具有1,3-PDO生产力和降低的3-HP生产力的重组棒状杆菌以及使用其生产1,3-PDO的方法与流程

本发明涉及一种具有1,3-pdo(1,3-丙二醇)生产能力和降低(抑制)的3-hp生产能力的重组棒状杆菌(corynebacterium)以及使用其生产1,3-pdo的方法，并且更特别地涉及一种突变体微生物，其具有缺失或减弱的3-hp生产能力并且从甘油产生1,3-pdo，其中所述突变体微生物通过以下方式产生：将编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因、编码甘油脱氢酶的基因、编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-pdo氧化还原酶的基因引入谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)，并且从所述谷氨酸棒状杆菌缺失或减弱编码醛脱氢酶的基因。
背景技术：
：1,3-丙二醇(1,3-pdo)是用作合成聚合物(诸如聚醚、聚氨酯和聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt))的单体的化学物质。主要用于生产1,3-pdo的常规方法是化学合成方法，并且可以使用丙烯醛的水合、在膦的存在下环氧乙烷的加氢甲酰化、或甘油的酶促转化。这些化学生产方法具有局限性，因为它们包括高成本且对环境有危害的生产过程(lee等人,renewableandsustainableenergyreviews,42(增刊c):963-972；美国专利号8,236,994b2)。使用微生物生产1,3-pdo的生物方法主要使用诸如克雷伯氏菌属(klebsiella)、梭状芽孢杆菌属(clostridia)、肠杆菌属(enterobacter)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)和乳酸杆菌属(lactobacilli)的微生物来进行。在所有这些方法中，通过使用甘油脱水酶将甘油转化为3-羟基丙醛(3-hpa)并且然后使用1,3-pdo氧化还原酶将3-hpa还原为1,3-pdo的两个连续代谢途径(图1)将甘油直接转化为1,3-pdo。dupontinc.已经通过将所述代谢途径引入大肠杆菌(e.coli)中而成功商业化了1,3-pdo。然而，存在缺点，其中包括用于生物合成1,3-pdo的大肠杆菌的大多数微生物与各种副产物(诸如甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、乙醇和2,3-丁二醇)一起产生。谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)是革兰氏阳性厌氧细菌，其被广泛用于氨基酸生产的发酵过程。另外，为了使用谷氨酸棒状杆菌生产各种化学物质和燃料，已经进行了大量的代谢工程研究，目的是实现消耗各种类型的碳源，诸如葡萄糖和木糖，但是关于生产1,3-pdo的研究很少，并且研究报道了使用葡萄糖和甘油作为碳源在谷氨酸棒状杆菌中通过用葡萄糖促进细胞生长来生产谷氨酸以及同时用甘油生产1,3-pdo(huang等人,scientificreports,7:42246,2017)。然而，作为1,3-pdo生物合成代谢途径中的中间体的3-羟基丙醛(3-hpa)在细胞中积累时具有毒性作用，并且充当3-羟基丙酸的前体，3-羟基丙酸是1,3-pdo的副产物之一。通过醛脱氢酶从3-hpa转化3-hp，这已被报道在通过在谷氨酸棒状杆菌中过表达gabd4(e209q/e269q)(gabd4的突变体酶)(编码源自杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)的醛脱氢酶的基因)生产3-hp的研究中(chen等人,metabolicengineering,39:151,2017)。然而，这是由外源酶的过表达引起的效果，并且在仍然天然存在于谷氨酸棒杆菌中并且参与3-hp生物合成的醛脱氢酶中，没有与特异性接受作为底物的3-hpa的基因相关的报道。因此，作为通过生物途径更有效地生产1,3-pdo的大量努力的结果，本发明诸位发明人已经发现，在培养谷氨酸棒状杆菌时，3-hp生产能力被抑制并且因此有效生产1,3-pdo，所述谷氨酸棒状杆菌通过引入编码甘油脱氢酶的基因、编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-pdo氧化还原酶的基因而被赋予1,3-pdo生产能力，并且同时在所述谷氨酸棒状杆菌中，3-hpa生产能力通过缺失谷氨酸棒状杆菌中存在的候选醛脱氢酶基因而被抑制，从而产生具有1,3-pdo生产能力并且其中3-hp生产能力被抑制或缺失的突变体谷氨酸棒状杆菌。基于此发现，完成本发明。