识别患有川崎病的受试者的方法

本公开涉及一种识别患有川崎病(kd)的受试者的方法，所述方法包含将所述受试者与患有另一种病症的受试者辨别开，所述另一种病症例如其它传染性和炎性病症，如表现出与kd类似的症状的病症。本公开还涉及在所述方法中采用的最小基因特征以及在所述方法中使用的定制基因芯片。本公开进一步扩展到对本公开的特征中的基因具有特异性的探针和/或引物。本公开进一步涉及已知的基因芯片在本公开的方法中的用途以及包括执行所述方法所需的元件的试剂盒。本公开还涉及所述方法用于提供复合表达评分的用途，所述复合表达评分可用于辨别细菌感染与病毒感染或炎性疾病，特别适用于资源不足的环境中。

背景技术：

川崎病(kd)是主要影响幼儿的急性炎性障碍。自从川崎病在日本被最初描述以来[1]，该疾病已成为获得性心脏病的最常见原因，五岁以下儿童的发病率在日本[2]为265/100,000，在其它亚洲国家[3-5]为51-194/100,000，并且在欧洲[6]和美国[7]分别为8-20/100,000。引起kd的这种担忧的是其与脉管炎的关系，脉管炎主要影响冠状动脉，导致多达25％的未经治疗的儿童形成冠状动脉瘤(caa)[8]。心肌梗死可能是由于动脉瘤的血栓阻塞所致，或者来自由于受损动脉中的血管重塑而导致狭窄病变的发展。对患有巨型caa的儿童进行的长期结局研究表明了令人担忧的预后：在30年内，有超过50％的患者需要进行血管重建或遭受心肌梗塞[9，10]。

静脉注射免疫球蛋白(ivig)的治疗，以及对于无反应的患者，额外施用ivig[11]或其它抗炎药剂(如类固醇和英夫利昔单抗)，可有效消除炎性过程并将caa的风险降低5-10％[12]。由于kd难以与其它常见的发热性病症区分开，因此许多kd儿童在病程中未能得到足够早的诊断和治疗从而防止caa的发生[13]。此外，不符合诊断性kd的临床标准(所谓的“不完全kd”)的患者仍可能患有caa。延迟的诊断向来是caa发展的危险因素，即使在具有丰富kd经验的中心，通常也只有在超声心动图上已经显示冠状动脉扩张时才开始治疗。caa的发展在临床上是无症状的，只有在几年后猝死或心肌梗塞时才能被认识到。

kd的症状与其它几种儿童期发热性疾病类似，包含葡萄球菌和链球菌中毒性休克综合征、麻疹和其它病毒疾病(如腺病毒感染、落基山斑疹热和儿童炎性疾病)，从而导致诊断困难并因此导致诊断和治疗延迟。根据临床体征和症状、超声心动图和实验室参数，已经制定了指导方针以促进临床诊断[14]。然而，尚无对该疾病的明确诊断测试。随着全球kd发病率的增加，迫切需要一种准确的测试来将kd与导致儿童长时间发烧的其它病症区分开来。

技术实现要素：

在精密医学时代，以前仅基于临床特征的许多病症的诊断已被基于分子病理学的诊断所取代。已显示，宿主血液基因表达特征可区分许多特定的传染性和炎性疾病，包含结核[15]、细菌和病毒感染[16]和全身性红斑狼疮[17]。对基于基因表达特征的kd诊断方法的支持来自于对kd中的microrna生物标志物的识别[18，19]，尽管现有研究受限于比较患者组的范围或需要从外泌体中提取rna。

因此，本发明人已经探索了使用全血基因表达模式来将kd与其它儿童期传染性和炎性病症区分开。本公开提供了一种在独立患者组中发现和验证的基因表达特征，其将kd与一系列细菌、病毒和炎性疾病区分开。

在以下段落中概括了本公开：

1.一种识别患有川崎病(kd)的受试者的方法，所述方法包括在受试者来源的rna样品中检测基因特征的基因表达水平的调节，所述基因特征包括以下基因中的至少5个基因：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

2.根据段落1所述的方法，其中所述基因特征包括所述基因中的6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个基因。

3.根据段落1或2所述的方法，其中所述基因特征包括以下基因中的至少一个基因：pyroxd2、smox、cacna1e、cd163、ddias、clic3、klhl2和hs.553068，具体地说，pyroxd2、smox、cacna1e和cd163中的至少一个基因。

4.根据段落1到3中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括pyroxd2。

5.根据段落1到4中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括cacna1e。

6.根据段落1到5中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括smox。

7.根据段落1到6中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括cd163。

8.根据段落1到7中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括：

(i)pyroxd2和cacna1e；

(ii)pyroxd2和smox；或

(iii)pyroxd2、cacna1e和smox。

9.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少5个基因或由所述至少5个基因组成：

(i)pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和smox；

(ii)pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2和smox；

(iii)pyroxd2、cacna1e、hs.553068、ifi27和smox；

(iv)pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27和smox；(v)pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和znf185；或

