用于同时检测单纯疱疹病毒I型/II型胶体金层析试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体涉及一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测单纯疱疹病毒i型/ii型核酸的试剂盒及其应用。
背景技术：
：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus，hsv)是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的病毒性病原体。hsv主要通过直接接触传播，临床上约80％感染者表现为无症状感染，这是造成hsv流行的主要原因。hsv根据抗原性不同，可分为hsvi和hsvii两种血清型。hsvi主要引起腰部以上，如眼、口部的皮肤黏膜以及中枢神经系统的感染，症状较轻，易于治疗；hsvii主要引起生殖器部位的皮肤黏膜及新生儿感染，孕妇感染hsvii，会诱发胎儿发育异常或者流产。由于hsvii型感染容易复发，其用药周期会较hsvi感染长。因此，有必要对其进行分型检测，避免药物滥用。hsv感染的实验室诊断方法有很多，一般可以分为直接涂片法、病毒分离培养法、血清学检测法以及pcr法。直接涂片法检测快速、费用低、结果直观，但是检测结果容易受到取样部位及病变时机的影响。病毒分离培养是hsv检测的金标准，该方法虽然可靠，但对实验条件要求高，耗时长(2到3周)，易污染，因此，该方法无法在临床上得到有效应用。血清学检测主要采用elisa法检测血清中的抗原或者抗体，该方法特异性和灵敏度适中，简便快捷，也是现在临床上常用的检测方法，但存在难以解决的假阴性假阳性问题。pcr的方法可直接检测hsv的核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，但是pcr的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的pcr诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的单纯疱疹病毒诊断方法。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测单纯疱疹病毒i型/ii型核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和t7rna聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的rna产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成rna扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在nc膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的rna提取过程，也不需要特殊的仪器，基于rna分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使单纯疱疹病毒i型/ii型核酸检测得到广泛应用成为一种可能。为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：第一方面，提供一种单纯疱疹病毒i型/ii型核酸联合检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于rna恒温扩增-金探针层析技术，包括：1)扩增反应液：含40mmtris-hcl(ph8.0)，12mmmgcl2，70mmkcl，15％dmso，5mmdtt，每种dntp各1mm，每种ntp各2mm，扩增引物各0.2μm；其中扩增引物包括三对：i型单纯疱疹病毒、ii型单纯疱疹病毒和人内参基因，具体如下：(1)i型单纯疱疹病毒(ul30基因一段保守区序列)扩增引物：hsvi-f(5’-3’)：cgtcgggtcgggcggcttct；hsvi-r(5’-3’)：taatacgactcactatagggagaggtgtgatggcgtccataaa；(2)ii型单纯疱疹病毒(ul30基因一段保守区序列)扩增引物：hsvii-f(5’-3’)：ccaccgtcaccgtcttccac；hsvii-r(5’-3’)：aatacgactcactatagggagaacctccgccttgttcatgtaaa；(3)内参基因(人18srrna一段保守区序列)的扩增引物：18s-f(5’-3’)：agaaacggctaccacatcc；18s-r(5’-3’)：taatacgactcactatagggagacaccagacttgccctcca；由于i型、ii型单纯疱疹病毒序列同源性高达50％左右，在设计引物时尽量选择序列保守性较高同时两型之间差异较大的序列。在保证各自单项引物扩增效率高的同时确保不同引物彼此之间无干扰。三对引物的r引物5’端都引入了t7rna聚合酶启动子序列。2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如amv或m-mlv)、t7rna聚合酶和rnaseh。3)细胞裂解液(购至美国signosis公司，货号cl-0001)：可以裂解细胞，释放核酸。4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、c线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为ces系列和les系列，其中ces系列和les系列又可以设计多条，具体(5’-3’)如下：(1)i型单纯疱疹病毒特异探针hsvi-ces1：ggccgcggcgctcgcgcctttttatctatagctggtgt；hsvi-ces2：tgtggggcggcgtggacctttttatctatagctggtgt；hsvi-les1：acgccccggcggggttcattttcgcagtgctcgagctctgagc；hsvi-les2：accccaccgtcaccgtctttttcgcagtgctcgagctctgagc；hsvi-les3：ttcacgtgtatgacatccttttcgcagtgctcgagctctgagc；(2)ii型单纯疱疹病毒特异探针hsvii-ces1:gcgtacagcatgcgcgccgcttttctatgtatctgtgagt；hsvii-ces2:ccagctccacgagcgatttattttctatgtatctgtgagt；hsvii-les1:tggacgccatcacgcccgccttttcgcagtgctcgagctctgagc；hsvii-les2:gggaccgtcatcacgcttctttttcgcagtgctcgagctctgagc；hsvii-les3:gggtctgacccccgaaggccttttcgcagtgctcgagctctgagc；(3)内参特异探针内参ces1:aaggaaggcagcaggcttttatctgtatagtgtctg；内参ces2:gcgcaaattacccactttttatctgtatagtgtctg；内参les1:cccgacccggggaggtttttcgcagtgctcgagctctgagc；内参les2:agtgacgaaaaataacttttcgcagtgctcgagctctgagc；内参les3:aatacaggactctttcttttccgcagtgctcgagctctgagc；(4)c线显色探针(5’-3’)tcagatcactatgtacttttcgcagtgctcgagctctgagc；(5)金探针金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：5’-cctactctgcagtgctccatcgtacgtctgtcatttttgctcagagctcgagcactgcg-3’；5)试纸条：所用试纸条被固定于pvc底板上，从左往右依次是样品垫、nc膜、吸水纸；nc膜上有c线(质控线)和三条t线(检测线)，从样品垫到吸水纸方向分别为hsvii-t、hsvi-t、内参-t和c线(如图3)；hsvi-t处包被hsvi包被探针、hsvii-t处包被hsvii包被探针、内参-t处包被内参包被探针、c线处包被c线包被探针，具体序列(5’-3’)为：c线包被探针：gtacatagtgatctgattttgtacatagtgatctga；内参线包被探针：cagacactatacagatttttcagacactatacagat；hsvi线包被探针：acaccagctatagatattttacaccagctatagata；hsvii线包被探针：actcacagatacatagttttactcacagatacatag。本发明提供利用上述基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测单纯疱疹病毒i型/ii型核酸的试剂盒检测单纯疱疹病毒i型/ii型核酸的方法，包括如下步骤：(1)rna恒温扩增本发明检测指标有三个：i型单纯疱疹病毒、ii型单纯疱疹病毒和人内参基因。针对每个指标设计一对(f/r引物)扩增引物，其中r引物5’端带有t7rna聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有t7启动子的r引物和逆转录酶的作用下，将待测rna转化为rna:cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna:cdna中的rna，得到单链cdna；在f引物和反转录酶的dna聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有t7启动子的双链dna；带有t7启动子的双链dna在t7rna聚合酶的作用下转录生成rna分子产物。转录的rna分子产物可以进入循环扩增过程，首先f引物会结合转录的rna分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的rna转化为rna:cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna:cdna中的rna，得到单链cdna；接着r引物会结合到单链cdna上，在反转录酶的dna聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有t7启动子的双链dna分子，为t7rna聚合酶提供更多的转录模板，进而在t7rna聚合酶的作用下转录生成大量的rna分子产物(如图1)。本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。(2)金探针层析a，设计特异探针、金探针、c线显色探针和包被探针特异探针：每个指标特异探针包括两种：ces系列和les系列，每种探针可以设计多条。其中ces探针包含两个部分，一端可以和扩增的rna产物特异性结合，另一端可以和包被在nc膜上的包被探针集合，起到固定扩增产物rna的作用，这两个部分用4～5个t链接。每条les探针也包含两个部分，一端可以和扩增的rna产物特异性结合，另一端可以和金探针结合，起到链接金探针显色的作用，这两个部分用4～5个t链接。金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，被标记到胶体金颗粒上。金探针可以和特异探针les的一端结合。包被探针：包被探针被固定在nc膜上，可以和特异探针ces的一端结合，起到固定的作用。每个包被探针含有两个拷贝，之间用4～5个t连接。c线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个t链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在nc膜上的c线包被探针结合。在层析时，无论有无rna扩增产物，c线显色探针都可以形成“c线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被nc膜上的c线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，ces系列同金探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。所述特异探针的ces系列和les系列设计多条的目的是为了提高固定的效率和结合更多的金探针，从而提高检测的灵敏度。b，试纸条检测所用试纸条有检测线和质控线，所述检测线包括在hsvi-t、hsvii-t、内参-t，其中hsvi-t处包被的hsvi包被探针能够特异性结合i型单纯疱疹病毒ces系列探针的一端；hsvii-t处包被的hsvii包被探针能够特异性结合ii型单纯疱疹病毒ces系列探针的一端；内参-t处包被的内参包被探针能够特异性结合内参ces系列探针的一端。所述质控线(c线)上包被c线包被探针能特异性结合c线显色探针。将特异探针ces、特异探针les、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效。结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：(1)核酸提取采集疑似单纯疱疹病毒患者生殖道或尿道拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒核酸分子。