本发明涉及一种氧化石墨烯复合物，所述复合物具有与其附接的由单链探针构成的结构，所述单链探针各自包含与靶核酸互补的核酸和荧光物质。
背景技术：
：：石墨烯具有填充在二维晶格中的碳原子的平面单层结构，并且是具有不同尺寸结构的所有石墨材料的基本结构。即，石墨烯可以是具有零维结构的富勒烯、具有一维结构的碳纳米管或堆叠成三维结构的石墨的基本结构。最近的许多研究指出，石墨烯具有独特的物理特性，例如，由于其六方晶体结构而具有零带隙、两个互穿的三角形亚晶格和对应于单个原子的厚度。另外，石墨烯具有独特的电子转移特性，因此展现出以前未曾观察到的独特现象。这些现象的例子包括半整数量子霍尔效应(halleffect)和双极型超电流晶体管效应，而这些也归因于石墨烯的独特结构。氧化石墨烯(go)是石墨烯的氧化形式，其可以通过荧光共振能量转移(fret)现象淬灭有机荧光染料的荧光信号。同时，检测特定核酸(dna或rna)或蛋白质的方法是科学研究中的至关重要的技术。通过能够检测和鉴定特定的核酸或蛋白质，研究人员可以确定哪些遗传和生物标记物是个人健康状况的指标。核酸和蛋白质检测方法的使用使得可以检测样品中存在的致病基因的修饰或特定基因的表达。这种分子诊断被用于各种领域，例如感染性疾病诊断、癌症诊断、遗传疾病诊断和个性化诊断，以诊断疾病的根源诸如dna或rna。代表性的分子诊断技术包括在短时间内扩增dna的pcr技术(saiki,r.等人,primer-directedenzymaticamplificationofdnawithathermostablednapolymerase.science239,487-91.1998)。然而，普通的pcr技术需要使用电泳方法来鉴定扩增的dna。为了进行这样的电泳，需要准备琼脂糖凝胶以及用etbr等将dna染色的繁琐操作。另外，最近使用的实时pcr方法由于使用荧光而不需要进行电泳，但是其问题在于需要使用昂贵的仪器和昂贵的荧光试剂(higuchi,r.,等人,kineticpcranalysis:real-timemonitoringofdnaamplificationreactions.naturebiotechnology11,1026-1030,1993)。近年来，已经开发并出售了cepheid的genexpert系统和试剂，它们是用于原位诊断的pcr产品，但由于所述系统和试剂非常昂贵，因此难以在一般测试应用中使用(helb,d.等人,rapiddetectionofmycobacteriumtuberculosisandrifampinresistancebyuseofon-demand,near-patienttechnology.j.clin.microbiol.48,229-237,2010)。其他方法包括核酸横向流测定，其中在pcr之后使用膜而不是凝胶电泳进行鉴定(aveyard,j.等人,onestepvisualdetectionofpcrproductswithgoldnanoparticlesandanucleicacidlateralflow(nalf)device.chem.commun.,41,4251-4253,2007)。但是，此测定比凝胶电泳技术更为复杂，因此无法在实验室中准备和使用。另外，必须使用附接到膜上的探针的序列，以使其可以根据pcr扩增产物特异性结合。由于这些技术限制，此测定在一般应用中的使用有限。特别是，这种基于pcr的测序方法极易受到特定错误的影响，并经常由于数据解释问题而导致严重的误诊。为此，已经进行了研究来表达当血液中的特定核酸生物标记物遇到与其互补的序列时以荧光、电位差、颜色变化等形式发生的改变。然而，对于大多数这些研究，一次只能检测一种生物标记物，因此很难有效地诊断涉及多种生物标记物的大多数疾病。另外，由于人类疾病通常是由多个基因的异常而非单个基因的异常所引起，因此，如果可以在单个测试中分析多个基因，则可以提高诊断的准确性和实用性。因此，对可以应用于具有高灵敏度和高再现性的诊断的多重测定平台的需求日益增加。技术实现要素：技术问题本发明的一个目的是通过在短时间内在没有pcr分析过程的情况下以高灵敏度在体外同时检测和量化多种生物标记物，有效地诊断涉及多种生物标记物的大多数疾病，并将诊断结果用于针对患者的治疗。技术方案为了实现上述目的，本发明提供了用于核酸检测的组合物。本发明还提供了用于多核酸检测的组合物。本发明还提供了用于核酸检测的方法。本发明还提供了用于多核酸检测的方法。有利效果根据本发明，与由单链探针(所述单链探针各自包含与靶核酸互补的核酸和荧光物质)构成的结构附接的氧化石墨烯可以在无需pcr的情况下以低成本和高灵敏度实时检测和量化多种生物标记物(靶核酸)，因此可以轻松诊断涉及多种生物标记物的大多数疾病，并评价药物使用的效果。附图说明图1是示出了与靶序列结合的四面体荧光核酸纳米结构的开发模型的图。图2示出了确认四面体荧光核酸纳米结构的合成的结果：泳道a至g：通过以一个至三个单链探针的可能组合将链混合且随后进行热处理而获得的产物；泳道h(t-dna)：通过混合所有四个单链探针获得的产物(四面体荧光核酸纳米结构)。图3是示出了与靶序列结合的三棱柱形荧光核酸纳米结构的开发模型的图。图4是示出了四面体荧光核酸纳米结构的设计和模拟结果的图：a：四面体荧光核酸纳米结构的设计；和b：当四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物结合至靶序列时的荧光发射模型。