本发明属于污水处理技术领域，特别涉及一种污水中厌氧氨氧化红菌分离纯化方法。
背景技术：
水体富营养化是指水生生物所需氮磷等营养物质大量进入湖泊，当其浓度超过一定数值引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，快速消耗水中溶解氧，导致水质恶化乃至生物死亡的现象。其中氮元素过高是引起水体富营养化的重要原因。因此污水在排放前需要脱氮。传统的脱氮方式是采用生化方式中的ao工艺。使用硝化菌将氨转换成亚硝酸盐或硝酸盐，然后反硝化菌再将其还原成氮气。硝化过程的微生物需要氧气，因此一些机器就要耗费大量的电来为这些污泥进行曝气，不但如此，反硝化过程还需要外碳源，例如甲醇。
厌氧氨氧化水处理工艺缩短了传统的氮循环途径，具有高效、节能、环保的特点，其原理是厌氧氨氧化菌在生长过程中以铵盐作为电子供体，以亚硝酸盐/硝酸盐作为电子受体，同步进行硝化反硝化作用，不消耗有机物，污泥产率低，尤其适合于处理高氨氮、低c/n的废水处理。
尽管厌氧氨氧化工艺具有高效脱氮、运行成本低等优势，但是由于氨氧化菌生长速度慢，培养条件苛刻，如何在较短时间内获得足够的厌氧氨氧化菌成为厌氧氨氧化工艺高效运行的关键所在，如果要获得足够数量的厌氧氨氧化菌，则需要对其进行分离，然后针对不同的厌氧氨氧化菌进行不同条件的单独培养，目前国内外尚未公开厌氧氨氧化菌分离纯化方法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种污水中厌氧氨氧化红菌分离纯化方法。该方法具有工艺简单、操作方便、材料易得、针对性强，对操作人员及设备要求较低、经济实用、分离纯化速度快和成功率高的优点。
本发明的目的公开了一种污水中厌氧氨氧化红菌分离纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)厌氧氨氧化红菌富集培养基的制备
将富集培养基溶于蒸馏水中，调节ph7.5～8，分装到医用注射瓶中，每瓶分装7ml，压帽；置于沸水中30-50min，灭菌。
其中，富集培养基配方为碳酸氢钠质量浓度0.2％～0.3％、蛋白胨质量浓度0.2％～0.3％、氯化铵质量浓度0.1％～0.2％、亚硝酸钠质量浓度0.1％～0.2％、氯化钙质量浓度0.1％～0.2％、氯化镁质量浓度0.05％～0.1％、微量元素溶液体积浓度1％～2％。
其中微量元素溶液：硫酸锌0.2g，硫酸亚铁0.5g，硫酸锰0.06g，维生素c1g，维生素b121g，蒸馏水1000ml。
(2)厌氧氨氧化红菌分离培养基的制备
将分离培养基溶于蒸馏水中，调节ph7.5～8，加热溶解，分装到医用注射瓶中，每瓶分装7ml，压帽；置于沸水中30-40min，灭菌。
其中，分离培养基配方为碳酸氢钠质量浓度0.2％～0.3％、氯化铵质量浓度0.1％～0.2％、亚硝酸钠质量浓度0.1％～0.2％、氯化钙质量浓度0.1％～0.2％、氯化镁质量浓度0.05％～0.1％、琼脂粉质量浓度0.6％～1％。
(3)厌氧氨氧化红菌的富集培养
取污水处理厂红色污泥注入上述制备好的富集培养基中，25℃～55℃恒温培养至培养液变红为止，得到富集培养物。
所述的红色污泥与富集培养基的质量比为1∶20-30。
(4)厌氧氨氧化红菌的分离培养
取0.77ml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10-4，将10-3和10-4梯度的稀释液用1ml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述50℃～55℃未凝固的分离培养基中，缓慢滚动混合均匀，垂直静置放置0.5h～1h得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为25℃～55℃，培养至培养基中出现红点为止，得到分离培养物。
(5)厌氧氨氧化红菌的纯化培养
用1ml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的红点，然后注入富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，培养温度25℃～55℃，培养3d～7d直到培养液变红，得到纯化培养物。
所述的红色污泥其现场采集后进行密封处理在4℃下保藏不超过7d。
所述的医用注射瓶体积为7～18ml，装液体积为90％～95％。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)工艺简单、操作方便、材料易得、针对性强，对操作人员及设备要求较低；
