1.本发明涉及抗病毒药物筛选技术领域，具体地，涉及一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法，及相应的筛选用组合物。
背景技术：
2.人乙型肝炎病毒(hbv)感染是世界范围内的重要公共健康问题。急性乙肝病毒感染后，仍有8％左右发展为慢性乙肝感染，持续性hbv感染将导致肝硬化，甚至肝癌。我国是乙肝大国，乙肝病毒携带者接近1.3亿人，约占总人口的9％。尽管随着乙肝疫苗的大范围普及，新乙肝感染率得到有效控制，但乙肝携带人口基数大，防治乙肝成为我国公共健康问题的重中之重。乙肝传播途径主要通过垂直传播与水平传播。垂直传播是指母婴传播；水平传播主要通过血液传播。
3.尽管目前市场上有很多抗hbv药物，主要通过使用干扰素或者核苷类似物进行抗病毒治疗。其中核苷类似物通过抑制hbv复制过程中的逆转录酶活性从而抑制hbv产生。逆转录酶抑制剂虽然可以使患者控制乙肝病毒水平，但是随之产生的耐药性、巨额的医药费用、药物严重的副作用等问题也不容小觑。针对hbv本身进行从头抗病毒药物研究成为一种迫切需求。想要获得从头抗病毒药物，必须先建立一种合适的药物筛选方法。
4.现有的乙肝药物筛选方法包括细胞水平筛选方法和动物水平筛选方法等。
5.细胞水平筛选方法能够直观地以模型细胞为对象筛选治疗剂的抗乙肝病毒功效，应用最为广泛的hbv细胞模型是1986年sells等用重组载体pdolt-hbv-1(含2个hbv头对尾二聚体，以尾对尾方向串联)转染hepg2细胞，经g418筛选获得的高水平分泌hbeag及hbsag的hepg22.2.15细胞模型，hbv病毒在hepg22.2.15细胞内复制可持续很长时间，可传代培养维持达1年。该模型下的评价指标包括细胞内的hbv病毒dna(如cccdna、rcdna、dsnda)和rna(如mrna、pgrna)水平以及细胞培养液中的乙肝抗原(如hbeag、hbsag等)水平等，然而，细胞水平实验无法全面地体现待筛选药物的实际抗病毒功效，因为其忽视了药物在治疗患者体内的实际代谢过程、肝脏靶向性以及pk/pd等因素。在细胞水平筛选获得的优异治疗剂并不一定能够在患病对象体内同样有效。
6.动物水平筛选方法包括构建适当的动物模型，并通过体内筛选方法筛选抗乙肝病毒药物。人类hbv属于嗜肝dna病毒科，有较强的种属特异性，hbv自然条件下只感染人、非人灵长类(如黑猩猩等)及树鼩。近年来，由于遗传和免疫背景清楚、易于饲养等优点，小鼠逐渐受到研究人员的关注，成为构建hbv动物模型的最佳选择。研究人员亦建立了人-鼠肝嵌合体hbv小鼠模型，基因转染hbv小鼠模型及hbv转基因小鼠模型等，参见cn104862336a、cn107080757a等(其公开内容通过引用全部并入本文)。相比于细胞水平筛选方法，动物水平筛选方法能够更全面地体现乙肝药物在患者体内的实际功效，为临床乙肝药物筛选提供有力的依据。然而，当前的动物水平筛选方法依旧存在着诸多问题，例如难以实现高通量、多药物同时筛选，筛选效率较低；药物体内递送后缺乏肝靶向性(包括肝部靶向性和肝细胞靶向性)，治疗效率低下，且缺乏高灵敏度的检测标记，由此导致检测难度较大，药物筛选分
辨率低。
7.脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25-1000nm不等。脂质体可用于转基因技术，或用于制备药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。此外，利用肝、脾网状内皮系统的被动靶向性，脂质体可靶向肝部，如肝利什曼原虫药锑酸葡胺脂质体，其肝中浓度比普通制剂提高了200～700倍。将脂质体作为载体封装抗乙肝药物可潜在改善其肝靶向性，并利用其脂质双层与亲脂性细胞膜的相似性，协助将亲水性药物以及带电荷的dna等载入肝细胞内。然而，将脂质体技术直接用于抗乙肝药物的高通量体内筛选尚无文献报道。