图5是示出了三棱柱形荧光核酸纳米探针的设计和模拟结果的图：a：当三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物结合至靶序列时的荧光发射模型；b：使用oxdna程序执行模拟的结果；和c：预测荧光与氧化石墨烯之间距离的结果。图6示出了合成四面体荧光核酸纳米结构的结果和通过与靶序列混合而产生四面体荧光核酸纳米结构的结果：泳道a至c：四个探针的组合；泳道d(t-dna)：通过混合所有四个探针且随后进行热处理而获得的产物(四面体荧光核酸纳米结构)；和泳道e至g：通过将四面体荧光核酸纳米结构与靶序列(c1、c2和c3)混合且随后进行热处理而获得的产物。图7示出了通过添加靶序列产生的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的靶核酸生物标记物检测范围：a至c：测量与通过在荧光核酸纳米结构的合成过程中以0至5倍的摩尔比(5、10、20和100pmol)添加靶序列(c1、c2和c3)来合成荧光核酸纳米结构而产生的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的fam(485nm/525nm)、cy3(540nm/570nm)和cy5(640nm/670nm)的吸收/发射波长相对应的荧光强度的结果；和d到f：通过将a至c放大到特定值而获得的图表。图8示出了在形成四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物之后添加靶序列时的生物标记物检测范围：a至c：当20pmol/10μl的靶序列(c-dna)与20pmol/50μl的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物反应时的荧光测量结果；d至f：当200pmol/10μl的靶序列(c-dna)与20pmol/50μl的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物反应时的荧光测量结果；a和d：fam(485nm/525nm)；b和e：cy3(540nm/570nm)；和c和f：cy5(640nm/670nm)。图9示出了取决于盐(nacl)浓度的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的靶核酸生物标记物检测能力。图10示出了取决于在三棱柱形荧光核酸纳米结构的产生过程中使用的盐(nacl)的浓度的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的靶核酸生物标记物检测能力。图11示出了取决于氧化石墨烯的量的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的靶核酸生物标记物检测能力。t-dna：未添加靶标的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物；t-dna+c1：通过添加靶序列c1(l858r)产生的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物；t-dna+c2：通过添加靶序列c2(t790m)产生的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物；t-dna+c3：通过添加靶序列c3(delex19(e746-a750))产生的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物；和t-dna+c1,2,3：通过添加靶序列c1、c2和c3产生的四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物。图12示出了取决于氧化石墨烯的量的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的靶核酸生物标记物检测能力：t.p.：未添加靶标的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物。图13描绘了显示取决于每个靶核酸生物标记物的量的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的荧光值的图表。图14描绘了显示三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物对提取自肺癌a549细胞的总mirna的检测能力的分析结果的图表。图15描绘了显示三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物对提取自肺癌pc-9细胞的总mirna的检测能力的图表。具体实施方式在下文中，将参考本发明的实施方案详细描述本发明。然而，以下实施方案是作为本发明的例子给出，而不是为了限制本发明，并且本发明可以在权利要求和由权利要求解释的等同物的范围内进行各种修改和应用。除非另有说明，否则核酸从左至右为5'→3'方向。说明书中列举的数字范围包括限定范围的数字，并且包括所限定的范围内的每个整数或任何非整数分数。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同。尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于测试本发明中所述的主题，但是本文描述了优选的材料和方法。