一株青霉MJ51及其应用的制作方法

本发明属于微生物菌剂技术领域，尤其涉及一株青霉mj51及其应用。

背景技术：

我国褐煤资源丰富，目前已探明褐煤保有储量约1300亿t。褐煤因为灰分高，水分和氧含量高，热值低，不适合作为固体燃料用于直接燃烧。褐煤有机质在演化过程中很大程度上保留了成煤植物的大分子结构，有机氧含量高，这一特性使褐煤成为制取腐植酸的较好原料。目前，关于褐煤黄腐酸的主要提取方法有三大类：物理法、化学法和微生物法。目前常用的方法为化学法，方法是：先用碱液提取，然后将上清液酸化，沉淀出其中的黄腐酸。但该法提取率低，工业生产成本高，且化学法生产的黄腐酸絮凝极限低，活性低，并产生污染环境的二次废物。与传统的化学降解褐煤得到活性较高的黄腐酸相比，微生物法反应条件温和，可清洁转化，产物生物活性高，是一种绿色环保型降解技术。

1981年，德国的fakoussa报道了一些细菌在以硬煤为唯一碳源的基质上生长，并产生有色液体；1982年，美国的cohen和gabriele发现真菌能使风化褐煤溶解生成小液滴。这些研究引发了世界各国研究者的广泛关注和研究兴趣。我国是从1987年开始这方面的研究，现今已经分离鉴定出来的降解煤炭的微生物有很多。细菌类有假单胞菌(pseudomonascepacia)、芽孢杆菌(bacillussp.)。放线菌主要为链霉菌：(streptomycesviridosporus，streptomycessetonii)。真菌主要有担子菌(phanerochaetechrysosporium，trametesuersicolor)、丝状真菌(aspergillusterricola，aspergillusochraceus)，霉菌(cunninghamellasp.)等。酵母菌中的一些菌种也具有降解褐煤的能力。但是现有技术中还未有关于青霉能够降解褐煤的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株青霉mj51及其应用，本发明提供的青霉mj51能够将褐煤降解生产黄腐酸。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株青霉mj51，所述青霉mj51的拉丁文为penicilliumcamemberti，所述青霉mj51保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18120。

本发明还提供了上述技术方案所述的青霉mj51在降解褐煤生产黄腐酸中的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：

1)将上述技术方案所述的青霉mj51接种于pda固体培养基上培养，得到青霉菌丝块；

2)将所述步骤2)得到的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中振荡培养，得到振荡培养物；

3)将所述步骤2)得到的振荡培养物接种于褐煤液体培养基中培养6～8d，得到培养物；

4)将所述步骤3)得到的培养物灭菌、过滤，得到滤液和沉淀，所述滤液为黄腐酸。

优选的，所述步骤3)褐煤液体培养基以水为溶剂，包括：质量浓度为0.5～0.6％的(nh4)2so4、质量浓度为0.2～0.25％的k2hpo4、质量浓度为0.1～0.15％的kh2po4、质量浓度为0.03～0.04％的mgso4·7h2o、质量浓度为0.002～0.003％的cacl2·2h2o和质量浓度为0.5～1％的褐煤，所述褐煤液体培养基的ph值为6.5～7.0。

优选的，所述步骤4)沉淀经碱溶液溶解后进行水浴，将得到的水浴物过滤，得到的滤液为腐植酸。

优选的，所述应用包括以下步骤：

a、将上述技术方案所述的青霉mj51接种于pda固体培养基上培养，得到青霉菌丝块；

b、将所述步骤a得到的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中振荡培养，得到振荡培养物；

c、将所述步骤b得到的振荡培养物接种于褐煤固体培养基中培养6～8d，得到培养物；

d、将所述步骤c得到的培养物灭菌后溶于水，过滤，得到滤液和沉淀，所述滤液为黄腐酸。

优选的，所述褐煤固体培养基包括以下重量份数的组分：褐煤40～50份、玉米秸秆15～25份、(nh4)2so41～3份和水30～40份。

优选的，所述沉淀经碱溶液溶解后进行水浴，将得到的水浴物过滤，得到的滤液为腐植酸。

优选的，所述碱溶液独立的包括氢氧化钾溶液。

优选的，所述水浴的时间为25～35min。

本发明提供了一株青霉mj51及其应用，所述青霉mj51的拉丁文为penicilliumcamemberti，所述青霉mj51保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18120。