8.综上所述，现有技术中存在着开发一种能够高通量筛选抗乙肝药物的体内筛选方法以及相应筛选组合物的迫切需求。
技术实现要素：
9.本发明通过设计一种基于脂质体载体的筛选组合物而解决了上述问题。
10.在一个方面中，本发明提供了一种用于筛选乙肝治疗剂的组合物，其包括至少一种载体，所述至少一种载体包括：(a)单细胞治疗有效量的至少一种待筛选乙肝治疗剂；(b)独特地识别所述至少一种乙肝治疗剂的一个或多个核酸条码；和(c)任选的标记。
11.在一些实施方式中，所述至少一种载体是1-5000种类型的载体。在一些实施方式中，所述至少一种载体是1-4000种类型的载体。在一些实施方式中，所述至少一种载体是1-2000种类型的载体。在一些实施方式中，所述至少一种载体是1-500种类型的载体。在其他实施方式中，所述至少一种载体是1-200种类型的载体。在其他实施方式中，所述至少一种载体是1-10种类型的载体。在其他实施方式中，所述至少一种载体是1-5种类型的载体。在其他实施方式中，所述至少一种载体是1-4种类型的载体。
12.在另一实施方式中，组合物进一步包括至少一种对照载体，所述对照载体不含乙肝治疗剂并且包括独特地识别所述对照载体的一个或多个核酸条码。
13.在一些实施方式中，所述治疗有效量基本上是单细胞治疗有效量。在另一实施方式中，所述治疗有效量足以调节单细胞的状态。在另一实施方式中，所述调节单细胞的状态选自调节受感染肝细胞的增殖、分化、衰老或凋亡等细胞活动的状态，以及受感染肝细胞内乙肝病毒的功能或活性。在一个实施方式中，评价所述乙肝病毒的功能或活性包括以下指标：hbv dna、hbv rna、hbeag、hbsag、cccdna等。
14.在另一实施方式中，所述核酸条码分子的长度为5-1000个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸条码分子的长度为5-500个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸条码分子的长度为5-400个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸条码分子的长度为5-300个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸条码分子的长度为5-250个核苷酸。在另一实施方式中，所述核酸条码分子的长度为15-200个核苷酸。
15.在另一实施方式中，所述核酸分子包括基本上不与所述细胞的核酸一致或互补的序列。在另一实施方式中，所述核酸分子不进入细胞核。在另一实施方式中，所述核酸分子不含能够进入细胞核的成分(诸如核定位信号(nls)或核运载体)。
16.在另一实施方式中，所述任选的标记(如，示踪物)选自荧光团、发色团、化学发光
分子、磁性颗粒或染料、金属、稀土和放射性同位素。在一些实施方式中，所述标记用于筛选和/或检测成功由所述载体靶向的肝细胞。在一些实施方式中，所述标记进一步用于检测所述乙肝治疗剂的活性。
17.在另一实施方式中，所述至少一种载体具有至多250nm(纳米)的直径。在另一实施方式中，所述至少一种载体具有至少50nm的直径。在另一实施方式中，所述至少一种载体是脂质基颗粒。在另一实施方式中，所述至少一种载体选自脂质体。
18.在另一实施方式中，配制所述组合物用于全身施用。
19.在另一方面中，提供了一种用于在患病对象中筛选乙肝治疗剂功效的方法，其包括以下步骤：
20.(a)向所述对象施用一种用于筛选乙肝治疗剂的组合物，其包括至少一种载体，所述至少一种载体包括：单细胞治疗有效量的至少一种待筛选乙肝治疗剂，独特地识别所述至少一种乙肝治疗剂的一个或多个核酸条码，和任选的标记；
21.(b)获得包括来自所述对象的肝细胞的样品；和
22.(c)通过独特的条码识别包括多种类型的载体的肝细胞中所述至少一种治疗剂的功效；由此在患病对象中筛选乙肝治疗剂功效。
23.在一些实施方式中，所述施用为静脉注射并且所述组合物包括每个所述对象肝的单细胞1-200个载体。