如本文所用，术语“荧光核酸纳米结构”包括单链探针，所述单链探针各自包含与靶核酸互补的核酸和荧光物质；由这些探针构成的结构或与靶核酸结合的探针。如本文所用，术语“荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物”或“石墨烯荧光核酸纳米结构”是指其中荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯的结构或复合物。如本文所用，术语“探针”是指可以特异性结合靶核酸生物标记物的核酸片段，例如rna或dna，包括mirna、mrna和dna，并且长度范围为几个核苷酸到数百个核苷酸。探针可以被标记以确定特定mrna的存在或不存在。可以将探针以寡核苷酸探针、单链dna探针、双链dna探针、rna探针等形式构建。在本发明中，术语“探针”是指单链核酸。在本发明的整个说明书中，当任何构件被称为在另一构件“上”时，不仅指任何构件与另一构件接触的情况，而且还指在两个构件之间存在第三构件的情况。如本文所用，术语“样品”包括获自受试者或患者的组织、细胞、血液、血清、尿液、唾液、血浆或体液。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检或抽吸物的实体组织；血液或任何血液成分；或来自受试者妊娠或发育过程中的任何时间的细胞。组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。如本文所用，术语“检测”或“测量”是指量化所检测或测量的对象的浓度。在一方面，本发明涉及一种用于核酸检测的组合物，所述组合物包含：单链探针，所述单链探针包含与靶核酸互补的核酸和荧光物质；和氧化石墨烯。在一个实施方案中，单链探针可以是dna、rna或dna和rna。在一个实施方案中，所述组合物可以包含一个或多个单链探针，所述一个或多个单链探针各自包含与靶核酸互补的核酸。当各自包含与靶核酸互补的核酸的单链探针的数目为3或更多时，可以通过进一步包括由除了与每个单链探针的靶核酸互补的核酸区域之外的一些序列的互补序列组成的单链探针来形成三维结构。另外，优点是，通过包括各自包含与不同靶核酸互补的核酸和不同荧光物质的一个或多个单链探针，可以对不同的靶核酸进行多重检测，并且三维结构使得能够稳定地保持检测结果，并且可以分别量化多个靶核酸。在一个实施方案中，本发明的荧光核酸纳米结构包含：与靶序列(c1、c2和c3/c1'、c2'和c3')互补的序列区域；荧光物质；三个单链探针(s1、s2和s3/s1'、s2'和s3')，所述单链探针各自包含构成所述结构的序列区域；以及与三个探针互补结合形成双链的探针(u1/u1')。在本发明的一个例子中，产生了能够检测三种不同靶核酸的四面体和三棱柱形荧光核酸纳米结构。四面体纳米结构的一面由双链组成，并且每个侧面的一部分(与靶序列互补结合的部分)和附接至氧化石墨烯的部分由单链组成。三棱柱形纳米结构的顶面由双链组成，并且每个侧面的一部分(与靶序列互补结合的部分)和与氧化石墨烯相附接的底部由单链组成。具体地，当在四面体荧光核酸纳米结构中不存在靶核酸(序列)即c1、c2和c3时，除了与s1、s2和s3的靶标互补的部分以及待附接至氧化石墨烯的聚a尾部之外，所述结构的所有部分通过形成双键(接点)形成三维结构；而当形成包含靶核酸c1、c2和c3的荧光核酸纳米结构时，靶核酸c1、c2和c3分别与s1、s2和s3的互补单链序列部分结合，因此所述结构的除聚a尾部之外的所有部分形成双键(见图1)。当在三棱柱形荧光核酸纳米结构中不存在靶核酸(序列)即c1'、c2'和c3’时，除了s1'、s2’和s3’的靶标互补部分以及三棱柱的结合氧化石墨烯的三角形底部之外，所述结构的所有部分通过形成接点的双键形成三维结构；而当形成包含靶核酸c1'、c2'和c3’的荧光核酸纳米结构时，靶核酸c1'、c2'和c3’分别与s1'、s2’和s3’的互补序列结合，因此，除三棱柱的待附接至氧化石墨烯的一个三角形面之外，所述结构的所有部分形成双键(见图3)。在一个实施方案中，由于每个探针的靶核酸互补部分的序列可以根据靶标而变化，因此可以选择对特定疾病具有特异性的核酸作为靶标并用于疾病的诊断。在本发明的一个例子中，将特异于肺癌的经修饰的egfrmrna序列c1、c2和c3和mirna序列c1'、c2’和c3’用作靶序列，因此这些靶序列可用于诊断肺癌并监测抗癌药的使用效果。本发明的探针可以使用亚磷酰胺固相支持法或其他众所周知的方法化学合成。还可以使用本领域已知的多种手段修饰此类核酸序列。此类修饰的非限制性例子包括甲基化、包囊化、将一个或多个天然核苷酸用其类似物取代、和核苷酸间修饰，例如对不带电荷的缀合物(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电缀合物(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰。在一个实施方案中，可以通过特定的热处理方法将包含与不同靶核酸互补的核酸和不同荧光物质的一个或多个单链探针组装成荧光核酸纳米结构。在一个实施方案中，根据荧光核酸纳米结构的结构，热处理可以有所不同。当荧光核酸纳米结构为四面体时，可以在以下条件下进行热处理：在95℃下保持2分钟；以1℃/min的速率从60℃降温；并在20℃下保持5分钟，并将温度降至4℃。