一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法与流程

文档序号：20275518发布日期：2020-04-04 11:43阅读：1001来源：国知局

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。

背景技术：

家蚕二分浓核病毒(bombyxmoribidensovirus,bmbdv)是一种可以引发家蚕罹患类似昆虫浓核症的病原，bmbdv特异性感染家蚕中肠柱状上皮细胞能够引起幼虫致死性软化病。被该病毒感染的家蚕会引起空头下痢等症状且，感染病毒后的家蚕有厌食症状。该病毒与昆虫浓核病毒（densovirus）有相似的病毒粒子特征和基因组结构。bmbdv为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20~24nm，包含2个线性单链dna分子，大小分别约6.5kb(vd1)和6kb(vd2)，vd1和vd2各自包装进病毒粒子，基因组末端具有反向末端重复序列。

目前还没有一种体外培养细胞系可供bmbdv感染，由于bmbdv没有敏感细胞系，对于该病毒的研究限制在家蚕幼虫上，bmbdv的增殖与基因功能研究受到极大限制，病毒的入侵和复制机制、病毒和宿主的相互作用等方面还远未阐明。因此，构建稳定高效的能拯救bmbdv的反向遗传体系尤为重要。

之前的研究中将重组质粒pvd1-ns1gfpf，pvd1-vp/gfp和pvd1-vpgfpf分别与puc119-vd2质粒线性化共转染bmn细胞；重组质粒pvd2-mcp/gfp与pmd18t-vd1质粒线性化共转染bmn细胞；但是，gfp标记的引入破坏了bmbdv基因，不利于后续的研究。故构建一种既便于检测又不破坏病毒基因结构的家蚕二分浓核病毒基因组重组质粒，对于构建该病毒的反向遗传体系十分必要的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。本发明所提供的重组质粒在不破坏家蚕二分浓核病毒vd2编码基因完整性的前提下加入标记基因的完整表达框，增加bmbdv复制分析的便捷性。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：

通过酶切酶连的方法将含有完整表达框的标记基因egfp片段插入到vd2基因组的非编码区中。

本发明提供一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒，其包含有vd2完整基因组，含有杆状病毒bmnpv的ie1启动子和sv40终止子完整表达框的标记基因片段，所述的标记基因为egfp基因或rgp基因。

本发明还提供了一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒构建方法，包括以下步骤：

（1）构建包含vd2完整基因组的puc-vd2/pmaci质粒：

（2）以步骤（1）中构建的puc-vd2/pmaci质粒为模板，设计引物序列f1和r1，f2和r2；以bmnpv和pfbdm质粒为模板构建得到pt-ie1-egfp-sv40质粒，根据构建的pt-ie1-egfp-sv40质粒设计引物序列f3和r3；

（3）利用步骤（2）中设计的引物序列分别进行pcr扩增，以puc-vd2/pmaci为模板pcr扩增分别得到上游产物片段vd2-u和下游产物片段vd2-d；以pt-ie1-egfp-sv40质粒为模板pcr扩增产物片段l-egfp；

（4）将步骤（3）中得到的产物片段酶切胶回收纯化，依次将酶切后的目的片段vd2-u，l-egfp，vd2-d与pfbdm质粒载体连接得到重组质粒pfbdm-vd2egfp。

步骤（1）中所述的puc-vd2/pmaci质粒是在bmbdv的vd2基因末端序列5'gtgtgtgt前插入cac三个核苷酸，在3'cacacaca前插入gtg三个核苷酸，将插入后的序列装配在puc119质粒上形成。

步骤（2）中所述的引物序列f1保留酶切位点noti，引物序列r1保留酶切位点sali，引物序列f2保留酶切位点stui，引物序列r2保留酶切位点ecori；引物序列f3保留酶切位点sali，引物序列r3保留酶切位点stui。

步骤（2）中所述f1的核苷酸序列如seqidno:1所示，r1的核苷酸序列如seqidno:2所示，f2的核苷酸序列如seqidno:3所示，r2的核苷酸序列如seqidno:4所示，f3的核苷酸序列如seqidno:6所示，r3的核苷酸序列如seqidno:7所示。

步骤（2）中所述的pt-ie1-egfp-sv40质粒的核苷酸序列如seqidno:5所示。

步骤（2）中所述的pt-ie1-egfp-sv40质粒是以bmnpv基因为模板扩增得到ie1启动子序列，以pfbdm质粒为模板扩增得到sv40终止子序列；将ie1启动子，egfp与sv40终止子酶切酶连后形成。