24.在另一实施方式中，所述方法进一步包括测序所述核酸分子的步骤。在另一实施方式中，所述方法进一步包括扩增所述核酸分子的步骤。
25.在另一实施方式中，在步骤(c)之前将所述样品分解为单细胞悬浮液。在另一实施方式中，使用选自下列的方法分选所述样品的所述细胞：facs、磁珠分选、酶联免疫吸附测定(elisa)、基于微流体的分选、基于细胞张力的分选等。
26.在第三方面中，提供了根据第一方面和/或第二方面的组合物在制备乙肝治疗剂筛选试剂盒中的用途。
27.本发明的技术方案具有以下有益的技术效果：
28.1、利用脂质体等载体的肝细胞靶向性，将待筛选的治疗剂以及核酸条码分子高效靶向载入肝细胞，且避免了循环系统对上述分子的代谢破坏。
29.2、利用核酸条码分子和任选的标记分子对不同待筛选治疗剂进行“唯一”的独特标记，通过上述分子建立细胞内特定治疗剂浓度(量)与治疗效果(抗病毒评价指标)之间的关联，从而实现单细胞水平上的微量、高灵敏度的治疗剂功效筛选。
30.3、通过在组合物中引入多种不同治疗剂或治疗剂的组合，可实现对多种不同治疗剂的同时、高通量筛选，大大提高筛选效率。
31.4、依托于已有的动物模型等体内模型，可以实现体内筛选，筛选结果更能反应治疗剂的实际抗乙肝病毒功效。
32.通过下文中给出的详细描述，本发明的进一步实施方式和全部范围将变得显而易见。然而，应当理解，虽然详细描述和具体实例指示本发明的优选实施方式，但是其仅通过说明的方式给出，因为根据详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员将变得显而易见。
具体实施方式
33.本发明提供了一种用于筛选乙肝治疗剂的组合物，其包括至少一种载体，所述至少一种载体包括：(a)单细胞治疗有效量的至少一种待筛选乙肝治疗剂；(b)独特地识别所述至少一种乙肝治疗剂的一个或多个核酸条码；和(c)任选的标记。本发明还提供了使用所述组合物的筛选方法。
34.在一些实施方式中，每个载体包含极低剂量的乙肝治疗剂，其足以仅治疗一个肝细胞且远在全身治疗阈值以下。
35.在一些实施方式中，至少一种乙肝治疗剂和核酸条码分子被封装在至少一种载体内。在其中载体进一步包括标记的实施方式中，至少一种乙肝治疗剂、核酸条码分子和标记被封装在至少一种载体内。
36.治疗剂
37.在一些实施方式中，所述治疗有效量是基本上单细胞治疗有效量。
38.如本文中所使用，“治疗有效量”或“有效量”指在剂量下有效并且持续所需时间周期以实现期望的治疗结果的量。乙肝治疗剂的治疗有效量将取决于障碍或症状的性质并取决于特定的试剂，且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。
39.如本文中所使用，“单细胞治疗有效量”指足以在单细胞内实现期望的治疗结果的有效量。在具体实施方式中，与治疗剂的最小有效剂量(med)相比，所述治疗剂的所述单细胞治疗有效量是试剂的相当低的剂量。在一些实施方式中，与所述治疗剂的最小有效剂量(med)相比，所述单细胞治疗有效量为至多0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％的试剂。在一些实施方式中，“单细胞治疗有效量”指足以在单细胞内实现期望的治疗结果的最小有效量。该量可以不同，取决于细胞类型、药物类型和/或治疗的持续时间。
40.在另一实施方式中，所述单细胞治疗有效量基本上足以调节单细胞的状态或在单细胞内实现期望的治疗结果。在另一实施方式中，所述治疗有效量不大于足以调节单细胞的状态或在单细胞内实现期望的治疗结果的量的50％、40％、30％、20％或10％。
41.治疗结果可以是，如，减轻症状、延长存活、提高移动性等。治疗结果不需要是“治愈”。治疗结果也可以是预防性的。