当荧光核酸纳米结构为三棱柱时，可以在以下条件下进行热处理：在95℃下保持5分钟；在85℃下保持5分钟；以0.5℃/min的速率降温；并在20℃下保持5分钟，并将温度降至4℃。在一个实施方案中，氧化石墨烯(go)是可以通过荧光共振能量转移选择性地淬灭荧光的通用淬灭剂(uq)。当靶核酸和本发明的单链探针彼此结合形成双键时，探针(或荧光核酸纳米结构)与氧化石墨烯之间的距离增加，从而可以检测到荧光物质的发光。即，氧化石墨烯具有更容易附接至单链序列而不是双链序列的独特特性，并且当氧化石墨烯与荧光核酸纳米结构的荧光物质之间的距离较小时，荧光由于荧光共振能量转移而被淬灭，并且当距离增加时，可以再次检测到荧光。因此，当多个靶核苷酸序列与包含荧光物质的探针的互补序列结合形成双键时，与氧化石墨烯的距离增加，从而发射荧光。基于这些特性，在本发明的一个例子中，设计了一种复合物，使得它可以同时识别和量化多个靶标。在另一方面，本发明涉及一种用于核酸检测的组合物，其中荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯，其中所述荧光核酸纳米结构包括：第一单链探针，其包含与第一靶核酸互补的核酸和荧光物质，其中单链的一部分附接至氧化石墨烯；第二单链探针，其包含与第二靶核酸互补的核酸和荧光物质；第三单链探针，其包含与第三靶核酸互补的核酸和荧光物质；和第四单链探针，其由与第一单链探针互补的序列、与第二单链探针互补的序列和与第三单链探针互补的序列构成。在一个实施方案中，单链探针中包括的荧光物质可以是具有不同波段的荧光物质。在一个实施方案中，荧光物质可以选自荧光素(fam)、德克萨斯红(texasred)、罗丹明、alexa、花菁(cy)、bodipy、乙酰氧基甲基酯和香豆素，但不限于此，并且可以使用任何荧光物质，只要它们是已知可以附接至单链核酸的荧光物质即可。在一个实施方案中，靶核酸可以是分别由seqidno:9、10和11的核苷酸序列代表的c1、c2和c3；第一至第三单链探针可以是分别由seqidno:2、3和4的核苷酸序列代表的s1、s2和s3，它们由荧光物质标记并包含与靶核酸互补的序列；并且第四单链探针可以是由seqidno:1的核苷酸序列代表的u1，其由与s1、s2和s3的部分互补的序列构成(见图1)。另外，在一个实施方案中，靶核酸可以是由seqidno:12、13和14的核苷酸序列代表的c1'、c2'和c3’；第一至第三单链探针可以是分别由seqidno:6、7和8的核苷酸序列代表的单链s1'、s2’和s3’，它们由荧光物质标记并包含与靶核酸互补的序列；并且第四单链探针可以是由seqidno:5的核苷酸序列代表的u1’，其由与s1'、s2’和s3’的部分互补的序列构成(见图3)。另外，可以根据靶标修饰每个探针中的靶核酸互补序列。在本发明的一个例子中，将特异于肺癌的经修饰的egfrmrna序列c1、c2和c3和mirna序列c1'、c2’和c3’用作靶序列，因此这些靶序列可用于诊断肺癌并监测抗癌药的使用效果。在一个实施方案中，由第四单链探针形成的四面体的一面可以在距氧化石墨烯最远处。在再另一方面，本发明涉及一种用于核酸检测的组合物，其中荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯，其中该荧光核酸纳米结构包括：第一单链探针，其包含与第一靶核酸互补的核酸和荧光物质；第二单链探针，其包含与第二靶核酸互补的核酸和荧光物质；第三单链探针，其包含与第三靶核酸互补的核酸和荧光物质；和第四单链探针，其由与第一单链探针的部分、第二单链探针的部分和第三单链探针的部分互补的序列构成。在一个实施方案中，在三棱柱的三角形面中，第四单链探针和由第一至第三单链探针形成的双链面的相对面(单链部分)可以附接至氧化石墨烯。在又另一方面，本发明涉及一种用于核酸检测的方法，其包括以下步骤：从样品中分离核酸；通过将分离的核酸与包含与靶核酸互补的核酸和荧光物质的单链探针混合且随后进行热处理来产生荧光核酸纳米结构；将所述荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯；并且通过荧光共振能量转移现象检测荧光。在一个实施方案中，在产生荧光核酸纳米结构的步骤和将荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯的步骤中，盐(nacl)的浓度可以为50至300mm。在再又另一方面，本发明涉及一种用于核酸检测的方法，所述方法包括以下步骤：从样品中分离核酸；使分离的核酸与根据本发明的用于核酸检测的组合物反应；并且通过荧光共振能量转移现象检测荧光。在一个实施方案中，根据本发明的用于核酸检测的组合物可以是石墨烯/荧光核酸纳米结构，其中荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯，其中所述荧光核酸纳米结构包括：第一单链探针，其包含与第一靶核酸互补的核酸和荧光物质；第二单链探针，其包含与第二靶核酸互补的核酸和荧光物质；第三单链探针，其包含与第三靶核酸互补的核酸和荧光物质；和第四单链探针，其由与第一单链探针的部分、第二单链探针的部分和第三单链探针的部分互补的序列构成。在又另一方面，本发明涉及一种用于多核酸检测的方法，其包括以下步骤：从样品中分离核酸；通过将分离的核酸与包含与不同靶核酸互补的核酸和荧光物质的一个或多个单链探针混合且随后进行热处理来产生荧光核酸纳米结构；将所述荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯；并且通过荧光共振能量转移现象检测荧光。