高分辨率DNA阵列的制备方法及其在测序中的应用与流程

交叉引用

本申请要求2018年1月5日提交的第62/614,307号美国临时专利申请的优先权，出于所有目的，其通过引用全文被纳入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在美国政府的支持下，由美国国立卫生研究院授予的拨款号为1r43hg008582-01和5r43hg008582-02的专利。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术：

生物科学的重大进步使人们在了解生命、健康、疾病和治疗机制方面取得了前所未有的进展。具体来说，基因组测序已被用于获取包括诊断、预后、生物技术、个体化医疗和法医等领域的生物医学信息。高密度核酸微阵列已被广泛应用于基因组序列分析，包括突变和多态性的检测和分析、细胞遗传学(拷贝数)、核蛋白质组学、基因表达谱和转录组分析。

将生物分子固定在固体载体上的生物分子阵列已被应用于分子生物学领域。生物分子固定化可以提供例如允许使用多种样本和靶分子信号的位置寻址识别的优势。在平坦的固体载体上建立生物分子阵列(包括寡核苷酸阵列)，已经吸引了大量的研究。

具体来说，微阵列(dna芯片)是生物分子高通量分析的重要工具。微阵列制备的一个关键组成部分是固定dna探针的化学方法。其他需要考虑的因素包括表面的亲水性、表面结合探针的可及性、探针的密度以及基本化学过程的再现性。a.sassolas等人，chem.rev.(2008)108(1):109-39。构建寡核苷酸微阵列的一种方法是使用光刻或沉积方法在芯片表面原位合成寡核苷酸。d.sethi等人，bioconjugatechem.(2008)19(11):2136-43。

技术实现要素：

尽管核酸测序技术的最新进展极大地改进了核酸(包括脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna))的常规检测，但解析大型生物分子的精确序列仍是一项重大挑战。核酸测序是现代技术例如个体化医疗的必不可少的一项基本技术。尽管近年来dna测序技术发展迅速，但仍然需要改进dna和rna测序方法，包括长核酸测序。

本发明提供了用于制备在至少一个维度上的特征不大于1μm的寡核苷酸微阵列的方法、系统和组合物。

一个方面，本发明提供了一种在微阵列上形成寡核苷酸的方法，包括：(a)通过将光刻胶组合物施加到基板的底层上而形成光刻胶层，其中所述光刻胶组合物包括光酸产生剂和光敏剂，底层包括多个被保护基团保护的官能团；(b)通过带图案的掩模将一定剂量的光照射到基板上；以及(c)去除基板的至少一个曝光区域内的多个官能团的一部分上的保护基团；从而在所述基板上形成图案，其中所述图案包括至少一个曝光区域，并且其中至少一个曝光区域在至少一个维度上不大于1微米。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述官能团是氨基或羟基。在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括：(d)使基板的至少一个曝光区域内的官能团与第一核苷酸试剂接触，从而将基板的至少一个曝光区域内的一部分官能团与第一核苷酸偶联。在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括：(e)通过另一图案掩模将另一剂量的光曝光到基板上；(f)在基板的至少另一曝光区域内去除多个官能团的另一部分上的保护基团；从而在基板上形成另一图案，其中所述另一图案包括至少另一曝光区域，并且所述至少另一曝光区域在至少一个维度上不大于1微米。在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括：(g)使基板的至少另一曝光区域内的官能团与第二核苷酸试剂接触，从而将基板的至少另一曝光区域内的一部分官能团与第二核苷酸偶联。在本发明提供的方面的一些实施方案中，第一核苷酸与第二核苷酸不同。在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述至少一个曝光区域与所述至少另一曝光区域不同。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括：(e)通过将另一种光刻胶组合物施加到所述基板上来形成另一种光刻胶层，其中所述另一种光刻胶组合物包含另一种光酸产生剂和另一种光敏剂，其中底层包括被保护基团保护的多个官能团；(f)通过另一带图案的掩模将另一剂量的光照射到基板上；(g)去除所述基板的至少另一曝光区域内的多个官能团的另一部分上的保护基团和/或所述第一核苷酸上的核苷酸官能团上的核苷酸保护基；从而在基板上形成另一图案，其中另一图案包括至少另一曝光区域。在本发明提供的方面的一些实施方案中，至少另一曝光区域在至少一个维度上不大于1微米。在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括(h)使基板的至少另一曝光区域内的第一核苷酸上的官能团和/或核苷酸官能团与第二核苷酸试剂接触，从而将基板的至少另一曝光区域内的另一部分官能团和/或核苷酸官能团与第二核苷酸偶联。在本发明提供的方面的一些实施方案中，第一核苷酸与第二核苷酸不同。在本发明提供的方面的实施方案中，所述至少一个曝光区域与所述至少另一曝光区域不同。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，至少一个曝光区域在至少一个维度上不大于950nm、900nm、850nm、800nm、750nm或700nm。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比基本相同。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比相同。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，光刻胶组合物还包括除酸剂、基质和溶剂。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光刻胶组合物包含：光酸产生剂：约2-5％(按重量计)；光敏剂：约2-5％(按重量计)；除酸剂：约0.1-0.5％(按重量计)；基质：约2.5-4.5％(按重量计)；溶剂：约85-93.4％(按重量计)。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光刻胶组合物包含：光酸产生剂：约2.5-4.5％(按重量计)；光敏剂：约2.5-4.5％(按重量计)；除酸剂：约0.15-0.35％(按重量计)；基质：约3.0-4.0％(按重量计)；溶剂：约86.7-91.8％(按重量计)。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比基本相同。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比相同。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述图案和/或另一图案包含寡核苷酸的特征；并且其中所述寡核苷酸的特征的最小尺寸在至少一个维度上不大于1μm。在本发明提供的方面的一些实施方案中，寡核苷酸的特征的最小尺寸在至少一个维度上不大于950nm、900nm、850nm、800nm、750nm或700nm。在本发明提供的方面的一些实施方案中，寡核苷酸在两个维度上的特征不大于950nm、900nm、850nm、800nm、750nm或700nm。在本发明提供的方面的一些实施方案中，通过使用超分辨率显微镜来测量图案的特征、另一图案的特征、至少一个曝光区域、至少另一个曝光区域和/或寡核苷酸特征的方法尺寸。

在另一方面，本发明提供了一种在微阵列上形成寡核苷酸图案的方法，其包括：(a)在选定区域中光敏剂存在时激活光酸产生剂，从而从光酸产生剂中生成酸，其中基板包括受保护基团保护的官能团，其中保护基团被酸除去；(b)使基板与用于寡核苷酸合成的试剂接触；(c)用另一种寡核苷酸合成的试剂重复步骤(a)和(b)；从而形成寡核苷酸图案，其中寡核苷酸图案的至少一个特征在至少一个维度上不大于1μm。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括加热基板。在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括将光引导至步骤(a)中的选定区域。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光的印刷剂量被引导至选定区域。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光的印刷剂量从光酸产生剂产生酸。在本发明提供的方面的一些实施方案中，当不超过三分之一的印刷剂量被导向选定区域时，选定区域内的另一种光酸产生剂不会从另一种光酸产生剂产生另一种酸。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(a)中包括除酸剂。在本发明提供的方面的一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(a)之前，用包含光酸产生剂和光敏剂的光刻胶制剂涂覆基板。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光刻胶制剂还包括基质和溶剂。在本发明提供的方面的一些实施方案中，寡核苷酸图案的至少一个特征包括寡核苷酸的多个特征。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，选定区域和/或寡核苷酸的多个特征在至少一个维度上不大于1μm。在本发明提供的方面的一些实施方案中，选定区域、寡核苷酸图案的至少一个特征和/或寡核苷酸的多个特征在至少一个维度上不大于950nm、900nm、850nm、800nm、750nm或700nm。在本发明提供的方面的一些实施方案中，选定区域、寡核苷酸图案的至少一个特征和/或寡核苷酸的多个特征在两个维度上不大于950nm、900nm、850nm、800nm、750nm或700nm。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，使用旋涂机进行步骤(a)。在本发明提供的方面的一些实施方案中，通过使用寡核苷酸合成仪进行步骤(b)。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比基本相同。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比相同。