42.在另一实施方式中，所述调节单细胞的状态选自选自调节受感染肝细胞的增殖、分化、衰老或凋亡等细胞活动的状态，以及受感染肝细胞内乙肝病毒的功能或活性。在一个实施方式中，评价所述乙肝病毒的功能或活性包括以下指标：hbv dna、hbv rna、hbeag、hbsag、cccdna等。
43.在一些实施方式中，所述至少一种乙肝治疗剂不能跨越肝细胞膜。在所述实施方式中，如与治疗单细胞的浓度相比，所述治疗有效量可以处于较高浓度。不能跨越细胞膜的乙肝治疗剂的实例包括但不限于rna(如rnai等)和亲水性药物。
44.核酸条码
45.在一个实施方式中，核酸条码分子(诸如dna链)呈现未限制数目的条码化选择。如贯穿本发明所使用，“条码”、“dna条码”彼此均是可互换的并且具有相同的含义。作为dna条码的本发明的核酸分子是脱氧核酸或核糖核酸或两者的聚合物，并且可以是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然或修饰的核苷酸碱基。在一些实施方式中，比如，利用生物素、放射性标记或荧光标记对核酸分子进行标记。
46.如本领域技术人员所应当理解的，将独特的dna条码并入治疗剂载体(封装)允许使用测定识别单个乙肝治疗剂，识别包括但不限于微阵列系统、pcr，核酸杂交(包括“印迹”)或高通量测序。
47.在一些实施方式中，通过在本发明的载体(例如脂质体)内封装dna条码实现使带负电荷的dna条码渗透通过细胞的带负电荷的脂质双层。
48.在一些实施方式中，核酸分子的序列不包括与天然存在于环境中或特定地天然存在于被本发明的方法和组合物靶向的所述细胞中的材料/物质/颗粒相关的序列、模式、特征或任何其他核酸序列。在另外的实施方式中，核酸分子的序列不含超过10个碱基的核苷酸序列。在另一实施方式中，所述核酸分子包括与所述细胞的基因组材料基本上不一致或互补的序列(诸如预防核酸分子与细胞的基因组材料的杂交，和/或预防假阳性扩增结果)。
49.在一些实施方式中，所述核酸序列可以进一步作为分子信标。所述核酸序列通常可以是单链分子，诸如发夹形状。所述核酸分子可以用于检测细胞中的互补基因，诸如用于检测细胞内部的基因突变。在一些实施方式中，所述核酸具有与带有突变的序列互补的序列。
50.在实施本发明的筛选方法之后，独特核酸条码适合用于识别载体内对应的至少一种乙肝治疗剂。用于检测核酸序列的存在和识别的方法对技术人员是已知的并且包括能够增强多个条码存在的测序和阵列(如，微阵列)系统(如，由ilumina inc.市售的)。
51.在一些实施方式中，诸如当期望增加的准确性时，核酸分子具有适合测序和/或扩增试验(如pcr)的长度。在另一实施方式中，所述核酸分子具有适合装载入本发明的载体的长度，优选地在纳米级。应当理解，所述核酸分子的长度取决于在本发明的组合物和方法中使用的载体的类型和大小(如，较短的序列适合用于纳米颗粒，而较长的序列可以用于微粒)。
52.在另一实施方式中，所述核酸分子具有至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多190、至多180、至多170、至多160、至多150、至多140、至多130或至多120个碱基的长度，其中每种可能性表示本发明的单独的实施方式。在另一实施方式中，所述核酸分子具有至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个碱基、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个碱基、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少200、至少300、至少400或至少500个碱基的长度，其中每种可能性表示本发明的单独的实施方式。
53.核酸长度的非限制性实例包括但不限于5-50个碱基、5-40个碱基、5-30个碱基、5-25个碱基、5-24个碱基、5-23个碱基、5-22个碱基、5-21个碱基、5-20个碱基、5-19个碱基、5-18个碱基、5-17个碱基、5-16个碱基或5-15个碱基、15-50个碱基、15-60个碱基、15-70个碱基、15-80个碱基、15-90个碱基、15-100个碱基、15-200个碱基、15-250个碱基或15-500个碱基。