步骤（3）中所述上游产物片段vd2-u核苷酸序列如seqidno:8所示，下游产物片段vd2-d核苷酸序列如seqidno:9所示，l-egfp核苷酸序列如seqidno:10所示。

在某一具体实施例中，本发明将构建的重组质粒pfbdm-vd2egfp转化到大肠杆菌感受态细胞内，在含有抗生素的培养基中过夜培养；挑选平板上阳性菌斑，用质粒抽提试剂盒提取质粒dna，得到重组质粒基因组。所述的抗生素为庆大霉素和氨苄青霉素，浓度分别是10μg/ml和100μg/ml。

本发明的有益效果是：

本发明成功构建了一种携带标记基因egfp的家蚕二分浓核病毒的重组表达质粒，所构建的重组质粒在不破坏家蚕二分浓核病毒vd2基因编码的前提下在加入标记基因的完整表达框，既不破坏家蚕二分浓核病毒vd2的编码基因，又增加分析的便捷性，避免了由于病毒基因编码框被破坏带来的实验阻力；本发明以egfp或rgp基因作为标记基因，能够较直观和便捷的判定转染及感染的成功与否，增加实验的便捷性。

附图说明

图1是重组质粒pfbdm-vd2egfp的信息标注图谱；

图2是抽提出的重组质粒pfbdm-vd2egfp基因组的双酶切验证图；图中，m1、m2是dna分子标准，泳道1~5分别表示不同的双酶切后序列；

图3重组质粒pfbdm-vd2egfp基因组转染48小时后hi5细胞的荧光情况。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。

本发明中对标记基因没有具体的限定，为了便于不同科研人员实验观察需求可以使用其他标记基因替换本实施例中的egfp基因，如红色荧光蛋白rgp基因。

实施例1：重组质粒pfbdm-vd2egfp的制备

（1）模板质粒puc-vd2/pmaci的构建：测定bmbdv的vd2全长序列（genbank登录号：dq017269）vd2全长为6022bp，在vd2共有末端序列5`gtgtgtgt前插入cac三个核苷酸，在3`cacacaca前插入gtg三个核苷酸，将插入后的序列装配在puc119质粒（购自于上海北诺生物科技有限公司）上，形成质粒puc-vd2/pmaci；质粒puc-vd2/pmaci包含病毒vd2完整基因组且不影响蛋白表达，酶切位点的选择是根据pfbdm质粒（出自invitrogen公司，全长序列5279bp，genbank登录号：dj417502.1）中的多克隆位点选择的，其在vd2基因组中无识别位点，仅在pfbdm质粒中存在单个识别位点，酶切位点在重组质粒中均是唯一的。

（2）利用primerpremier5.0设计特异性引物，以步骤（1）中构建的puc-vd2/pmaci质粒为模板，设计引物序列f1和r1，f2和r2；引物序列f1保留酶切位点noti，引物序列r1保留酶切位点sali；所述f1的核苷酸序列如seqidno:1所示，即:5'-ttgcggccgcacgtgtgtgtatactggggcggtattga-3'（上游引物带notⅰ位点），所述r1的核苷酸序列如seqidno:2所示，即:5'-gcgtcgacccttaaatgctatataaagat-3'（下游引物带salⅰ位点）；引物序列f2保留酶切位点stui，引物序列r2保留酶切位点ecori；所述f2的核苷酸序列如seqidno:3所示，即:5'-aaggccttttaaatggattgtataatt-3'（上游引物带stuⅰ位点），所述r2的核苷酸序列如seqidno:4所示，即:5'-ggaattcacgtgtgtgtatactggggcggtatt-3'（下游引物带ecorⅰ位点）。