技术实现要素：因此，已鉴于以上问题提出了本发明，并且本发明的目的是提供一种突变体谷氨酸棒状杆菌，其由于抑制的3-hp产生能力而能够有效生产1,3-pdo。本发明的另一个目的是提供一种通过培养所述突变体谷氨酸棒状杆菌来生产1,3-pdo的方法。根据本发明的一个方面，以上和其他目的可以提供一种突变体微生物来实现，所述突变体微生物具有缺失或减弱的3-hp生产能力并且从甘油产生1,3-pdo，其中(i)编码甘油易化蛋白的基因、(ii)编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因、(iii)编码甘油脱水酶的基因、(iv)编码甘油再激活酶的基因和(v)编码1,3-pdo氧化还原酶的基因被引入谷氨酸棒状杆菌中，并且从所述谷氨酸棒状杆菌缺失或减弱编码醛脱氢酶的基因。根据本发明的另一方面，提供了一种从甘油生产1,3-pdo的方法，其包括(a)在含甘油培养基中培养所述突变体微生物以产生1,3-pdo，以及(b)收集所产生的1,3-pdo。附图说明图1是说明根据本发明的突变体谷氨酸棒状杆菌的总体代谢途径的示意图，包括1,3-pdo生物合成代谢途径、3-hp生物合成代谢途径和甘油分解代谢途径。图2示出了其中插入了编码甘油降解代谢途径的glpf、glpk和glpd基因的pcsglpfkd重组载体。图3示出了为缺失ncgl0049基因(在13种醛脱氢酶候选物中)而产生的pcg-9ts-ald1重组载体。图4示出了通过插入编码甘油脱水酶的pducdegh基因簇而产生的pek-pdu重组载体，以便构建3-hpa生物合成代谢途径。图5示出了通过将编码大肠杆菌1,3-pdo氧化还原酶的yqhd基因插入pek-pdu载体中而产生的pek-pduye重组载体，以便构建1,3-pdo生物合成代谢途径。图6示出了通过将pcsglpfkd和pek-pduye载体引入其中缺失11种类型的醛脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌菌株中，在使用甘油作为单一碳源时3-hp产生的结果。图7示出了通过将pcsglpfkd和pek-pduye载体引入其中缺失11种醛脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌菌株中，在使用甘油作为单一碳源时1,3-pdo产生的结果。具体实施方式除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同的意义。一般而言，本文使用的术语是本领域所熟知且通常使用的术语。在本发明中，具有增加的1,3-pdo生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌通过以下方式产生：在突变体谷氨酸棒状杆菌中抑制从与3-hpa(其为1,3-pdo的前体)相同的前体转化的3-hp的生产能力，以便使用具有1,3-pdo生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌改善1,3-pdo产率。在本发明中，具有1,3-pdo生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌通过以下方式产生：将编码甘油脱氢酶的基因、编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-pdo氧化还原酶的基因引入天然不具有1,3-pdo生产能力的谷氨酸棒状杆菌中。在本发明中使用的编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-pdo氧化还原酶的基因是klebsiellapneumoniae(克雷伯氏肺炎菌)来源的pducdegh和大肠杆菌来源的yqhd，并且在将所述基因引入谷氨酸棒状杆菌中后确定1,3-pdo生产能力。在本发明中使用的谷氨酸棒状杆菌是天然允许甘油扩散但当使用单一碳源时不允许细胞生长的微生物。出于此原因，通过引入编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因来产生能够从甘油碳源进行细胞生长的谷氨酸棒状杆菌。在本发明中，源自大肠杆菌的glpf、glpk和glpd分别作为编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因被引入。在本发明中，除了1,3-pdo外，引入了1,3-pdo生物合成代谢途径的谷氨酸棒状杆菌还产生作为主要副产物的3-hp(3-羟基丙酸)，并且3-hp是从3-hpa(3-羟基丙醛)通过醛脱氢酶转化的，3-hpa是与3-pdo相同的前体。从存在于谷氨酸棒状杆菌中的醛脱氢酶的候选酶中鉴定特异性地与3-hpa强烈反应的酶，并且确定通过体内培养获得的效果。