54.在另一实施方式中，每个载体内所述核酸分子具有每载体或每靶细胞一个或多个链的浓度。很好地确定核酸分子的量在本领域技术人的能力范围内。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是1-10000个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分
子是1-1000个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是1-5000个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是1-500个核酸分子。在另一实施方式中，所述一个或多个核酸分子是5-500个核酸分子。本领域技术人员将理解可以预先确定每个颗粒中核酸分子的量以便适合执行的具体试验，如测序和/或扩增试验。
55.根据一些实施方式，每种颗粒包括独特的条码。本领域技术人员将理解，利用独特的条码来条码化每种颗粒(即，载体)可以指示进入单细胞的颗粒的量。在一些实施方式中，本发明提供确定用于治疗乙肝疾病的治疗剂量的方法，其包括向对象施用包括多种类型的载体的组合物，其中每种类型的载体包括一种或多种治疗剂，其中在所述一种或多种治疗剂的剂量中每种类型的载体不同。
56.在另一实施方式中，组合物内的所述载体进一步包括用于可操作地使用所述核酸分子作为细胞内的条码的另外的试剂(如化学或生物试剂)。所述试剂的非限制性实例包括dna酶或rna酶，诸如防止分别被dna或rna条码的内源或外源酶降解。
57.在一个实施方式中，每细胞存在1-5种类型的载体(例如，条码化脂质体)/细胞。在另一实施方式中，每细胞存在1-5种类型的载体提供足够的数据和高的信噪比(snr)。在另一实施方式中，分析每细胞包括1-5种类型的载体的细胞。在另一实施方式中，分析每细胞包括1-4种类型的载体的细胞。
58.在一个实施方式中，每肝细胞经由静脉注射施用1-200个颗粒。在另一实施方式中，每肝细胞经由静脉注射施用1-300个颗粒。在另一实施方式中，每肝细胞经由静脉注射施用1-400个颗粒。在另一实施方式中，每肝细胞经由静脉注射施用1-500个颗粒。在另一实施方式中，每肝细胞经由静脉注射施用1-1000个颗粒。
59.标记
60.在另一实施方式中，本发明的一种或多种载体任选地包括至少一种标记或可检测的部分。在一些实施方式中，对于所有载体使用同一标记。在其他实施方式中，对于载体的子集使用独特的标记。
61.可用于本发明的组合物和方法的标记包括但不限于荧光团、发色团、化学发光分子、放射性标记物、金属、稀土元素、磁性颗粒或染料。
62.在一些实施方式中，标记或可检测的部分是在试验中有用的标记，其包括但不限于免疫测定，诸如elisa，珠基、芯片基或平板基多重免疫测定、质谱法、电泳、免疫比浊法、酶促测定、比色或荧光测定，如通过光度计可评估的，和基于荧光相关细胞分选(facs)的分析或通过其他临床建立的测定。所有这些方法对本领域技术人员是已知的，且在文献中描述。
63.通常，标记的量将取决于待执行的测定，并且可通过本领域技术人员的能力确定，并且很好地在本领域技术人员能力下。在一些实施方式中，载体包括所述标记的一个分子或多个分子。
64.载体
65.在一些实施方式中，所述至少一种载体是脂质基颗粒。在另一实施方式中，所述脂质基颗粒是脂质体。
66.在一个实施方式中，载体(如，脂质体)的直径小于500nm，以促进其通过胞外基质进入细胞。在一个实施方式中，载体(如，脂质体)的直径小于400nm，以促进其通过胞外基质
进入细胞。