以家蚕核多角体病毒(bmnpv，genbank登录号:l33180.1）为模板设计引物得到ie1启动子序列和以pfbdm质粒（genbank登录号：dj417502.1）为模板设计引物得到sv40终止子序列，在ie1启动子序列上下游分别加kpni，avrii酶切位点；在egfp序列（genbank登录号：nc_025025.1）上下游分别加avrii，mlui酶切位点；在sv40终止子序列上下游分别加mlui，sal酶切位点；再通过酶切酶连接方式依次将ie1，egfp，sv40序列连接，构建得到pt-ie1-egfp-sv40质粒，其核苷酸序列如seqidno:5所示。根据构建的pt-ie1-egfp-sv40质粒为模板，设计引物序列f3和r3，引物序列f3保留酶切位点sali，引物序列r3保留酶切位点stui；所述f3的核苷酸序列如seqidno:6所示，即:5'-gcgtcgacagttcgggacataaatgt-3'（上游引物带salⅰ位点），所述r3的核苷酸序列如seqidno:7所示，即:5'-aaggcctgatgagtttggacaaaccac-3'（下游引物带stuⅰ位点）。

（3）利用步骤（2）中设计的引物序列分别进行pcr扩增，以puc-vd2/pmaci为模板pcr扩增分别得到上游产物片段vd2-u（产物长度1744bp）和下游产物片段vd2-d（产物长度4300bp）；以pt-ie1-egfp-sv40质粒为模板pcr扩增产物片段l-egfp（产物长度1575bp）。上游产物片段vd2-u核苷酸序列如seqidno:8所示，下游产物片段vd2-d核苷酸序列如seqidno:9所示，l-egfp核苷酸序列如seqidno:10所示。pcr扩增反应体系均为：模板：1μl（质粒稀释25倍），引物f：2μl，引物r：2μl，2×primestarmax：25μl，加入重蒸水（ddh2o）补充至反应体系总体积为50μl。

由于引物的退火温度不同，故本发明中涉及到的pcr条件也存在不同。

上游产物片段vd2-u和下游产物片段vd2-d的pcr条件均为：95℃3min；预变性95℃40s，66℃30s，72℃2min，2循环；变性95℃40s，64℃30s，72℃2min，2循环；退火95℃40s，62℃30s，72℃2min，2循环；延伸95℃40s，60℃30s，72℃2min，2循环；后延伸95℃40s，58℃30s，72℃2min，30循环；72℃10min。

产物片段l-egfp的pcr条件为：预变性95℃3min，变性95℃40s，退火58℃30s，延伸72℃2min，32个循环，后延伸，72℃10min。

产物序列由上海捷瑞生物公司合成，之后加入一定量的te配置成10μm的终浓度，-20度保存备用。

（4）分别将步骤（3）中的pcr产物经dna纯化试剂盒纯化（omega公司）后进行双酶切。

酶切体系如下：纯化后pcr产物2μg，酶1（noti、sali、stui、ecori其中的一种）2μl，酶2（noti、sali、stui、ecori其中的一种）2μl，buffer5μl，加入重蒸水（ddh2o）补充至反应体系总体积为50μl。37℃水浴酶切3-5h后进行dna琼脂糖凝胶电泳及胶回收。电泳条件：配制1%的琼脂糖凝胶，5000bpdnamaker，电压120v，恒压电泳30min。胶回收步骤按照琼脂糖凝胶回收试剂盒（omega公司）说明书操作进行。

依次将酶切后的目的片段vd2-u，l-egfp，vd2-d与pfbdm质粒载体通过t4连接酶体系进行分步连接，经过三次酶切连接循环反应形成重组质粒pfbdm-vd2egfp。酶切连接循环反应体系均为：目的片段（酶切后）4μl，载体（酶切后）1μl，t4连接酶0.5μl，t4缓冲液1μl，加入重蒸水（ddh2o）补充至反应体系总体积为10μl。连接体系中目的片段与载体的摩尔比为3:1，16℃孵育器中连接过夜。

将重组质粒pfbdm-vd2egfp转化大肠杆菌dh5α感受态细胞：从-80℃冰箱中取出感受态细胞ecolidh5α，冰浴至即将融化状态，将10μl重组质粒pfbdm-vd2egfp加入100μl的ecolidh5α细胞中，放置冰上30min，42℃热激90s，迅速放置冰上4-5min，加入900μllb培养基，在37℃，220rpm，摇菌60min，5000rpm离心1min，弃去900μl上清，余下的沉淀混匀，取30μl涂含有庆大霉素和氨苄青霉素的平板，37℃恒温培养箱中培养12-14小时，观察菌落生长情况，挑单菌落至装有5μl加抗生素的培养基试管中，37℃，220rpm，摇菌12-14小时，菌液pcr验证正确后，用浓度为15%的甘油保存菌液至-80℃。

