一种富硒乳酸菌制剂及其制备方法与流程

本发明涉及乳酸菌制剂的
技术领域：
，尤其涉及一种富硒乳酸菌制剂及其制备方法。
背景技术：
：硒是人体必需的微量矿质元素，是维持生命正常生长代谢的重要元素；已被联合国粮食与农业组织(foodandagricultureorganization，fao)和世界卫生组织(worldhealthorganization，who)共同确认为人体必需的一种重要微量元素，与机体正常生理功能的维持以及多种疾病的发生发展密切相关，是哺乳动物体内许多酶活性中心的必需组分，如谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，gpx)、脱碘酶(iodothyroninedeiodinases，id)等，具有保护细胞膜的结构和功能免受过度氧化损伤，抗癌、解毒、保肝和提高人体免疫力的生理功能。硒在人体无法长期贮存，也无法合成，人体必须从膳食中不断获得硒元素来供机体需要。据统计我国有2/3的人口居住在低硒或缺硒的地区，约有3亿人处于缺硒状态，因而人工补硒方法已受到国内外有关专家的广泛关注。传统的补硒的方法是用无机的亚硒酸钠制成口服制剂，但亚硒酸钠具有较强的毒副作用。有研究表明无机硒经生物转化后的有机硒化合物毒性低且吸收率更高，对于我国推广并用以改善硒缺乏的状态有极大的意义。近年来富硒乳酸菌已经成为乳酸菌领域一个重要的研究方向，有望取代富硒酵母成为首选的高效富硒微生态制剂。从相关的知识产权布局来看，目前对于富硒乳酸菌的研究还仅仅局限于有限的几株乳杆菌；更为重要的是，已有的研究均为乳酸菌在合成培养基中对于化学无机硒试剂(主要为硒酸钠)的富集情况，相关结果对于食品行业的指导意义有限。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的是公开一种富硒乳酸菌制剂及其制备方法，在植物乳杆菌st-iii的基础上，采用发酵手段从富硒茶中高效富集有机硒；其中植物乳杆菌st-iii菌种在公告号为cn1207382c的发明专利，发明名称为植物乳杆菌st-iii菌株及其在调节血脂方面的应用中公开。本发明是通过以下技术方案实现的：具体地，一方面，提供了一种富硒乳酸菌制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)活化菌种：将冷冻保存的lb.plantarumst-iii菌种接种于mrs液体培养基中，在37℃下厌氧培养18-22h，循环传代培养2-3次，得菌体培养物；(2)制备富硒茶浸出物：称取富硒茶样品2g，加入100℃、100ml的纯净水浸泡10min取上清液，经无菌滤膜过滤，得富硒茶浸出物；(3)配置番茄汁-te培养基：番茄汁的制备过程：成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸10分钟，6000g离心10分钟，取上清；并将所得番茄汁经115℃10min灭菌，待冷却至室温后加入步骤(2)所得富硒茶浸出物；其中所述富硒茶浸出物加入番茄汁-te培养基的质量浓度为0.06％-0.10％；(4)收集菌体：离心步骤(1)所得的菌体培养物，收集菌体；(5)发酵菌体：将步骤(4)收集的菌体经生理盐水清洗三次后重悬于步骤(3)所得的番茄汁-te培养基中，充分摇匀后静置37℃发酵48-96h；(6)将步骤(5)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次，离心、去上清，即得所述富硒乳酸菌制剂。通过上述技术方案，使用植物乳杆菌发酵的手段从富硒茶中高效富集有机硒。进一步地，所述富硒茶为恩施富硒茶。进一步地，在步骤(2)中，所述无菌滤膜的孔径为0.44μm。进一步地，在步骤(3)中，所述富硒茶浸出物的添加量为30ml/l-50ml/l。进一步地，所述mrs液体培养基的组成为：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000ml蒸馏水；所述mrs液体培养基的ph值为6.5，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min。另一方面，本发明还提供了一种富硒乳酸菌制剂，其由上述的富硒乳酸菌制剂的制备方法直接制得。通过上述技术方案，所得的制剂中富含有机硒元素，可以更好的发挥硒元素的健康功效。与现有技术相比，本发明具有以下优点：①、现有技术中仅仅提供了乳酸菌在合成培养基时，其对于化学试剂中的无机硒(主要为硒酸钠na2seo3)的富集情况。而本发明是采用发酵手段从绿茶中高效富集有机硒；②、所使用的恩施富硒茶自身含硒量也较高，能为乳酸菌提供丰富的硒来源，提高乳酸菌产品中硒的含量；③、本发明中制得的乳酸菌制剂能在富集的同时对硒元素进行转化，形成有机硒。附图说明图1是富硒乳酸菌的菌泥外观(st-iii：植物乳杆菌st-iii(l.plantarumst-iii)；lgg:鼠李糖乳杆菌gg(l.rhamnosusgg)；(-和+分别表示富硒前和富硒后)。