67.在另一实施方式中，载体(如，脂质体)的直径为至少1nm、至少5nm、至少10nm、至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少1500nm、至少200nm、至少250nm或至少300nm。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。
68.在一些实施方式中，用于静脉施用的载体的直径为5-250nm。在一些实施方式中，其中用于静脉施用的载体是脂质体，载体的直径为40-250nm。
69.在一个实施方式中，可以选择和/或制备载体以优化治疗剂和核酸分子(dna条码)至靶细胞的递送。例如，对于本发明所述的靶细胞是肝细胞的情形，可以优化转移载体的性质(如，大小、电荷和/或ph)以向靶细胞有效递送这样的载体。
70.脂质体并入的治疗剂、核酸和/或标记可以完全地或部分地位于脂质体的内部空间，在脂质体的双层膜内。将试剂并入脂质体在本文中也称为“封装”，其中试剂被完全包含在脂质体的内部空间内。将试剂并入载体如脂质体的目的常常是为了保护试剂不受环境损害，环境可能包含降解试剂(如，核酸)的酶或化学试剂和/或引起试剂的快速排泄的系统或受体。因此，在本发明的优选实施方式中，选择的转移载体能够增强乙肝治疗剂和核酸条码分子以及任选地包含在其中的标记的稳定性。脂质体可以使封装的试剂到达靶细胞和/或可以优先使封装的试剂到达靶细胞，或可选地限制试剂至其它不期望的靶部位或细胞的递送。
71.在一些实施方式中，载体促进封装的治疗有效量的至少一种治疗剂、独特地识别至少一种治疗剂的核酸分子和任选的标记渗透至细胞。在一些实施方式中，通过封装在载体内，能够使治疗有效量的至少一种治疗剂、独特地识别至少一种治疗剂的核酸分子和任选的标记渗透至细胞。
72.在另一实施方式中，所述至少一种载体是纳米脂质体。纳米脂质体能够通过提高生物活性试剂的溶解度和生物利用率、体内外稳定性，以及避免他们与其他分子的不希望的相互作用来增强他们的性能。纳米脂质体的另一优点是细胞特异性靶向，其是获得靶细胞中最优治疗效果同时最小化对健康细胞和组织的副作用所需的药物浓度的先决条件。
73.本发明的组合物中使用的脂质体载体可以通过目前在本领域内已知的各种技术来制备。多层小泡(mlv)可以通过常规技术来制备，例如，通过在合适的溶剂中溶解脂质然后蒸发溶剂以在器皿的内部上留下薄膜或通过喷雾干燥而在适合的容器或器皿的内壁上沉积选择的脂质。然后可以利用涡流运动将水相添加至器皿，其可以导致mlv的形成。然后可以通过均化、超声或挤出多层小泡来形成单层小泡(ulv)。另外，可以通过洗涤剂去除技术来形成单层小泡。
74.在某些实施方式中，本发明的组合物可以装载有诊断放射性核素、荧光材料或体外和体内应用二者中可检测的其他材料。
75.在一些实施方式中，本发明的载体包括40-70％mol的形成脂质体的脂质。在一些实施方式中，本发明的载体包括20-50％mol的胆固醇。在一些实施方式中，本发明的载体包括4-8％mol的peg-脂质。在一些实施方式中，本发明的载体包括0-3％mol的功能脂质(如，阳离子脂质或具有靶向部分的脂质)。根据具体实施方式，包括40-70％mol的形成脂质体的脂质、20-50％mol的胆固醇、4-8％mol的peg-脂质和0-3％mol的功能脂质的纳米颗粒适合
用于静脉施用。
76.乙肝治疗剂筛选用途
77.根据一些实施方式，提供了用于筛选乙肝治疗剂的包括多种载体的组合物，多种载体独立地包括治疗有效量的至少一种乙肝治疗剂，独特地识别所述至少一种乙肝治疗剂的核酸条码分子，以及任选的标记。
78.根据一些实施方式，提供了一种用于在患病对象中筛选乙肝治疗剂功效的方法，其包括以下步骤：
79.(a)向所述对象施用一种用于筛选乙肝治疗剂的组合物，其包括至少一种载体，所述至少一种载体包括：单细胞治疗有效量的至少一种待筛选乙肝治疗剂，独特地识别所述至少一种乙肝治疗剂的一个或多个核酸条码，和任选的标记；
80.(b)获得包括来自所述对象的肝细胞的样品；和
81.(c)通过独特的条码识别包括多种类型的载体的肝细胞中所述至少一种治疗剂的功效；由此在患病对象中筛选乙肝治疗剂功效。