另一方面，本发明提供了一种光刻胶组合物，其包含：光酸产生剂：约2-5％(按重量计)；光敏剂：约2-5％(按重量计)；除酸剂：约0.1-0.5％(按重量计)；基质：约2.5-4.5％(按重量计)；和溶剂：约85-93.4％(按重量计)。

在本发明提供的方面的一些实施方案中，光刻胶组合物包含：光酸产生剂：约2.5-4.5％(按重量计)；光敏剂：约2.5-4.5％(按重量计)；除酸剂：约0.15-0.35％(按重量计)；基质：约3.0-4.0％(按重量计)；溶剂：约86.7-91.8％(按重量计)。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比基本相同。在本发明提供的方面的一些实施方案中，光敏剂的重量百分比与光酸产生剂的重量百分比相同。

通过下文的详细描述，本发明的其他方面和优点对于本领域的技术人员来说将变得显而易见，其中仅示出和描述了本发明的示例性实施方案。技术人员将会认识到，本发明具有实现其他不同的实施方案的能力，并且能够修改各个明显方面的若干细节，所有这些都不偏离本发明内容。因此，附图和说明应被视为是示例性的，而非限制性的。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物和专利申请均以引用方式并入本文中，如同每个单独的出版物或专利申请都被明确地单独指出通过引用被纳入一样。

附图说明

本发明的新颖特征特别在所附权利要求书中示出。参考以下详细说明和附图(此处也指“fig”和“figs”)，将更好地理解本发明的特征和优点。详细说明中给出了采用本发明原理的示例性实施方案，其中：

图1示意性地图示了寡核苷酸zipcode的示例。图1公开了seqidno:3。

图2描绘了百万碱基测序的示例。

图3显示了由asmlpa/60i-line步进机计算出的空间图像的示例。

图4图示了“对比度”曲线测量的示例。

图5a示出了使用asmlpa/60进行单碱基添加的制剂的1.2μm线和间隔(l/s)图案(2.4μm间距)。

图5b示出了使用asmlpa/60进行单碱基添加的制剂的0.6μml/s图案。

图5c示出了使用asmlpa/60进行单碱基添加的制剂的0.4μml/s图案。

图6描绘了用于单碱基添加的制剂的600nml/s图案的随机光学重建显微镜(storm)图像。

图7示出了生成酸的制剂的剂量-反应曲线。

图8图示了使用碱基添加的制剂时的接触光刻网点分辨率图案。

图9a描绘了700nml/s图案的印刷的标记寡核苷酸的荧光图像。图9b图示了沿图9b所示图案截面的荧光强度。

图10示出了印刷的标记寡核苷酸的storm超分辨率图像。

具体实施方式

尽管在此已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以作出许多改变、变型和替代。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

人类基因组具有复杂的结构。即使借助可读取短片段dna片段的dna测序技术，这些结构仍可能难以分析。长dna片段测序的一种方法可能是将长dna分子排列到zipcodedna或rna阵列上。zipcode阵列可包括空间定义的寡核苷酸或可编码位置信息的其他聚合物，诸如，举例而言，与阵列有关的寡核苷酸的位置信息。这些在空间定义的寡核苷酸也可以称为位置编码的zipcode分子、zipcode分子、zipcodedna或zipcoderna。这些位置编码的zipcode分子可以与阵列表面排列的长dna分子发生反应，以将dna序列复制到位置编码的zipcode分子上，或者将zipcode分子附接到相邻的分子上，无论是相邻的zipcode分子、排列的长dna分子，还是排列的长dna分子的一个片段。可能存在生化方法将这些zipcode分子连接到阵列表面上的定位的或排列的dna序列，以便在对连接的分子进行测序时，代表长dna分子一部分的片段可与阵列表面的一个或多个zipcode分子相关联。由于通过解码的zipcode分子的序列可以知道zipcode分子的位置，因此可以确定长dna分子内dna片段序列的位置关系。

如本文所用，术语“zipcode”通常是指已知的、可确定的和/或可解码的序列，诸如，举例而言，核酸序列(dna序列或rna序列)、蛋白质序列和聚合物序列(包括合成聚合物、碳水化合物、脂质等)，可以识别在一维、二维或多维空间中的例如核酸的序列的特定位置。zipcode可以对可解码序列的自身位置进行编码。例如，每个zipcode可以是核酸(可以是在一个空间定义的位置上的多个拷贝，该空间定义的位置可以是例如从大约10nm到大约1cm的任何尺寸的正方形特征，包括例如，不大于0.1μm、不大于0.2μm、不大于0.3μm、不大于0.4μm、不大于0.5μm、不大于0.6μm、不大于0.7μm、不大于0.8μm、不大于0.9μm、不大于1μm、不大于1.2μm、不大于1.4μm、不大于1.6μm、不大于1.8μm、不大于2μm、不大于5μm、不大于10μm、不大于20μm、不大于30μm、不大于40μm、不大于50μm、不大于100μm、不大于200μm、不大于500μm、不大于1mm、不大于2mm和不大于5mm。zipcode阵列可用于检测核糖核酸(rna)、蛋白质、脱氧核糖核酸(dna)或其他分子在二维或三维空间中的分布。可以在组织、细胞、生物或非生命系统中检测到这些分子。如果核酸序列是zipcode，则该核酸序列的互补序列也可以是zipcode。在本发明中，zipcode及其互补拷贝对zipcode阵列中的相同定位/位置进行编码。

可以设计zipcode以实现精确的序列性能，例如，gc含量在40％至60％之间、均聚物不连续出现超过2次、自互补片段的长度不大于3，并且由没有出现在人类基因组参考中的序列组成。zipcode可以有足够的长度，并且包括可以足够不同的序列，以允许通过与每个核酸或肽相关联的zipcode来识别每个核酸(例如，寡核苷酸)或肽。

除非上下文另外明确规定，否则在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，提及的“一个分子”包括多个这样的分子等等。

本文使用的“大约”或“接近”一般指约定数量的正负15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％以内。

除非另有说明，否则本文使用的开放性术语，例如，“包含”、“含有”、“包括”、“具有”等是指包括。

如本文所用，术语“嵌入”和“一系列合成步骤”一般指设计用于在基板上形成单个聚合物的一系列有效和无效步骤，并且可以互换使用。例如，在采用光导合成方法的情况下，“嵌入”指的是一系列曝光和非曝光步骤。

如本文所用，术语“条形码”通常是指传递或能够传递关于分析物的信息的标记或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以独立于分析物。条形码可以是附着在分析物(例如，核酸分子)上的标签，也可以是除了分析物的内源性特征(例如，分析物的大小或末端序列)之外的标签的组合。条形码可以是唯一的。条形码可以有各种不同的格式。例如，条形码可以包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附着在分析物上。例如，可以在样品测序之前、期间和/或之后将条形码添加到脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)样本的片段中。条形码可允许识别和/或量化单个序列读段(reads)。