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例的原料，如未作具体说明，均为市售购买所得。实施例1一种富硒乳酸菌制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)活化菌种：将冷冻保存的lb.plantarumst-iii菌种接种于mrs液体培养基中，在37℃下厌氧培养18-22h，循环传代培养2-3次，得菌体培养物；其中mrs液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。(2)制备绿茶浸出物：称取绿茶样品2g，加入100℃、100ml的纯净水浸泡10min取上清液，经无菌滤膜过滤，得绿茶浸出物；(3)配置番茄汁-te培养基：番茄汁的制备过程：成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸10分钟，6000g离心10分钟，取上清；并将所得番茄汁经115℃10min灭菌，待冷却至室温后加入步骤(2)所得绿茶浸出物；其中所述绿茶浸出物加入番茄汁-te培养基的质量浓度为0.10％；(4)收集菌体：离心步骤(1)所得的菌体培养物，收集菌体；(5)发酵菌体：将步骤(4)收集的菌体经生理盐水(0.9％nacl)清洗三次后重悬于步骤(3)所得的番茄汁-te培养基中，充分摇匀后静置37℃发酵48h；(6)将步骤(5)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次，离心、去上清，即得所述富硒乳酸菌制剂。按以下方法测定硒含量：按gb5009.93—2017《食品中硒的测定》中氢化物原子荧光光谱法进行测定。具体的富硒量按如下公式计算：富硒量(mg/g)＝菌体细胞内硒含量(mg)/菌体中细胞干重(g)经测定，本实施例1所得的富硒乳酸菌制剂中的硒含量为13.5mg/g。实施例2一种富硒乳酸菌制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)活化菌种：将冷冻保存的lb.plantarumst-iii菌种接种于mrs液体培养基中，在37℃下厌氧培养18-22h，循环传代培养2-3次，得菌体培养物；其中mrs液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。(2)制备绿茶浸出物：称取绿茶样品2g，加入100℃、100ml的纯净水浸泡10min取上清液，经无菌滤膜过滤，得绿茶浸出物；(3)配置番茄汁-te培养基：番茄汁的制备过程：成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸10分钟，6000g离心10分钟，取上清；并将所得番茄汁经115℃10min灭菌，待冷却至室温后加入步骤(2)所得绿茶浸出物；其中所述绿茶浸出物加入番茄汁-te培养基的质量浓度为0.06％；(4)收集菌体：离心步骤(1)所得的菌体培养物，收集菌体；(5)发酵菌体：将步骤(4)收集的菌体经生理盐水(0.9％nacl)清洗三次后重悬于步骤(3)所得的番茄汁-te培养基中，充分摇匀后静置37℃发酵48h；(6)将步骤(5)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次，离心、去上清，即得所述富硒乳酸菌制剂。测定硒含量的方法与实施例1相同；经测定，本实施例2所得的富硒乳酸菌制剂中的硒含量为10.8mg/g。实施例3一种富硒乳酸菌制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)活化菌种：将冷冻保存的lb.plantarumst-iii菌种接种于mrs液体培养基中，在37℃下厌氧培养18-22h，循环传代培养2-3次，得菌体培养物；其中mrs液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。(2)制备恩施富硒茶浸出物：称取恩施富硒茶样品2g，加入100℃、100ml的纯净水浸泡10min取上清液，经无菌滤膜过滤，得恩施富硒茶浸出物；(3)配置番茄汁-te培养基：番茄汁的制备过程：成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸10分钟，6000g离心10分钟，取上清；并将所得番茄汁经115℃10min灭菌，待冷却至室温后加入步骤(2)所得恩施富硒茶浸出物；其中恩施富硒茶浸出物加入番茄汁-te培养基的质量浓度为0.08％；(4)收集菌体：离心步骤(1)所得的菌体培养物，收集菌体；(5)发酵菌体：将步骤(4)收集的菌体经生理盐水(0.9％nacl)清洗三次后重悬于步骤(3)所得的番茄汁-te培养基中，充分摇匀后静置37℃发酵72h；(6)将步骤(5)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次，离心、去上清，即得所述富硒乳酸菌制剂。测定硒含量的方法与实施例1相同；经测定，本实施例3所得的富硒乳酸菌制剂中的硒含量为12.7mg/g。