(vi)pyroxd2、ddias、cd163、klhl2和smox。

10.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少6个基因或由所述至少6个基因组成：

(i)pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox；

(ii)pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、linc02035和smox；

(iii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27和smox；

(iv)pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox；

(v)pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、smox和znf185；

(vi)pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2、rtn1和smox；

(vii)pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、klhl2和smox；

(viii)pyroxd2、cacna1e、clic3、ifi27、klhl2和smox；

(ix)pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27、rtn1和smox；或

(x)pyroxd2、ddias、cd163、ifi27、klhl2和smox。

11.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少7个基因或由所述至少7个基因组成：

(i)pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2和smox；

(ii)pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox；

(iii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox；

(iv)pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2、rtn1和smox；或

(v)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox。

12.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少8个基因或由所述至少8个基因组成：

(i)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox；

(ii)pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox；

(iii)pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox；或

(iv)pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2、s100p和smox。

13.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少9个基因或由所述至少9个基因组成：

(i)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox；

(ii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox；或

(iii)pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox。

14.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少10个基因或由所述至少10个基因组成：

(i)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox；或

(ii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox。

15.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少11个基因或由所述至少11个基因组成：

(i)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox；

(ii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox；或

(iii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185。

16.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括例如选自以下的基因中的至少12个基因或由所述至少12个基因组成：

(i)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185；

(ii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox；或

(iii)pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p、smox和znf185。

17.根据段落1到8中任一项所述的方法，其中所述基因特征包括以下或由以下组成：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

18.根据段落1到17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括检测表达水平或一个或多个管家基因，如1个、2个、3个、4个或5个管家基因，所述管家基因例如选自肌动蛋白、gapdh、泛素、18srrna、rpii(polr2a)、tbp、ppia、gusb、hspcb、ywhaz、sdha、rps13、hprt1和b4galt6。

19.根据段落1到18中任一项所述的方法，其中可以在存在以下一项或多项的情况下识别患有kd的受试者：细菌感染、病毒感染和炎性病症。

20.根据段落1到19中任一项所述的方法，其中可以将患有kd的受试者与患有以下一项或多项的患者辨别开：细菌感染、病毒感染和炎性病症。

21.根据段落19或20所述的方法，其中所述细菌感染选自由以下组成的组：肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热衣原体(chlamydophilapsittaci)、支原体肺炎(mycoplasmapneumonia)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、b组链球菌(groupbstreptococcus)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)，或耐酸细菌，如麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、结核分枝杆菌(mycobateriumtuberculosis)、溃疡分枝杆菌(mycobacteriumulcerans)、鸟间分枝杆菌(mycobacteriumaviumintercellularae)、百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、犬布鲁氏菌(brucellacanis)、羊布鲁氏杆菌(brucellamelitensis)、猪布鲁氏菌(brucellasuis)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、大肠杆菌(escherichiacoli)、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)、问号钩端螺旋体(leptospirainterrogans)、淋病奈瑟氏球菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、假单胞菌(pseudomonasspp)、立克次体立克次氏菌(rickettsiarickettsii)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、宋内志贺菌(shigellasonnei)、梅毒螺旋体(treponemapallidum)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)、金格杆菌(kingellakingae)、寡养单胞菌(stenotrophomonas)、克雷伯氏杆菌(klebsiella)、革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、支原体、百日咳、分枝杆菌以及葡萄球菌和链球菌中毒性休克综合征，例如革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、支原体或百日咳和分枝杆菌，具体地说，选自由以下组成的组：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、b组链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肠球菌、金氏杆菌、流感嗜血杆菌、假单胞菌、寡养单胞菌、克雷伯氏杆菌、葡萄球菌和链球菌中毒性休克综合征，具体地说，葡萄球菌或链球菌中毒性休克综合征。

22.根据段落19到21中任何一项所述的方法，其中所述病毒感染选自由以下组成的组：流感，如a型流感(包含但不限于：h1n1、h2n2、h3n2、h5n1、h7n7、h1n2、h9n2、h7n2、h7n3、h10n7)、b型流感和c型流感、呼吸道合胞病毒(rsv)、鼻病毒、肠病毒、博卡病毒、副流感(如1-4型副流感)、腺病毒、偏肺病毒、单纯疱疹病毒、水痘病毒、人类乳头瘤病毒、肝炎、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘带状疱疹病毒、人类巨细胞病毒、人类疱疹病毒、8型bk病毒、jc病毒、天花、细小病毒b19、人类星形病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、严重急性呼吸综合征病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、风疹病毒、人类免疫缺陷病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉萨病毒、马丘波病毒、萨比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒和落基山斑疹热，例如选自由以下组成的组：呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒、副流感病毒(如1-4型副流感)、流感(如a型、b型或a+b型流感)、博卡病毒、偏肺病毒、鼻病毒和肠病毒，具体地说，rsv、a型/b型流感和腺病毒，具体地说，麻疹、腺病毒感染和落基山斑疹热。

23.根据段落19到22中任一项所述的方法，其中所述炎性病症选自由以下组成的组：哮喘、消化性溃疡、结核、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、鼻窦炎、肝炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、干燥性疾病、炎性肠病、红斑狼疮(包含全身性红斑狼疮)、纤维化疾病(如肺纤维化)、过敏性紫癜(hsp)和青少年特发性关节炎(jia)，具体地说，过敏性紫癜(hsp)或青少年特发性关节炎(jia)。

