一种冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶的方法及专用菌株与流程

本发明属于发酵制茶技术领域，具体涉及一种冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶的方法及专用菌株。

背景技术：

冠突散囊菌(eurotiumcristutum)俗称“金花菌”，属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌，常见生长于黑砖茶上，属益生菌。经科学研究发现，冠突散囊菌能分泌淀粉酶和氧化酶，可催化茶叶中的淀粉转化为单糖，多酚类化合物质氧化，使茶叶汤色变棕红，消除粗青味。使茶叶在口味上更加醇和爽口，甜滑回甘。它还具有较强的促消化、降血脂、溶解脂肪、调节糖类代谢等功效。

枸杞芽又名枸杞头、枸芽子、甜菜头，即枸杞的嫩梢、嫩叶，枸杞叶是枸杞的成熟茎叶。枸杞芽和枸杞叶略带苦味，后味微甜，很爽口，能清火明目，民间常用来治疗阴虚内热、咽干喉痛、肝火上扬、头晕目眩、低热等。《食疗本草》中记载枸杞芽和枸杞叶有坚筋耐老、除风、补益筋骨和去虚劳等作用。枸杞叶可用来泡枸杞茶饮用，能够促进血液循环、防止动脉硬化、还可预防肝脏内脂肪的囤积；降血压、增强免疫力、降血糖、润肠通便、生津补肝，内含的各种维生素、必需氨基酸及亚麻油酸，更可以促进体内的新陈代谢，也能够防止老化。由于枸杞芽和枸杞叶具有良好的保健作用，从古至今一直都有对它的食用。现代人一般用枸杞芽和枸杞叶做菜，也可将其制作成茶饮满足爱好饮茶人群的需求。

枸杞芽茶和叶茶的一般制作方法，都是将采摘的新鲜枸杞芽和枸杞叶经过萎凋、揉捻和烘干等工序，控制好各阶段的温度和时间等参数，根据枸杞芽和枸杞叶的失水程度、色泽和气味等确定茶叶何时加工完成。但是，目前市面上的枸杞芽茶和叶茶都是未经过发酵的茶叶，虽然较多的保留了茶叶内的天然物质，具有消炎、杀菌、抗衰老等功效；不过，其茶多酚含量比发酵茶高很多，收敛性也比发酵茶强。与发酵茶相比，具有一定的刺激性，容易刺激胃部。申请号201910194942.0的专利申请公开了一种枸杞叶茶的制作方法，主要步骤包括采摘、清洗、萎凋、烘炒杀青、揉捻、炒干成型及干燥提香、包装成品工序，其主要工艺在于将枸杞叶炒干成型时通过揉捻机和炒干机配合炒干并形成枸杞叶茶坯，其采用的是传统的枸杞叶茶制备方法。申请号201810617019.9的专利申请公开了一种枸杞芽茶和叶茶加工工艺，该枸杞芽茶和叶茶加工工艺包括对枸杞芽和枸杞叶依次进行萎凋工序、揉捻工序、发酵工序和烘干工序，其主要工艺在于增加了发酵工序，发酵工序为自然发酵6h-8h，使枸杞芽茶和叶茶的茶多酚含量降低，刺激性减小，具有良好的养胃护胃的功效。上述发酵程序极为简单(自然发酵几个小时)，目的是使枸杞芽茶和叶茶的茶多酚含量降低，减小对胃部刺激性。但是上述专利文献基本上还是采用传统工序制备的枸杞叶茶，外观色泽偏暗，或多或少残留生青味，茶汤香味欠佳，口感较涩，且叶绿素及其他功效性物质流失较多。

技术实现要素：

针对传统枸杞叶茶“外观色泽偏暗，具有生青味，茶汤香味欠佳，口感较涩，容易刺激胃部等”的问题，本发明提供了一种冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶的方法及专用菌株。申请人首先从发酵茶中经筛选、系列条件优化后获得一株生长速度快且发酵能力强的冠突散囊菌菌株ncps2018015。采用上述的菌株发酵枸杞叶结合具体的工艺条件可制成日常饮用的茶叶，能够最大限度保持枸杞叶中的叶绿素及其他功效性物质，制作的茶叶外观色泽鲜亮，翠绿与金黄色相交，且能够去除枸杞叶茶容易有的青草味、涩味，适当降低茶多酚含量。并且发酵后使其功效性成分更加容易经开水浸泡后溶出，以实现枸杞叶内含各种成分更容易吸收，保健作用更好的功效。