因此，在一方面，本发明涉及一种突变体微生物，其具有缺失或减弱的3-hp生产能力并且从甘油产生1,3-pdo，其中所述突变体微生物通过以下方式产生：将(i)编码甘油易化蛋白的基因、(ii)编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因、(iii)编码甘油脱水酶的基因、(iv)编码甘油再激活酶的基因和(v)编码1,3-pdo氧化还原酶的基因引入谷氨酸棒状杆菌中，并且从所述谷氨酸棒状杆菌缺失或减弱编码醛脱氢酶的基因。在本发明中，编码醛脱氢酶的基因(其为参与提供具有抑制的3-hp生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌的酶)包括谷氨酸棒状杆菌中存在的11种候选基因，即ncgl0049、ncgl0157、ncgl0437、ncgl0463、ncgl0521、ncgl0523、ncgl0900、ncgl2272、ncgl2578、ncgl2619、和ncgl2698。在本发明中，确定由于针对3-hp生物合成抑制选择的11种候选基因的缺失而引起的3-hp产生的变化，并且产生具有增加的1,3-pdo产生的突变体谷氨酸棒状杆菌。在本发明中，可以缺失或减弱至少一种编码醛脱氢酶的基因。在本发明中，编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因、和编码甘油脱氢酶的基因可以分别是glpf、glpk和glpd，并且编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因、和编码1,3-pdo氧化还原酶的基因可以是pducdeg或yqhd。在本发明中，所述引入的基因可以通过选自tac、trc和tuf的强启动子过表达。如本文所用，术语“固有活性”是指微生物天生具有的处于未修饰状态的酶的活性，表述“经修饰以具有与固有活性相比增强的活性”意指与修饰前的酶活性相比活性是新引入或改善的。如本文所用，术语“酶活性的增强”不仅包括通过新引入酶的活性或将其改善而具有超出原始功能的作用，而且还包括基于内源基因活性的增加、由于内部或外部因素引起的内源基因扩增、基因表达的抑制性调节因子的缺失、基因拷贝数的增加、来自外部来源的基因的引入、表达调节序列的修饰(特别是启动子替代或修饰)而增加的酶活性，以及由于基因突变而增加的酶活性。如本文所用，术语“经修饰以具有与固有活性相比增强的活性”意指这样的状态，在所述状态下操纵后微生物的活性与操纵前微生物的活性相比增加，所述操纵诸如展现出活性的基因或增加的相应基因的拷贝数的引入以及基因表达的抑制性调节因子的缺失或对表达调节序列的修饰(例如增强的启动子的使用)。如本文所用，术语“缺失”涵盖其中通过对基因的一部分或全部碱基进行突变、替代或缺失的方法使基因不表达的情况，以及其中即使所述基因表达，其酶活性也不表达的情况；并且包括阻断相应基因的酶所介导的生物合成途径的所有操作。如本文所用，术语“过表达”是指表达水平高于细胞中相应基因在正常状态中表达的水平，并且包括通过将存在于基因组上的基因的启动子用更强的启动子替代或者将相应基因克隆至表达载体中以与所述表达载体一起转化细胞而引起的表达水平的增加。如本文所用，术语“载体”意指dna产物，其含有与合适控制序列可操作连接的编码靶蛋白的多核苷酸的碱基序列，以在合适宿主中表达靶蛋白。控制序列包括能够启动转录的启动子、用于控制这种转录的任何操纵基因序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及用于控制转录和翻译终止的序列。将载体转化至合适的宿主细胞中后，它可以独立于宿主基因组进行复制或执行功能，并可以与基因组整合。由于质粒是最常用的载体类型，因此术语“质粒”和“载体”可以在本发明的说明书中可互换使用。为了本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于此目的的典型质粒载体包括(a)有效进行复制使得每个宿主细胞中包括几百个质粒载体的复制起点，(b)用于筛选由质粒载体转化的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)其中了插入外源dna片段的限制性酶切位点。即使不存在合适的限制性酶切位点，也可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接体或接头容易地将所述载体和外源dna连接。连接后，应将载体转化到适当的宿主细胞中。本发明中优选的宿主细胞是原核细胞。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌dh5α、大肠杆菌jm101、大肠杆菌k12、大肠杆菌w3110、大肠杆菌x1776、大肠杆菌xl-1blue(stratagene)、大肠杆菌b、大肠杆菌b21等。