24.根据段落1到23中任一项所述的方法，其中所述受试者是儿童，例如，所述儿童在2到59个月的年龄范围内。

25.根据段落1到23中任一项所述的方法，其中所述受试者是在0到59天的年龄范围内的婴儿。

26.根据段落1到25中任一项所述的方法，其中所述受试者发烧。

27.根据段落1到26中任一项所述的方法，其中基因表达调节的分析采用微阵列或基因芯片。

28.根据段落1到27中任一项所述的方法，其中所述分析基因表达调节采用：pcr，如rt-pcr，具体地说，多重pcr。

29.根据段落14或15所述的方法，其中所述pcr是定量的。

30.根据段落28到29中任一项所述的方法，其中所述pcr中采用的引物包括标记或标记的组合，例如其中所述标记是荧光的或彩色的，例如彩色珠。

31.根据段落1到30中任一项所述的方法，其包括另外的步骤：基于所述基因特征的分析结果，向所述受试者开出或施用针对川崎病(kd)的治疗。

32.一种治疗患有川崎病(kd)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用针对kd的治疗，其中所述受试者先前已经通过在受试者来源的rna样品中检测基因特征的基因表达水平的调节而被识别为患有川崎病，所述基因特征包括以下基因中的至少5个基因：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

33.根据段落31或32所述的方法，其中所述治疗是γ球蛋白(ivig)、阿司匹林或其它抗炎药剂，如类固醇和英夫利昔单抗，或其组合。

34.用于在识别患有川崎病(kd)的受试者的方法中使用的引物集合，所述引物集合包括对来自以下基因中的至少5个基因的多核苷酸基因转录本具有特异性的引物：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

35.根据段落34所述的引物集合，其由仅对以下基因具有特异性的引物组成：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

36.一种基因芯片，其由对以下基因中的至少5个基因具有特异性的探针组成：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

37.一种基因芯片，其由以下组成：对以下基因中的至少5个基因具有特异性的探针：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1；以及一个或多个对照探针。

38.根据段落37所述的基因芯片，其中所述一个或多个对照探针对选自由以下组成的组的基因具有特异性：肌动蛋白、gapdh、泛素、18srrna、rpii(polr2a)、tbp、ppia、gusb、hspcb、ywhaz、sdha、rps13、hprt1和b4galt6。

39.一种用于识别患有川崎病(kd)t的受试者的即时测试，所述即时测试包括段落34或35中定义的引物集合或根据段落36到38中任一项所述的基因芯片。

40.一种段落34或35中定义的引物集合或根据段落36到38中任一项所述的基因芯片在用于检测样品例如血液样品中的川崎病(kd)的测定法中的用途。

本公开提供了一种识别患有川崎病(kd)的受试者的方法，所述方法包括检测以下基因中的至少5个基因的表达水平：cacna1e、ddias(c11orf82)、klhl2、pyroxd2(c10orf33)、smox、znf185、linc02035(loc100129550)、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

因此，一方面，存在一种识别患有川崎病(kd)的受试者的方法，所述方法包括在受试者来源的rna样品中检测基因特征的基因表达水平的调节，所述基因特征包括以下基因中的至少5个基因：cacna1e、ddias(c11orf82)、klhl2、pyroxd2(c10orf33)、smox、znf185、linc02035(loc100129550)、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

有利地，在根据本公开的方法中使用所述基因特征允许稳健且准确地识别患有kd的受试者。重要的是，所述方法允许在患有kd的患者与表现出类似症状但患有其它细菌感染、病毒感染和/或炎性病症的患者之间进行准确辨别。换句话说，所述方法允许在存在或不存在细菌、病毒感染和/或炎性病症的情况下准确检测kd，而无需依赖临床标准和/或实验室测试，如超声心动图。

基因特征通常包括大量基因，这些基因只有结合在一起才能显示生物学意义上的模式或标志物。非常令人惊讶的是，本公开的基因特征可以基于少至13个基因，并且仍然可靠地识别kd的存在。包括上述13个基因中的至少5个基因的本公开的基因特征提供了良好的预测力。然而，所述特征中可以包含另外的基因，以进一步增强和增加所述基因特征的辨别力。因此，在一个实施例中，所述特征包括所述基因中的至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个基因。

因此，在一个实施例中，所述特征至少包括pyroxd2。在一个实施例中，所述特征至少包括smox。在一个实施例中，所述特征至少包括cacna1e。在一个实施例中，所述特征至少包括cd163。在一个实施例中，所述特征至少包括ddias。在一个实施例中，所述特征至少包括clic3。在一个实施例中，所述特征至少包括klhl2。在另一个实施例中，所述特征至少包括hs.553068。在另一个实施例中，所述特征至少包括rtn1。在另一个实施例中，所述特征至少包括znf185。在另一个实施例中，所述特征至少包括ifi27。在另一个实施例中，所述特征至少包括s100p。在另一个实施例中，所述特征至少包括linc02035。

在一个实施例中，所述基因特征包括以下基因中的至少一个：pyroxd2、smox、cacna1e、cd163、ddias、clic3、klhl2和hs.553068。在另一个实施例中，所述基因特征包括以下基因中的至少一个：pyroxd2、smox、cacna1e和cd163。本发明人发现这些特定基因具有较高的辨别力，并且因此更有可能以最佳的预测力存在于所述特征中。

例如，所述基因特征可以包括以下任何基因组合或由所述基因组合组成：pyroxd2、smox、cacna1e和cd163；pyroxd2、smox和cacna1e；pyroxd2、smox和cd163；smox、cacna1e和cd163；pyroxd2、cacna1e和cd163；pyroxd2和smox；pyroxd2和cacna1e；pyroxd2和cd163；smox和cacna1e；smox和cd163；或cacna1e和cd163；或任何其它组合。

