一种嗜几丁质类芽孢杆菌的菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及嗜几丁质类芽孢杆菌的菌株及其应用。

背景技术：

几丁质(chitin)又称甲壳素、甲壳质、壳蛋白、壳多糖、明角质等，是以n-乙酰-d-氨基葡萄糖为单体，通过β-1,4糖苷键连接而成的高分子多聚物，是自然界中仅次于纤维素的第二大丰富的天然聚合物。几丁质广泛存在于真菌、细菌、高等植物中，特别是节肢动物如虾、蟹、昆虫等外壳的重要成分，据估计自然界每年生物合成的几丁质约为1×10¹¹t，是一种巨大的可再生资源。

几丁质酶(chitinaseec3.2.1.14)是一类重要的糖苷水解酶，细菌、真菌、植物及低等动物均能产生，能够催化几丁质水解产生n-乙酰氨基葡萄糖单体或低分子量几丁寡糖。

几丁质降解产物在化学、医药、食品、农业、环保等领域都具有广阔的市场开发前景。目前这些产品的生产通常采用化学降解法，不仅成本高，不易控制，而且对环境污染严重。与化学法相比，从经济和社会的实际情况着眼，微生物分解以其生产工艺简单且成本较低，是理想的几丁质降解方法，具有良好的应用前景。

目前，微生物来源几丁质酶菌株的研究已经取得了一定的进展，但一个限制性的因素就是已报道的菌株距离工业化生产还有一定的差距。而菌株是发酵工业的灵魂，许多工业过程都是在极端的ph值和温度下进行的。例如，工业虾和蟹壳通常需要酸进行预处理，需要酶具有良好的耐受性。因此筛选出耐受性强、几丁质酶活性高菌株显得尤为重要。

技术实现要素：

针对上述现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种几丁质酶活性高的嗜几丁质类芽孢杆菌的菌株，它能有效的降解虾和/或蟹壳粉末获得几丁寡糖。

本申请提供一种嗜几丁质类芽孢杆菌，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期：2019年7月3日，保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心（保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号：gdmccno：60710，分类命名为paenibacilluschitinolyticusumbr0002。

上述菌株在初筛培养基30℃培养3d后，形成浅黄色、表面光滑、湿润的菌落。易挑取，培养时间超过3d，菌落易成树枝状，边缘不规则，菌株和透明圈逐渐变大。进入对数生长期时间为4h，适宜生长温度为20-37℃，适宜生长ph:6.0-8.0，耐盐生长范围：0-1％。

一种嗜几丁质类芽孢杆菌在降解几丁质中的应用。该菌株能有效的降解几丁质。

一种嗜几丁质类芽孢杆菌在降解虾和/或蟹壳中的应用。该菌株能够直接降解虾和/或蟹壳或其粉末从而获得几丁寡糖。

一种嗜几丁质类芽孢杆菌的使用方法，包括如下步骤：

步骤一：将初筛获得的菌株接种到种子培养基中得到种子培养液；

步骤二；调节培养液ph值5-8；

步骤三：将种子液接种于产酶发酵培养基中于20-40℃、100-300r/min下恒温震荡培养三小时以上，产生几丁寡糖和n-乙酰-d-葡萄糖胺。

有益效果：本研究的一种嗜几丁质类芽孢杆菌，该菌株产几丁质酶活性高，它能有效的降解几丁质，尤其是能够直接降解虾和/或蟹壳粉末获得几丁寡糖，降低工业生产的成本，这不仅克服化学方法对环境造成污染等弊端，而且采用生物的方法降解几丁质制备几丁质降解产物具有反应比较温和、可控制、效率高等优势，可产生很好的经济效益和社会效益。现有的类芽孢杆菌属微生物产几丁质酶的水平大多数在0.10u/ml-1.55u/ml之间，但是本发明菌株菌所分泌的几丁质酶可降解几丁质获得几丁寡糖，经发酵培养基组分及培养条件的优化，以几丁质粉末为碳源进行分解的酶活可达12.58u/ml，相比现有的类芽孢杆菌属微生物，该菌株的产酶活力提高了数十倍，所产几丁质酶可迅速降解几丁质。该菌所产的酶的酸碱耐受性十分突出，ph为4.0-10.0范围内稳定性良好。这个效果是我们之前所无法想象的。