本发明实施例的结果显示：褐煤经过青霉mj51生物降解后，腐植酸和黄腐酸含量分别从30.73％和1.71％提高到69.06％和33.57％。对降解前后褐煤褐煤粗黄腐酸(afa)和真菌转化褐煤黄腐酸(bfa)的化学性质进行研究，尺寸排除色谱分析表明，与afa相比，bfa的绝对分子量降低了80.7％；ftir及¹³cnmr光谱分析表明，afa比bfa含有更多的芳香族结构，而bfa比afa含有更多的羧基及烷基结构。青霉mj51具有脱羧、脱氨和破坏芳香环侧链的能力，可以降解褐煤，并显示出从褐煤生产高附加值腐植酸和黄腐酸的潜力。青霉mj51降解褐煤所产黄腐酸比传统化学法提取黄腐酸生物活性更强，能显著促进玉米生长。

附图说明

图1为ftir和迟排阻色谱分析结果；

图2为¹³cnmr分析光谱图；

图3为平板液化试验结果；

图4为固体发酵产物黄腐酸ftir分析结果；

图5为降解产物fa在玉米上的应用效果图。

保藏说明

青霉mj51，拉丁文为penicilliumcamemberti，于2019年08月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.18120。

具体实施方式

本发明提供了一株青霉mj51，所述青霉mj51的拉丁文为penicilliumcamemberti，所述青霉mj51保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18120。本发明提供的青霉mj51能够降解褐煤生产黄腐酸。

本发明还提供了上述技术方案所述的青霉mj51在降解褐煤生产黄腐酸中的应用。

在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：

1)将上述技术方案所述的青霉mj51接种于pda固体培养基上培养，得到青霉菌丝块；

2)将所述步骤2)得到的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中振荡培养，得到振荡培养物；

3)将所述步骤2)得到的振荡培养物接种于褐煤液体培养基中培养6～8d，得到培养物；

4)将所述步骤3)得到的培养物灭菌、过滤，得到滤液和沉淀，所述滤液为黄腐酸。

本发明将上述技术方案所述的青霉mj51接种于pda固体培养基上培养，得到青霉菌丝块。

本发明对所述pda固体培养基的组分和含量没有特殊限定，采用常规即可。本发明对所述青霉mj51接种的接种量和接种方式没有特殊限定，此用常规即可。本发明对所述青霉mj51在pda固体培养基上培养的条件没有特殊限定，采用常规即可。

本发明将得到的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中振荡培养，得到振荡培养物。

本发明优选将0.5×0.5cm的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中。在本发明中，所述振荡培养的条件优选包括：振荡培养的温度为28℃，振荡培养的转速为150rpm，振荡培养的时间为3d。本发明在培养3d后，pda液体培养基中出现大量菌丝球，将得到的菌丝球与pda液体培养基混合均匀后，得到培养物。本发明对所述pda液体培养基的组分和含量没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选每个菌丝块接种于100～200ml的pda液体培养基中。

本发明将得到的振荡培养物接种于褐煤液体培养基中培养6～8d，得到培养物。

在本发明中，所述振荡培养物与褐煤液体培养基的体积比优选为1:10。在本发明中，所述褐煤的粒径优选为80目。在本发明中，所述褐煤液体培养基优选以水为溶剂，包括：质量浓度为0.5～0.6％的(nh4)2so4、质量浓度为0.2～0.25％的k2hpo4、质量浓度为0.1～0.15％的kh2po4、质量浓度为0.03～0.04％的mgso4·7h2o、质量浓度为0.002～0.003％的cacl2·2h2o和质量浓度为0.5～1％的褐煤，所述褐煤液体培养基的ph值为6.5～7.0。本发明对褐煤的来源没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述振荡培养物接种于褐煤液体培养基中培养的条件优选包括：培养温度为28℃，培养的转速为150rpm，培养的时间为6～8d，更优选为7d。

本发明将得到的培养物灭菌、过滤，得到滤液和沉淀，所述滤液为黄腐酸。

在本发明中，所述灭菌的条件优选包括：灭菌的温度为120℃，灭菌的时间为20min。本发明对所述过滤的条件没有特殊限定，采用常规过滤青霉发酵物的过滤条件即可。在本发明中，所述滤液优选为水溶性的黄腐酸。

在本发明中，所述沉淀优选经碱溶液溶解后进行水浴，将得到的水浴物过滤，得到的滤液为腐植酸。在本发明中，所述碱溶液优选包括氢氧化钾溶液，所述氢氧化钾溶液的浓度优选为10g/l。在本发明中，所述水浴优选为沸水浴，所述沸水浴的时间优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述水浴物过滤后，得到的滤液中含有腐植酸，本发明对所述过滤的条件没有特殊限定，采用常规过滤条件即可。

在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：

a、将上述技术方案所述的青霉mj51接种于pda固体培养基上培养，得到青霉菌丝块；

b、将所述步骤a得到的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中振荡培养，得到振荡培养物；

c、将所述步骤b得到的振荡培养物接种于褐煤固体培养基中培养6～8d，得到培养物；

d、将所述步骤c得到的培养物灭菌后溶于水，过滤，得到滤液和沉淀，所述滤液为黄腐酸。

本发明将上述技术方案所述的青霉mj51接种于pda固体培养基上培养，得到青霉菌丝块。

本发明对所述pda固体培养基的组分和含量没有特殊限定，采用常规即可。本发明对所述青霉mj51接种的接种量和接种方式没有特殊限定，此用常规即可。本发明对所述青霉mj51在pda固体培养基上培养的条件没有特殊限定，采用常规即可。