在一个实施例中，所述特征包括pyroxd2以及cacna1e和smox中的至少一个。因此，在一个实施例中，所述特征包括pyroxd2和cacna1e。在另一个实施例中，所述特征包括pyroxd2和smox。在又一个实施例中，所述特征包括pyroxd2、cacna1e和smox。

在一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少5个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、hs.553068、ifi27和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和znf185。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cd163、klhl2和smox。

在一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少6个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、linc02035和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、smox和znf185。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2、rtn1和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、clic3、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27、rtn1和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cd163、ifi27、klhl2和smox。

在一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少7个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2、rtn1和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox。

在另一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少8个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox。在另一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2、s100p和smox。

在另一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少9个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox。在一个实施例中，ddias，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox。在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox。

在另一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少10个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox。在另一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox。

在另一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少11个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox。在另一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox。在另一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185。

在一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少12个基因。因此，在一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185。在另一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox。在另一个实施例中，所述特征包括以下或由以下组成：pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p、smox和znf185。

在一个实施例中，所述特征包括所有13个基因。因此，在一个实施例中，所述基因特征包括以下或由以下组成：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。有利地，包括所有13个基因的特征具有最高的辨别力，并允许以最高程度的敏感性和特异性来识别kd。

由于kd与可能会导致冠状动脉瘤(cca)的形成的血管炎相关，因此对kd的识别尤为重要。心肌梗死可能是由于动脉瘤的血栓阻塞所致，或者来自由于受损动脉中的血管重塑而导致狭窄病变的发展。因此，对于正确和可靠地识别kd，存在非常大的未满足的临床需求。本公开的基因特征是在治疗如发热患者等患者的道路上迈出的一大步，因为所述基因特征允许准确且快速的诊断，进而允许对患者进行适当和及时的治疗。

此外，可以以简单的形式提供本文公开的方法中采用的成分，这些成分具有成本效益、快速、经济有效并且可以在资源不足和/或农村环境中使用。

本发明人发现，与未患有kd的受试者相比，患有kd的受试者中的cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035和clic3的转录表达水平增加，并且与未患有kd的受试者相比，患有kd的受试者中的s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1的转录表达水平降低。

有利地，本发明人能够使用检测上文列出的13个基因的基因表达水平的调节的基因特征来将患有kd的受试者与未患有kd的受试者辨别开，其具有～96.2％的高auc，以及高敏感性(～81.7％)和特异性(～92.1％)。

有利地，所述基因特征是从包含一系列种族的训练集中发展而来的。这意味着本公开的基因特征和方法可以应用于来自不同种族的受试者的样品。进一步有利的是，使用患病不超过7天的kd患者来开发基因特征。这意味着所述特征可以有助于在发烧5天之前进行早期kd诊断，这有助于kd患者的早期识别并可以及早进行适当的治疗。

因此，本发明人已经证明所述方法可适用于广泛的不同样品和患者组，这表明所述方法是稳健且可靠的。

因此，在一方面，本公开提供了一种诊断患有川崎病的受试者的方法，所述方法包括在受试者来源的rna样品中检测基因特征的基因表达水平的调节，所述基因特征包括以下基因中的至少5个基因：cacna1e、ddias(c11orf82)、klhl2、pyroxd2(c10orf33)、smox、znf185、linc02035(loc100129550)、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

在一个实施例中，在体外执行诊断方法。

在一个实施例中，所述方法进一步采用一个或多个管家基因，如1个、2个、3个、4个或5个管家基因。在本说明书的上下文中，管家基因不被认为是特征的一部分。在一个实施例中，所述管家基因选自由以下组成的组：肌动蛋白、gapdh、泛素、18srrna、rpii(polr2a)、tbp、ppia、gusb、hspcb、ywhaz、sdha、rps13、hprt1和b4galt6。

在一个实施例中，本公开的方法能够在存在细菌感染、病毒感染和/或炎性病症的情况下识别患有kd的受试者。

在一个实施例中，本公开的方法能够将患有kd的受试者与患有细菌感染、病毒感染和/或炎性病症的患者辨别开。

在一个实施例中，所述细菌感染选自由以下组成的组：肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、支原体肺炎、白喉棒状杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、b组链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌，或耐酸细菌，如麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、鸟间分枝杆菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋体、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、铜绿假单胞菌、假单胞菌、立克次体立克次氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌、金格杆菌、寡养单胞菌、克雷伯氏杆菌、革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、支原体、百日咳、分枝杆菌以及葡萄球菌和链球菌中毒性休克综合征，例如革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、支原体或百日咳和分枝杆菌。

在一个实施例中，所述细菌感染选自由以下组成的组：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、b组链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肠球菌、金氏杆菌、流感嗜血杆菌、假单胞菌、寡养单胞菌和克雷伯氏杆菌。

在一个实施例中，所述细菌感染是葡萄球菌或链球菌中毒性休克综合征。

在一个实施例中，所述病毒感染选自包括以下或由以下组成的组：流感，如a型流感(包含但不限于：h1n1、h2n2、h3n2、h5n1、h7n7、h1n2、h9n2、h7n2、h7n3、h10n7)、b型流感和c型流感、呼吸道合胞病毒(rsv)、鼻病毒、肠病毒、博卡病毒、副流感、腺病毒、偏肺病毒、单纯疱疹病毒、水痘病毒、人类乳头瘤病毒、肝炎、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘带状疱疹病毒、人类巨细胞病毒、人类疱疹病毒、8型bk病毒、jc病毒、天花、细小病毒b19、人类星形病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、严重急性呼吸综合征病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、风疹病毒、人类免疫缺陷病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉萨病毒、马丘波病毒、萨比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒和落基山斑疹热。