附图说明

图1为菌株在胶体几丁质平板所产透明圈的情况；

图2为菌株的菌落形态；

图3为菌株的生长曲线；

图4为菌株的16srrna扩增产物的琼脂糖(1％)电泳检测结果；

图5为菌株的n-j系统发育树。

图6为本发明实施例中几丁质酶的最适反应温度；

图7为本发明实施例中几丁质酶的温度稳定性；

图8为本发明实施例中几丁质酶的最适ph；

图9为本发明实施例中几丁质酶的ph稳定性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下面结合图1～5，对本发明请求保护的一种嗜几丁质类芽孢杆菌的菌株及其应用做详细的介绍。

本申请提供一种嗜几丁质类芽孢杆菌，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期：2019年7月3日，保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心（保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号：gdmccno：60710，分类命名为paenibacilluschitinolyticusumbr0002。

一、菌株的筛选

(一)材料准备

1、样品采集

以红树林虾塘养殖基地底泥为样品，在深度约为15cm处用灭菌勺挖取土样约50g至无菌密封袋中，保存于4℃保温箱中，迅速带回实验室进行下一步处理。

2、培养基

筛选培养基(g/l)：胶体几丁质3.0，胰蛋白胨5.0，盐溶液10.0，琼脂15.0，ph自然，去离子水1l，121℃，高压灭菌20min。

种子培养基(g/l)：几丁质粉末10.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，硫酸镁0.5，k2hpo40.3，kh2po40.7，去离子水1l，121℃，高压灭菌20min。

发酵培养基(g/l)：粉末几丁质10.0，(nh4)2so42.0；mgso4·7h2o0.5，k2hpo40.3，kh2po40.7，feso40.1，ph自然，去离子水1l，121℃，高压灭菌20min。

保藏培养基lb(g/l)：蛋白胨10.0，葡萄糖1.0，酵母膏粉5.0，nacl5.0，去离子水1l，121℃，高压灭菌20min。

需要说明的是，在具体实施时，上述制备培养基的方法并非唯一的，具体配比和浓度等可根据需要进行调整。

(二)菌株的筛选分离与纯化

1、筛选分离

将10.0g样品土样加入90ml无菌水中制备土壤悬液。将土壤悬液经过室温处理30min后，用生理盐水梯度稀释制成10^-1-10^-5倍的样品，然后取10^-3、10^-4及10^-5三个稀释倍数的样品各0.1ml，分别涂布到筛选培养基平板上，30℃倒置恒温培养4～5d后观察。本发明实施例采用平板透明圈法筛选，待菌落周围出现水解圈后，挑取透明圈菌落进行反复划线分离划线以获得纯的单菌落，菌株所产透明圈的情况如图1所示。需要说明的是，本发明并不限制菌株的筛选方法，只要本领域技术人员能够实现的，能够达到筛选出目的菌株的方法，均为本发明要求保护的菌株筛选方法。

2、复筛/纯化

将初筛获得的菌株接种到种子培养基中，然后按照2％的接种量接种于产酶发酵培养基中，于30℃、200r/min下恒温震荡培养6d检测几丁质酶活性。将获得的几丁质菌株接种于斜面培养基培养后于-4℃低温保藏及于30％甘油管-80℃超低温保藏，最终保留产酶活力最高的菌株，其中一株产几丁质酶活力为13.47u/ml，命名为umbr0002。

(三)菌落形态特征及生理生化特征/鉴定方法

1、菌株形态学及生理生化特性

菌株形态特征如图2所示，该菌株在胶体培养基30℃培养3d后，形成浅黄色、透明、表面光滑、边缘不整齐、湿润的菌落。易挑取，培养时间超过3d，菌落易成树枝状，边缘不规则，菌株和透明圈逐渐变大。