如本文所用，术语“基板”通常指包含非生物、合成、无生命、平面、球形或平坦表面的物质、结构、表面、材料、装置或组合物。基板可以包括，例如但不限于半导体、合成金属、合成半导体、绝缘体和掺杂剂；金属、合金、元素、化合物和矿物；合成、切割、蚀刻、光刻、印刷、机加工和微加工的载玻片、器件、结构和表面；工业聚合物、塑料、薄膜；硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；木材、纸张、纸板、棉花、羊毛、布、织造和非织造纤维、材料和织物；纳米结构和微观结构。基板可包含固定基质，例如但不限于不溶性物质、固相、表面、层、涂层、织造或非织造纤维、基质、晶体、膜、不溶性聚合物、塑料、玻璃、生物或生物相容或生物可侵蚀或生物可降解的聚合物或基质、微粒或纳米颗粒。其它示例可包括，例如但不限于单分子层、双分子层、商用膜、树脂、基质、纤维、分离介质、色谱载体、聚合物、塑料、玻璃、云母、金、珠、微球、纳米球、硅、砷化镓、有机和无机金属、半导体、绝缘体、微观结构和纳米结构。微观结构和纳米结构可包括但不限于微型化、纳米级和超分子探针、针尖、棒、钉、塞、杆、套、线、丝和管。

如本文所用，术语“核酸”通常是指包含一个或多个核酸亚基或核苷酸的聚合物。一个核酸可以包括一个或多个选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的亚基。一个核苷酸可以包括a、c、g、t或u或其变体。一个核苷酸可以包括可以掺入一个正在生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是a、c、g、t或u，或对一个或多个互补a、c、g、t或u特异的任何其他亚基，或与嘌呤(即a或g或其变体)或嘧啶(即c、t或u或其变体)互补的任何其他亚基。亚基可以使单个核酸碱基或碱基组(例如，aa、ta、at、gc、cg、ct、tc、gt、tg、ac、ca或尿嘧啶对应物)被拆解。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)或其衍生物。核酸可以是单链或双链的。

如本文所用，术语“相邻(adjacent)”或“相邻(adjacentto)”包括“邻近(nextto)”、“毗连(adjoining)”和“邻接(abutting)”。在一个实例中，当第一位置与第二位置直接接触并且共享公共边界，并且两个位置之间没有空间时，第一位置与第二位置相邻。在某些情况下，相邻不是对角线相邻。

如本文所用，术语“生物分子”通常是指存在于生物体或其衍生物中的任何分子。生物分子包括蛋白质、抗体、肽、酶、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、适体、初级代谢物、次级代谢物和天然产物。

如本文所用，术语“受试者”通常是指动物，例如哺乳动物(例如，人)或禽类(例如，鸟)，或其他有机体，例如植物。例如，受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如小鼠)、灵长类、猿猴或人。动物可以包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可以是健康或无症状的个体、患有或疑似患有疾病(例如癌症)或易感疾病的个体和/或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。受试者可以是微生物(如细菌、真菌、古菌、病毒)。

如本文所用，术语“基因组”通常是指来自受试者的基因组信息，这些信息可能是例如一个受试者的遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以编码为dna或rna。基因组可以包括编码区(例如，蛋白质编码区)以及非编码区。基因组可以包括生物体中所有染色体的序列。例如，人类基因组通常总共有46条染色体。所有这些序列共同构成人类基因组。

术语“衔接头”和“标签”可以同义使用。衔接头或标签可以通过任何方法(包括连接、杂交或其他方法)与多核苷酸序列偶联以被“标记”。

如本文所用，术语“测序”通常是指确定一种或多种多核苷酸中核苷酸碱基的序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)等核酸分子，包括其变体或衍生物(如单链dna)。测序可通过现有的各种系统进行，所述系统例如但不限于，pacificbiosciencesoxford或lifetechnologies的测序系统。替代地或附加地，也可采用核酸扩增、聚合酶链反应(pcr)(例如，数字pcr、定量pcr或实时pcr)或等温扩增来进行测序。此类系统可提供多个由系统从受试者提供的样品生成的、与受试者(例如，人)的遗传信息相对应的原始遗传数据。在一些实例中，此类系统提供了测序读段(在本文中也称为“读段”)。一个读段可包括与已测序的核酸分子序列相对应的一串核酸碱基。在某些情况下，本文提供的系统和方法可以与蛋白质组信息一起使用。

如本文所用，术语“样品”通常是指受试者的生物样品。生物样品可以包含任意数量的大分子，如细胞大分子。样品可以是细胞样品。样品可以是细胞系或细胞培养物样品。样品可以包括一个或多个细胞。样品可以包括一种或多种微生物。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品也可以是碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可以从另一个样品中获得。样品可以是组织样品，如活检、核心活检、穿刺抽吸或细针抽吸。样品可以是液体样品，例如血液样品、尿液样品或唾液样品。该样品可以是皮肤样品。样品可以是脸颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是无细胞或脱细胞的样品。无细胞样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从选自血液、血浆、血清、尿液、唾液、黏膜分泌物、痰液、粪便和泪液的身体样本中分离。

本文所用的术语“核酸序列”或“核苷酸序列”通常是指具有给定核苷酸序列的核酸分子，其中可期望知道所述核苷酸的存在或数量。核苷酸序列可以包括核糖核酸(rna)或dna，或衍生自rna或dna的序列。核苷酸序列的实例是对应于天然或合成rna或dna(包括基因组dna和信使rna)的序列。序列的长度可以是可以被扩增成核酸扩增产物或扩增子的任何长度，例如，长度为最高达约20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、1,000、1,200、1,500、2,000、5,000、10,000或大于10,000个核苷酸，或长度为至少约20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、1,000、1,200、1,500、2,000、5,000、10,000或10,000个核苷酸。

如本文所用，术语“模板”通常是指单个多核苷酸分子，可以通过核酸聚合酶从该多核苷酸分子合成另一种核酸(包括互补的核酸链)。此外，模板可以是多核苷酸的一条链或两条链，所述多核苷酸能够作为模板，用于由核酸聚合酶催化的依赖模板的核酸聚合。该术语的使用不应被视为将本发明的范围限制为在随后的酶催化的聚合反应中实际用作模板的多核苷酸。模板可以是rna或dna。模板可以是对应于rna序列的cdna。模板可以是dna。

如本文所用，模板核酸的“扩增”一般是指生成(例如，在体外)与至少一部分的模板核酸序列或用作模板核酸序列的替代物的通用序列或标签序列相同或互补的核酸链的过程，所有这些都只有在模板核酸存在于样本中时才会产生。通常，核酸扩增使用一种或多种核酸聚合酶和/或转录酶来产生模板核酸或其片段的多个拷贝，或与模板核酸或其片段互补的序列的多个拷贝。体外核酸扩增技术可包括转录相关的扩增方法，例如转录介导扩增(tma)或基于核酸序列的扩增(nasba)，以及其他方法，例如聚合酶链反应(pcr)、逆转录酶pcr(rt-pcr)、复制酶介导的扩增以及连接酶链反应(lcr)。

如本文所用，术语“转座体”通常是指包含整合酶(如整合酶或转座酶)和包含整合识别位点(如转座酶识别位点)的核酸的复合物。在一些实例中，转座酶可以与能够催化转座反应的转座酶识别位点形成功能复合物。转座酶可以结合到转座酶识别位点并将该转座酶识别位点插入到靶核酸中，这个过程有时被称为“标记片段化(tagmentation)”。在一些实例中，转座酶识别位点的一条链可被转移到靶核酸中。在一些实例中，转座体可以包括二聚转座酶，该二聚转座酶包含两个亚基和两个不连续的转座子序列。在一些实例中，转座体可以包含二聚转座酶，该二聚转座酶包含两个亚基和连续的转座子序列。