在一个实施例中，病毒感染选自由以下组成的组：呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒、副流感病毒(如1-4型副流感)、流感(如a型、b型或a+b型流感)、博卡病毒、偏肺病毒、鼻病毒和肠病毒，具体地说，rsv、a型/b型流感和腺病毒。一个实施例中，所述病毒感染选自由以下组成的组：麻疹、腺病毒感染和落基山斑疹热。

根据权利要求4到11中任一项所述的方法，其中所述炎性病症选自由以下组成的组：哮喘、消化性溃疡、结核、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、鼻窦炎、肝炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、干燥性疾病、炎性肠病、红斑狼疮(包含全身性红斑狼疮)、纤维化疾病(如肺纤维化)、过敏性紫癜(hsp)和青少年特发性关节炎(jia)。

在一个实施例中，所述炎性疾病是以下疾病：青少年特发性关节炎(jia)、过敏性紫癜(hsp)。

在另一方面，本公开提供了一种采用本文的方法来治疗诊断后患有kd的受试者的方法。

在一个实施例中，所述受试者是儿童，例如17岁以下，如2到59个月大。

在一个实施例中，所述受试者是婴儿，例如在0到59天的年龄范围内。

在一个实施例中，所述受试者发烧，例如为发热患者。

在一个实施例中，本公开的方法用于患者来源的样品，例如血液样品。

在一个实施例中，基因表达调节的分析采用微阵列。

在一个实施例中，基因表达调节的分析采用pcr，如rt-pcr。

在一个实施例中，所述pcr是多重pcr。

在一个实施例中，所述pcr是定量的。

在一个实施例中，所述pcr中采用的引物包括标记或标记的组合。

在一个实施例中，所述标记是荧光的或彩色的，例如所述标记是彩色珠。

在一个实施例中，基因表达调节的分析采用双色逆转录酶多重连接依赖性探针扩增。

在一个实施例中，通过采用荧光光谱法检测所述基因表达调节。

在一个实施例中，通过采用比色分析来检测所述基因表达调节。

在一个实施例中，通过采用阻抗谱法检测所述基因表达调节。

在一个实施例中，所述方法包括另外的步骤：基于基因特征的分析结果，向患有kd的受试者开出或施用治疗。

因此，在一方面，提供了一种通过施用如γ球蛋白(ivig)、阿司匹林或其它抗炎药剂(如类固醇和英夫利昔单抗)等治疗来治疗kd患者的方法，其中所述患者的特征在于所述患者通过本文公开的方法已被识别为kd阳性。因此，在一方面，提供了一种治疗患有川崎病(kd)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用针对kd的治疗，其中所述受试者先前已经通过在受试者来源的rna样品中检测基因特征的基因表达水平的调节而被识别为患有川崎病，所述基因特征包括以下基因中的至少5个基因：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。kd的合适治疗是技术人员已知的，包含但不限于γ球蛋白(ivig)、阿司匹林或其它抗炎药剂，如类固醇和英夫利昔单抗，或其组合。

在一方面，提供了一种确定是否施用如γ球蛋白(ivig)、阿司匹林或其它抗炎药剂(如类固醇和英夫利昔单抗)等kd治疗的方法，所述方法包括以下步骤：执行根据本公开的方法，并且如果所述方法指示所述受试者患有kd，则将kd施用于所述受试者。

因此，当前公开的方法可以帮助对如发热患者等患者进行适当治疗，例如在不清楚发烧是由于川崎病还是由于细菌感染、病毒感染、炎性病症或其组合的情况下。这具有确保快速且适当的治疗而无需等待实验室测试结果的优点。

在本公开的一个方面，提供了用于多重pcr的引物集合，其中所述引物集合包含对来自以下基因中的至少5个基因的多核苷酸基因转录本具有特异性的核酸序列：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。因此，在一个实施例中，所述引物集合对至少来自pyroxd2的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自smox的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自cacna1e的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自cd163的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自ddias的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自clic3的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自klhl2的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自hs.553068的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自rtn1的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自znf185的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自ifi27的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自s100p的转录本具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对至少来自linc02035的转录本具有特异性。

在一个实施例中，所述引物集合对来自以下基因中的至少一个基因的转录本具有特异性：pyroxd2、smox、cacna1e、cd163、ddias、clic3、klhl2和hs.553068。在另一个实施例中，所述引物集合对来自以下基因中的至少一个基因的转录本具有特异性：pyroxd2、smox、cacna1e和cd163。

例如，所述引物集合对来自以下任何基因组合的转录本具有特异性：pyroxd2、smox、cacna1e和cd163；pyroxd2、smox和cacna1e；pyroxd2、smox和cd163；smox、cacna1e和cd163；pyroxd2、cacna1e和cd163；pyroxd2和smox；pyroxd2和cacna1e；pyroxd2和cd163；smox和cacna1e；smox和cd163；或cacna1e和cd163；或任何其它组合。

在一个实施例中，所述引物集合对来自pyroxd2以及cacna1e和smox中的至少一个的转录本具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2和cacna1e具有特异性。在另一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2和smox具有特异性。在又一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e和smox具有特异性。

