本发明属于农业微生物
技术领域：
，特别涉及一种缓解马铃薯连作障碍的微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：马铃薯又称土豆、洋芋、山药蛋等，其食用部位是地下块茎，富含淀粉和粗蛋白质，可粮菜饲兼用；工业上可生产淀粉、酒精等，是典型的高产作物，也是我国部分马铃薯主产区农民脱贫致富、增加收入的支柱产业。马铃薯是全球第四大粮食作物，中国是世界马铃薯总产最多的国家。连作障碍引起的土壤恶化、病害积累等一直是困扰马铃薯生产的一大障碍。近年来，随着马铃薯产业化程度的提高，连作问题更加突出。马铃薯连作障碍的发生，不仅影响马铃薯产量和品质，同时还降低了产品的安全性。因此，急需解决马铃薯连作障碍问题，从而实现马铃薯的高产、稳产。马铃薯连作障碍形成机制主要有土壤微生物变化、养分比列失调、土壤物理结构改变及植物自毒作用等，通过实施轮作、科学施肥等措施，可以缓解连作障碍对马铃薯生产的影响。目前马铃薯施用的肥料以化学肥料为主，造成土壤板结，肥力下降等问题；病虫害的防治主要采用化学农药，不仅易产生抗药性，还会造成严重的环境污染等问题。因此，为了解决的上述问题，本发明提供了一种复合微生物菌剂，该菌剂能够调节土壤微生物群落结构，提高土壤生态系统功能，缓解马铃薯的连作障碍，增强马铃薯抗土传病害能力，从而达到提高马铃薯产量和品质的目的。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种缓解马铃薯连作障碍的微生物菌剂及其制备方法和应用，由于本发明采用的为复合微生物菌剂，在连作土壤中添加有益微生物菌种，能够调节土壤微生物群落结构，提高土壤生态系统功能，缓解马铃薯的连作障碍，增强马铃薯抗土传病害能力，从而达到提高马铃薯产量和品质的目的。一种缓解马铃薯连作障碍的微生物菌剂，包括以下菌株：芽孢杆菌，荧光假单胞菌，灰黄青霉，木霉菌，放线菌；所述菌剂中的群落总数为：芽孢杆菌2.0×108-9.0×109cfu/g、荧光假单胞菌5.0×107-1.0×109cfu/g、灰黄青霉1.0×103-5.0×104cfu/g、木霉菌1.0×103-5.0×104cfu/g、放线菌5.0×108-8.0×1010cfu/g。优选地，所述菌剂中的群落总数为：芽孢杆菌4.0×108cfu/g、荧光假单胞菌5.0×108、灰黄青霉3.0×103cfu/g、木霉菌5.0×103cfu/g、放线菌3.0×1010cfu/g。优选地，所述芽孢杆菌包括菌种重量百分比为：枯草芽孢杆菌40-60％、多粘类芽孢杆菌10-15％、胶冻样芽孢杆菌5-10％、巨大芽孢杆菌5-10％、地衣芽孢杆菌5-25％。本发明采用的是复合菌剂，由多种微生物复合而成，不同菌具有不同的功能，功能相互补充且生长代谢中相互促进，应用上具有集团军作战的优势，功能性强，状态稳定。其中灰黄青霉对马铃薯连作常见的土传病害原菌茄病镰刀菌、大丽轮枝菌等有较强的抑制作用，同时，灰黄青霉素孢子包衣能提高薯块数和单株产量。芽孢杆菌对马铃薯干腐病菌、黑痣病菌等致病菌有拮抗作用。荧光假单胞菌在植物病害的生物防治中有着广泛地应用。嗜酸乳杆菌能够分解在常态下不易分解的木质素和纤维素，合成各种氨基酸，维生素、产生消化酶、促进新陈代谢，还有融化不溶性无机磷的能力。放线菌有固氮、解磷、释钾、抗病等功能，对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等有降解作用，放线菌也会促进固氮菌增殖，并且可以增加马铃薯株高，改善薯块商品性及土壤微生物种群结构，降低连作马铃薯发病率。木霉菌可直接杀死作物根部和土壤中的根结线虫和地下害虫，能消灭耕层土壤病菌及害虫，可抑制多种植物真菌病，如根腐病、立枯病、猝倒病、枯萎病等土传病害。微生物起到的作用主要是施入土壤后大量繁殖形成优势菌群，是靠菌量和活性来完成拮抗恶性菌、调节土壤、降解有机物等工作的，而本发明菌剂定殖率显著提高，均不低于50％，所以本发明菌剂达到的技术效果显著。上述所述的一种缓解马铃薯连作障碍的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)芽孢杆菌、、荧光假单胞菌或放线菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种接于装有100mllb培养基的250ml摇瓶中，30-40℃、150-180r/min活化培养20-26h，然后将活化的菌液按体积比8-10％的接种量接入装有500mllb培养基的1000ml摇瓶中，30-40℃、150-180r/min培养10-14h，得到种子液；将种子液按体积比8-10％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，30-40℃、150-180