本发明将得到的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中振荡培养，得到振荡培养物。

本发明优选将0.5×0.5cm的青霉菌丝块接种于pda液体培养基中。在本发明中，所述振荡培养的条件优选包括：振荡培养的温度为28℃，振荡培养的转速为150rpm，振荡培养的时间为3d。本发明在培养3d后，pda液体培养基中出现大量菌丝球，将得到的菌丝球与pda液体培养基混合均匀后，得到培养物。本发明对所述pda液体培养基的组分和含量没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选每个菌丝块接种于100～200ml的pda液体培养基中。

本发明将得到的振荡培养物接种于褐煤固体培养基中培养6～8d，得到培养物。

本发明对所述振荡培养物接种于褐煤固体培养基中的接种量没有特殊限定，采用常规即可，在本发明具体实施方式中，所述振荡培养物的体积与褐煤固体培养基的质量比优选为30ml:50g。在本发明中，所述褐煤的粒径优选为80目。

在本发明中，所述振荡培养物接种于褐煤固体培养基中培养的条件包括：培养的温度为28℃，所述培养优选为静置培养。在本发明中，所述培养优选在三角瓶中进行，对三角瓶的规格无特殊限定，优选为1000ml。

在本发明中，所述褐煤固体培养基优选包括以下重量份数的组分：褐煤40～50份、玉米秸秆15～25份、(nh4)2so41～3份和水30～40％份。在本发明中，所述褐煤固体培养基的准备方法优选包括：将所述(nh4)2so4和水混合后，再与褐煤、玉米秸秆、麸皮、豆饼粉混合，浸湿30min。在本发明中，所述玉米秸秆优选为粉碎的玉米秸秆，本发明对所述粉碎的玉米秸秆的长度没有特殊限定，采用常规微生物发酵时玉米秸秆的长度即可。

本发明将得到的培养物灭菌后溶于水，过滤，得到滤液和沉淀，所述滤液为黄腐酸。

在本发明中，所述沉淀优选经碱溶液溶解后进行水浴，将得到的水浴物过滤，得到的滤液为腐植酸。在本发明中，所述碱溶液优选包括氢氧化钾溶液，所述氢氧化钾溶液的浓度优选为10g/l。在本发明中，所述水浴优选为沸水浴，所述沸水浴的时间优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述水浴物用中速滤纸(孔径为30～50微米)过滤后，得到的滤液中含有腐植酸，本发明对所述过滤的条件没有特殊限定，采用常规过滤条件即可。

在本发明中，所述应用优选包括：将青霉mj51菌株接种在pda固体平板上，28～30℃培养3～5d，形成菌落后，在菌落上加经高温灭菌(121℃，30min)的褐煤，培养3d。在本发明中，培养3d后，青霉mj51降解褐煤生成黑色液滴，用毛细管收集黑色液滴，溶于去离子水水后8000rpm离心5min，上清液即为黄腐酸。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)配料

将青霉mj51(cgmccno.18120)接种在pda固体培养基上，将生长旺盛的青霉mj51菌丝块(0.5*0.5cm)接种至pda液体培养基中，置于恒温摇床28℃、150rpm培养3天，直到培养基出现大量菌丝球，混合均匀后，得到培养物；

2)发酵

无菌条件下取10ml培养物加入100ml褐煤液体培养基中，立即摇匀，置于28℃摇床培养，转速150rpm，培养时间7d。

褐煤液体培养基以水为溶剂含有：质量浓度为0.5％的(nh4)2so4、质量浓度为0.2％的k2hpo4、质量浓度为0.1％的kh2po4、质量浓度为0.03％的mgso4·7h2o、质量浓度为0.002％的cacl2·2h2o和质量浓度为1％的褐煤，褐煤液体培养基的ph值为7.0；

将褐煤(来自云南昭通煤矿)粉碎至80目，其他辅料粉碎至2mm；

3)提取步骤：培养结束后，120℃灭菌20min，过滤得上清液即为水溶性黄腐酸，沉淀部分用70ml、10g/l氢氧化钾溶液溶解，沸水浴30min，过滤得上清液即为腐植酸粗提液。

