芽孢杆菌DL-1的全细胞在催化拆分乙酸苏合香酯的应用的制作方法

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种从西太平洋深海沉积物样品中分离的芽孢杆菌dl-1的全细胞作为生物催化剂在催化拆分乙酸苏合香酯的应用。

背景技术：

全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。使用全细胞生物催化剂的优势在于：其一，无需酶的提取和纯化，减少了酶活损失，制备简单，大幅降低生产成本；其二，在无水或非传统介质中培养可增强全细胞生物催化剂在反复使用中的稳定性；其三，更能实现能量和辅酶的原位再生，其完整的多酶体系可实现酶的级联反应。全细胞催化技术因其自身的优点，必将成为整个生物催化技术的核心。手性醇作为合成手性药物的重要中间体，在当今制药领域具有广泛的用途。传统化学合成手性醇及其衍生物，具有试剂昂贵、反应条件苛刻、成本高、污染大等问题。利用全细胞作为生物催化剂制备手性醇显示出其独特的优势。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从西太平洋深海沉积物中分离的芽孢杆菌bacillussp.dl-1，以及该菌的全细胞作为生物催化剂在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解制备出高光学纯的(r)-1-苯乙醇和(s)-乙酸苏合香酯中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种可用于酯类不对称水解的海洋来源的芽孢杆菌bacillussp.dl-1。所述的芽孢杆菌bacillussp.dl-1的保藏编号为：gdmcc1.1696。

所述的芽孢杆菌bacillussp.dl-1来源于西太平洋深海沉积物，其16srrna核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供芽孢杆菌bacillussp.dl-1的全细胞在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。

具体的，是提供芽孢杆菌bacillussp.dl-1的全细胞在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(r)-1-苯乙醇中的应用。

以及，提供芽孢杆菌bacillussp.dl-1的全细胞在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(s)-乙酸苏合香酯中的应用。

本发明的芽孢杆菌bacillussp.dl-1的全细胞作为生物催化剂可不对称水解(±)-乙酸苏合香酯制备高光学纯的(r)-1-苯乙醇和(s)-乙酸苏合香酯。

所述的芽孢杆菌bacillussp.dl-1的全细胞需用脱脂奶粉液体培养基对芽孢杆菌bacillussp.dl-1进行发酵培养约24h，离心去上清液，细胞沉淀用ph＝7.2无菌的tris/hcl缓冲液洗涤三次。

所述的芽孢杆菌bacillussp.dl-1的全细胞催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(r)-1-苯乙醇的最佳反应条件为：反应体系包括细胞浓度以细胞湿重计为48mg/ml的芽孢杆菌bacillussp.dl-1、50mm底物(±)-乙酸苏合香酯、体积分数为5％的甲醇，其余为ph6.0的pb缓冲液；反应温度为40℃、反应时间为0.5h。

在上述最佳反应条件下制备得到的(r)-1-苯乙醇的对映体过量值(e.e.p)为96.6％，转化率为24.5％，产率为48.1％。

所述的芽孢杆菌bacillussp.dl-1的全细胞催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(s)-乙酸苏合香酯的最佳反应条件为：反应体系包括细胞浓度以细胞湿重计为60mg/ml的芽孢杆菌bacillussp.dl-1、50mm底物(±)-乙酸苏合香酯、体积分数为5％的丙酮，其余为ph6.0的pb缓冲液；反应温度为35℃、反应时间为5h。

在上述最佳反应条件下制备得到的(s)-乙酸苏合香酯的对映体过量值(e.e.s)为98.4％，转化率为56.6％，产率为86.2％。

本发明利用bacillussp.dl-1的全细胞作为生物催化剂在手性拆分(±)-乙酸苏合香酯的反应中具有较高的底物耐受性和光学选择性。绿色低成本的bacillussp.dl-1全细胞生物催化剂在生物化工领域有较大的应用价值。

本发明的芽孢杆菌bacillussp.dl-1，于2019年8月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc1.1696，保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，任何人在本申请日之前都可以到该保藏中心购买到该菌株。

附图说明

图1为bacillussp.dl-1的生长曲线。

图2为(±)乙酸苏合香酯和(±)-1-苯乙醇标准品的气相色谱图。

图3为最适反应条件下芽孢杆菌dl-1全细胞对(±)乙酸苏合香酯的选择性水解生成高光学纯的(r)-1-苯乙醇的气相色谱图。

图4为最适反应条件下芽孢杆菌dl-1全细胞对(±)乙酸苏合香酯的选择性水解得高光学纯的(s)-乙酸苏合香酯的气相色谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的芽孢杆菌bacillussp.dl-1是从西太平洋深海沉积物中筛选得来并保存在中国科学院南海海洋研究所生物催化实验室。