r/min发酵培养20-26h，获得发酵种子液，然后将发酵种子液按体积比8-10％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，30-40℃、150-180发酵培养46-48h，得到芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；(2)灰黄青霉或木霉菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种接入装有100ml马铃薯培养基的摇瓶中，25-30℃、150-180r/min活化培养20-26h，然后将活化的种子液按体积比6-8％的接种量接入装有500ml马铃薯培养基的1000ml摇瓶中，25-30℃、150-180r/min振荡培养20-26h得到种子液；将种子液按体积比6-8％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，25-30℃、150-180r/min发酵培养20-24h，得到发酵种子液，将发酵种子液按体积比6-8％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，25-30℃、150-180r/min发酵培养58-62h，得到灰黄青霉或木霉菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；(3)将所述步骤(1)得到的菌体与所述步骤(2)得到的菌体按群落数为：芽孢杆菌2.0×108-9.0×109cfu/g、荧光假单胞菌5.0×107-1.0×109cfu/g、灰黄青霉1.0×103-5.0×104cfu/g、木霉菌1.0×103-5.0×104cfu/g、放线菌5.0×108-8.0×1010cfu/g的比例混合，置于鼓风干燥箱或自然条件下干燥通风处，干燥，即得到该微生物菌剂。优选地，所述步骤(1)中种子罐和发酵罐中的发酵培养基为葡萄糖4-6g/l，蛋白胨9-12g/l，磷酸二氢钾9-12g/l，ph6.8-7.2，121℃实罐灭菌20min。优选地，所述步骤(2)中种子罐和发酵罐中的发酵培养基为玉米粉18-22g/l，蔗糖4-7g/l，ph5-6，121℃灭菌20min。连作马铃薯种植土壤大多数存在板结、酸化、物理性状改变和土传病害病原菌积累等问题，生物菌施入土壤中大多数不能成活，活下来的小部分繁殖也面临问题，并且一般长期使用化肥农药，使得土壤中恶性菌大量存在，有益生物菌施入菌量相对小，营养争夺和生态位点竞争比不过恶性菌，而通过本发明制备方法得到的菌种纯度高、活性强、菌量大在恶性土壤中存活率高。上述所述的一种缓解马铃薯连作障碍的微生物菌剂在缓解马铃薯连作障碍种植中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的马铃薯复合微生物菌剂施用后大量的有益菌补充到连作土壤中后，在马铃薯根系周围形成保护屏障，抑制有害菌的生长，繁殖，保护马铃薯根系，同时抑制各种病害病原物的发生和蔓延，从而提高马铃薯抗病害能力；活菌在根际定殖后，能够改善种植土壤生态环境，改良土壤结构和理化性质，降低连作障碍；(2)本发明的微生物菌剂能够为马铃薯生长提供营养，发酵过程中微生物产生多种有效代谢产物具有固氮、解磷、解钾的作用，从而提高马铃薯的产量和品质；(3)本发明的微生物菌剂，不污染环境，无毒副作用；现有技术中多种菌复合容易出现菌株之间相互抑制，影响生长的现象，本发明选择的菌株之间不会相互抑制，在定殖生长、功能效果上还能互补。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1(1)芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接于装有100mllb培养基的250ml摇瓶中，30℃、150r/min活化培养26h，然后将活化的菌液按体积比8％的接种量接入装有500mllb培养基的1000ml摇瓶中，30℃、150r/min培养14h，得到种子液；将种子液按体积比8％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，30℃、150r/min发酵培养26h，获得发酵种子液，然后将发酵种子液按体积比8％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，30℃、150r/min发酵培养48h，得到芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为葡萄糖4g/l，蛋白胨9g/l，磷酸二氢钾9g/l，ph6.8-7.2，121℃实罐灭菌20min；(2)灰黄青霉或木霉菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接入装有100ml马铃薯培养基的摇瓶中，25℃、150r/min活化培养26h，然后将活化的种子液按体积比6％的接种量接入装有500ml马铃薯培养基的1000ml摇瓶中，25℃、150r/min振荡培养26h得到种子液；将种子液按体积比6％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，25℃、150r/min发酵培养24h，得到发酵种子液，将发酵种子液按体积比6％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，25℃、150r/min发酵培养62h，得到灰黄青霉或木霉菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为玉米粉18g/l，蔗糖4g/l，ph5-6，121℃灭菌20min。(3)将所述步骤(1)得到的菌体与所述步骤(2)得到的菌体按比例混合，置于鼓风干燥箱或自然条件下干燥通风处，干燥，即可得到该微生物菌剂。所述菌剂中的群落总数为：芽孢杆菌2.0×108cfu/g、荧光假单胞菌5.0×107、灰黄青霉1.0×103cfu/g、木霉菌1.0×103cfu/g、放线菌5.0×108cfu/g；其中芽孢杆菌包括菌种重量百分比为：枯草芽孢杆菌40％、多粘类芽孢杆菌15％、胶冻样芽孢杆菌10％、巨大芽孢杆菌10％、地衣芽孢杆菌25％。实施例2(1)芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接于装有100mllb培养基的250ml摇瓶中，30℃、150r/min活化培养26h，然后将活化的菌液按体积比8％的接种量接入装有500mllb培养基的1000ml摇瓶中，30℃、150r/min培养14h，得到种子液；将种子液按体积比8％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，30℃、150r/min发酵培养26h，获得发酵种子液，然后将发酵种子液按体积比8％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，30℃、150r/min发酵培养48h，得到芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为葡萄糖4g/l，蛋白胨9g/l，磷酸二氢钾9g/l，ph6.8-7.2，121℃实罐灭菌20min；(2)灰黄青霉或木霉菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接入装有100ml马铃薯培养基的摇瓶中，25℃、150r/min活化培养26h，然后将活化的种子液按体积比6％的接种量接入装有500ml马铃薯培养基的1000ml摇瓶中，25℃、150r/min振荡培养26h得到种子液；将种子液按体积比6％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，25℃、150r/min发酵培养24h，得到发酵种子液，将发酵种子液按体积比6％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，25℃、150r/min发酵培养62h，得到灰黄青霉或木霉菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为玉米粉18g/l，蔗糖4g/l，ph5-6，121℃灭菌20min。(3)将所述步骤(1)得到的菌体与所述步骤(2)得到的菌体按比例混合，置于鼓风干燥箱或自然条件下干燥通风处，干燥，即可得到该微生物菌剂。所述菌剂中的群落总数为：芽孢杆菌3.0×109cfu/g、荧光假单胞菌5.0×108、灰黄青霉8.0×103cfu/g、木霉菌8.0×103cfu/g、放线菌4.0×109cfu/g；其中芽孢杆菌包括菌种重量百分比为：枯草芽孢杆菌45％、多粘类芽孢杆菌15％、胶冻样芽孢杆菌10％、巨大芽孢杆菌10％、地衣芽孢杆菌20％。