在再另一方面，本发明涉及一种用于产生荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的方法，所述方法包括以下步骤：通过将包含与不同靶核酸互补的核酸和不同荧光物质的一个或多个单链探针混合且随后进行热处理来产生荧光核酸纳米结构；并且将所述荧光核酸纳米结构附接至氧化石墨烯。在一个实施方案中，包含与不同靶核酸互补的核酸和不同荧光物质的一个或多个单链探针可以是：第一单链探针，其包含与第一靶核酸互补的核酸和荧光物质；第二单链探针，其包含与第二靶核酸互补的核酸和荧光物质；第三单链探针，其包含与第三靶核酸互补的核酸和荧光物质；和第四单链探针，其由与第一单链探针的部分、第二单链探针的部分和第三单链探针的部分互补的序列构成。在又另一方面，本发明涉及组合物用于核酸检测的用途，所述组合物包含：一个或多个单链探针，所述一个或多个单链探针各自包含与靶核酸互补的核酸、荧光物质和与其他单链探针互补的核酸；和氧化石墨烯。在又另一方面，本发明涉及一种使用包含一个或多个单链探针和氧化石墨烯的组合物检测生物标记物的方法，所述一个或多个单链探针各自包含与靶核酸互补的核酸、荧光物质和与其他单链探针互补的核酸。实施例将参考以下实施例更加详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于详细说明本发明，而本发明不受限于这些。实施例1.氧化石墨烯的合成用研钵和研杵将1g石墨和50g盐(nacl)研磨15分钟。之后，为了除去盐，将研磨的石墨和盐添加到水中，然后搅拌6小时以上。使用布氏漏斗过滤石墨，并在80℃的烘箱中干燥。将23ml的98％硫酸添加到干燥的石墨中，并搅拌12小时。在添加3g高锰酸钾后，将混合物在35℃下搅拌30分钟，然后加热至70℃，然后搅拌45分钟。在添加46ml水后，将混合物在98℃下搅拌30分钟，然后向其中添加140ml水和10ml的30％过氧化氢，然后搅拌1小时。所有反应完成后，将30ml反应产物置于50ml管中，以11,000rpm离心20分钟，并用5％盐酸洗涤一次，以及用水洗涤3次。为了分级，将所得的材料以5,000g离心10分钟，收集上清液，并以11,000rpm离心60分钟，然后收集下层。实施例2.荧光核酸纳米结构的合成2-1.四面体荧光核酸纳米结构的合成合成了四面体荧光核酸纳米结构，其中四面体的底部由双链组成，而侧面和待附接至氧化石墨烯的部分由单链组成。具体地，总共四个单链包括：所述结构的顶面(四面体的底部)的序列u1(由分别与s1、s2和s3互补的序列组成)，其由双链组成；以及s1、s2和s3，其分别包含与靶序列c1、c2和c3(egfrmrna的修饰)互补的序列(表1)。通过测量在260nm波长处的吸光度来定量荧光标记的核酸单链s1、s2和s3以及u1。然后，以相同的摩尔数将这些链按不同方式组合(一至三个链的组合和所有四个链的组合)，以使所有序列之间的摩尔比为1:1，并且将盐浓度调节至150mm。此后，将每种组合置于聚合酶链反应(pcr)系统中。接着，在以下连续条件下对每种组合进行热处理：温度升至95℃并保持该温度2分钟；温度降至60℃；温度以1℃/min的速率降至20℃；在20℃下保持5分钟；以及温度降至4℃。随后，通过琼脂糖凝胶电泳确认所产生的四面体荧光核酸纳米结构的合成。图1示出了四面体荧光核酸纳米结构的特定开发模型。表1通过琼脂糖凝胶电泳确认通过以一至三个链的所有可能的组合将链混合而获得的荧光核酸纳米结构(a至g)和通过将所有四个链混合而获得的荧光核酸纳米结构(h)，并且结果表明，单链彼此组合，因此电泳凝胶上的条带逐渐变高。另外，证实了当将四个链一起热处理时，形成了纳米结构(h)(图2)。2-2.三棱柱形荧光核酸纳米结构的合成合成了三棱柱形荧光核酸纳米结构，其中三棱柱的顶面由双链组成，而侧面和待附接至氧化石墨烯的底部由单链组成。具体地，总共四个单链包括：所述结构的顶面(三棱柱的底部的一部分)的序列u1’，其由双链组成；以及s1'、s2’和s3’，其包含与靶序列c1'、c2'和c3’(mirna)互补的序列(表2)。通过测量在260nm波长处的吸光度来定量荧光标记的单链s1'、s2’和s3’以及u1’。然后，以相同的摩尔数将这些链按不同方式组合(一至三个链的组合和所有四个链的组合)，以使所有序列之间的摩尔比为1:1，并且将盐浓度调节至200mm(最佳盐浓度是通过额外进行盐浓度优化实验来确定的，因为三棱柱的序列比四面体的序列更长且更复杂；参见下面的实施例5-2)。此后，将每种组合置于聚合酶链反应(pcr)系统中。接着，在以下连续条件下对每种组合进行热处理：温度升至95℃并保持该温度5分钟；温度降至85℃并保持该温度5分钟；温度以0.5℃/min的速率降至20℃并保持该温度5分钟；以及温度降至4℃。此后，通过琼脂糖凝胶电泳确认所产生的三棱柱形荧光核酸纳米结构的合成(数据未示出)。图3示出了三棱柱形荧光核酸纳米结构的详细开发模型。表2实施例3.荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的形成3-1.四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的产生将上述实施例2-1中生产的20pmol四面体荧光核酸纳米结构与实施例1中生产的3μg氧化石墨烯混合以达到50μl的总体积，并将混合物中的盐浓度调节至200mm。