转座酶可包括但不限于mu、tn10、tn5、高活性tn5。参见goryshin和reznikoff,j.biol.chem.,273:7367(1998)。一些实例可以包括使用高活性tn5转座酶和tn5型转座酶识别位点。参见goryshin和reznikoff,j.biol.chem.,273:7367(1998)。一些实例可以包括mua转座酶和包括rl和r2末端序列的mu转座酶识别位点。参见mizuuchi,k.,cell,35:785,1983；savilahti,h等人,emboj.,14:4893,1995。例如，与高活性tn5转座酶(例如转座酶，epicenterbiotechnologies，madison，wisconsin)形成复合物的转座酶识别位点可包括以下分别为5’agatgtgtataagagacag3’(seqidno:1),5’ctgtctcttatacacatct3’(seqidno:2))的19b转移链(镶嵌末端或“me”)和非转移链。

如本文所用，术语“薄膜”通常是指具有一种或多种成分的层或涂层，该层或涂层以大体上均匀的方式(例如旋涂)施加在基板的整个表面上。在某些情况下，薄膜是所选聚合物的溶液、悬浮液、分散液、乳液或其他可接受的形式。在某些情况下，薄膜可以包含光酸产生剂、除酸剂、敏化剂和基质(成膜聚合物)。基质或成膜聚合物是在相容的溶剂中熔融或溶解后，可以在基板上形成均匀的膜的聚合物。

如本文所用，术语“pag”或“光酸产生剂”通常是指适当地选自在常规光刻胶中使用的已知光酸产生剂的任何光酸产生剂。光酸产生剂的实例包括但不限于鎓盐、二羧酰亚胺基磺酸酯、肟磺酸酯、重氮(磺酰基甲基)化合物、二磺酰基亚甲基肼化合物、硝基苄基磺酸酯、联咪唑化合物、重氮甲烷衍生物、乙二肟衍生物、β-酮砜衍生物、二砜衍生物、硝基苄基磺酸盐衍生物、磺酸酯衍生物、酰亚胺基磺酸盐衍生物、卤代三嗪化合物，其等价物或其组合物。鎓盐光酸产生剂可包括但不限于烷基磺酸根阴离子、取代和未取代的芳基磺酸根阴离子、氟烷基磺酸根阴离子、氟芳基烷基磺酸根阴离子、氟代芳基烷基磺酸根阴离子、六氟磷酸根阴离子、六氟砷酸根阴离子、六氟锑酸根阴离子、四氟硼酸根阴离子，其等价物或其组合物。

光酸产生剂的一些实例为三苯基锍三氟甲烷磺酸盐、三苯基锍九氟正丁烷磺酸盐、三苯基锍全氟正辛烷磺酸盐以及三苯基锍2-(二环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、4-环己基苯基二苯基锍三氟甲烷磺酸盐、4-环己基二苯基锍九氟正丁烷磺酸盐、4-环己基苯基二苯基锍全氟正辛烷磺酸盐、4-环己基苯基二苯基锍2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、4-甲烷磺酰基苯基二苯基锍三氟甲烷磺酸盐、4-甲烷磺酰基苯基二苯基锍九氟正丁烷磺酸盐、4-甲烷磺酰基苯基二苯基锍全氟正辛烷磺酸盐和4-甲烷磺酰基苯基二苯基锍2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、二苯基碘鎓三氟甲烷磺酸盐、二苯基碘鎓九氟正丁烷磺酸盐、二苯基碘鎓全氟正辛烷磺酸盐、二苯基碘鎓2(双环[2.2.1]庚-2-基])-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、双(4-叔丁基苯基)碘鎓三氟甲烷磺酸盐、双(4-叔丁基苯基)碘鎓九氟正丁烷磺酸盐、双(4-叔丁基苯基)碘鎓全氟正辛烷磺酸盐、双(4-叔丁基苯基)碘鎓2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、1-(4-正丁氧基萘-1-基)四氢噻吩三氟甲烷磺酸盐、1-(4-正丁氧基萘-1-基)四氢噻吩九氟正丁烷磺酸盐、1-(4-正丁氧基萘-1-基)四氢噻吩全氟正辛烷磺酸盐、1-(4-正丁氧基萘-1-基)四氢噻吩2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、1-(6-正丁氧基萘-2-基)四氢噻吩三氟甲烷磺酸盐、1-(6-正丁氧基萘-2-基)四氢噻吩九氟正丁烷磺酸盐、1-(6-正丁氧基萘-2-基)四氢噻吩全氟正辛烷磺酸盐、1-(6-正丁氧基萘-2-基)四氢噻吩2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、1-(3,5-二甲基-4-羟苯基)四氢噻吩三氟甲烷磺酸盐、1-(3,5-二甲基-4-羟苯基)四氢噻吩九氟正丁烷磺酸盐、1-(3,5-二甲基-4-羟苯基)四氢噻吩全氟正辛烷磺酸盐、1-(3,5-二甲基-4-羟苯基)四氢噻吩2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸n-(三氟甲烷磺酰氧基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二羧酰亚胺、n-(九氟正丁烷磺酰氧基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二羧酰亚胺(dicarboxylmide)、n-(全氟正辛烷磺酰氧基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二羧酰亚胺、n-[2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酰氧基]双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二羧酰亚胺、n-[2-(四环[4.4.0.12,5.17,10]十二烷-3-基)-1,1-二氟乙烷磺酰氧基]双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二羧酰亚胺、1,3-二氧异二氢吲哚-2-基三氟甲烷磺酸盐、1,3-二氧异二氢吲哚-2-九氟正丁烷磺酸盐、1,3-二氧异二氢吲哚-2-基全氟辛烷磺酸盐、3-二氧异二氢吲哚-2-基2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐、3-二氧异二氢吲哚-2-基n42-(四环[4.4.0.12,5.17,10]十二烷-3-基)-1,1-二氟乙烷磺酸盐、1,3-二氧-1h-苯并[脱]异喹啉-2(3h)-基三氟甲烷磺酸盐、1,3-二氧-1h-苯并[脱]异喹啉-2(3h)-基九氟正丁烷磺酸盐、1,3-二氧-1h-苯并[脱]异喹啉-2(3h)-基全氟正辛烷磺酸盐、1,3-二氧-1h-苯并[脱]异喹啉-2(3h)-基2-(双环[2.2.1]庚-2-基)-1,1,2,2-四氟乙烷磺酸盐或1,3-二氧-1h-苯并[脱]异喹啉-2(3h)-基n-[2-(四环[4.4.0.12,5.17,10]十二烷-3-基)-1,1-二氟乙烷磺酸盐、(e)-2-(4-甲氧基苯乙烯基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(甲氧基苯基)-4,6-双(三氯甲基)-均三嗪(s-triazine)、2-[2-(呋喃-2-基)乙烯基]-4,6-双(三氯甲基)-均三嗪、2-[2-(5-甲基呋喃-2-基]乙烯基)-4,6-双(三氯甲基)-均三嗪、2-[2-(3,4-二甲氧基苯基)乙烯基]-4,6-双(三氯甲基)-均三嗪、其等价物或其组合物。在某些情况下，能够生成具有高酸强度的全氟烷基磺酸的光酸产生剂被用作本公开的制剂中的pag。这种光酸产生剂包括但不限于能够产生部分氟化烷基磺酸、全氟化烷基磺酸、全氟己烷磺酸、全氟辛烷磺酸、全氟-4-乙基环己烷磺酸、全氟烷基醚磺酸和全氟丁烷磺酸的光酸产生剂。