(2)rna恒温扩增向17μl的含有i型单纯疱疹病毒、ii型单纯疱疹病毒和内参引物的扩增反应液中加入2μl核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μl扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有单纯疱疹病毒核酸，扩增时会对指标rna分子进行大量扩增富集。(3)试纸条层析a，预杂交将rna恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及c线显色探针)混合，42℃预杂交10分钟。扩增出的rna分子与特异探针(包括ces系列探针与les系列探针)互补配对结合。ces系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端同nc膜上的包被探针结合；les系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当有扩增产物时可以形成“ces探针-rna分子-les探针-金探针复合物”。b，层析检测将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着nc膜向吸水纸方向层析，当有待测rna扩增产物时，“ces探针-rna分子-les探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被nc膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼看见的条带，此为阳性(如图4阳性)。若无待测rna产物扩增，“ces探针-rna分子-les探针-金探针复合物”就不会形成，胶体金颗粒就不能在t线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性(如图4阴性)。无论有无待测rna产物扩增，c线显色探针都可以形成“c线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着nc膜向前流动，当到达c线时，与c线处包被的探针结合，从而滞留在c线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。第二方面，提供上述基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测单纯疱疹病毒i型/ii型核酸的试剂盒在制备单纯疱疹病毒i型和/或ii型检测试剂中的应用。本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：1、本发明通过rna恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增i型单纯疱疹病毒、ii型单纯疱疹病毒和内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为rna，rna在自然环境中容易降解，相比较于pcr的方法扩增出dna更容易起到防止污染的效果。rna恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。2、由于i型、ii型单纯疱疹病毒序列同源性高达50％左右，在设计引物时尽量选择序列保守性较高同时两型之间差异较大的序列，既可以对两型病毒进行全覆盖又能达到分型检测的目的。同时本发明在设计引物时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。3、本发明在设计时引入的特异探针ces系列和特异探针les系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将金探针和rna核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标rna核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在nc膜上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表3所列的32种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对hsvi(atccvr-539)的最低检测限为8.0tcid50/ml、hsvii(atccvr-540)的最低检测限为6.4tcid50/ml。对于464份诊断结果均与单纯疱疹病毒感染相关临床样本的i型、ii型单纯疱疹病毒检测灵敏度、特异性高于某商品化检测i型、ii型单纯疱疹病毒荧光定量pcr试剂盒。4、本发明采用rna恒温扩增技术和试纸条层析技术，即应用了rna恒温扩增对仪器要求低的特点，又成功的融合了胶体金快速的特点。通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于单纯疱疹病毒核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。附图说明图1rna恒温扩增原理图；图2试纸条显色原理图；图3试纸条示意图；图4检测阴阳性示意图；a：hsvi阴性、hsvii阴性、内参阴性；b：hsvi阴性、hsvii阴性、内参阳性；c：hsvi阳性、hsvii阴性、内参阳性；d：hsvi阴性、hsvii阳性、内参阳性；e：hsvi阳性、hsvii阳性、内参阳性；具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(newyork:coldspringharborlaboratorypress,2005)中所述的条件进行。【实施例1】核酸检测试纸条的制备在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(nc膜)、样本垫、吸水纸、pvc底板等。1、喷膜：检测线hsvii-t：能够捕获结合hsvii特异探针ces序列，10μmhsvii包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；检测线hsvi-t：能够捕获结合hsvi特异探针ces序列，10μmhsvi包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；检测线内参-t：能够捕获结合内参特异探针ces序列，10μm内参包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；质控线(c线)：能够捕获结合c线显色探针序列，10μmc线包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2小时，存于干燥环境中备用。