2、菌株对不同碳源的利用和生化反应情况

表1菌株对不同碳源的利用和生化反应情况

3、菌体生长量测定

采用比浊法测定培养液的光密度(od600值)来间接确定细菌的生长量。菌种的生长曲线如图3所示。

4、温度耐受实验

本发明实施例采用lb培养基作为基础培养基，分别在4℃、10℃、15℃、20℃、28℃、37℃、45℃、55℃条件下培养，不接菌的培养基试管做阴性对照。测得菌种适宜生长温度为：20-37℃。

5、ph值耐受实验

本发明实施例采用lb培养基作为基础培养基测定生长ph耐受范围(ph1.0-11.0)，在基本培养基中加入如下的缓冲液，不接菌的培养基试管做阴性对照。测得适宜生长ph:6.0-8.0。

6、缓冲液体系：hcl-kcl(ph1.0-2.0),phosphate(ph2.0–8.0),glycine–naoh(ph8.0–11.0)。

7、nacl耐受实验

本发明实施例采用lb培养基(未添加nacl)作为基础培养基，分别加入1％、2％、3％、4％、5％的nacl,不接菌的培养基试管做阴性对照。耐盐生长范围：0-1％。

8、分子鉴定

本发明实施例采用chelex-100加热法提取该菌株的基因组dna，使用细菌16srrna基因通用引物进行16srrna基因扩增。对16srrna基因扩增的产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶做电泳检验，电泳结果如图4所示，合格的pcr产物送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列提交到ezbiocloud网站进行序列比对(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)，确定其属地位。下载同源序列后，采用mega5软件中邻近法(neighbor-joining)构建菌株系统发育树，分析其进化地位，菌株的n-j系统发育树如图5所示。

(四)菌株产酶活性的测定方法

1、胶体几丁质的制备

将10.0g几丁质粉溶于176ml浓盐酸，搅拌均匀，放4℃静置24h，加去1.0l离子水，继续静置24h,8000r/min离心5min，取沉淀，用无菌水将其冲洗至中性，最后用去离子水溶解，配制成浓度为25.0g/l的胶体几丁质溶液，4℃冰箱保存备用。

2、酶活力测定

取发酵液2ml，8000rpm/min离心10min，获取上清粗酶液。取1ml处理好的胶体几丁质溶液(1％)于4ml离心管中，45℃恒温水浴中预热10min，然后向离心管中加入1ml适当稀释的粗酶液。45℃反应1h后，混匀酶反应液取出200μl加入300μldns试剂终止反应，并在沸水中显色10min。待反应体系冷却至室温后，加入300μl的去离子水，8000rpm/min离5min，取上清液于540nm处测定吸光值。对待测样品以及样品空白分别进行检测。几丁质酶酶活单位定义：45℃水浴保温条件下，每升溶液每分钟释放1μg乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量定为一个酶活力单位。

3、几丁质酶的酶学性性质分析

最适反应温度性研究：在ph为7.0的条件下，分别测定在不同温度(25、30、40、45、50、60、70、80℃)下的重组酶的酶活力，以测得的最高酶活力为100％计算相对酶活力，确定最适反应温度。结果表明最适温度为45℃(图6)；温度稳定性研究：将重组酶分别置于不同温度(25、30、40、45、50、60、70℃)中保温60min和90min，按照标准方法测定酶活力，以未处理组的酶活力为100％，计算各温度条件下几丁质酶的残余酶活百分比。结果表明在25-45℃内保温60min和90min，几丁质酶仍然具有较高的相对酶活(>70％)(图7)。最适反应ph研究：在45℃条件下，分别测定不同ph缓冲溶液(phosphate(ph2.0–8.0)，glycine–naoh(ph8.0–11.0))的胶体几丁质底物中的重组酶几丁质酶的活力，以测得的最高酶活力值为100％，计算相对酶活力，确定最适反应ph。结果表明最适ph为5.0(图8)；ph稳定性研究：将重组酶置于不同ph缓冲液中4℃条件下保温5h，在最适ph条件下按照标准方法测定酶活力，以测得的最高酶活力值为100％，计算各ph下几丁质酶的残余酶活百分比。结果表明ph为4.0-10.0范围内几丁质酶稳定性均较好，如图9所示，在ph为8.0时几丁质酶的稳定性最好。