然而，还可以使用诸如fmb101、nm522、nm538和nm539的大肠杆菌菌株，以及其他原核生物物种和属等。除了上文提及的大肠杆菌，如下菌株也可以用作宿主细胞：农杆菌属(agrobacterium)的菌株，如农杆菌a4；芽孢杆菌属(bacillus)菌株，如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；其他肠细菌，如鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)；以及假单胞菌属(pseudomonas)的各种菌株。原核细胞的转化可以使用1.82部分(sambrook等人，同上引文)中描述的氯化钙方法容易地进行。可替代地，电穿孔(neumann等人,emboj.,1:841,1982)可以用于这些细胞的转化。用于过表达根据本发明的基因的载体可以是本领域已知的任何表达载体，并且优选地是基于pet的载体(novagen)。当使用基于pet的载体进行克隆时，组氨酸基团与所表达的蛋白质的末端结合，从而可以有效地纯化所述蛋白质。所表达的蛋白质可以通过本领域已知的通用方法从所克隆的基因分离，并且可以使用ni-ntahis-缀合的树脂(novagen)使用色谱法进行特异性分离。在本发明中，所述重组载体可以是pet-slti66，并且所述宿主细胞可以是大肠杆菌或农杆菌。如本文所用，术语“表达控制序列”意指对于与特定宿主生物可操作地连接的编码序列的表达所必需的dna序列。这样的控制序列包括用于进行转录的启动子、用于控制这样的转录的任何操纵基因序列、用于编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及用于控制转录和翻译的终止的序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包括启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。对基因在质粒中的表达水平具有最大影响的因子是启动子。优选地使用srα启动子、巨细胞病毒来源的启动子等作为用于高表达的启动子。可以将多种多样的表达控制序列中的任何一种用于载体以便表达本发明的dna序列。有用的表达控制序列包括例如sv40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、tac或trc系统、t3和t7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他乙二醇裂解酶的启动子、磷酸酶的启动子(如pho5)、酵母α-交配系统的启动子、和已知控制原核或真核细胞或病毒的基因表达的其他序列及其各种组合。t7启动子可用于在大肠杆菌中表达本发明的蛋白质。当核酸序列基于功能性关系与另一核酸序列对齐时，它与其“可操作地连接”。它可以是一个或多个基因和一个或多个控制序列，其以这样的方式连接以便当合适的分子(例如，转录激活子蛋白)与所述一个或多个控制序列连接时能够进行基因表达。例如，当作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，前序列或分泌前导序列的dna与多肽的dna可操作地连接；当启动子或增强子影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；或者当核糖体结合位点影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；或者当被定位以促进翻译时，核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的dna序列与其接触，并且分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。然而，增强子不需要与其接触。这些序列通过在便利的限制酶切位点处的连接(ligation/linkage)进行连接。当不存在此类位点时，使用根据常规方法的合成的寡核苷酸衔接子或接头。如本文所用，术语“表达载体”通常是指其中插入了异源dna片段的重组载体，并且通常意指双链dna片段。在本文中，异源dna是在宿主细胞中不天然存在的外源dna。一旦表达载体存在于宿主细胞中，它就可以独立于宿主染色体dna进行复制，并且可以产生载体和其插入的(异源)dna的若干个拷贝。如本领域熟知的，为了增加转基因在宿主细胞中的表达水平，所述基因应当与在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，表达控制序列和相应基因被包括在一个含有细菌选择标记和复制起点的表达载体中。当表达宿主是真核细胞时，表达载体应当在真核表达宿主中进一步包括有用的表达标记。