实施例3(1)芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接于装有100mllb培养基的250ml摇瓶中，35℃、170r/min活化培养24h，然后将活化的菌液按体积比7％的接种量接入装有500mllb培养基的1000ml摇瓶中，35℃、170r/min培养12h，得到种子液；将种子液按体积比7％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，35℃、170r/min发酵培养24h，获得发酵种子液，然后将发酵种子液按体积比8％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，35℃、170r/min发酵培养47h，得到芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为葡萄糖5g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾10g/l，ph6.8-7.2，121℃实罐灭菌20min；(2)灰黄青霉或木霉菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接入装有100ml马铃薯培养基的摇瓶中，27℃、170r/min活化培养24h，然后将活化的种子液按体积比7％的接种量接入装有500ml马铃薯培养基的1000ml摇瓶中，27℃、170r/min振荡培养24h得到种子液；将种子液按体积比7％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，24℃、170r/min发酵培养22h，得到发酵种子液，将发酵种子液按体积比7％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，27℃、170r/min发酵培养60h，得到灰黄青霉或木霉菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为玉米粉20g/l，蔗糖5g/l，ph5-6，121℃灭菌20min。(3)将所述步骤(1)得到的菌体与所述步骤(2)得到的菌体按比例混合，置于鼓风干燥箱或自然条件下干燥通风处，干燥，即可得到该微生物菌剂。所述菌剂中的群落总数为：芽孢杆菌4.0×108cfu/g、荧光假单胞菌5.0×108、灰黄青霉3.0×103cfu/g、木霉菌5.0×103cfu/g、放线菌3.0×1010cfu/g；其中芽孢杆菌包括菌种重量百分比为：枯草芽孢杆菌50％、多粘类芽孢杆菌15％、胶冻样芽孢杆菌5％、巨大芽孢杆菌10％、地衣芽孢杆菌20％。实施例4(1)芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接于装有100mllb培养基的250ml摇瓶中，35℃、170r/min活化培养24h，然后将活化的菌液按体积比7％的接种量接入装有500mllb培养基的1000ml摇瓶中，35℃、170r/min培养12h，得到种子液；将种子液按体积比7％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，35℃、170r/min发酵培养24h，获得发酵种子液，然后将发酵种子液按体积比8％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，35℃、170r/min发酵培养47h，得到芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为葡萄糖5g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾10g/l，ph6.8-7.2，121℃实罐灭菌20min；(2)灰黄青霉或木霉菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接入装有100ml马铃薯培养基的摇瓶中，27℃、170r/min活化培养24h，然后将活化的种子液按体积比7％的接种量接入装有500ml马铃薯培养基的1000ml摇瓶中，27℃、170r/min振荡培养24h得到种子液；将种子液按体积比7％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，24℃、170r/min发酵培养22h，得到发酵种子液，将发酵种子液按体积比7％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，27℃、170r/min发酵培养60h，得到灰黄青霉或木霉菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为玉米粉20g/l，蔗糖5g/l，ph5-6，121℃灭菌20min。(3)将所述步骤(1)得到的菌体与所述步骤(2)得到的菌体按比例混合，置于鼓风干燥箱或自然条件下干燥通风处，干燥，即可得到该微生物菌剂。所述菌剂中的群落总数为：芽孢杆菌8.0×108cfu/g、荧光假单胞菌9.0×108、灰黄青霉1.0×104cfu/g、木霉菌1.0×104cfu/g、放线菌5.0×109cfu/g；其中芽孢杆菌包括菌种重量百分比为：枯草芽孢杆菌55％、多粘类芽孢杆菌10％、胶冻样芽孢杆菌5％、巨大芽孢杆菌5％、地衣芽孢杆菌25％。