之后，使混合物在25℃下反应30分钟，从而产生石墨烯/四面体荧光核酸纳米结构，其具有如下结构：其中四面体的底部朝上，并且侧表面的靶标互补单链部分和s1链的腺嘌呤序列(聚a)突出并附接至氧化石墨烯。3-2.三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的产生将上述实施例2-2中产生的10pmol三棱柱形荧光核酸纳米结构与实施例1中产生的3μg氧化石墨烯混合，并向其中添加水和盐以达到50μl的总体积，并将混合物中的盐浓度调节至200mm。之后，使混合物在25℃下反应30分钟，从而产生石墨烯/三棱柱形荧光核酸纳米结构，其具有如下结构：其中侧面包括由单链组成的靶互补部分，并且在三棱柱的两个三角形面中，由单链组成的底部附接至氧化石墨烯。3-3.荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的结构模拟3-3-1.四面体结构为了检查是否形成了产生的荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的结构，并检查最终形状和荧光位置变化(取决于是否存在靶标)，使用oxdna程序进行模拟。具体地，将靶序列逐个组装到四面体荧光核酸纳米结构中，且结果表明，在预定位置形成了双键而没有扭曲(图4a和4b)。3-3-3.三棱柱形结构为了检查是否形成了产生的荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的结构(石墨烯/三棱柱形荧光核酸纳米结构)，并检查最终形状和荧光位置变化(取决于是否存在靶标)，使用oxdna程序进行模拟。具体地，将靶序列逐个组装到三棱柱形荧光核酸纳米结构中，且结果表明，在预定位置形成了双键而没有扭曲(图5a和5b)。另外，通过使用vmd(视觉分子动力学)分析通过oxdna模拟获得的数据，预测了荧光与氧化石墨烯之间的距离，结果确认了当结合靶序列时，荧光与氧化石墨烯之间的距离增加(图5c)。实施例4.根据靶序列添加时机，检查结构的检测能力4-1.添加靶序列后合成荧光核酸纳米结构在以上实施例2-1中的四面体荧光核酸纳米结构的合成期间，以0至5倍的摩尔比额外添加靶序列c1、c2和c3。然后，根据相同的方案合成荧光核酸纳米结构，并通过琼脂糖凝胶电泳确认所产生的荧光核酸纳米结构的合成(图6)。之后，将3μg氧化石墨烯添加至20pmol荧光核酸纳米结构中，并向其中添加水和盐，使得盐浓度达到200mm，从而制备50μl总体积的溶液。然后，使溶液反应30分钟。将反应产物添加到96孔板中，并使用读板仪测量在fam(485nm/525nm)、cy3(540nm/570nm)和cy5(640nm/670nm)的吸收/发射波长下的荧光值。当四面体荧光核酸纳米结构处于恒定浓度(20pmol/50μl)时，测量了取决于靶序列(c-dna)浓度的荧光值变化，且结果表明，当在添加高浓度靶序列后合成纳米结构时，绝对荧光值显著增加，但是当在添加少量靶序列后合成纳米结构时，在存在和不存在靶标的情况下出现相对荧光差异(图7)。4-2.合成荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物后添加靶序列在合成荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物之后添加靶序列，并检查复合物的检测能力。具体地，如以上实施例2-1中所述合成荧光核酸纳米结构，然后如以上实施例3-1中所述合成荧光核酸纳米结构与氧化石墨烯的复合物。向20pmol/50μl产生的石墨烯/四面体荧光核酸纳米结构中分别添加10μl以2μm和20μm浓度制备的靶序列c1、c2和c3(egfrl858r、t790m和e746-a750)，然后检查荧光值如何随时间增加。结果，如图8所示，可以确认当添加10倍浓度的靶序列时(图8d至8f)，靶标确实结合到所述结构的互补序列区域，从而使荧光值增加。然而，如图8f所示，即使在添加10倍浓度的靶序列时，荧光值也低于c2情况下的荧光值。因此，可以看出，当荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物形成且随后与靶序列反应时，与在添加靶序列之后形成复合物时相比，需要更高浓度的靶序列。实施例5.根据盐浓度，检查结构的检测能力5-1.根据盐浓度，检查四面体荧光核酸纳米结构的检测能力在以上实施例2-1中的荧光核酸纳米结构的合成期间，将靶序列c1、c2和c3一起添加并合成荧光核酸纳米结构。将20pmol合成的荧光核酸纳米结构样品与3μg氧化石墨烯混合，并向其中添加盐和水，使得盐浓度为0至200mm，从而制备各自具有50μl总体积的混合物。将每种混合物添加到96孔板中，并测量在485nm/525nm(fam)、540nm/570nm(cy3)和640nm/670nm(cy5)的吸收/发射波长下的荧光值。结果是，可以确认，随着盐浓度的增加，每个靶标的荧光值增加，并且容易区分荧光值之间的差异(图9)。由此可以推断，由于氧化石墨烯的表面带有负电荷并且核酸纳米结构的主链具有负电荷，随着盐浓度的增加，荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物更容易形成，从而使得附接在单链dna上的荧光更容易被淬灭。5-2.根据盐浓度，检查三棱柱形荧光核酸纳米结构的检测能力在以上实施例2-2中的荧光核酸纳米结构的合成期间，将靶序列c1'、c2'和c3’一起添加，然后以相同的方式合成三棱柱形核酸纳米结构。