如本文所用，术语“光敏剂”或“引发剂增效剂”通常是指能够吸收光并将吸收的能量传递至光酸产生剂的光敏化合物。一般来说，光敏剂可以扩大光酸产生剂的活性能量束的光敏波长范围。光敏剂的实例可包括蒽、n-烷基咔唑和噻吨酮化合物。光敏剂可包括但不限于蒽类{蒽、9,10-二丁氧基蒽、9,10-二甲氧基蒽、2-乙基-9,10-二甲氧基蒽、2-叔丁基-9,10-二甲氧基蒽、2,3-二甲基-9,10-二甲氧基蒽、9-甲氧基-10-甲基蒽、9,10-二乙氧基蒽、2-乙基-9,10-二乙氧基蒽、2-叔丁基-9,10-二乙氧基蒽、2,3-二甲基-9,10-二乙氧基蒽、9-乙氧基-10-甲基蒽、9,10-二丙氧基蒽、2-乙基-9,10-二丙氧基蒽、2-叔丁基-9,10-二丙氧基蒽、2,3-二甲基-9,10-二丙氧基蒽、9-异丙氧基-10-甲基蒽、9,10-二苄氧基蒽、2-乙基-9,10-二苄氧基蒽、2-叔-9,10-二苄氧基蒽、2,3-二甲基-9,10-二苄氧基蒽、9-苄氧基-10-甲基蒽、9,10-二-α-甲基苄氧基蒽、2-乙基-9,10-二-α-甲基苄氧基蒽、2-叔-9,10-二-α-甲基苄氧基蒽、2,3-二甲基-9,10-二-α-甲基苄氧基蒽、9-(α-甲基苄氧基)-10-甲基蒽、9,10-二苯基蒽、9-甲氧基蒽、9-乙氧基蒽、9-甲基蒽、9-溴蒽、9-甲硫基蒽、9-乙硫基蒽等}；芘、1,2-苯并蒽；苝；并四苯；晕苯；噻吨酮类{噻吨酮、2-甲基噻吨酮、2-乙基噻吨酮、2-氯噻吨酮、2-异丙基噻吨酮、2、4-二乙基噻吨酮等}；吩噻嗪；氧杂蒽酮；萘类{1-萘酚、2-萘酚、1-甲氧基萘、2-甲氧基萘、1,4-二羟基萘、1,5-二羟基萘、1,6-二羟基萘、2,7-二羟基萘、2,7-二甲氧基萘、11’-硫代双(2-萘酚)、1,1’-双-(2-萘酚)、4-甲氧基-1-萘酚等}；酮类{二甲氧基苯乙酮、二乙氧基苯乙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯丙烷-1-酮、4’-异丙基-2-羟基-2-甲基苯丙酮、2-羟甲基-2-甲基苯丙酮、2,2-二甲氧基-1,2-二苯乙烷-1-酮、对二甲氨基苯乙酮、对叔丁基二氯苯乙酮、对叔丁基三氯苯乙酮、对叠氮基亚苄基苯乙酮、1-羟基环己基苯基酮、苯偶姻、苯偶姻甲醚、苯偶姻乙醚、苯偶姻异丙基醚、苯偶姻正二丁基醚、苯偶姻异丁基醚、1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙-1-酮、二苯甲酮、邻苯甲酰基苯甲酸甲酯、四甲基米氏酮、44’-双二乙氨基二苯甲酮、4,4’-二氯二苯甲酮、4-苯甲酰基-4’-甲基二苯硫醚等}；咔唑类{n-苯基咔唑、n-乙基咔唑、聚-n-乙烯基咔唑、n-环氧丙基咔唑等}；{1,4-二甲氧基1,4-二乙氧基1,4-二丙氧基1,4-二苄氧基1,4-二-α-甲基苄氧基等}；和菲类{9-羟基菲、9-甲氧基菲、9-乙氧基菲、9-苄氧基菲、9,10-二甲氧基菲、9,10-二乙氧基菲、9,10-二丙氧基菲、9,10-二苄氧基菲、9,10-二α-甲基苄氧基菲、9-羟基-10-甲氧基菲、9-羟基-10-乙氧基菲。

如本文所用，术语“除酸剂”或“胺猝灭剂”或“胺碱”通常是指用以猝灭产生的酸以改善光刻胶图案的形式和稳定性的胺碱。所述除酸剂可以是脂肪叔胺或受阻胺。除酸剂的实例包括但不限于：2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基硬脂酸酯、1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶基硬脂酸酯、2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基苯甲酸酯、双(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)癸二酸酯、双(1,2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)癸二酸酯、双(1-辛氧基-2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)癸二酸酯、四(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)-1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、四(1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶基)-1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、双(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)·二(十三烷基)-1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、双(1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶基)·二(十三烷基)-1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、双(1,2,2,4,4-五甲基-4-哌啶基)-2-丁基-2-(3,5-二-t-4-羟基苄基)丙二酸酯、1-(2-羟乙基)-2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇和丁二酸二乙酯的缩聚物、1,6-双(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基氨基)己烷和2,4-二氯-6-吗啉-均三嗪的缩聚物、1,6-双(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基氨基)己烷和2,4-二氯-6-叔辛基氨基-均三嗪的缩聚物、1,5,8,12-四[2,4-双(n-丁基-n-(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)氨基)-均三嗪-6-基]-1,5,8,12-四氮杂十二烷、1,5,8,12-四[2,4-双(n-丁基-n-(1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶基)氨基)-均三嗪-6-基]-1,5,8-12-四氮杂十二烷、1,6,11-三[2,4-双(n-丁基-n-(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)氨基)-均三嗪-6-基]氨基十一烷和1,6,11-三[2,4-双(n-丁基-n-(1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶基)氨基)-均三嗪-6-基]氨基十一烷。

如本文所用，在描述两个受试者之间的相对数值、相对数量或相对程度时，术语“基本上”通常是指数值、数量或程度在彼此的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％或110％内。

如本文所用，术语“基质”通常是指当光刻胶制剂施加于基板的上表面时，能够向基板提供足够附着力，并且当溶解于溶剂并铺展于基板上时，能够形成基本上均匀的薄膜的聚合物材料。所述基质可以包括但不限于聚酯、聚酰亚胺、聚萘二甲酸乙二醇酯(pen)、聚氯乙烯(pvc)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)和聚碳酸酯或其组合。可根据使用光刻胶制剂时用于产生酸的辐射的波长、基质与基板上表面的附着力特性、基质与制剂的其他组分的相容性，以及使用后移除或降解(如果需要)的便利程度来选择基质。

如本文所用，术语“溶剂”通常是指在涂覆期间将光刻胶施加在基板的上表面的有机溶液。在涂覆和后续步骤中，溶剂可以帮助将制剂的其他组分作为基本均匀的膜(如薄膜)铺展在基板的上表面。所述溶剂可包括但不限于甲乙酮、乳酸乙酯、丙二醇甲醚乙酸酯(pgmea)、丙二醇乙醚乙酸酯、乙酸戊酯或乙醚丙酸酯(eep)或其组合。

核酸的序列信息可以是通过临床或物质手段改善人们生活的基础。(参见ansorge,w.,“next-generationdnasequencingtechniques,”newbiotech.(2009)25(4):195-203，其通过引用整体纳入本文)。市场上已经出现了若干平行的dna测序平台。ngs的可用性加速了生物和生物医学研究，使得能够全面分析基因组、转录组和相互作用组。(参见shendure,j.和ji,h.,“next-generationdnasequencing,”naturebiotech.(2008)26:1135-45，其通过引用整体纳入本文)。ngs领域的研究人员面临的一个特殊挑战是生成一组测序样本(例如一组条形码样本)的更可靠的方案。