2、试纸条组装分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的nc膜、样品垫从上到下依次固定于pvc底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。【实施例2】灵敏度测试将atcc来源的hsvi(atcc编号vr-539)、hsvii(atcc编号vr-540)的病毒原液进行梯度稀释液最低检测限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，检出结果如下：hsvi最低检测限检测表1.1不同滴度hsvi的检测实验数据表1.2hsvi最低检测限实验数据hsvii最低检测限检测表2.1不同滴度hsvii的检测实验数据表2.2hsvii最低检测限实验数据最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：检测指标病毒株最低检测限hsviatccvr-5398.0tcid50/mlhsviiatccvr-5406.4tcid50/ml【实施例3】特异性验证1，测试菌株将不同的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体及滴度如下：表3特异性验证测试菌株信息微生物浓度微生物浓度腺病毒3型1.58×107tcid50/ml流行性腮腺炎病毒6.3×109tcid50/ml腺病毒7型1.58×108tcid50/ml呼吸道合胞病毒a型1.58×107tcid50/ml柯萨奇病毒b组5型2.8×108tcid50/ml呼吸道合胞病毒b型8.89×105tcid50/ml埃可病毒9型1.58×107tcid50/ml肺炎衣原体1.58×108tcid50/ml肠道病毒71型1.58×106tcid50/ml大肠杆菌(12～14)×108cfu/ml柯萨奇病毒a组16型1.58×105tcid50/ml流感嗜血杆菌2.4×106cfu/ml人副流感病毒1型1.58×104tcid50/ml无毒结核分枝杆菌3.2×106cfu/ml人副流感病毒2型2.8×106tcid50/ml肺炎链球菌2.6×106cfu/ml人副流感病毒3型1.58×107tcid50/ml化脓链球菌2.0×106cfu/ml麻疹病毒3.2×109tcid50/ml唾液链球菌2.1×106cfu/ml腮腺炎病毒8.89×105tcid50/ml人冠状病毒1.6×106tcid50/ml风疹病毒3.2×109tcid50/ml巨细胞病毒3.0×106tcid50/ml肺炎支原体106cfu/ml鼻病毒1a型4.0×106tcid50/ml铜绿假单胞菌(14～22)×108cfu/ml百日咳杆菌5.5×106cfu/ml金黄色葡萄球菌(24～40)×108cfu/ml脑膜炎奈瑟菌6×106cfu/ml淋球菌1.0×106cfu/ml人偏肺病毒2.8×106tcid50/ml2，测试结果测试结果如下：表4特异性验证测测试结果3，结论从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。【实施例4】临床样本的验证1，临床样本信息在湖北省武汉市第一医院共检测生殖道或尿道拭子样本464份，其中男性标本和女性标本分别为176例和288例，分别占比为37.93％和62.07％。464例标本中，患者年龄最大为67岁，最小为1个月，平均年龄为28.13岁，标准差为10.5岁，中位数为30岁。入组患者的诊断结果均与单纯疱疹病毒感染相关，2，检测结果(1)i型单纯疱疹病毒检测结果检测时使用本发明试剂盒和某商品化检测i型、ii型单纯疱疹病毒荧光pcr试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：对于不一致的3例样本采用“基因测序法”进行复测，1例阳性，为本发明专利检测阳性某商品化检测i型、ii型单纯疱疹病毒荧光pcr试剂盒检测阴性样本。测序结果表明某商品化检测i型、ii型单纯疱疹病毒荧光pcr试剂盒漏检一例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本时i型单纯疱疹病毒检测灵敏度更高，特异性更强。(2)ii型单纯疱疹病毒检测结果检测时使用本发明试剂盒和某商品化检测i型、ii型单纯疱疹病毒荧光pcr试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：对于不一致的9例样本采用“基因测序法”进行复测，5例阳性，为本发明专利检测阳性某商品化检测i型、ii型单纯疱疹病毒荧光pcr试剂盒检测阴性样本。测序结果表明某商品化检测i型、ii型单纯疱疹病毒荧光pcr试剂盒漏检5例，假阳4例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本时ii型单纯疱疹病毒检测灵敏度更高，特异性更强。序列表<110>武汉中帜生物科技股份有限公司<120>用于同时检测单纯疱疹病毒i型/ii型胶体金层析试剂盒及其应用<160>27<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgtcgggtcgggcggcttct20<210>2<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2taatacgactcactatagggagaggtgtgatggcgtccataaa43<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccaccgtcaccgtcttccac20<210>4<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aatacgactcactatagggagaacctccgccttgttcatgtaaa44<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agaaacggctaccacatcc19<210>6<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6taatacgactcactatagggagacaccagacttgccctcca41<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ggccgcggcgctcgcgcctttttatctatagctggtgt38<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tgtggggcggcgtggacctttttatctatagctggtgt38<210>9<211>43<212>dna<213>人工序列(artificial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