82.在另一实施方式中，所述方法进一步包括测序所述核酸分子的步骤。在另一实施方式中，所述方法进一步包括扩增所述核酸分子的步骤。用于扩增和测序核酸的方法对本领域技术人员是熟知的。
83.在另一实施方式中，在确定功效之前所述样品被分解为单细胞悬浮液。将细胞样品分解为单细胞悬浮液的方法在本领域内是已知的并且可以包括例如gentlemacs
tm
组织处理器(dissociator)。
84.在另一实施方式中，所述方法进一步包括细胞分选步骤。细胞分选的方法在本领域内是众所周知的并且包括但不限于facs、磁珠分选、elisa、基于微流体的分选、基于细胞张力的分选等。根据优选实施方式，通过分选肝脏靶细胞和使细胞状态与dna条码相关联来分析每种乙肝治疗剂的活性。在另外的实施方式中，该方法能够针对它们的病人特异性和细胞特异性活性筛选多种药物。
85.在实施方式中，本文中公开的方法包括提供持续的时间量的治疗剂以执行其治疗活性。在取样靶细胞之前的持续的时间量将取决于障碍或症状的性质，和取决于特定试剂，并且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。作为非限制性实例，持续的时间量包括在施用组合物后大约24、大约30、大约48小时，或超过24小时。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，为了避免细胞内部条码的dna酶降解，持续的时间量小于72小时。
86.在另一实施方式中，所述组合物被配制用于全身施用。在另一实施方式中，所述全身施用为静脉注射。
87.如本文中所使用，术语“对象”指本发明的组合物和方法被施用至其的任何动物(如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长类、啮齿类等。在一些实施方式中，关于人类对象，术语“对象”和“病人”在本文中可交换地使用。在其他实施方式中，关于非人类对象，术语“对象”和“病人”在本文中可交换地使用。在特定实施方式中，所述对象包括动物模型。
88.如本文中所使用，当与值组合时，术语“大约”指参考值的正负10％。例如，大约1000纳米(nm)的长度指1000nm+-100nm的长度。
89.在查阅了下面的实施例之后，本发明的另外的目的、优势和新特征对本领域普通技术人员将变得显而易见，其不旨在限制性的。
90.实施例
91.实施例1人源化乙型肝炎鼠模型构建
92.人源化乙型肝炎鼠模型的具体制备步骤为：
93.一、获取人干细胞
94.1、分离培养人干细胞
95.1)获得纯化人干细胞。
96.2)干细胞培养，传代。
97.3)培养于20℃-40℃，2％-10％co2的培养箱中。
98.2、获取商品化的分离或冻存的人干细胞或细胞系。
99.二、干细胞移植入肝损伤的鼠
100.1、获得不同品系的实验鼠，实验鼠包括正常小鼠、免疫缺陷小鼠、正常大鼠和免疫缺陷大鼠。
101.2、通过腹腔、肌肉、外周静脉注射、口服或灌胃的方式予以肝损药物，或予以外科部分肝切除术，建立肝损伤鼠模型。
102.3、通过外周静脉、门静脉、脾脏或肝脏注射的方式移植1
×
10
4-8
干细胞。
103.三、hbv感染人源性鼠
104.通过外周静脉、皮下、肌肉或腹腔每只鼠注射乙型肝炎病毒。
105.实施例2脂质体合成/制备/转染
106.使用本领域内已知的方法制备脂质体。将hspc、peg-dspe和胆固醇58％、2％、40％溶解在纯的乙醇中并在65℃下加热直到完全溶解。
