一种基于circNFIX基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒及其使用方法与流程

【技术领域】

本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体涉及一种基于circnfix基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒及其使用方法。

背景技术：

胶质瘤是神经系统死亡率比较高的一种肿瘤，现在普遍的治疗方式是手术结合放射疗法或者化疗。尽管在胶质瘤的治疗上有许多进展，但是有效的策略仍被限制。因此，发现新标靶改善癌症治疗是很有必要的。一种有前途的疗法是基于环状rna(circrnas)。

circrnas是一种非长链编码rna，通过调控多种生物学过程在不同种类癌症中起到重要作用，包括增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭，它将rna的3'末端到5'末端环状化。它们分布在神经组织中，在大脑疾病中发挥关键作用，包括胶质瘤。列如，lei等报道，circrna中_circ_0076248通过调控mir-181和sirt1促进胶质瘤增殖和侵袭。shi等研究表明，circrna中_circ_0014359通过标靶mir-153/pi3k促进胶质瘤发展。此外，wang等提到，circrna中_circ_0005198通过海绵状mir-1294促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。除了这些，circrna中_circ_0079593也曾被报道促进癌症发生并且表明胶质瘤的不良预后。至于nfix,已经被证实与多种器官系统的发展有关联，包括大脑。更重要的是，相应的circnfix能够通过调控mir-34a-5p促进胶质瘤细胞增殖。然而，circnfix在胶质瘤中的影响和机制还需要更多的研究。

微小rnas(mirnas)作为一种小非长链编码rna已经被视为治疗大脑癌症重要的标靶。此外，新出现的证据表明，mirnas在胶质瘤形成和发展过程中起到关键的作用。先前有研究证实，mir-378在胶质瘤中异常表达并且起到抑制肿瘤的作用。mir-378e是mir-378家族中的一个重要成员，并且这个研究想要去调查mirna在胶质瘤中更深层次的作用。先前有研究表明circrnas在癌症中通过竞争内源性rnas(cernas)网发挥主要的生物学作用。starbase在线数据库预测了mir-378e和rpn2互补序列，表明了circnfix/mir-378e/rpn2潜在的cerna网。通过这项研究，我们了解到circnfix在胶质瘤细胞中的作用和机制。通过结合体外和体内试验，我们证实了在circnfix在胶质瘤中的调控机制与mir-378e/rpn2有关联。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题，在于提供一种基于circnfix基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒及其使用方法，其可特异、灵敏、快速的检测出circnfix的含量，可为胶质瘤辅助诊断和预后判断提供更加精准、更加客观的参考指标。

本发明是这样实现的：

一种基于circnfix基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括扩增circnfix基因的pcr引物对、扩增内参基因gapdh的pcr引物对、聚合酶链式反应体系、rna提取试剂以及mrna反转录为cdna的体系；

所述扩增circnfix基因的pcr引物对为：

正向引物序列为：5’-aggagatgcggacatcaaac-3’，如seqidno.1所示；

反向引物序列为：5’-gtgaaatacgggctcgactg-3’，如seqidno.2所示；

所述扩增内参基因gapdh的pcr引物对为：

正向引物序列为：5’-gaatgggcagccgttaggaa-3’，如seqidno.3所示；

反向引物序列为：5’-aaaagcatcacccggaggag-3’，如seqidno.4所示。

进一步地，所述聚合酶链式反应体系包括pcr缓冲液、dntps、荧光染料、无酶水和荧光定量加样板。

进一步地，所述rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、乙醇和无酶水。

进一步地，所述反转录为cdna的体系包含gdnaeraser、gdnaeraserbuffer、反转录反应液、反转录酶和dntps。

进一步地，所述的基于circnfix基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)、将获取的新鲜组织经过研碎后，进行rna抽提；

