段核苷酸序列如seq.idno7、seq.idno8、seq.idno9所示。本发明的另一个目的是提供利用上述特异性分子标记引物(glmi001-f/r、glmi002-f/r和glmi003-f/r)对紫灵芝和赤灵芝菌种进行快速鉴定的方法。本发明采用上述特异性分子标记引物(glmi001-f/r、glmi002-f/r和glmi003-f/r)作为特异性扩增引物，以紫灵芝和赤灵芝菌种基因组dna为模板，进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果分别出现一条187bp、365bp和168bp的dna条带，则待测样本为紫灵芝菌种；若电泳结果未出现上述dna条带，则待测样本为赤灵芝菌种。上述方法中扩增引物的选择、基因组dna的提取确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。需要说明的是，本发明特异性性分子标记引物和检测方法仅适用于紫灵芝和赤灵芝菌种的鉴别，即待测样本是限定为紫灵芝和赤灵芝菌种样本的范围内，本领域普通技术人员采用本发明方法可对紫灵芝和赤灵芝菌种进行快速鉴定，方法简便、准确、快速，是其他现有鉴别方法不能实现的。具体的所述方法如下：(1)取紫灵芝和赤灵芝菌种0.3-0.5g，利用真菌基因组dna提取试剂盒提取待测样本的基因组dna；(2)以步骤(1)所得的基因组dna为模板，以所述特异性分子标记引物(glmi001-f/r、glmi002-f/r和glmi003-f/r)为扩增引物，进行普通pcr扩增：pcr反应体系(总体积为30μl)组成如下：体系组分体积(μl)10×pcrbuffer(含mg2+)310mmol/ldntps0.920μmol/l上游引物0.620μmol/l下游引物0.65u/μltaq酶0.5dna模板(50ng/μl)1ddh2o23.4pcr反应程序为：94℃预变性5分钟；30个循环(94℃变性30秒，退火温度(glmi001为54℃、glmi002为60℃和glmi003为61℃)复性45秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。(3)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得的pcr扩增产物，利用凝胶成像系统进行成像拍照，若电泳结果分别出现一条187bp(glmi001)、365bp(glmi002)和168bp(glmi003)的dna条带，则待测样本为紫灵芝菌种；若电泳结果未出现上述dna条带，则待测样本为赤灵芝菌种。本发明的有益效果主要体现在：本发明的特异性分子标记引物(glmi001-f/r、glmi002-f/r和glmi003-f/r)可从紫灵芝和赤灵芝菌种中进行紫灵芝菌种的分子鉴定，方法简单、准确、高灵敏度，是其他现有鉴别方法不能达到的。附图说明图1为采用本发明的特异性分子标记glmi001-f/r对紫灵芝和赤灵芝菌种进行pcr扩增后的电泳图；图2为采用本发明的特异性分子标记glmi002-f/r对紫灵芝和赤灵芝菌种进行pcr扩增后的电泳图；图3为采用本发明的特异性分子标记glmi003-f/r对紫灵芝和赤灵芝菌种进行pcr扩增后的电泳图；其中：通道m为dna标准分子量markerdl2000；通道1～9：(1)吉林赤灵芝1、(2)吉林赤灵芝2、(3)山东赤灵芝1、(4)山东赤灵芝2、(5)安徽赤灵芝1、(6)安徽赤灵芝2、(7)河南赤灵芝、(8)浙江赤灵芝1、(9)浙江赤灵芝2(寿仙谷菌种)；通道10：紫灵芝(寿仙谷菌种)。具体实施方式以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，本发明的目的和效果将变得更加明白。实施例11.待测紫灵芝和赤灵芝菌种基因组dna提取取待测紫灵芝和赤灵芝菌种的菌丝0.3-0.5g，使用上海生物工程技术有限公司的真菌基因组dna抽提试剂盒提取待测紫灵芝和赤灵芝菌种样本基因组dna，用1.5％琼脂糖凝胶对所得dna进行电泳以检测纯度，并利用美国赛默飞世尔公司的nanodroptm1000型超微量紫外分光光度计检测dna浓度，然后稀释至50ng/μl，4度冰箱放置备用。2.合成特异性分子标记引物设计基于紫灵芝特异序列的三对分子标记引物，上游引物glmi001-f：5’-acccggtgaaacaaca-3’和下游引物glmi001-r：5’-gcagtgagtttggcttat-3’；上游引物glmi002-f：5’-cggacagcgaacagacg-3’和下游引物glmi002-r：5’-ggcagcaatgaggacacc-3’；上游引物glmi003-f：5’-agcgacgccgtcaactc-3’和下游引物glmi003-r：5’-aagcagccacagccaact-3’，由上海生工合成。