4、几丁质酶解产物分析

200μl酶解反应体系中加入100μl浓度为1％的胶体几丁质和100μl几丁质酶液，45℃水浴锅反应30min。煮沸灭活5min，8000r·min^-1离心10min收集上清液。利用esi-ms分析酶解产物，在正离子的模式下，m/z为244/260、447/463、650的离子峰代表不同聚合度寡糖的钠或钾或氢加合物[(glcnac)n-h2on-1+na/k/h]。从结果可知chi为一种18家族的内切几丁质酶，随机水解底物生成几丁寡糖。

本发明从红树林虾塘养殖基地底泥来源嗜几丁质类芽孢杆菌中克隆得到几丁质酶基因，为沿海地区来源野生菌株几丁质酶的研究提供理论基础。根据ncbi该菌全基因组序列设计引物调取几丁质酶基因，构建工程菌进行几丁质酶基因片段全长克隆与表达，并对几丁质酶序列进行生信分析，为该几丁质酶的相关研究提供基础。采用ni-nta亲和层析柱和梯度洗脱的方式对重组几丁质酶进行纯化，该几丁质酶蛋白的回收率为72.2％，说明采用ni-nta亲和层析柱对该几丁质酶蛋白分离是一种有效率的方法。酶学性质表明该几丁质酶的最适ph为5.0，ph为4.0-10.0范围内稳定性良好，在ph为8.0时稳定性最好；该几丁质酶的最适温度为45℃，几丁质酶在25-45℃内保温60min和90min，仍然具有较高的相对酶活(>70％)。因此，该重组酶具有良好的耐受性。事实上，许多工业过程都是在极端的ph值和温度下进行的，此过程中酶活稳定性扮演重要角色。例如，工业虾和蟹壳通常需要酸进行预处理，需要酶具有良好的耐受性。

一种嗜几丁质类芽孢杆菌在降解几丁质中的应用。该菌株能产几丁质酶，有效的降解几丁质。

一种嗜几丁质类芽孢杆菌在降解虾和/或蟹壳中的应用。该菌株能够直接降解虾和/或蟹壳或其粉末从而获得几丁寡糖。

菌株在发酵产几丁质酶降解几丁质中的应用：

1、在相同的发酵条件下，将基础发酵培养基中的碳源改为虾壳粉末，以几丁质粉末为对阳性照，以不接接菌的发酵液为空白对照。发酵6天检测酶活力和几丁寡糖含量如表2。

2、在相同的发酵条件下，将基础发酵培养基中的碳源改为蟹壳粉末，以几丁质粉末为对阳性照，以不接接菌的发酵液为空白对照。发酵6天检测酶活力和几丁寡糖含量如表2。

3、在相同的发酵条件下，将基础发酵培养基中的碳源改为虾蟹壳粉末混合物，以几丁质粉末为对阳性照，以不接接菌的发酵液为空白对照。发酵6天检测酶活力和几丁寡糖含量如表2。

表2菌株在相同的发酵条件下对不同碳源的产酶情况

现有的类芽孢杆菌属微生物产几丁质酶的水平大多数在0.10u/ml-1.55u/ml之间，从表2可以看出，该菌株的产酶水平最高可以达到12.58±0.77u/ml，较低时也可到达3.65±0.17u/ml，相比现有的类芽孢杆菌属微生物，该菌株的产酶活力提高了数十倍，且该菌株产几丁质酶活性较高，从其在相同的发酵条件下对不同碳源进行分解产生的几丁寡糖的含量来看，该菌株能有效的降解几丁质，分解产生的几丁寡糖的含量越高，其几丁质的分解效率越高，同时该菌株能够直接降解虾和/或蟹壳粉末获得几丁寡糖，降低工业生产的成本，这不仅克服化学方法对环境造成污染等弊端，而且采用生物的方法降解几丁质制备几丁寡糖具有反应比较温和、可控制、效率高等优势，可产生很好的经济效益和社会效益。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。