用上述表达载体转染或转化的宿主细胞构成本发明的另一方面。如本文所用，术语“转染”意指将dna引入宿主中并使dna可使用染色体外因子或染色体整合进行复制。如本文所用，术语“转化”意指表达载体容纳在宿主细胞中，而不管是否实际表达任何编码序列。应当理解，并非所有载体和表达控制序列在表达本发明的dna序列时都同样地起作用。同样，并非所有宿主针对同一表达系统都同样地起作用。然而，本领域技术人员将能够在没有过多的实验负担和不脱离本发明的范围的情况下从各种载体、表达控制序列和宿主中进行适当的选择。例如，对载体的选择应该在考虑宿主的情况下进行，因为所述载体应该在其中复制。还应考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由相应载体编码的其他蛋白的表达(例如抗生素标记的表达)。在选择所述表达控制序列时，应考虑许多因素。例如，特别是关于可能的二级结构，应当考虑序列的相对强度、可控性和与本发明的dna序列的相容性。可以在考虑诸如以下因素的情况下选择单细胞宿主：所选载体、由发明的dna序列编码的产物的毒性、分泌特征、准确折叠蛋白质的能力、培养和发酵因素、以及从宿主中由根据本发明的dna序列编码的产物的易纯化性。在这些因素的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大型动物培养中表达本发明的dna序列的各种载体/表达控制序列/宿主组合。作为用于通过表达克隆来克隆蛋白质的cdna的筛选方法，可以应用结合方法、淘选方法、膜乳液方法等。在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于举例说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。在以下实施例中，仅给出了源自特定菌株的基因作为待引入的基因的例子，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，可以不受限制地使用任何基因，只要它们在待引入它们的宿主中表达并且展现出相同的活性即可。实施例1：用于生产能够使用甘油作为单一碳源生长的突变体谷氨酸棒状杆菌的pcsglpfkd载体的产生1-1：用于构建甘油分解代谢途径的pcsglpfkd载体的产生谷氨酸棒状杆菌已知不能使用甘油作为单一碳源进行细胞生长。因此，为了构建甘油分解代谢途径，首先使用谷氨酸棒状杆菌穿梭载体pces208s-h36-s3表达编码源自大肠杆菌w3110的酶并且负责甘油分解代谢途径的基因。使用大肠杆菌w3110(atcc39936)的染色体dna作为模板以及seqidno:1和2的引物进行pcr以获得编码甘油易化蛋白的glpfk基因片段和甘油激酶操纵子酶，并且使用seqidno:3和4的引物进行pcr以获得编码甘油-3-磷酸脱氢酶的glpd基因片段。为了将glpfk基因片段与glpd基因片段连接，使用seqidno:1和4的引物进行重叠pcr以产生glpfkd基因片段(seqidno:53)。为了用抗生素大观霉素线性化pces208s-h36-s3载体((通过替代pces208-h36载体(韩国专利特开平10-2013-0022691，或yims.s.等人,biotechnol.bioeng.,110:2959,2013,seqidno:54)的km抗生素而获得的载体(seqidno:21))，使用seqidno:5和6的引物进行pcr，并且使用产生的glpfkd基因片段和gibson组装方法构建pcsglpfkd载体(图2)。[表1]用于产生pcsglpfkd载体的引物实施例2：用于抑制3-hp生物合成的醛脱氢酶缺失载体的产生当从甘油产生1,3-pdo时，通过细胞中存在的醛脱氢酶将产生的前体3-hpa转化为3-hp。然而，尚未报道在谷氨酸棒状杆菌中催化接受作为底物的前体的反应的酶。因此，为了鉴定介导所述反应的醛脱氢酶并且从菌株的基因组中缺失编码所述酶的基因以从而抑制3-hp生物合成，首先选择谷氨酸棒状杆菌中存在的13种醛脱氢酶(表2)。然后，为了确认通过缺失编码这13种醛脱氢酶的基因(seqidno:56至68)而对3-hp生物合成的抑制作用，首先产生包括转化到谷氨酸棒状杆菌中的ptaccc1-hrt载体的菌株(cho等人,metabolicengineering,42:157-167,2017)。然后，产生i)各自含有12种类型的基因的sgrna序列的pcg9ts系列，以及ii)各自与所产生的谷氨酸棒状杆菌菌株的13种基因结合的ssodn，以在谷氨酸棒状杆菌中进行基因缺失。2-1：含有13种基因的sgrna指导序列的pcg9ts系列载体的产生首先，使用分析sgrna指导序列的非特异性靶标并且提供最佳sgrna指导序列的在线程序crispy-web(blin等人,syntheticandsystemsbiotechnology,1(2):118-121,2016)，选择以下具有低的脱靶效应的最佳指导序列(表2)。