107.合成空白脂质体：脂质体包含下列的脂质组合物：58％mol的氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、mw 762.1；2mol％的聚乙二醇二硬脂酰-磷酸乙醇胺(m2000peg dspe)——其作用是降低脂质体由于空间效应的聚集/融合，mw 2805.54；和40mol％的胆固醇mw 386.65。溶液中总脂质的工作浓度为50mm。培养基为去离子水中10％pbs/5％葡萄糖。首先，将脂质溶解在纯乙醇中，升温至65℃并加入至1ml的培养基(也升温至相同的温度)。在直接注入和移液之后，加入更多培养基以达到最终的脂质浓度。氢化大豆磷脂酰胆碱由lipoid贡献(ludwigshafen，germany)；m2000peg-dspe从avanti(alabaster，alabama，usa)购买和胆固醇(分类号：c8667-500mg)来自sigma(rehovot，israel)。
108.合成载治疗剂脂质体：参考以上空白脂质体的合成方法，区别在于在乙醇溶解过程中一并引入待筛选乙肝治疗剂的不同浓度系列稀释液。加热乙醇中脂质组分和治疗剂直至完全溶解，采用共焦/细胞观测仪等检测封装百分比。
109.dna封装：25毫微摩且脱盐的ssdna寡聚物从sigma&idt(leuven belgium)购买，其具有50-120个碱基对的长度范围。在两个ssdna的退火之后，将原液稀释至100μm并分为100微升(μl)的等分试样。对于5ml的脂质溶液，在添加溶解的脂质(对于3ml-150μl的dsdna)之前，将300μl的dsdna加入至1ml的培养基溶液。在封装之后，使用挤出机生产200nm的脂质体。
110.挤出过程：通过400nm和200nm的膜挤出脂质溶液3次。挤出机温度被设置为65摄氏
度(℃)。
111.经由dls的粒径确定粒径(动态光散射)——在挤出之后，通过dls进行大小确定。pdi范围在0.003-0.08之间。
112.体内转染：向人源化乙型肝炎鼠模型中静脉注射100μl的脂质体溶液。36小时之后，处死小鼠并在冰内取其肝脏用于进一步步骤。
113.dna提取：利用胰蛋白酶使细胞与板分离并转移入1.5ml的eppendorf管。在1200rpm下离心细胞7min，并且丢弃胰蛋白酶。使用bligh和dyer试验进行dna提取；添加167μl的1∶2氯仿：甲醇(v/v)、55.5μl的氯仿、和100μl的去离子水。在1000rpm离心5min后，收集上部水相。
114.dna扩增：在循环变温器(“daniel biotech”)中使用50μl的反应中预混合物(ready mix)(“ornat”)来扩增dsdna。经过pcr，将溶液装载至3％(w/w)的琼脂糖凝胶(“hy-labs”)并进行25min。
115.rt-pcr：在dna提取之后，在rt-pcr循环变温器(“bio rad”)使用taqman探针扩增和分析链。
116.细胞分选：取具有106/ml的浓度的15ml的细胞悬浮液至流动活化细胞分选仪(facs-aria)。对细胞设门(gating)后，它们被分选为1,000个细胞、100个细胞、10个细胞和单个细胞。所有细胞被分选入聚丙烯的圆锥透明96孔。在分选之后，进行b&d和pcr。
117.细胞稀释：将细胞悬浮在1ml的培养基中并计数。下一步是在900μl的pbsx1中一系列稀释，至多103细胞-100μl。每个稀释为再稀释10倍，从而得到103、102和10个细胞：10μl至90μl的去离子水。最终，为了在理论上得到单细胞，从100个细胞稀释取1μl放入99μl的pbsx1。
118.共焦/细胞观测仪：dna封装——使用上面描述的方法制备包含fam缀合dna的脂质体。在10％pbs(膜类型)上透析脂质体持续24小时。分别地利用dls(制造)激发和发射566-345nm测量透析之前和之后的样品(三份)的荧光。再分透析之后和之前的荧光值以给出封装百分比。
119.单细胞治疗有效量确定：单细胞治疗有效量的确定可以受感染肝细胞的凋亡等为指标。将包含不同稀释浓度乙肝治疗剂的条码化脂质体静脉注射入人源化乙型肝炎鼠模型中，36小时之后，处死小鼠并在冰内取其肝脏。将肝脏组织解离为单细胞悬浮液，并根据它们的生存力(凋亡/未凋亡)筛选细胞，基于统计学方法确定特定乙肝治疗剂的单细胞治疗有效量，以上试验一式三份进行。