在一个实施例中，所述引物集合对来自所述13个基因中的至少5个基因的转录本具有特异性：因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、hs.553068、ifi27和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和znf185具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cd163、klhl2和smox具有特异性。

在一个实施例中，所述引物集合对所述13个基因中的至少6个基因具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、linc02035和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、smox和znf185具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2、rtn1和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、clic3、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27、rtn1和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cd163、ifi27、klhl2和smox具有特异性。

在一个实施例中，所述特征包括所述13个基因中的至少7个基因。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，ddias，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2、rtn1和smox具有特异性。在一个实施例中，ddias，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox具有特异性。

在另一个实施例中，所述引物集合对所述13个基因中的至少8个基因具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在另一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2、s100p和smox具有特异性。

在另一个实施例中，所述引物集合对所述13个基因中的至少9个基因具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox具有特异性。在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox具有特异性。

在另一个实施例中，所述引物集合对所述13个基因中的至少10个基因具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox具有特异性。在另一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox具有特异性。

在另一个实施例中，所述引物集合对所述13个基因中的至少11个基因具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox具有特异性。在另一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox具有特异性。在另一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185具有特异性。

在一个实施例中，所述引物集合对所述13个基因中的至少12个基因具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185具有特异性。在另一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox具有特异性。在另一个实施例中，所述引物集合对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p、smox和znf185具有特异性。

在一个实施例中，所述引物集合对所有13个基因均具有特异性。因此，在一个实施例中，所述引物集合对cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1具有特异性。

在一个实施例中，所述基因转录本是rna，例如mrna或crna。因此，在一个实施例中，

在一个实施例中，每个基因的引物是至少一对核酸引物序列。

在一个实施例中，所述引物的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个或100个碱基长度。

在一个实施例中，每个基因的至少一个引物包括标记。

在一个实施例中，引物上的标记独立地选自荧光标记、彩色标记以及抗体、步骤标签、his标签。

在一个实施例中，给定引物对中的每个引物都被标记，例如其中当所述标记彼此相邻时，一个标记使另一个标记的荧光猝灭。

在本公开的另一方面，提供了一种基因芯片，所述基因芯片由用于检测以下基因中的至少5个基因的基因表达水平调节的探针组成：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

在一个实施例中，表2中示出了13个基因的因美纳(illumina)探针id。可替代地，技术人员能够基于13个基因中的每一个基因的核酸序列设计定制探针。

在一个实施例中，所述基因芯片进一步包括对照探针。在本公开的上下文中，所述对照探针不被认为是所述基因特征的一部分。因此，在一个实施例中，所述基因芯片由以下组成：针对以下基因中的至少5个基因的探针：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1；以及一个或多个对照探针。在一个实施例中，所述对照探针对来自以下基因中的一个或多个基因的转录本具有特异性：肌动蛋白、gapdh、泛素、18srrna、rpii(polr2a)、tbp、ppia、gusb、hspcb、ywhaz、sdha、rps13、hprt1和b4galt6。

有利地，具有针对13个基因中的至少5个基因的探针的芯片能够准确且可靠地区分样品，例如将来自患有kd的受试者的全血与来自患有细菌/病毒感染和/或炎性病症的受试者的样品区分开。这种带有少量探针的芯片可以廉价地生产，使得该芯片特别适合在资源匮乏的环境中使用。

因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对pyroxd2的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对smox的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对cacna1e的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对cd163的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对ddias的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对clic3的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对klhl2的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对hs.553068的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对rtn1的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对znf185的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对ifi27的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对s100p的探针。在一个实施例中，所述基因芯片包括至少针对linc02035的探针。

在一个实施例中，所述基因芯片包括针对以下基因中的至少一个基因的探针：pyroxd2、smox、cacna1e、cd163、ddias、clic3、klhl2和hs.553068。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对以下基因中的至少一个基因的探针：pyroxd2、smox、cacna1e和cd163。

例如，所述基因芯片包括针对以下任何基因组合的探针：pyroxd2、smox、cacna1e和cd163；pyroxd2、smox和cacna1e；pyroxd2、smox和cd163；smox、cacna1e和cd163；pyroxd2、cacna1e和cd163；pyroxd2和smox；pyroxd2和cacna1e；pyroxd2和cd163；smox和cacna1e；smox和cd163；或cacna1e和cd163；或任何其它组合。

在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2以及cacna1e和smox中的至少一个的探针。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2和cacna1e的探针。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2和smox的探针。在又一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e和smox的探针。

在一个实施例中，所述基因芯片包括针对所述13个基因中的至少5个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、hs.553068、ifi27和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2和znf185的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cd163、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。

在一个实施例中，所述基因芯片包括针对所述13个基因中的至少6个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、linc02035和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、klhl2、smox和znf185的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、ifi27、klhl2、rtn1和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、clic3、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、ifi27、rtn1和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cd163、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。

在一个实施例中，基因芯片包括针对所述13个基因中的至少7个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，ddias，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、ifi27、klhl2、rtn1和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27和smox的探针或由所述探针组成。

在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对所述13个基因中的至少8个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、hs.553068、ifi27、klhl2、s100p和smox的探针或由所述探针组成。

在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对所述13个基因中的至少9个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1和smox的探针或由所述探针组成。在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox的探针或由所述探针组成。