[表2]使用crispy-web，用于13种任意种类的醛脱氢酶的sgrna指导序列为了产生包含sgrna指导序列(seqidno:7至19)的pcg9ts系列载体，将靶向ncgl0049基因并且编码sgrna-t1/te序列的dna片段(韩国专利申请号2017-0042124；cho等人,metabolicengineering,42:157-167,2017)使用puc19-sgrna载体(韩国专利申请号2017-0042124；cho等人,metabolicengineering,42:157-167,2017，seqidno:55)作为模板以及seqidno:20和23的引物进行扩增。使用seqidno:21和22的引物，通过pcr将扩增的dna片段扩增。在将pekts-cas9载体(韩国专利申请号2017-0042124；cho等人,metabolicengineering,42:157-167,2017，seqidno:66)用stui酶处理后，用扩增的片段通过gibson组装最终产生表达靶向ncgl0049基因的sgrna以及cas9蛋白的pcg9ts-ald1载体。然后，以与以上相同的方式产生靶向编码13种任意种类的酶中的每一种的基因的片段(在seqidno:20、21和22的情况下相同；对于相应的基因以seqidno:24至35的顺序进行pcr)以产生pcg9ts-ald2、pcg9ts-ald3、pcg9ts-ald4、pcg9ts-ald5、pcg9ts-ald6、pcg9ts-ald7、pcg9ts-ald8、pcg9ts-ald9、pcg9ts-ald10、pcg9ts-ald11、pcg9ts-ald12和pcg9ts-ald13载体。[表3]用于扩增sgrna-t1/te片段的引物seqidno核苷酸序列seqidno:20tatagatatcccgcggtatattaattaatataaacgcagaaaggcccseqidno:21tggatgatggggcgattcaggtatagatatcttgacaattaatcatcggctseqidno:22aaggtgttgctgactcataccaggtatagatatcccgcggtata[表4]用于产生pcg9ts系列载体和13种随机选择的酶的引物2-2：各自与13种类型的基因结合的ssodn的产生设计用于缺失13种任意种类的靶基因的ssodn，使得sgrna指导序列结合的位点位于ssodn的两个结合序列之间，并且全长为80个核苷酸(表5)。同时，ssodn由5’同源臂和3’同源臂组成，并且每个同源臂是40个碱基对，并且被设计为结合至包含与sgrna指导序列互补的序列的靶基因区域的两端的外部分。当ssodn与靶标结合时，形成环结构，并且此部分成为发生缺失的区域。缺失区域的长度被设计为具有100个碱基对，使得可以通过pcr容易地检测靶基因的缺失。[表5]与任意13种醛脱氢酶基因结合的ssodn序列实施例3：具有抑制的3-hp生产能力和改善的1,3-pdo生产能力的谷氨酸棒状杆菌的产生和确认3-1：具有抑制的3-hp生产能力的谷氨酸棒状杆菌的产生将实施例2-1和2-2中产生的pcg9ts-ald载体和ssodn各自转化到野生型谷氨酸棒状杆菌(atcc13032)中，以便从基因组中缺失预期参与3-hp生物合成的编码任意13种醛脱氢酶的基因。然后，对于转化的突变体谷氨酸棒状杆菌菌株，通过在37℃bhi板上固化去除ptaccc1-hrt载体(韩国专利申请号2017-0042124；cho等人,metabolicengineering,42:157-167,201，seqidno:57)和pcg9ts-ald载体。通过此过程产生的菌株在表6中示出。然而，不产生wah3菌株和wah9菌株，并且相应的两个基因被认为是细胞存活所必需的基因。[表6]11种任意醛脱氢酶缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株3-2：用于构建1,3-pdo生物合成代谢途径的pek-pduye载体的产生为了构建1,3-pdo生物合成代谢途径，使用谷氨酸棒状杆菌的pekex1穿梭载体(eikmanns等人,gene102:93,1991,seqidno:58)表达克雷伯氏肺炎菌dsmz2026(kctc4952)和大肠杆菌w3110来源的外源酶。首先，使用克雷伯氏肺炎菌的dsmz2026菌株的染色体dna作为模板以及seqidno:49和50的引物进行pcr以获得编码甘油脱水酶和甘油再激活酶的pducdegh基因簇片段(seqidno:59)。为了将获得的pducdegh基因片段与作为穿梭载体的pekex1载体连接，通过用限制酶ecori和psti处理并且然后使用gibson组装进行连接来产生pek-pdu载体(图4)。