(2)、将抽提出的rna反转录成对应的cdna；

(3)、将反转录后的cdna进行circnfix和gapdh基因的pcr扩增；

(4)、以gapdh作为内参，记录每个反应的ct值，检测结果以δct表示。

本发明具有如下优点：

本发明的试剂盒为circnfix的检测提供了新的方式，且本发明试剂盒可特异、灵敏、快速的检测出circnfix的含量，可为胶质瘤辅助诊断和预后判断提供更加精准、更加客观的参考指标。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为胶质瘤组织和正常样本中circnfix表达水平系列图。

图2为circnfix基因敲低导致胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡，抑制胶质瘤细胞糖酵解、迁移和侵袭影响系列图，其中，a为qrt-pcr检测t98和u251细胞转染si-circnfix或si-nc后的转染效率图，转染si-circnfix后，细胞表达circnfix明显降低；b为流式细胞检测图之一，该图数据显示，敲低circnfix后t98胶质瘤细胞停滞在细胞周期g0-g1期的比例明显上升；c为流式细胞检测图之二，该数据显示，敲低circnfix后u251胶质瘤细胞停滞在细胞周期g0-g1期的比例明显上升；d为敲低circnfix可抑制胶质瘤细胞代谢分析图，敲低circnfix后t98和u251胶质瘤细胞中糖酵解的水平明显降低；e为敲低circnfix可抑制胶质瘤细胞代谢分析图，敲低circnfix后t98和u251胶质瘤细胞中的乳酸生成明显减少；f为敲低circnfix可抑制胶质瘤细胞代谢分析图，敲低circnfix后t98和u251胶质瘤细胞中的代谢相关蛋白hk2蛋白的含量明显下降；g为trans-well实验结果图之一，该图表明敲低circnfix显着抑制了t98和u251胶质瘤细胞的迁移能力；h为trans-well实验结果图之二，该图表明敲低circnfix显着抑制了t98和u251胶质瘤细胞的侵袭能力；i为流式细胞实验结果图，该图显示敲低circnfix导致t98和u251胶质瘤细胞大量凋亡。

【具体实施方式】

本发明涉及一种基于circnfix基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括扩增circnfix基因的pcr引物对、扩增内参基因gapdh的pcr引物对、聚合酶链式反应体系、rna提取试剂以及mrna反转录为cdna的体系；

所述扩增circnfix基因的pcr引物对为：

正向引物序列为：5’-aggagatgcggacatcaaac-3’，如seqidno.1所示；

反向引物序列为：5’-gtgaaatacgggctcgactg-3’，如seqidno.2所示；

所述扩增内参基因gapdh的pcr引物对为：

正向引物序列为：5’-gaatgggcagccgttaggaa-3’，如seqidno.3所示；

反向引物序列为：5’-aaaagcatcacccggaggag-3’，如seqidno.4所示。

所述聚合酶链式反应体系包括pcr缓冲液、dntps、荧光染料、无酶水和荧光定量加样板。

所述rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、乙醇和无酶水。

所述反转录为cdna的体系包含gdnaeraser、gdnaeraserbuffer、反转录反应液、反转录酶和dntps。

本发明还涉及所述的基于circnfix基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)、将获取的新鲜组织经过研碎后，进行rna抽提；

(2)、将抽提出的rna反转录成对应的cdna；

(3)、将反转录后的cdna进行circnfix和gapdh基因的pcr扩增；

(4)、以gapdh作为内参，记录每个反应的ct值，检测结果以δct表示。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例中的实验方法若无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料若无特殊规定均为常规生化试剂和材料。

实施例

一、临床标本来源的胶质瘤中circnfix表达高低绘制生存曲线

申请人测量了circnfix在64个胶质瘤组织和15个正常样本中的水平。将64例患者被分为高或低circnfix表达组，如图1a所示，与正常对照组相比，胶质瘤组织中circnfix的表达水平明显增强，且低级和高级组之间存在显著差异。此外，如图1b所示，与ha细胞相比较，circnfix的丰度在胶质瘤细胞中显着上调，特别是在t98和u251细胞中。另外，将64例患者被分为高或低circnfix表达组，且我们发现circnfix高表达与who阶段，肿瘤大小和病患低生存率有关。进一步在胶质瘤临床样本中证实了高表达circnfix的患者预后显著差于低表达circnfix患者。