本发明首先从发酵茶中经筛选、系列条件优化后获得一株生长速度快且发酵能力强的冠突散囊菌菌株ncps2018015。该菌株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为cctccno:m2018882。

本发明还提供了一种冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶的方法，其特征是，其依次经由以下工艺步骤进行加工制作：采摘、清洗、烫青、揉捻、发酵和干燥；

具体如下：

1)采摘：选择无病虫害和无变质的色泽嫩绿、肥厚、新鲜的枸杞嫩茎叶；

2)清洗：清水清洗，沥干，摊晾至叶片萎软；

3)烫青：在90～100℃的热水中烫煮，烫青后立即投入冷水中浸泡冷却；烫青后直接低温烘制；

4)揉捻：将烘制后的原料放于揉板上，揉捻3～5min，待果胶分解物形成紧结的条索状后，放入70±5℃的锅中快速翻炒，烘焙至手捻叶条细碎成粉、含水率低于6％，即可出锅摊开冷却；

5)发酵：将步骤4)揉捻烘焙后的枸杞叶装入耐高温培养袋，每100克揉捻烘焙后的枸杞叶加入20-25ml5±1％的葡萄糖溶液及20-25ml麦芽汁，灭菌，得到培养料；然后按照每100克揉捻烘焙后的枸杞叶接种8-12ml冠突散囊菌ncps2018015种子液的比例接种至培养料中；将接种后的培养袋于温度为28-30℃下培养12-14天；

6)干燥：培养结束后，烘干至水分8-12％，根据需要将枸杞叶茶装袋或者压制成砖型、饼型、坨型，即为成品枸杞叶茶。

进一步的，种子液制备为：采用麦芽汁液体培养基28-30℃摇床振荡培养冠突散囊菌ncps2018015菌株60-84h，得种子液。

进一步的，所述步骤3)的烫青为：在90～100℃的热水中烫煮60～100s。烫青后立即投入冷水中浸泡冷却，必须保证每一片芽叶皆冷却至30℃以下。

进一步的，所述步骤3)的低温烘制，烘制温度60-70℃，烘制至含水率为60±5％。

本发明的优势是：

1)开发优势菌株

申请人首先从发酵茶中经筛选、系列条件优化后获得一株冠突散囊菌菌株ncps2018015。相比其他菌株，该菌株具有生长速度快且发酵能力强的优势，采用该菌株发酵枸杞叶茶，具有发酵时间短，菌体含量高的优势。

2)本发明首次采用冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶

目前未发现有采用冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶的报道，本发明首次采用冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶，结合本工艺的具体条件，其发酵时间短，仅为10-14天，产孢量高(孢子含量可达到10⁷-10⁸)，金花菌能产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，这些酶都可能有利于降低人体内脂肪的堆积，茶汤可以维持机体的血脂平衡，能够有助于肥胖症和高血脂症的治疗，经过发酵的枸杞叶还可以最大程度保留了枸杞叶原有的功效性物质。

3)产品好

采用冠突散囊菌ncps2018015发酵制备的枸杞叶茶，其茶叶外观为翠绿与金黄色相交，非常美观，茶汤色为黄褐色，茶香味浓郁，无生青味，入口微苦无涩味，有回甘，极好的解决了枸杞叶作为代茶饮的缺陷。同时由于制备的枸杞叶茶中含有大量的金花菌菌体，有助于肥胖症和高血脂症的治疗。

附图说明

图1为本发明菌株ncps2018015的菌落形态图；其中a图为培养4-5天的菌落形态图，b图为培养10-11天的菌落形态图；

图2为发明菌株ncps2018015的菌落进行棉兰染色后的显微观察图；a图和b图为培养4-5天的菌落图片；c图和d图分别为培养6天和7天的子囊果图片；

图3为采用本发明菌株ncps2018015发酵制作枸杞叶茶，烘干前(左)和烘干后(右)的图片；

图4为采用菌株072发酵制作枸杞叶茶，烘干前(左)和烘干后(右)的图片；

图5为采用菌株055发酵制作枸杞叶茶，烘干前(左)和烘干后(右)的图片；

图6为采用菌株100发酵制作枸杞叶茶，烘干前(左)和烘干后(右)的图片。

具体实施方式

实施例1：目标菌株的分离与鉴定

1.菌株的分离

分别取购买的陕西泾阳茯砖茶及湖南安化黑茶加入无菌水中，摇床震荡2小时左右，系列稀释，取稀释度为10⁴、10⁵的悬液涂布麦芽汁固体平板(含有0.01％氯霉素)，平板28-30℃培养4-5天，根据菌落外观，挑取长势较好的单菌落至麦芽汁斜面培养基，培养6-7天后，再次进行系列稀释分纯工作，挑取后的单菌落斜面培养待用。