然后，使用通过将源自大肠杆菌w3110的yqhd插入作为模板的ptac15k载体(来源于p15a，tac启动子，kmr)中而获得的ptac15kyqhd重组载体(重组载体(seqidno:60)以及seqidno:51和52的引物进行pcr以获得编码1,3-pdo氧化还原酶的yqhd基因片段。为了将获得的基因片段与pek-pdu载体连接，通过用drai限制酶处理并且使用gibson组装进行连接来产生pek-pduye载体(图5)。[表7]用于产生pek-pduye载体的引物3-3：通过体内培养确认对3-hp生产能力的抑制以及1,3-pdo生产能力的改善将实施例3-1中制备的每种菌株用用于构建甘油降解代谢途径的pcsglpfkd载体和用于构建1,3-pdo生物合成代谢途径的pek-pduye转化。然后，在补充有25μg/l的卡那霉素和200μg/l的大观霉素的bhis板培养基(含有37g/l的脑心浸液(bhi)、91g/l的山梨糖醇和15g/l的琼脂)上进行选择。将11种转化的突变体微生物接种到含有10mlbhis培养基(含有37g/l的脑心浸液(bhi)和91g/l的山梨糖醇)的试管中，并且在30℃下预培养16小时。然后，将1ml预培养溶液接种到在250ml挡板烧瓶中的25mlcgxii培养基(表8)中并且进行培养。将甘油的初始浓度设定为40g/l，并且在培养基中添加10g/l的酵母提取物，并且一式三份地进行烧瓶培养48小时。[表8]用于培养谷氨酸棒状杆菌的cgxii培养基的组分cgxii-甘油培养基的组分浓度cacl2·2h2o13mg/lfeso4·7h2o10mg/lmnso4·5h2o14mg/lznso4·7h2o1mg/lcuso4·5h2o300μg/lnicl2·6h2o20μg/l(nh4)2so420g/l脲2g/lkh2po41g/lk2hpo41g/l生物素200μg/l硫胺素500μg/l原儿茶酸30mg/lmops42g/l甘油40g/l大观霉素200μg/l用于测量3-hp浓度的hplc条件如下。首先，使用agilent1100系列hplc仪器，并且将dad检测器、agilentmetacarb87h柱和另一个uv210nm检测器用作检测器和柱。同时，在40℃下以0.5ml/min的流速进料0.1％h3po4作为缓冲液。接下来，将waters1515高效液相色谱法(waters1co.，米尔福德，马萨诸塞州，美国)用于测量1,3-pdo。本文使用的检测器和柱是waters2414折射率检测器和ametacarb87h柱(300x7.8mm；agilent)。此时，在35℃下以0.5ml/min的流速进料0.01nh2so4作为缓冲液。结果是，如从图6和7可以出，用来自wah13菌株的pcsglpfkd载体和pek-pduye载体转化的菌株最多地抑制了3-hp产生，并且因此最多地增加了1,3-pdo产生。另外，可以看出wah1、wah2、wah5、wah6和wah7也展现出抑制的3-hp产生和增加的1,3-pdo产生。工业实用性根据本发明的突变体谷氨酸棒状杆菌可以使用廉价的甘油作为碳源通过抑制产生副产物3-hp的能力来以高效率产生1,3-pdo。尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求和其等同物限定。序列文本附有电子文件。<110>韩华思路信韩国科学技术院<120>具有1,3-pdo生产力和降低的3-hp生产力的重组棒状杆菌以及使用其生产1,3-pdo的方法<130>pp-b2190<150>kr10-2018-0058952<151>2018-05-24<160>68<170>kopatentin2.0<210>1<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物(primer)<400>1ttggttggtaggagtagcatgggatccatgagtcaaacatcaacctt47<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物(primer)<400>2gtttccatctatatctccttttattcgtcgtgttcttccc40<210>3<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物(primer)<400>3aaggagatatagatggaaaccaaagatctgat32<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物(primer)<400>4taattataatggccggctgggcctctagagttacgacgccagcgataacc50<