在所述纳米结构的合成期间，由于与四面体纳米结构相比，序列更长且更复杂，因此将盐浓度调节至150至300mm。将合成的荧光核酸纳米结构样品与氧化石墨烯混合，并将盐浓度保持在200mm，从而合成石墨烯/三棱柱形核酸纳米结构。将50μl合成的石墨烯/三棱柱形荧光核酸纳米结构添加到96孔板中，并使用读板仪测量在485nm/525nm(fam)、540nm/570nm(cy3)和640nm/670nm(cy5)的吸收/发射波长下的荧光值。结果是，可以确认，当在150mm的盐浓度下合成荧光核酸纳米结构时，即使在除了c2序列以外的靶序列的情况下，fam荧光值也显著增加，但是当在200mm的盐浓度下合成荧光核酸纳米结构时，对于每个靶标的灵敏度都很好(图10)。另外，即使在使用更高浓度的盐时，靶标检测能力也类似于在200mm下合成的纳米结构的靶标检测能力。实施例6.根据氧化石墨烯的量，检查结构的检测能力6-1.根据氧化石墨烯的量，检查四面体荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯的检测能力在以上实施例2-2中的荧光核酸纳米结构的合成期间，将靶序列c1、c2和c3一起添加，然后以相同的方式合成荧光核酸纳米结构。之后，使用20pmol合成的荧光核酸纳米结构和各种量的氧化石墨烯，产生荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物。在此，进一步添加盐和水，使得盐浓度为200mm，从而制备各自具有50μl总体积的混合物。将产生的反应产物添加到96孔板中，并使用读板仪测量在fam(485nm/525nm)、cy3(540nm/570nm)和cy5(640nm/670nm)的吸收/发射波长下的荧光值。结果是，可以确认，当氧化石墨烯的量为2.5至3.5μg时，荧光差异不显著，但是随着氧化石墨烯量的增加，fam荧光信号越来越难以区分，并且随着氧化石墨烯量的减少，难以区分cy3荧光信号。因此，可以发现，当氧化石墨烯的量为3μg时，这是区分所有荧光信号的适当量(图11)。6-2.根据氧化石墨烯的量，检查三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的检测能力在以上实施例2-2中的荧光核酸纳米结构的合成期间，将靶序列c1′、c2′和c3’一起添加，然后以相同的方式合成三棱柱形荧光核酸纳米结构。然后，使用20pmol的荧光核酸纳米结构样品和各种量(3、6和9μg)的氧化石墨烯，产生荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物(石墨烯/荧光核酸纳米结构)。将反应产物添加到96孔板中，并使用读板仪测量在fam(485nm/525nm)、cy3(540nm/570nm)和cy5(640nm/670nm)的吸收/发射波长下的荧光值。结果证实，当氧化石墨烯的量为3μg或更多时，取决于氧化石墨烯量的荧光没有显著差异(图12)。实施例7.根据靶序列的量，荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯的检测能力和检测限在三棱柱形核酸纳米结构的合成期间，添加0至300nm量的靶序列c1′、c2′和c3′，然后通过执行相同的热处理方案产生荧光核酸纳米结构。之后，如以上实施例3中所述，将3μg氧化石墨烯添加至10pmol的各荧光核酸纳米结构中，并向其中添加水和盐，使得盐浓度达到200mm，从而制备50μl总体积的各溶液。使用这些溶液产生三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物。然后，测量复合物的荧光值，并获得取决于靶序列的添加量的标准曲线。结果是，可以看出荧光强度随靶生物标记物浓度的增加而线性增加(图13)。另外，可以将测得的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的荧光值转换为样品中存在的靶核酸生物标记物的浓度，从而计算出三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的检测限。具体地，根据临床和实验室标准协会(clsi)发布的ep17指南计算检测限。结果，如下表3所示，发现结构的检测限对于mir-21(c1′)为49.16nm，对于let-7f(c2′)为48.86nm，且对于mir-200b-3p(c3′)为43.43nm(以摩尔和克表示)。表3序列名称靶序列检测限(nm)检测限(ng/μl)c1’mir-2149.160.3443c2’let-7f48.860.3462c3’mir-200b-3p43.430.3052实施例8.检查三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的针对肺癌来源mirna的功能8-1.检查对源自肺癌a549细胞的mirna的检测能力为了检查本发明的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物是否可以通过与实际样品中的靶序列互补结合而发射荧光，检查所述复合物对检测提取自肺癌细胞的mirna的作用。具体地，从肺癌a549细胞提取总mirna，并且发现其浓度为499.68ng/μl。在荧光核酸纳米结构中，添加0至10μg量的提取自肺癌细胞的总mirna，并产生浓度为200nm的荧光核酸纳米结构。