(2)针对性强，本方法只适合进行厌氧氨氧化红菌菌种分离纯化；
(3)分离纯化的速度快，从厌氧氨氧化红菌富集和分离培养基的制备到纯化培养物只需要3～5d；
(4)分离纯化的成功率高，一次分离纯化既可得到纯化培养物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)厌氧氨氧化红菌富集培养基的制备
将富集培养基溶于蒸馏水中，调节ph8，分装到7.8ml的医用注射瓶中，每瓶分装7ml，压帽。置于沸水中30min，灭菌。其中，富集培养基配方为碳酸氢钠质量浓度0.2％、蛋白胨质量浓度0.2％、氯化铵质量浓度0.1％、亚硝酸钠质量浓度0.1％、氯化钙质量浓度0.1％、氯化镁质量浓度0.05％、微量元素溶液体积浓度1％。
其中微量元素溶液：硫酸锌0.2g，硫酸亚铁0.5g，硫酸锰0.06g，维生素c1g，维生素b121g，蒸馏水1000ml。
(2)厌氧氨氧化红菌分离培养基的制备
将分离培养基溶于蒸馏水中，调节ph7.5，加热溶解，分装到医用注射瓶中，每瓶分装7ml，压帽。置于沸水中30min，灭菌。其中，分离培养基配方为碳酸氢钠质量浓度0.2％、氯化铵质量浓度0.1％、亚硝酸钠质量浓度0.1％，氯化钙质量浓度0.1％、氯化镁质量浓度0.05％、琼脂粉质量浓度0.6％。
(3)厌氧氨氧化红菌的富集培养
取某污水处理厂红色污泥0.2g注入上述制备好的富集培养基中，55℃恒温培养至培养液变红为止，得到富集培养物。
(4)厌氧氨氧化红菌的分离培养
取0.77ml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10-4，将10-3和10-4梯度的稀释液用1ml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述55℃未凝固的分离培养基中，缓慢滚动混合均匀，垂直静置放置1h得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为55℃，培养至培养基中出现红点为止，得到分离培养物。
(5)厌氧氨氧化红菌的纯化培养
用1ml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的红点，然后注入富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，培养温度55℃，培养3d直到培养液变红，得到纯化培养物。
所述的红色污泥其现场采集后进行密封处理在4℃下保藏5d。
所述的医用注射瓶体积为7ml，装液体积为90％。
实施例2
(1)厌氧氨氧化红菌富集培养基的制备
将富集培养基溶于蒸馏水中，调节ph7.5，分装到7.8ml的医用注射瓶中，每瓶分装7ml，压帽。置于沸水中50min，灭菌。其中，富集培养基配方为碳酸氢钠质量浓度0.3％、蛋白胨质量浓度0.3％、氯化铵质量浓度0.2％、亚硝酸钠质量浓度0.2％、氯化钙质量浓度0.2％、氯化镁质量浓度0.1％、微量元素溶液体积浓度2％。
其中微量元素溶液：硫酸锌0.2g，硫酸亚铁0.5g，硫酸锰0.06g，维生素c1g，维生素b121g，蒸馏水1000ml。
(2)厌氧氨氧化红菌分离培养基的制备
将分离培养基溶于蒸馏水中，调节ph7.5，加热溶解，分装到7.8ml的医用注射瓶中，每瓶分装7ml，压帽。置于沸水中40min，灭菌。其中，分离培养基配方为碳酸氢钠质量浓度0.3％、氯化铵质量浓度0.2％、亚硝酸钠质量浓度0.2％，氯化钙质量浓度0.2％、氯化镁质量浓度0.1％、琼脂粉质量浓度1％。
(3)厌氧氨氧化红菌的富集培养
取某污水处理厂红色污泥0.2g注入上述制备好的富集培养基中，25℃恒温培养至培养液变红为止，得到富集培养物。
(4)厌氧氨氧化红菌的分离培养
取0.77ml上述富集培养物用制备好的富集培养基按照10倍系列稀释法稀释至10-4，将10-3和10-4梯度的稀释液用1ml无菌注射器取0.1ml，分别缓慢注入至上述50℃未凝固的分离培养基中，缓慢滚动混合均匀，垂直静置放置1h得到透明的半固体培养基，然后置于恒温培养箱中培养，培养温度为25℃，培养至培养基中出现红点为止，得到分离培养物。
(5)厌氧氨氧化红菌的纯化培养
用1ml无菌注射器抽取0.2ml富集培养基，接着用该注射器吸入分离培养物中轮廓清晰的红点，然后注入富集培养基中，放置在恒温培养箱中培养，培养温度25℃，培养7d直到培养液变红，得到纯化培养物。
所述的红色污泥其现场采集后进行密封处理在4℃下保藏3d。
所述的医用注射瓶体积为18ml，装液体积为95％。