用质粒抽提试剂盒提取质粒dna，得到重组质粒基因组。质粒提取严格按照质粒提取试剂盒说明书（详见omegaplasmid说明书）进行。

实施例2：重组质粒pfbdm-vd2egfp的验证

使用双酶切体系进行对抽提质粒进行验证。酶切体系如下：重组质粒1μg，酶1（noti、sali、stui、ecori其中的一种）0.5μl，酶2（noti、sali、stui、ecori其中的一种）0.5μl，注：酶1和酶2避免同一种酶。酶buffer1μl，加入重蒸水（ddh2o）补充至反应体系总体积为10μl。37℃水浴1小时，取酶切体系5μl上样，10000dnamaker，进行dna琼脂糖凝胶电泳检测，120v恒压电泳30分钟。

图1是重组质粒pfbdm-vd2egfp的信息标注图谱。由图1可见，载体名称为pfbdm-vd2egfp，载体大小为12862bp，载体类型是昆虫细胞表达系统载体，载体启动子：polyhedrin，p10，载体抗性为氨苄青霉素，载体筛选标记为庆大霉素，noti与sali中间为上游片段vd2-u（1744bp）stui与ecori中间为下游片段vd2-d（4300bp），sali与stui之间为片段egfp（1575bp）。

图2是抽提出的重组质粒pfbdm-vd2egfp基因组的双酶切验证图；图中，m1、m2是dna分子标准，泳道1~5分别表示不同的双酶切后序列。其中，泳道1是stui和sali双酶切质粒得到egfp（1575bp）和其他序列（11287bp）；泳道2是noti和sali双酶切质粒得到vd2-u（1744bp）和其他序列（11118bp）；泳道3是ecori和stui双酶切质粒得到vd2-d（4300bp）和其他序列（8562bp）；泳道4是noti和ecori双酶切质粒得到vd2-u，vd2-d，egfp总序列（7619bp）和pfbdm载体剩余序列（5243bp）；泳道5是sali和ecori双酶切质粒vd2-d，egfp总序列（5875bp）和vd2-u+pfbdm载体总序列（6987bp）。由图2可得，重组质粒pfbdm-vd2egfp成功构建。

实施例3：重组质粒pfbdm-vd2egfp基因组转染hi5细胞

观察27℃细胞恒温培养箱中昆虫hi5细胞（购自于invitrogen公司）的生长状态，转染前一天选取生长状况良好的昆虫细胞，更换适量新鲜的完全细胞培养基（grace’s昆虫培养基）用灭菌的巴氏管轻轻吹打贴壁细胞使之悬浮于培养基中，并按每孔75%的细胞密度铺于6孔板内，置恒温培养箱过夜贴壁培养15h左右用于后续的转染实验，本实验采用的是脂质体转染法，转染步骤如下：

（1）吸出6孔板内原来的培养基，加入1000μl无血清无双抗的grace’s培养基，重复洗涤细胞三次，最后加入10μl无血清无双抗的grace’s培养基温育约40min；

（2）配制dna-cellfectin混合液：

a液：吸取100μl无血清无双抗的grace’s培养基于灭菌后1.5mlep管中，每管加入2μg重组质粒pfbdm-vd2egfp，轻弹混合液体使其混匀，室温下静置10min左右；

b液：吸取100μl无血清无双抗的grace’s培养基于ep管中，每管分别加入7μl脂质体cellfectineregent试剂（购自于invitrogen公司），轻弹混合液体使其混匀，室温下静置约10min；

将a液、b液混合一起形成c液，用移液枪轻轻洗打使之混匀，室温下静置40min，每10min轻弹混匀一次；

（3）温育40min后，6孔板各孔中缓慢加入c液和1000μl无血清无双抗的grace’s培养基；

（4）封口膜密封后放于27℃恒温培养箱中培养6h；

（5）灭菌后的移液枪弃去培养6h后的细胞转染混合液，加入1000μl新鲜的grace’s完全培养基；

（6）密封后放于27℃培养箱中培养48h左右，取出6孔板在荧光倒置显微镜下观察细胞内的荧光情况，判断重组质粒的感染效率和质粒表达情况。

图3是重组质粒pfbdm-vd2egfp基因组转染48小时后hi5细胞的荧光情况图；其中，图a是荧光情况下hi5细胞状态，图b是白光状态下的hi5细胞状态。由图3可见，可以直观判断出重组质粒在hi5细胞中进行复制和表达。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>江苏大学

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