实施例1：芽孢杆菌菌种的鉴定

筛选纯化后的菌株bacillussp.dl-1利用其保守的16srrna序列对其菌种进行鉴定。用16srrna通用引物27f：5'-agagtttatcctggctcag-3'；和1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'，以芽孢杆菌dl-1菌液为dna模板对其进行pcr扩增。建立如表1所示反应体系：

表1pcr反应体系

pcr扩增条件：94℃预变性10min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环30次；最后72℃延伸10min，冷却到18℃。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，进行检测，然后送至美吉生物技术有限公司进行双向测序。得到该菌的16srrna序列拼接后(其核苷酸序列如seqidno.1所示)利用blast鉴定出该菌株为芽孢杆菌，并命名为bacillussp.dl-1。该芽孢杆菌bacillussp.dl-1，于2019年8月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc1.1696，保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2：bacillussp.dl-1的生长曲线

将保存的芽孢杆菌bacillussp.dl-1划线到lb固体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％nacl，1.5％琼脂粉，溶剂为水；以上均为质量分数)上，37℃培养16h，然后挑取单菌落接种到100ml的lb液体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％nacl，溶剂为水；以上均为质量分数)中，200r/min，37℃培养12h，得到种子液，按1％v/v的接种量接种于lb液体培养基中培养，200r/min，37℃培养，每隔2h测定其生物量od-600nm，结果如图1所示。

实施例3：bacillussp.dl-1全细胞的制备

将bacillussp.dl-1的种子液按1％v/v的接种量接种于脱脂奶粉液体培养基(将10g高蛋白脱脂高钙奶粉(购于内蒙古伊利实业集团股份有限公司)溶于1l水，于115℃灭菌30min，冷却即得)进行发酵培养，200r/min，37℃培养24h(培养基变澄清)，得到发酵液，离心去上清液，细胞沉淀用ph＝7.2灭菌后的tris/hcl缓冲液洗涤三次，离心收集细胞沉淀即得bacillussp.dl-1全细胞。

实施例4：全细胞拆分(±)乙酸苏合香酯制备(r)-1-苯乙醇最适反应条件的表征

(1)反应效果评价标准及测定方法：反应生成的产物1-苯乙醇的对映体过量值(e.e.p)越大，底物转化率(c)越接近50％，反应效果越好。若不能同时满足时优先选择e.e.p更大的反应条件。反应产物通过乙酸乙酯从水相中萃取然后用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e.p和c。

公式1：公式2：

rnol和snol分别表示(r)-1-苯乙醇和(s)-1-苯乙醇的峰面积。r0和s0分别表示反应前对应构型的底物浓度；r和s分别代表反应后对应构型的底物浓度。

(2)反应条件：bacillussp.dl-1全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(r)-1-苯乙醇的最优反应条件为：反应体系包括细胞浓度48mg/ml(wcw)芽孢杆菌bacillussp.dl-1全细胞，50mm底物(±)-乙酸苏合香酯，5％(v/v)甲醇，其余为ph6.0的pb缓冲液，反应温度40℃，反应时间0.5h。最适条件下芽孢杆菌dl-1全细胞对(±)乙酸苏合香酯的选择性水解制备高光学纯的(r)-1-苯乙醇的反应前后气相色谱图见图2、图3。在上述最佳反应条件下制备得到的(r)-1-苯乙醇的对映体过量值(e.e.p)为96.6％，转化率为24.5％，产率为48.1％。

反应式表示如下：

实施例5：全细胞拆分(±)乙酸苏合香酯制备(s)-乙酸苏合香酯最适反应条件的表征

(1)反应效果评价标准及测定方法：底物乙酸苏合香酯的对映体过量值(e.e.s)越大，底物转化率(c)越接近50％，反应效果越好。若不能同时满足时优先选择e.e.s更大的反应条件。反应产物通过乙酸乙酯从水相中萃取然后用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e.s和c。

公式3：

sac和rac分别表示(s)-乙酸苏合香酯和(r)-乙酸苏合香酯的峰面积。

(2)反应条件：bacillussp.dl-1全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(s)-乙酸苏合香酯的最优反应条件为：反应体系包括细胞浓度60mg/ml(wcw)芽孢杆菌bacillussp.dl-1，50mm底物(±)-乙酸苏合香酯，5％(v/v)丙酮，其余为ph6.0的pb缓冲液，反应温度35℃，反应时间5h。最适条件下芽孢杆菌dl-1全细胞对(±)乙酸苏合香酯的选择性水解制备高光学纯的(s)-乙酸苏合香酯的反应前后气相色谱图见图2、图4。在上述最佳反应条件下制备得到的(s)-乙酸苏合香酯的对映体过量值(e.e.s)为98.4％，转化率为56.6％，产率为86.2％。

反应式表示如下：

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>芽孢杆菌dl-1的全细胞在催化拆分乙酸苏合香酯的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1434

<212>dna

<213>芽孢杆菌dl-1(bacillussp.dl-1)

<400>1

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