使用这些纳米结构产生三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物。测量了所产生的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的荧光强度，且结果是，可以确认荧光强度随肺癌细胞来源mirna的添加量的增加而线性增加(图14)。8-2.检查对源自肺癌pc-9细胞的mirna的检测能力为了检查本发明的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物是否可以通过与实际样品中的靶序列互补结合而发射荧光，检查所述复合物对检测提取自肺癌细胞的mirna的作用。具体地，从肺癌pc-9细胞提取总mirna，并且发现其浓度为312.16ng/μl。在荧光核酸纳米结构中，添加0至6.24μg量的提取自肺癌细胞的总mirna，并产生浓度为200nm的荧光核酸纳米结构。使用这些纳米结构产生三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物。测量了所产生的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的荧光强度，且结果是，可以确认荧光强度随提取自pc-9的mirna的量的增加而线性增加(图15)。由此，可以看出，本发明的三棱柱形荧光核酸纳米结构/氧化石墨烯复合物的棱柱部分中的单链核酸确实与存在于肺癌细胞的总mirna中的c1'、c2'和c3'mirna互补结合，并且荧光强度根据靶序列的浓度增加而增加。<110>蛋白科技先锋<120>用于核酸检测的荧光核酸纳米结构-石墨烯生物传感器<130>pn1710-398<160>14<170>kopatentin3.0<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>u1<400>1aggctgattcggttcatgcggatccacttacggcgaatg39<210>2<211>76<212>dna<213>人工序列<220><223>s1<400>2ccgatgaacaccgaatcagcctgcgaacgaccagtttggcccgcccaaaatctatcacca60gaaaaaaaaaaaaaaa76<210>3<211>70<212>dna<213>人工序列<220><223>s2<400>3gtaggtacctggatccgcatgagttcatcggcatgagctgcatgatgagctggcagttga60gctggtgata70<210>4<211>61<212>dna<213>人工序列<220><223>s3<400>4gtcgttcgccattcgccgtaagggtacctactttcggagatgtcttgatagcctcaactg60c61<210>5<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>u1'<400>5aggctgattcggttcatgcggatccacttacggcgaatg39<210>6<211>92<212>dna<213>人工序列<220><223>s1'<400>6acggttgtacgtactaagctcagtctattcaacatcagtctgataagctagacaccggaa60ccaagacagccacacggcgacaacagaaggta92<210>7<211>92<212>dna<213>人工序列<220><223>s2'<400>7tacttaccgtgtctgtgttggcctgttcaactatacaatctactacctcataccttccgc60cggaacgccggaacaagaagaacaagtagccg92<210>8<211>92<212>dna<213>人工序列<220><223>s3'<400>8ggacgaacttcatatcgcatgtacaggatcatcattaccaggcagtattacggctaccgg60accagcaccaaggcgagaacaagaacggtgtc92<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>c1<400>9gattttgggcgggccaaactg21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>c2<400>10cagctcatcatgcagctcatg21<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>c3<400>11gctatcaagacatctccgaaa21<210>12<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>c1'<400>12uagcuuaucagacugauguuga22<210>13<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>c2'<400>13ugagguaguagauuguauaguu22<210>14<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>c3'<400>14uaauacugccugguaaugauga22当前第1页12当前第1页12