在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对所述13个基因中的至少10个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox的探针或由所述探针组成。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1和smox的探针或由所述探针组成。

在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对所述13个基因中的至少11个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p和smox的探针或由所述探针组成。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox的探针或由所述探针组成。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185的探针或由所述探针组成。

在一个实施例中，所述基因芯片包括针对所述13个基因中的至少12个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、rtn1、s100p、smox和znf185的探针或由所述探针组成。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、hs.553068、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p和smox的探针或由所述探针组成。在另一个实施例中，所述基因芯片包括针对pyroxd2、ddias、cacna1e、cd163、clic3、ifi27、klhl2、linc02035、rtn1、s100p、smox和znf185的探针或由所述探针组成。

在一个实施例中，所述基因芯片包括针对所有13个基因的探针或由所述探针组成。因此，在一个实施例中，所述基因芯片包括针对cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3、s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1的探针或由所述探针组成。

在另外的实施例中，本公开包含一种已知或可商购的基因芯片在本公开的方法中的用途。

在一方面，提供了一种用于识别患有kd的受试者的即时测试，所述即时测试包括如上定义的引物集合或基因芯片。有利地，当前公开的测试可以在短短几个小时内快速执行，而无需复杂的诊断或实验室设备。因此，当前公开的方法可以容易地在医院环境中以及在资源匮乏的环境中(如在偏远的村庄中)作为现有患者护理程序的一部分来实施。

在一方面，提供了一种如上定义的引物集合或基因芯片在检测样品例如血液样品中的kd的测定法中的用途。

具体实施方式

表2所示的13个基因/基因转录本可用于识别患有kd的患者或将kd与细菌感染辨别开。在一个实施例中，本公开的方法能够将患有kd的受试者与具有类似临床症状的不同病症/疾病或感染(如细菌/病毒感染或炎性病症)区分开。在另一个实施例中，这13个基因/基因转录本可用于辨别病毒感染。在又一个实施例中，这13个基因/基因转录本可用于辨别患有kd的患者与炎性疾病，如青少年特发性关节炎(jia)、过敏性紫癜(hsp)或全身性红斑狼疮(sle)。

在一个实施例中，采用一个探针来检测每个基因的基因表达的调节，例如选自表2中所示的探针列表。

在另一个实施例中，采用两个或更多个探针来检测每个基因的调节。在本公开的一个实施例中，基因特征是最佳地检测感染或辨别疾病(例如在细菌/病毒感染之间和/或在炎性疾病之间)所需的最小基因集合。

最佳是指辨别kd与细菌/病毒感染和/或炎性病症而又不显著丧失特征检测或辨别能力的特异性和/或敏感性的最小基因集合。

如本文所采用的，检测旨在指在样品中识别kd的过程，具体地说，通过检测特征中相关基因的调节来进行识别。在一个实施例中，可能检测到受试者仅患有kd。在另一个实施例中，受试者可能患有kd，并且还患有细菌感染、病毒感染、炎性病症或其组合。

辨别是指特征区分不同疾病状态(例如kd与病毒/细菌感染或炎性疾病)的能力。在基因特征的上下文中，检测和辨别是可互换的。

本文所采用的，受试者是疑似患有kd的人或发烧的人，样品来自于所述受试者。术语患者可以互换使用，尽管在一个实施例中患者具有病状。

在一个实施例中，对来自患有或疑似患有kd的受试者的样品执行本公开的方法，例如其中受试者表现出通常与kd相关的症状。

在一个实施方案中，对来自患有或疑似患有细菌/病毒感染或炎性病症但不怀疑患有kd的受试者的样品执行本公开的方法，例如其中受试者表现出通常与kd不相关的症状。对来自此类受试者的样品进行测试可以帮助识别通常不会被正确诊断的患有kd的个体。

在一个实施例中，受试者表现出病毒感染的症状。在另一个实施例中，受试者表现出细菌感染的症状。在又一个实施例中，受试者同时表现出细菌感染和病毒感染的症状。在一个实施方案中，受试者表现出炎性病症的症状。

在另外的实施例中，样品是来自发热受试者的样品；也就是说，温度高于37.5℃的正常体温。

在又另外的实施例中，执行分析以确定发烧是否与kd有关。确定发烧/感染源有利地允许开出和/或施用适当的药物，例如，可以向患有kd的患者施用如γ球蛋白(ivig)、阿司匹林等适当的治疗，而对于患有细菌感染的患者可以施用抗生素，并且对于患有病毒感染的患者可以施用退烧药。

高效治疗是有利的，因为其可以最大程度地减少住院时间，确保患者获得适当的治疗，这可以挽救生命，尤其是当患者是婴儿或儿童时，并且还可以确保合理使用资源。

近年来，很明显，应避免过度使用抗生素，因为这会导致细菌产生耐药性。因此，应避免对未患有细菌感染的患者使用抗生素。

在一个实施例中，受试者是成年人。成年人在本文中定义为18岁以上的人。

在一个实施例中，受试者是儿童。如本文所采用的，儿童是指未满18岁(如5到17岁)的人。

在一个实施例中，受试者是婴儿。如本文所采用的，婴儿是指在0到59天年龄范围内的人。

如本文所采用的，基因表达的调节是指一个或多个基因的上调或下调。

如本文所采用的，上调旨在指相对于例如不含相关疾病或感染的对照样品，或患有潜在疾病或感染或处于疾病或感染的不同阶段(视情况而定)的样品，在患病或感染的患者样品中以较高水平表达的基因转录本。