常用且可商购的ngs测序平台包括illuminagenomeanalyzer、roche(454)genomesequencer、lifetechnologiessolid平台以及诸如pacificbiosciences的实时测序仪。这些平台大多数都需要从生物样品中构建一组dna片段。在大多数情况下，dna片段的两端都有平台特定的接头。构建这样一组dna片段的常用方法可包括以下操作，例如：片段化样本dna、抛光片段末端、将衔接头序列连接到末端、选择片段大小、通过pcr对片段进行扩增并将最终样品产物定量以进行测序。最后一组测序样品中的插入片段的大小或目标dna片段的大小是ngs分析的关键参数。

dnazipcode阵列设计

可以用传统的接触式光刻工艺来制造zipcode阵列。在某些情况下，可以制造出一个面积约为10mm×10mm的dnazipcode阵列，其特征大小约为2μm，即精确对齐的相同dna条形码的面积为2μm×2μm。在某些情况下，使用光导合成可以在微阵列上制备约2500万个唯一的zipcode。每个zipcode寡核苷酸都可以符合dna条形码的设计要求，例如，举例而言，约40-60％的gc含量、没有均聚物、没有超过3个碱基的自互补片段，并且在人类基因组参考中不存在。每个zipcode寡核苷酸可在5’端包含一个上游zipcode(也称为“上游条形码”)，在3’端包含一个下游zipcode(也称为“下游条形码”)，其中上游和下游zipcode之间用一个“ggg”序列隔开，如图1所示。在本示例中，顶部衔接头位于每个zipcode序列的5’端；底部衔接头位于每个zipcode序列的3’端，并与芯片表面相连；ggg序列将上游zipcode和下游zipcode分开；上游zipcode对zipcode序列的y坐标进行编码；下游zipcode对zipcode序列的x坐标进行编码，x和y坐标确定zipcode序列在zipcode阵列上的空间位置。如本文所用，术语“坐标”通常是指二维表面上或三维主体中特定位置的数值或符号表示。例如，可以根据坐标系的x和y坐标定义二维表面，其中x和y坐标分别是任何位置或可寻址点的水平和垂直地址。图1中的底部和顶部衔接头可能包含后续的dna标记和ngs文库步骤所需的通用序列。

拉伸的dna可以放置在物理dna芯片的zipcode阵列上。然后，可以将拉伸的dna切割成多个片段。每个dna片段的两个末端可以分别附着到每一端附近的zipcode上。可以对dna片段及其附着的zipcode进行扩增和测序。对dna片段进行测序后，可以使用每个dna片段的zipcode来映射回物理dna芯片上的确切的x-y坐标位置。

图2示出了百万碱基测序的示例。在本示例中，左上区域中可以提供zipcode阵列芯片。长的核酸可以被拉伸并放置在zipcode阵列芯片上。zipcode阵列芯片(例如，尺寸为5mm×3mm)可区分最高达1μm×1μm尺寸的物理位置，即，1μm×1μm尺寸内的所有zipcode都相同，但与相邻的1μm×1μm尺寸不同。左下区域显示了zipcode阵列芯片的另一种配置，其尺寸为5mm×5mm，包括由zipcode编码的1μm×1μm的独特位置。右上区域显示了具有1μm×1μm独特位置(或特征)的编码阵列芯片和具有2μm×2μm独特位置(或特征)的另一zipcode阵列芯片的图片。底部区域显示了zipcode阵列芯片的分解示例，其条形码x位于一个独特位置(或特征)中，条形码y位于另一个独特位置(或特征)中。

高分辨率阵列制备

从头测序可以作为dnazipcode阵列的一种应用。在某些情况下，基因组dna可以被拉伸并放置在zipcode阵列上。然后，通过各种分子生物学技术，可将zipcode阵列上的zipcode或阵列寡核苷酸掺入到拉伸的基因组dna的片段中，从而得到可通过商业dna测序仪分析的阵列基因组材料。zipcode或阵列寡核苷酸可以是微阵列上的合成寡核苷酸。如上所述，zipcode可被设计来识别基因组dna的每个片段的位置信息，从而为dna片段提供位置信息，以便可以映射相邻的dna片段。在对dna片段进行测序并解码zipcode后，根据每个片段的zipcode信息，可以明确地组装测序片段。在某些情况下，微阵列上的合成寡核苷酸可在1μm特征尺寸或更小下进行解析，得到关于测序dna片段的位置的约2000bp分辨率。本文所述的光刻胶可经配制用于提供亚微米图案分辨率以及应用到各特征的化学空间分布，并与每个特征的dna化学相容。本文所述的光刻胶可提供在1μm特征尺寸或更小下解析的高分辨率图案，而不对每个特征内的寡核苷酸产生实质性的测序误差。例如，每个特征内寡核苷酸的测序误差可不大于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％。寡核苷酸的测序误差可能包括dna条形码中的插入和删除(插入缺失)。

可配制光刻胶以合成高分辨率dna寡核苷酸zipcode微阵列。影响光刻工艺制备的寡核苷酸zipcode微阵列特征分辨率的一个因素可能是来自普通商用步进机的投影(晶片平面上的光子分布)。图3显示了由asmlpa/60i-line步进机计算出的投影。在图3中，可以模拟从400nm到1.2μm的各种周期线和空间(l/s)图案。x轴为nm，y轴为光强度。对于400nml/s图案，名义上曝光区域中的强度可能不会达到最大强度，并且名义上未曝光区域中的任何地方都不能完全排除光线。对于较大的特征，例如，举例而言，700nml/s图案，曝光线之间的光强度可以达到零。然而，如果光刻胶要产生与光子强度成线性关系的化学反应，投影的逐渐倾斜可能是个问题。例如，在图案制作中，由于光强度的逐渐倾斜而导致的未曝光区域中光的存在，所以曝光区域之外的寡核苷酸的一部分上可以印刷额外的碱基。

因此，在本发明的一个实施方案中，可以选择具有高“对比度”的光刻胶制剂。如本文所用，描述光刻胶制剂时，术语“高对比度”通常是指这样的制剂，在接收到少于全部的化学光量时，不印刷化学反应或基本不印刷化学反应，但在接收到全部的化学光量后，迅速转化为完全化学反应。如本文所用，术语“完全化学反应”一般指由充分的光照或由充分的光照所产生的化学物质所触发的一个或多个化学反应。

表1.“低胺，低itx”制剂的组成

表2.“高胺，低itx”制剂的组成

表3.“低胺，高itx”制剂的组成

表4.“高胺，高itx”制剂的组成

表5.“中胺，中itx”制剂的组成

图4示出了低对比度制剂和高对比度制剂的示例，其中可以对除酸剂(也称为“胺猝灭剂”)和光敏剂(也称为“引发剂增效剂”或itx)进行2×2实验设计(doe)。对于表1-5所列的组合物，可使用以下组分：光酸产生剂(pag)可以是双(4-叔丁基苯基)碘鎓全氟-1-丁烷磺酸盐(bbi-pfbs)；光敏剂可以是2-异丙基噻吨酮(itx)；除酸剂可以是1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶醇；基质可以是聚甲基丙烯酸甲酯(pmma，分子量约35k)；并且溶剂可以是丙二醇单甲醚乙酸酯(pgmea)。

可以在改变任何组分后记录“对比度”曲线，例如，改变光刻胶制剂的两个变量。在图4中的这些示例中，可以改变两种组分，即除酸剂(也称为胺猝灭剂)和光敏剂(如itx)的浓度。在这种情况下，具有高itx的制剂可以表现出高的“对比度”。在低剂量的光下(通过以秒为单位的曝光时间测量，不超过9秒)，所有制剂都可能显示出合理的响应(如，光的剂量可能不会印刷化学反应，如图4所示)。然而，当已经传递了用于印刷化学反应的全部剂量的光时，具有高itx浓度的制剂可能会比具有低itx浓度的制剂表现出更大的“对比度”(如图4所示，在曝光时间等于或接近20秒时)。在这种情况下，高“对比度”制剂可能会在光子强度的微小变化(接近所需的全部剂量或装载量的光)内导致非常高的印刷化学反应，因此可能会导致从图3中所示的投影中印刷出更精细的特征图。此外，当光刻胶吸收少量的光时(即，低于或基本低于化学反应所需的光的剂量(量)的阈值)，该光刻胶可能不会产生化学反应。因此，相应的高“对比度”制剂可以印刷例如图3所示的400nml/s图案，印刷线之间没有化学反应，并可能锐化名义上曝光和名义上未曝光区域之间的过渡。