实施例4一种富硒乳酸菌制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)活化菌种：将冷冻保存的lb.plantarumst-iii菌种接种于mrs液体培养基中，在37℃下厌氧培养18-22h，循环传代培养2-3次，得菌体培养物；其中mrs液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。(2)制备恩施富硒茶浸出物：称取恩施富硒茶样品2g，加入100℃、100ml的纯净水浸泡10min取上清液，经无菌滤膜过滤，得恩施富硒茶浸出物；(3)配置番茄汁-te培养基：番茄汁的制备过程：成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸10分钟，6000g离心10分钟，取上清；并将所得番茄汁经115℃10min灭菌，待冷却至室温后加入步骤(2)所得恩施富硒茶浸出物；其中恩施富硒茶浸出物加入番茄汁-te培养基的质量浓度为0.10％；(4)收集菌体：离心步骤(1)所得的菌体培养物，收集菌体；(5)发酵菌体：将步骤(4)收集的菌体经生理盐水(0.9％nacl)清洗三次后重悬于步骤(3)所得的番茄汁-te培养基中，充分摇匀后静置37℃发酵96h；(6)将步骤(5)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次，离心、去上清，即得所述富硒乳酸菌制剂。测定硒含量的方法与实施例1相同；经测定，本实施例4所得的富硒乳酸菌制剂中的硒含量为13.9mg/g。对比实施例1本对比实施例的制备方法与实施例1相同，不同之处在于使用含硒量低的绿茶(信阳毛尖)，所得制剂中的含硒量为30μg/g。对比实施例2本对比实施例的制备方法与实施例1相同，不同之处在于直接使用mrs-mn培养基。经同样的操作，本对比实施例所得乳酸菌制剂中的硒含量为未检出。对比实施例3一种富硒乳酸菌制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)活化菌种：将冷冻保存的lb.rhamnosusgg菌种(immunomodulatoryconsequencesoforaladministrationoflactobacillusrhamnosusstraingginhealthyvolunteers.schultzm,lindehj,lehnn,zimmermannk,grossmannj,falkw,j.jdairyres.2003may；70(2):165-73)接种于mrs液体培养基中，在37℃下厌氧培养18-22h，循环传代培养2-3次，得菌体培养物；其中mrs液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。(2)制备绿茶浸出物：称取绿茶样品2g，加入100℃、100ml的纯净水浸泡10min取上清液，经无菌滤膜过滤，得绿茶浸出物；(3)配置番茄汁-te培养基：番茄汁的制备过程：成熟番茄清洗，去皮，榨汁，过滤取汁，煮沸10分钟，6000g离心10分钟，取上清；并将所得番茄汁经115℃10min灭菌，待冷却至室温后加入步骤(2)所得绿茶浸出物；其中绿茶浸出物加入番茄汁-te培养基的质量浓度为0.10％；(4)收集菌体：离心步骤(1)所得的菌体培养物，收集菌体；(5)发酵菌体：将步骤(4)收集的菌体经生理盐水(0.9％nacl)清洗三次后重悬于步骤(3)所得的番茄汁-te培养基中，充分摇匀后静置37℃发酵48h；(6)将步骤(5)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次，离心、去上清，即得所述富硒乳酸菌制剂。测定硒含量的方法与实施例1相同；经测定，本实施例3所得的富硒乳酸菌制剂中的硒含量为9.3mg/g。效果实施例1实施例与对比例的效果比较：单位(mg/g)，见下表1：实施例1对比例1对比例2对比例3富集后硒含量13.50.03-(未检出)9.3乳酸菌对硒的转化：现有技术中乳酸菌富集的硒主要表现为单质态和有机态；而单质态的硒会使所制得乳酸菌制剂呈现红色；本实施例中对鼠李糖乳杆菌gg(l.rhamnosusgg)菌泥的形态观察表明，其含有的硒主要为无机态，而本发明对植物乳杆菌st-iii(l.plantarumst-iii)菌泥的形态观察表明，其含有的硒为有机态(具体的比较见附图1)。本发明采用乳酸菌发酵的手段从绿茶等植物中高效富集硒元素；具体地，将植物乳杆菌按常规活化，离心收取菌体并洗涤后接种于mrs-te培养基(加入一定量的绿茶浸出物)，继续恒温培养24后离心、无菌生理盐水洗涤3次，即得富含有机硒的乳酸菌制剂；相比其他的富硒乳酸菌，本发明在制备方法和lb.plantarumst-iii菌种的协同作用下能在富集硒的同时对硒元素进行转化，形成有机硒(见附图1)。以上所述实施方式仅表达了本发明的一种或多种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3