实施例5(1)芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接于装有100mllb培养基的250ml摇瓶中，40℃、180r/min活化培养20h，然后将活化的菌液按体积比8％的接种量接入装有500mllb培养基的1000ml摇瓶中，40℃、180r/min培养10h，得到种子液；将种子液按体积比8％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，40℃、180r/min发酵培养20h，获得发酵种子液，然后将发酵种子液按体积比8％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，35℃、170r/min发酵培养46h，得到芽孢杆菌、荧光假单胞菌或放线菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为葡萄糖6g/l，蛋白胨12g/l，磷酸二氢钾12g/l，ph6.8-7.2，121℃实罐灭菌20min；(2)灰黄青霉或木霉菌的发酵培养过程是：将斜面保存的菌种分别接入装有100ml马铃薯培养基的摇瓶中，30℃、180r/min活化培养20h，然后将活化的种子液按体积比8％的接种量接入装有500ml马铃薯培养基的1000ml摇瓶中，30℃、180r/min振荡培养20h得到种子液；将种子液按体积比8％的接种量接入种子罐的发酵培养基中，30℃、180r/min发酵培养20h，得到发酵种子液，将发酵种子液按体积比8％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中，30℃、180r/min发酵培养58h，得到灰黄青霉或木霉菌的发酵菌液，离心，菌体离心备用；种子罐和发酵罐中的发酵培养基为玉米粉22g/l，蔗糖7g/l，ph5-6，121℃灭菌20min。(3)将所述步骤(1)得到的菌体与所述步骤(2)得到的菌体按比例混合，置于鼓风干燥箱或自然条件下干燥通风处，干燥，即可得到该微生物菌剂。所述菌剂中的群落总数为：芽孢杆菌9.0×109cfu/g、荧光假单胞菌1.0×109、灰黄青霉5.0×104cfu/g、木霉菌5.0×104cfu/g、放线菌8.0×1010cfu/g；其中芽孢杆菌包括菌种重量百分比为：枯草芽孢杆菌60％、多粘类芽孢杆菌5％、胶冻样芽孢杆菌5％、巨大芽孢杆菌5％、地衣芽孢杆菌25％。实施例6田间应用效果施用时间为马铃薯块茎形成期。施用方法：处理组：有机肥+微生物菌剂混合施用或根圈土壤浇灌，以不施用本产品微生物菌剂同一地域同马铃薯品种(费乌瑞它)为试验对照。试验地点：湖南农业大学植物保护学院种植基地，供试土地为马铃薯连作4年土地，露地直播，覆盖地膜。试验设计采用完全随机区组设计，共6个相同面积区组，株距20～25cm，行距60～70cm，各处理间设保护行。各种栽培管理措施按照当地高产优质马铃薯栽培技术精心管理。各处理马铃薯达到收获期进行样品采集。试验结果：(1)施用实施例1-5微生物菌剂处理的马铃薯总重量及单个个体重量明显比常规对照组高，两者达到显著差异，微生物菌剂处理的马铃薯产量比对照提高了32.9％以上。由此表明施用微生物菌剂能明显降低连作障碍，提高马铃薯的产量。具体见表1。表1不同处理马铃薯产量(2)马铃薯的表皮粗糙程度反映马铃薯的品相、口感，表皮粗糙程度与产品品相和口感成正比。施用本发明实施例1-5微生物菌剂对马铃薯品相和口感有很大的协同增强效应，处理的马铃薯表皮粗糙度明显大于常规对照。由此可见，马铃薯专用复合微生物菌剂不仅提高马铃薯产量，同时对马铃薯的生物品质和品相方面都有极大的提高，提升了马铃薯的市场竞争力。具体见表2。表2不同处理马铃薯品质对比项光滑个数占比(％)粗糙个数占比(％)对照组5941实施例17921实施例27822实施例38020实施例48020实施例57723(3)施用本发明实施例1-5微生物菌剂处理的土壤能够明显改善其土壤理化性质，提高土壤肥力，提高土壤有效氮磷钾的含量，改善土壤ph值，能明显降低连作障碍，提高马铃薯的产量。具体见表3。表3不同处理土壤理化性状(4)施用本发明实施例1-5的微生物菌剂将大量的有益菌补充到土壤中后，在马铃薯根系周围形成保护屏障，抑制有害菌的生长，繁殖，保护马铃薯根系，同时抑制各种病虫害，降低各种疾病的发病率，从而提高马铃薯抗旱、抗病虫害等抗逆性。具体见表4。表4不同处理对马铃薯发病率的影响本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页1 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