为了获得光刻胶制剂的不同“对比度”水平，可以改变或优化许多因素。这些因素包括，例如光酸产生剂、光敏剂(引发剂增效剂)、除酸剂(胺猝灭剂)、基质(基板)和溶剂。高“对比度”制剂(即，其表现类似图4中的高itx制剂)可用于使用实际的l/s图案印刷化学反应。

当可以使用本公开的高“对比度”制剂在约1μm分辨率水平上绘制特征，并且图案可以使用100×的荧光显微镜成像时，可以使用计量学来确定所获得图像的细节。图5a-图5c显示了分别使用1.2μm、0.6μm和0.4μml/s图案在asmlpa/60上绘制本公开的相同制剂的结果，所有图案均印刷在同一晶片上。图5a-图5c展示了单碱基延伸实验。在本实验中，四个连续的胸腺嘧啶核苷酸(4t)可沿着3’端到5’端方向固定(即共价键合)到基板(例如晶片)的表面上，5’端的末端t(即，基板表面远端的顶部t)受其5’-羟基上的4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmt)基团保护。然后，可将光刻胶旋涂到与4t键合的表面上，然后使用掩模将所得的具有光刻胶的基板曝光，以在图案中生成酸，并解封顶部t的dmt基团。顶部t上释放的5’-羟基基团可在固相寡核苷酸合成条件下与荧光素亚磷酰胺反应。基板(即，表面结合有荧光素亚磷酰胺的晶片)可在荧光显微镜下成像。

图5a显示，1.2μml/s的图案可表明，线(右侧所示)中的化学浓度峰值(这里用荧光峰表示)与大块图案(左侧所示)中的化学浓度峰值相似。图5b显示，600nml/s图案可表明，线(右侧所示)中的化学浓度峰值与大块图案(左侧所示)中的相似，但没有实质性差异。然而，图5c显示，400nml/s图案可表明，线中(右侧所示)的化学浓度峰值与大块图案中(左侧所示)的化学浓度峰值不同。在400nml/s图案中，线与大块图案化学峰值的不同可能是由于步进机造成的空间成像强度下降所致，也可能是由测量工具的影响造成的。

图5c还显示了l/s图案(即低“对比度”)中从完全化学反应过渡到无化学反应的渐变曲线。这种渐变的过渡可能会导致一些化学反应在距离化学反应的理想发生位置大约300-400nm处完成(换句话说，一些化学反应发生在错误的位置)。由渐变坡度引起的错误化学反应可能会导致在zipcode阵列中临近目标特征(预期位置)的特征(非预期位置)中添加“插入”碱基。同时，在名义上曝光区域内靠近线边缘的地方，由于曝光不足，可能会发生不完全解封。

未能观察到“顶帽式”化学分布(即具有尖锐边缘或陡坡的基本恒定的化学分布)，可能是由测量工具造成的。在这种情况下，使用100倍物镜、1.49na、针孔大小设置为0.6个艾里(airy)单位的佳能fv3000点扫描共聚焦工具，可以使用瑞利判据(rayleighcriterion)来分辨相距150-200nm左右的相邻特征。图5a-图5c所示的图像没有经过反卷积处理。然而，即使经过反卷积处理，测量工具的大约150nm的点扩展函数(psf)也会与实际化学分布发生卷积。对于相邻特征可能彼此很接近(例如，在彼此的400nm内)的zipcode阵列中的小特征，无法确定化学反应是否在空间上被正确定义，或者测量工具是否存在问题，这种不确定性可能会造成问题。

为了解决这种不确定性，可以使用超分辨率显微镜。超分辨率显微镜可以通过排除相邻的荧光团来指定单个分子的位置，并在许多闪烁周期中测量psf。通过这种方式，可以确定psf的中心，通常约为几十nm的量级上。在这种情况下，可以采用随机光学重建显微镜(storm)。图6显示了600nml/s图案的storm成像过程的结果。图6中的图像可能具有来自storm成像的一些伪像，并且可以用多发射器例程进行改善，以在图像中的强度和晶片上的化学反应之间产生更线性的响应，并去除图像中心附近的光致漂白区域。然而，图6的storm图像显示，在这种情况下，图像从亮区到暗区的过渡可能约为100nm，这表明真实的化学分布可能是顶帽式分布，或者说是具有100nm漏光墙的梯形分布，而不是如图5所示点共聚焦图像中显示的3-400nm。对于600nm线，将真正的化学反应识别为在名义上未曝光区域中具有约100nm漏光的更多的顶帽分布形状，可能意味着某些化学反应可能存在于相邻特征中的约1/6或约16％，而正常曝光区域中不存在或基本上不存在化学反应的缺失。

因此，将图6中600nml/s的storm图像与图5b中600nml/s的共聚焦图像进行比较，可以发现不同的测量工具对尺寸不大于1μm的特征的化学反应可能提供不同的图像和结论。例如，图5b可表明，额外的(或错误的)化学反应可能几乎出现在整个未曝光区域，例如，可能出现在约80％的未曝光区域。图5b也可表明，在大约100％的线的曝光区域中缺乏化学反应。因此，对晶片上实际的化学反应分布的认识，可以为这些精细特征的尺寸不大于1μm的寡核苷酸印刷提供更好的指导，并且使用所有类型的超分辨率显微技术可能是表征这种精细特征的计量工具。

制剂

在一些实施方案中，可以将光刻胶制剂施加到图案化的寡核苷酸上，并且可添加碱，例如胺碱，而不会对光刻胶层下的寡核苷酸造成过度损害。在这种情况下，诸如lc/ms等的技术和各种荧光/杂交实验可以用来显示光刻胶层下的寡核苷酸序列的损伤程度或无损伤程度。

为了形成光刻胶层，与其他基质聚合物，如聚苯乙烯、聚(α-甲基苯乙烯)等相比，聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)中的制剂可为寡核苷酸微阵列产生更好的对比度。pmma也可以以不含杂质的纯形式获得，所述杂质例如，举例而言，残留引发剂、重金属等，这些杂质可能导致与光刻胶下的寡核苷酸的相容性问题。

对于光引发剂而言，在某些情况下，在辐射下释放出pka极低的酸可以产生高分辨率。此外，pka极低的酸可能对除碱基g之外的合成寡核苷酸的损害很小或基本没有损害。然而，具有不同pka范围的其他酸也可能有用。

对于溶剂而言，在某些情况下，考虑到标准洁净室中的安全性和相容性，可以使用丙二醇甲醚乙酸酯(pgmea或1-甲氧基-2-丙醇乙酸酯)和乳酸乙酯，这样光刻胶就可以与其他制剂一起在半导体制备工厂(制造车间或铸造车间)中使用，以便可以利用现有的生产基础设施。