3.特异性分子标记引物(glmi001-f/r、glmi002-f/r和glmi003-f/r)的pcr扩增pcr扩增体系(总体积30μl)：10×pcrbuffer(含mg2+)3μl，10mmol/ldntps0.9μl，20μmol/l上游引物0.6μl，20μmol/l下游引物0.6μl，5u/μltaq酶0.5μl，dna模板(50ng/μl)1μl，ddh2o23.4μl。pcr反应程序为：94℃预变性5分钟；30个循环(94℃变性30秒，退火温度(glmi001为54℃、glmi002为60℃和glmi003为61℃)复性45秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。4.电泳检测取步骤(3)pcr扩增产物5～10μl，利用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果如图1～3所示。按照上述方法，利用特异性分子标记glmi001对紫灵芝和赤灵芝菌种进行检测，电泳图见图1，其中编号为10的为紫灵芝菌种个体，扩增出一条187bp的dna条带；其他编号为赤灵芝菌种个体，均无扩增出一条187bp的dna条带。按照上述方法，利用特异性分子标记glmi002对紫灵芝和赤灵芝菌种进行检测，电泳图见图2，其中编号为10的为紫灵芝菌种个体，扩增出一条365bp的dna条带；其他编号为赤灵芝菌种个体，均无扩增出一条365bp的dna条带。按照上述方法，利用特异性分子标记glmi003对紫灵芝和赤灵芝菌种进行检测，电泳图见图3，其中编号为10的为紫灵芝菌种个体，扩增出一条168bp的dna条带；其他编号为赤灵芝菌种个体，均无扩增出一条168bp的dna条带。这表明本发明的特异性分子标记glmi001、glmi002和glmi003具有极高的专一性，因此可以用于紫灵芝和赤灵芝菌种的快速鉴定。序列表<110>杭州师范大学浙江寿仙谷植物药研究院有限公司<120>一组用于鉴别紫灵芝和赤灵芝菌种的特异性分子标记及鉴别方法和应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>引物(primer)<400>1acccggtgaaacaaca16<210>2<211>18<212>dna<213>引物(primer)<400>2gcagtgagtttggcttat18<210>3<211>17<212>dna<213>引物(primer)<400>3cggacagcgaacagacg17<210>4<211>18<212>dna<213>引物(primer)<400>4ggcagcaatgaggacacc18<210>5<211>17<212>dna<213>引物(primer)<400>5agcgacgccgtcaactc17<210>6<211>18<212>dna<213>引物(primer)<400>6aagcagccacagccaact18<210>7<211>187<212>dna<213>紫灵芝(ganodermasinense)<400>7gcagtgagtttggcttatgcgcatgttgaactgaaattcacctacgccagccgccttctt60cgaggacttctcgttgacgaatttttctcttcgtcggacgaggtgcttttttccggcgac120aggttttgaaggggatgggggaggagggattgacggcgtaccaactggcattgttgtttc180accgggt187<210>8<211>365<212>dna<213>紫灵芝(ganodermasinense)<400>8ggcagcaatgaggacacccttggagaacgagtgccgggagacgatctccgactgcgggct60ctcgcccgttaggtagcggacgtcggcgcggagctggggcacggagatgttgctcacaat120agacgcaacgacgggatcaaacttgaggccatgaaggatgtccttcacgcgctggacggc180c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