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物(primer)<400>5tctagaggcccagccggccattataattag30<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物(primer)<400>6ggatcccatgctactcctaccaaccaaggt30<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>7ttcgtggactaagaaacggt20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>8tgcaggattgtagacaggag20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>9ttcacctcagagacgattag20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>10tgtttgctaaagagtaggaa20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>11aactccccgcgaaagatccg20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>12ttcggagacacacacatgta20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>13ccagtgactttagagctagg20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>14ccaactgatatcgtgctgta20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>15gtcgccagtgtatgcgtgaa20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>16gcgcagcaaagctacgtttc20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>17atcgtcgtaaggattgatat20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>18gaggttatagcgccatttac20<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna<400>19cttgccaatccgattagagc20<210>20<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna-t1/te片段的引物(primer)<400>20tatagatatcccgcggtatattaattaatataaacgcagaaaggccc47<210>21<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna-t1/te片段的引物(primer)<400>21tggatgatggggcgattcaggtatagatatcttgacaattaatcatcggct51<210>22<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sgrna-t1/te片段的引物(primer)<400>22aaggtgttgctgactcataccaggtatagatatcccgcggtata44<210>23<211>78<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pcg9ts-系列载体制备的引物(primer)<400>23ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggttcgtggactaagaaacggtgtttta60gagctagaaatagcaagt78<210>24<211>78<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pcg9ts-系列载体制备的引物(primer)<400>24ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggtgcaggattgtagacaggaggtttta60gagctagaaatagcaagt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