二、为了研究circnfix在胶质瘤中的作用，在胶质瘤t98和u251细胞中，circrna的表达通过导入si-circnfix被敲低，如图2a所示。此外，流式细胞术的数据显示，敲低circnfix导致t98和u251细胞中的g0-g1期的细胞周期停滞，如图2b和2c所示。此外，敲低circnfix显着抑制了两种细胞中的糖酵解，通过降低葡萄糖消耗，乳酸产生和hk2蛋白水平显示，如图2d-2f所示。此外，trans-well的分析描述了通过沉默circnfix显着抑制t98和u251细胞的迁移和侵袭，如图2g和2h所示。除此外，流式细胞仪的结果显示，circnfix敲低导致t98和u251细胞大量凋亡，如图2i所示。可见circnfix也是潜在的胶质瘤治疗靶点。

三、本发明试剂盒的检测过程如下：

1.将待测的新鲜组织研碎，在碎裂后的组织中加入trizol，使用移液枪反复吹打，室温孵育5-10min。

2.将待测标本中加入氯仿，上下颠倒混匀。待溶液充分乳化后，室温静置5min。4℃离心。

3.从离心机中小心取出离心管，吸取上层上清液移至新的离心管中。

4.加入等体积的异丙醇，充分混匀后，室温静置10min；4℃离心，取沉淀。再次加入1ml75％乙醇，4℃离心后弃去上清。

5.室温干燥沉淀5min，加入适量的rnase-free水溶解沉淀，利用nanodrop检测rna的浓度及纯度。od260/od280比值在1.70-2.0之间，说明rna纯度符合实验要求。

6.将rna反转录呈cdna：首先配置5×gdnaeraserbuffer(2μl)、gdnaeraser(1μl)、rna(1μ)和rnase-free水混合体系，共10μl，42℃，2min；将5×primescriptbuffer2(4μl)、primescriptrtenzymemix(1μl)、rtprimermix(1μl)、rnase-free水(4μl)及上述混合液(10μl)进行混合，短暂离心后放入pcr仪，反应条件：37℃反应15min，85℃反应5秒，获得cdna。

7.使用荧光定量板，每个样本设2个复孔，将cdna(稀释4～5倍，稀释后取2μl)、将sybergreen和rcr缓冲液混合一起每孔12μl，pcr引物每孔8μl。

8.pcr反应体系设置：95℃10min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，30-50个循环；

9.circnfix含量分析：以gapdh作为内参，记录每个反应的ct值，ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。δct＝ctgene-ctgapdh，δct越小表示其起始拷贝数越多，circnfix表达越高。

在pcr扩增后，通过凝胶电泳检测是否提取到的rna就是circnfix，将rna药品4.5μl和上样缓存液1μl，混合后电泳上样(100伏，10-30分钟)，上样前预电泳5min。rrna作为内部参照分子，通过观察rrna的两条带(28s和18s)的对比，可以判断提取mrna存在降解，确定提取到的就是circnfix。

综上，在胶质瘤临床样本中证实了高表达circnfix的患者预后显著差于低表达circnfix患者，本发明的试剂盒为circnfix的检测提供了新的方式，且本发明试剂盒可特异、灵敏、快速的检测出circnfix的含量，可为胶质瘤辅助诊断和预后判断提供更加精准、更加客观的参考指标。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110>福建医科大学附属第一医院

<120>一种基于circnfix基因的胶质瘤辅助诊断试剂盒及其使用方法

<130>100

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>1

aggagatgcggacatcaaac20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>2

gtgaaatacgggctcgactg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>3

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<211>20

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>4

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