检测单菌落生长活性：麦芽汁液体培养基培养液分装于500ml三角瓶中，每瓶装250ml，121℃灭菌待用。斜面挖块接入上述液体培养基，28℃，180rpm，摇床震荡培养72小时，培养过程观察长势，培养结束后离心收集菌体，烘干后测定菌体干重，选取菌体量最高的10株菌接种黑茶，按照传统黑茶发酵工艺进行发酵，测定最终发酵产品中金花菌(冠突散囊菌)含量，结果如下。

表1不同菌株发酵黑茶所产生的金花菌含量

从表1的结果可以看出：菌株015发酵黑茶所产生金花菌(冠突散囊菌)数量最高，经过多次重复性实验表明，该菌株稳定性较好，因此选取015号菌株作为最终菌株进行菌种鉴定，命名为ncps2018015。

2.菌株的鉴定

1)菌落形态观察：将分离到的菌株接种到20％czg平板培养基中，于28℃培养箱中培养，观察并记录菌株生长的颜色、形态、大小及质地的变化。结果如图1所示。从图1可以看出：28℃培养4-5天，菌落直径25-30mm；菌落呈较规则圆形，质地比较致密，内部具规则晕圈，边缘黄色较浅，接近橄榄浅黄色，由边缘至中间颜色逐渐加深，近于橄榄褐至丁香褐色，并附有大量具饰菌丝，老后成褐色；培养至10-11天，菌落直径可达60mm，整个菌落颜色全部变成橄榄色至丁香褐色。早期，菌落背面黄色晕圈清晰可见，老后则呈黑褐色，且大面积扩散渗透于整个培养基中。

2)显微观察：在已培养生长的菌落边缘，将无菌的盖玻片以45°度角斜插入培养基中。培养4-5天，待菌丝延伸至盖玻片上时，镊子小心夹出盖玻片，盖至已加有棉兰染色剂的载玻片上，避免气泡产生，静置10分钟后再行观察，结果如图2所示。

由图2的a图可见，菌落由子囊果与菌丝组成，子囊果呈球形或近球形，黄色(因棉兰染色，呈现淡蓝色)，直径约150-200μm，其中含有许多子囊，子囊呈球形或近球形，直径约5μm。由a图和b图可见，显微镜下呈现大量黄色，具饰菌丝，具横隔璧，分枝不对称，有隔膜和菌核。图c和图d可见，培养6-7天后，子囊果开始破裂，逐渐释放子囊。

通过对菌落形态特征和菌丝、孢子等显微结构特征观察，根据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》可初步鉴定ncps2018015菌为散子囊菌属真菌，但仅由形态特征难以鉴定到种，需结合分子生物学手段作进一步鉴定。

3)菌株its序列鉴定结果：

测定ncps2018015的its序列结果如下(seq-1)：

cctgcggaaggatcattaccgagtgcgggccctctgggtccaacctcccatccgtgtctatctgtaccctgttgcttcggcgtggccacggcccgccggagactaacatttgaacgctgtctgaagtttgcagtctgagtttttagttaaacaatcgttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataattaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcttccgtccctggcaacggggacgggcccaaaaggcagtggcggcaccatgtctggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcccgtaggtccagctggcagctagcctcgcaaccaatctttttaaccaggtgacctcggatcagtacgatccactct。

运用genbank的dna序列局部相似查询系统，搜索与供试菌株dna序列相似的序列，并进行比对分析。blast比对结果显示，在数据库中有一个编号为mf993117.1的冠突散囊菌(eurotiumcristatum)its区段dna序列与供试菌株的同源性为99％(499/500)。两者相比较的score值为917bits，e值为0.0。

因此，根据菌落形态特征和菌丝、孢子等显微结构特征观察，以及分子生物学its序列测定结果，可以判定，菌株ncps2018015为冠突散囊菌(eurotiumcristatum)。该菌株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为cctccno:m2018882。