在选择增效剂时，可以考虑能量转移的速度。此外，增效剂的相容性能够有效地产生酸，而不会发生激发态与另一基质或另一dna分子的交叉反应。

可基于pkb、非亲核性以及与光刻胶制剂的其他组分结合时可以增强对比度性能的角度来考虑碱性添加剂。

制剂的剂量反应

在某些情况下，可以使用商用dmt寡核苷酸单体和光酸产生剂(pag)体系在石英基板上进行寡核苷酸合成。在这种情况下，zipcode宏阵列的特征尺寸和间距可以减小到1μm以下。该制剂是基于pgmea的光刻胶聚合物薄膜，具有优化的光酸产生剂化学反应，可以在生成编码特征时增强对比度。图6显示了所测量的剂量反应曲线，其中150mj/cm²的印刷紫外(uv)剂量可被视为通过在光刻胶薄膜中生成酸而完全“印刷”特征。在该印刷uv剂量下，光产生的酸可能会使寡核苷酸上的dmt基团从羟基中脱保护。释放的羟基可与标记的亚磷酰胺反应，后者提供荧光信号作为产酸过程的指示。当提供不同剂量的uv光时，随后的荧光测量可提供如图7所示的剂量反应曲线的数据点。如图7所示，虽然150mj/cm²的uv剂量(印刷剂量)可产生充分高浓度(或量)的酸，但50mj/cm²的uv剂量可能不会产生可检测的酸浓度(量)。因此，如果特征周围的暗区可能接收到少于完全化学反应所需的印刷剂量，例如，不超过所需印刷剂量的三分之一，则暗区可保持惰性(不产生酸)，从而防止错误的碱基被添加到特征周围暗区的zipcode中。图7中的s形剂量反应曲线可表明可接收印刷剂量的特征与可接收少于印刷剂量的暗区(例如，印刷剂量的三分之一)之间在产酸(通过观察到的荧光信号来测量)方面的强烈(或高)对比。

这种对比度增强的pag薄膜的接触印刷可以产生分辨率在尺寸上低至1μm的特征阵列(图8)。图8示出了在同一基板上具有4μm、2μm和1μm分辨率的正方形的接触光刻点分辨率图案。图8中的40x荧光图像可显示在尺寸上低至1μm的荧光素异硫氰酸酯(fitc)标记的寡核苷酸特征。

此外，可以使用投影光刻系统(例如，stanfordnanofabricationfacility的asmlpas5500)将特征阵列的5x缩小的投影投射到本公开的旋涂pag薄膜上。在某些情况下，可以如图9a-图9b中的一维线和空间(l/s)图案所示印刷700nm的寡核苷酸特征。图9a示出了通过asmlpas5500投影光刻系统印刷的fitc标记的寡核苷酸的700nm线和间隔图案的荧光图像(100×油浸)。图9b示出了通过平行线切开的l/s图案的横截面，表明特征的宽度可为约700nm。

在这些低至约1μm或以下的小尺度上，高分辨率图像的采集可能会受到常规显微镜物镜的衍射极限的影响。为了测量印刷图案的尺寸，可以在具有60×浸没物镜的vutara超分辨率显微镜(bruker)上扫描基板。使用storm技术，单个分子可以在图10中成像(背景上的点)，并且合成图像可以描绘出印刷的线条和间隔图案。对图像分子直方图的分析可以表明，图10中的半最大值全宽(fwhm)线宽约为723nm。在本案例中，用cy5标记寡核苷酸用于检测。

本公开的光刻胶制剂不仅可以为微阵列上的特征提供μm以下的分辨率，而且还可以提供与聚合物-pag化学反应的化学相容性，以及足够的反应产率，以便随后将核苷酸印刷到不断增长的寡核苷酸链上。例如，由于紫外线和光酸的产生对寡核苷酸的损害可以减少至每层不超过1.5％。考虑到聚合物-pag体系的解封效率，寡核苷酸合成的总收率可达每层90％左右。

在某些情况下，可将光可裂解基团(pcg)置于亚磷酰胺试剂的5’-oh基团上。例如，式i的化合物可用于本公开的寡核苷酸合成方法中：

其中pcg是可光裂解基团；x是h(用于dna合成)或受保护的2’-羟基基团(用于rna合成)；碱基是核酸碱基或核碱基，包括但不限于：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其类似物；并且pg可以是无基团，或是碱基上的活性基团(例如，n原子或o原子)上的保护基团。特别地，pg可包括但不限于n-苯甲酰基(bz)、n-乙酰基(ac)、n-异丁酰基(ibu)、n-苯氧基乙酰基(pac)和n-叔丁基苯氧基乙酰基(tbpac)。此外，pcg可包括但不限于5’-(α-甲基-2-硝基胡椒基)氧基羰基(menpoc)、2-(2-硝基苯基)丙氧基羰基(nppoc)、碳酸二甲氧基苯偶姻(dmboc)和硫代苯基-2-(2-硝基苯基)-丙氧基羰基(sph-nppoc)，其结构如下所示：

在某些情况下，可以通过以下的混合方法实现zipcode微阵列：使用式i化合物(高达约97％的层收率)进行特征(较大的尺寸)的大多数低分辨率构建，然后补充多达六个、七个、八个、九个或十个定义最小特征的高分辨率聚合物-pag合成层。

实施例

1)光刻胶制备

pag“v4.0”光刻胶组分：

a)光酸产生剂(pag)

双(4-叔丁基苯基)碘鎓全氟-1-丁烷磺酸盐(bbi-pfbs，电子级，

来自sigma-aldrich)：

约3.4％w/w，最终浓度约为50mm

b)除酸剂(胺猝灭剂)

1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶醇(sigma-aldrich)：

约0.2％w/w，最终浓度约为12mm

c)基质(聚合物)

聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma，mw约35000，sigma-aldrich)：

约3.2％w/w

d)光敏剂(引发剂增效剂)

2-异丙基噻吨酮(itx)：

约3.2％w/w，最终浓度约为125mm

e)溶剂

丙二醇单甲醚乙酸酯(pgmea)

约90％(平衡)

制备过程：首先将pmma溶解在pgmea中，因为需要长时间加热和搅拌(大约在45-55℃之间，约18-36小时)。然后将其他组分(pag、除酸剂和光敏剂)添加到聚合物溶液中，通过室温搅拌溶解过夜，得到pag“v4.0”光刻胶制剂。将溶液储存在4℃左右，并在制备后8周内使用。

2)基板加工：

1.在加工实验前20分钟左右打开电源，使热板达到温度(约50℃)。

2.将光刻胶混合物(例如pag“v4.0”光刻胶制剂)放入装有过滤器和针头的5ml注射器中。

3.将6”晶片放在旋涂机的卡盘上(ceebrewerscience200cb光刻胶旋涂机热板组合工具)

4.运行程序时，在0rpm下分配循环10秒，在500rpm下铺展循环10秒(1000加速度)，以及在1500rpm下“厚度”循环60秒(1000加速度)。

在分配循环过程中，用5ml注射器将约1.5ml光刻胶注入到晶片中心。

允许旋涂机完成其整个周期。

5.从旋转卡盘上拆下晶片。用pgmea润湿的纸巾手动去除边缘珠。如果使用polos旋涂机(sps-europe)进行单晶片旋涂，可以在旋涂工具上进行擦拭步骤。

6.将晶片放在热板销上。运行程序：在20mm的销钉上放置10秒，在0mm的销钉上放置2秒，并在盖打开的情况下在50℃下进行178秒的真空烘烤。

7.从热板上取下晶片。现在可以使用掩模对准器(neutronix/quintelnxq9000对准器)进行曝光。

8.根据制造商建议的真空接触模式和36mj/cm²的曝光剂量(365nm)加载、对准和曝光晶片。

9.最后一次曝光后，让基板静置4分钟，然后依次用pgmea、丙酮和异丙醇(ipa)在旋涂机上连续冲洗3次。

10.晶片被转移到合成器的流动池中，以添加所需的核苷、连接剂或荧光亚磷酰胺单体。如在别处(ghmcgallandjafidanza,methodsinmolecularbiologydnaarraysmethodsandprotocols,editedbyj.b.rampalhumana,totowa,n.j.,2001,pp.71-101)所述采用标准寡核苷酸合成化学反应。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言，显然这些实施方案仅仅是作为示例提供的。并非意图通过说明书中提供的特定示例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和图示并不意味着以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到大量的变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述、构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，可以预期的是，本发明还将涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。