4)产物分析

本实施例中发酵产品是直接用水提取的，所以是黄腐酸产品。因为辅料是有机物，测定产物中含有5～6％氨基酸，3～5％核酸。对所得黄腐酸进行以下特性分析：

红外光谱分析表明：黄腐酸在2932cm^-1、1637cm^-1、1401cm^-1、1049cm^-1处有吸收峰，与河南巩县(现为巩仪市)黄腐酸的吸收光谱相符(巩县风化煤黄腐酸及其配合物的傅里叶变换红外光谱研究，盛芬玲,杨育晖,刘世芳等.核化学与放射化学[j],1995,17(2),44-45)，在稀酸(0.01mol/lhcl)、中性及稀碱(0.01mol/lnaoh)条件下均可溶，所以表明是黄腐酸。褐煤经过青霉mj51生物降解后，腐植酸和黄腐酸含量分别从30.73％和1.71％提高到69.06％和33.57％(结果见表1)。对降解前后褐煤褐煤粗黄腐酸(afa)和真菌转化褐煤黄腐酸(bfa)的化学性质进行研究，尺寸排除色谱分析表明，与afa相比，bfa的绝对分子量降低了80.7％(图1、表1)；ftir及¹³cnmr光谱分析表明，afa比bfa含有更多的芳香族结构，而bfa比afa含有更多的羧基及烷基结构(图1、图2、表2)。

表1降解前后褐煤中腐植酸及黄腐酸含量变化

表2¹³cnmr分析结果

实施例2

1)配料

以配料总量的质量百分含量计，褐煤45％、玉米秸秆20％、(nh4)2so42％和水33％。

2)操作步骤

将各种料混合、搅拌均匀，加入适量水(以料湿润、疏松为原则，(nh4)2so4溶入水中加入)，静置30分钟后搅拌均匀，以10％接种量接入培养物(将青霉mj51(cgmccno.18120)接种在pda固体培养基上，将生长旺盛的青霉mj51菌丝块(0.5*0.5cm)接种至pda液体培养基中，置于恒温摇床28℃、150rpm培养3天，直到培养基出现大量菌丝球，混合均匀后，得到培养物)，28℃～30℃静置培养7～10天。发酵完毕用实施例1中所述方法在25℃提取黄腐酸。

3)黄腐酸分析鉴定

如图4红外光谱分析结果表明：黄腐酸在2932cm^-1、1629cm^-1、1560cm^-1、1401cm^-1、1050cm^-1处有吸收峰，与河南巩县(现为巩仪市)黄腐酸的吸收光谱相符(巩县风化煤黄腐酸及其配合物的傅里叶变换红外光谱研究，盛芬玲杨育晖刘世芳陶祖贻.核化学与放射化学，1995，17(2))，在稀酸(0.01mol/lhcl)、中性及稀碱(0.01mol/lnaoh)条件下均可溶，所以表明是黄腐酸。

4)产物黄腐酸效果鉴定：

本试验设在河南农业大学牧医楼实验室日光温室中进行，恒温30℃，采用水培试验，选用底直径9cm、上部直径14cm、高7cm的外部为黑色的塑料盆，供试玉米品种为郑单958，于2019年5月28日培养种子，将种子消毒、浸种、培养箱培养、沙培，最后移入水培盆中。水培试验设置2个处理，3个重复，每个盆中三棵苗，每盆加水500ml。以化学法提取的afa为对照，提取方法参考文献(李秀颖，叶华，刘变变，等.矿源黄腐酸的提取工艺研究[j].腐植酸，2016(05)：24-27)。

处理1afa，浓度为100μg/ml

处理2bfa，浓度为100μg/ml

试验结果表明，如图5和表3，青霉mj51降解褐煤所产黄腐酸可显著促进玉米生长，株高显著提高41.5％，叶绿素显著提高19.5％，生物量显著性提高66.7％，对植株氮磷钾的影响不显著。

表3微生物降解褐煤产黄腐酸对玉米植株生长及植株养分的影响

实施例3

1)菌株培养

接种在pda固体培养基上生长旺盛的青霉mj51菌丝块(0.5*0.5cm)至pda固体培养基中，置于28℃恒温培养箱培养3～5天，直到平板全部被菌落覆盖。

2)平板液化试验

将褐煤灭菌后在无菌条件下均匀地撒到28℃在pda平板上培养了三天的青霉mj51上，为处理c，再将平板放回培养箱中28℃继续培养，观察黑色液滴形成情况。同时将等量煤撒到无菌的pda平板为对照b，以生长同样天数的青霉mj51为对照a。两个对照同处理组一起放入恒温培养箱培养。

3)产物分析

培养三天后，处理组mj51+煤平板上出现黑色小液滴，两个对照组则无小液滴现象(图3)。对降解后残余煤与原煤进行元素分析结果表示：与原煤相比，残煤的h和o含量分别提高9.1％、19.4％，c、n、s和灰分含量分别降低5.7％、18.3％、108.7％、8.1％(表4)。

表4降解前后原煤和残余煤元素分析结果

由以上实施例可以得出，本发明提供的青霉mj51能够将褐煤降解生成黄腐酸。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。