3.相比其他金花菌的优势

采用成品茯砖茶分离菌株发酵黑茶、本发明菌株ncps2018015发酵黑茶和成品茯砖(陕西泾阳产)的产品性能比较如表2所示。

表2不同茶叶的产品性能

从表2可以看出：相比茯砖茶分离菌株发酵黑茶和成品茯砖(陕西泾阳产)，采用本发明的冠突散囊菌菌株ncps2018015发酵黑茶，其产品效果更佳。

实施例2：发酵制作枸杞叶茶

1)采摘：选择无病虫害和无变质的色泽嫩绿、肥厚、新鲜的枸杞嫩茎叶。

2)清洗：把选好的枸杞叶用清水清洗，主要是洗掉叶面上的尘土和其他污物，沥干，摊晾，摊晾在干燥处晾干或用风扇吹干，摊晾期间翻动1-2次，至叶片萎软，失水率为5-10％。

3)烫青：在90～100℃的热水中烫煮60～100s即可，枸杞叶尚保持嫩绿，有效成分几乎不流失，可保持茶叶颜色美观。烫青后立即投入冷水中浸泡冷却，必须保证每一片芽叶皆冷却至30℃以下。

烫青后采用直接烘制的方法，烘制温度60-70℃，可有效保护叶绿素及其他功效性物质，经此步骤制作出的茶汤香味欠佳，会残留生青味，且茶汤的口感较涩，有收敛感，此缺点经后续发酵工艺可完全改观。烘制至叶片柔软，握之成团，手松不散，含水率为60±5％即可。

4)揉捻：将烘制后的原料放于揉板上，每锅分3次用力均匀揉捻，一般应揉捻3～5min，待果胶分解物形成紧结的条索状后，放入70±5℃左右的锅中快速翻炒，烘焙至手捻叶条细碎成粉、含水率低于6％，即可出锅摊开冷却。

5)发酵

斜面培养：斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基，28-30℃培养7天；麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁150ml，琼脂3g，ph6.4±0.2，高温灭菌后倒平板。

种子液制备为：将麦芽汁液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶装250ml，121℃灭菌30min，冷却后取出备用；斜面挖块接种于种子液培养基(麦芽汁液体培养基)，摇床振荡培养，28℃，180rpm，培养72hr，得种子液。麦芽汁液体培养基(每升)：氯霉素0.1g，麦芽膏粉130g，ph5.6±0.2。

发酵：将揉捻烘焙后的原料装入耐高温培养袋，每100克揉捻烘焙后的枸杞叶加入20-25ml5％的葡萄糖溶液及20-25ml麦芽汁，121℃30分钟灭菌后冷却至常温，按照每100克揉捻烘焙后的枸杞叶接种10ml种子液的比例接种入培养袋。将接种后的培养袋置于恒温室内培养，无需控制湿度，温度为28-30℃，培养时间为12-14天，最终培养得到的枸杞叶茶其金花菌(冠突散囊菌)孢子含量可达到10⁷-10⁸。

6)干燥：培养结束后，烘干至水分8-12％，将根据需要将枸杞叶茶装袋或者压制成砖型、饼型、坨型，即为成品枸杞叶茶，如图6所示，上述枸杞叶茶进行冲泡品尝，做出感官评价如表3所示。

对比例：分别采用表1中金花菌(冠突散囊菌)产量较高的菌株072、055和100发酵枸杞叶制备枸杞叶茶(除采用的菌株不同外，其余同实施例2)，其发酵效果图依次如图4-图6所示，菌株072、055和100发酵枸杞叶制备的枸杞叶茶进行冲泡品尝，做出感官评价如表3所示。

表3不同金花菌发酵的枸杞叶茶冲泡品尝的感官评价

结果分析：如图3-图6所示，从外观可以看出，本发明菌株发酵制备的枸杞叶茶色泽明亮，发出的金花色泽金黄且金花量大(图3)；而普通金花菌(菌株072、055和100)发酵的枸杞叶茶则色泽灰暗且菌体量明显偏少(图4-6)。由表3的表观及感官评价可见，本发明菌株ncps2018015发酵的枸杞叶茶，金花菌菌体量非常大，色泽鲜亮，茶叶香味浓郁，入口微苦，有回甘，口感佳，而普通金花菌(菌株072、055和100)发酵的枸杞叶茶则色泽灰暗，且苦味较重，口感不佳。

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<110>山东省农业科学院农产品研究所

<120>一种冠突散囊菌发酵制作枸杞叶茶的方法及专用菌株

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<213>冠突散囊菌菌株（eurotiumcristatum）ncps2018015的its序列

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