如本文所采用的，下调旨在指相对于例如不含相关疾病或感染的对照样品，或患有潜在疾病或感染或处于疾病或感染的不同阶段的样品，在患病或感染的患者样品中以较低水平表达的基因转录本。因此，与未患有kd的受试者相比，被上调的基因是在患有kd的受试者中以较高水平表达的基因。同样，与未患有kd的受试者相比，被下调的基因在患有kd的受试者中以较低的水平表达。

通过使用适当的技术测量基因表达的水平来测量调节。

如本文所采用的，基因表达是将来自基因的信息用于功能性基因产物的合成的过程。这些产物通常是蛋白质，但是在非蛋白质编码基因(如核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)或小核rna(snrna)基因)中，产物是功能性rna。也就是说，rna具有功能。在本公开的上下文中，测量基因的表达水平通常是指测量与该基因相关的转录本的水平。

如本文所采用的，基因表达数据旨在指从患者样品产生的指示两个或多个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)基因的表达的任何数据。

在一个实施例中，一个或多个(例如，1到21个，如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个)基因被具有同等功能的基因所取代，条件是特征保留了检测/辨别相关临床状态的能力，而特异性和/或敏感性没有明显下降。

在一个实施例中，所采用的基因与表2所列的13个基因具有同一性。

在一个实施例中，与来自未患有kd的受试者的样品相比，在患有kd的受试者的样品中13个基因特征中的一个或多个基因显著差异表达。

如本文所使用的，基因特征旨在指两个或更多个基因，当一起测试时，它们能够检测/辨别相关的临床状态。因此，基因特征代表具有足够的辨别力以识别患有kd的受试者或将患有kd的受试者与患有细菌/病毒感染或炎性疾病的受试者辨别开的最小基因集合。

如本文所采用的，显著差异表达是指与来自未患有kd的受试者(例如，患有细菌/病毒感染和/或炎性病症的受试者)的样品相比，基因在来自患有kd的受试者的样品中显示log2倍数变化>0.5或<-0.5。

在一个实施例中，如本文所使用的，上调是指该基因显示log2倍数变化>0.5。

在一个实施例中，如本文所使用的，下调是指该基因显示log2倍数变化<-0.5。

在一个实施例中，以下基因中的一个或多个基因在患有kd的受试者中被下调：s100p、ifi27、hs.553068、cd163和rtn1。

在一个实施例中，以下基因中的一个或多个基因在患有kd的受试者中被上调：cacna1e、ddias、klhl2、pyroxd2、smox、znf185、linc02035、clic3。

如本文所采用的，以所述形式存在是指以探针形式在微阵列上放置来自一个或多个特征的基因。

如本文所采用的，准确且稳健地是指以下事实：可以在实际环境或资源匮乏的环境(如非洲)中采用所述方法，并且所述方法的执行结果正确地给出了获得真实结果的高置信度。

当所述方法提供很少的假阳性结果(例如，当受试者未患有细菌感染时结果却表明受试者患有细菌感染)并且也几乎没有假阴性(例如，当受试者确实患有细菌感染时结果却表明受试者未患有细菌感染)时，所述方法将提供高置信度。

当采用适当的统计学测试时，高置信度将包含90％或更高的置信度，如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％置信度。

在一个实施例中，所述方法提供80％或更高(如90％或更高，具体地说，95％或更高)的敏感性，例如其中敏感性的计算如下：

在一个实施例中，所述方法提供高水平的特异性，具体来说，例如80％或更高，如90％或更高，具体地说，95％或更高，例如其中如下所示计算特异性：

在一个实施例中，基因特征方法的敏感性为90％到100％，如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一个实施例中，基因特征方法的特异性为85％到100％，如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一个实施例中，基因特征方法的敏感性为85％到100％，如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一个实施例中，基因特征方法的特异性为85％到100％，如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

存在可以测量基因表达的多种方法，包含微阵列、平铺阵列、dna或rna阵列(例如在基因芯片上)、rna-seq和基因表达的系列分析。

在本公开的方法中可以采用任何合适的测量基因调节的方法。

在一个实施例中，所测量的基因表达是宿主(例如，人类)的基因表达，例如宿主的炎症反应，即不是传染原或疾病的基因表达。

在一个实施例中，分析了来自受试者样品的dna或rna。

在一个实施例中，分析了来自受试者样品的rna。

在一个实施例中，分析了来自受试者样品的mrna。

在一个实施例中，分析了来自受试者样品的crna。

在一个实施例中，样品是固体或流体，例如血液或血清或所述血液或血清中任一种的加工形式。

如本文所采用的，流体样品是指源自活人体内的液体。所述液体包含从体内排泄或分泌的液体，以及通常不从体内排出的水。包含羊水、房水和玻璃体液、胆汁、血清、母乳、脑脊液、耳垢(耳屎)，乳糜、内淋巴和外淋巴、胃液、粘液(包含鼻腔引流和痰瘀)、痰、腹膜液、胸膜液体、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、汗液、眼泪、阴道分泌液、呕吐物、尿液。具体地说，血液和血清。

如本文所采用的，血液是指全血，即血清、血细胞和凝血因子，通常是外周全血。

如本文所采用的，血清是指全血中除血细胞或凝血因子以外的成分。其是纤维蛋白原被去除的血浆。

在一个实施例中，受试者来源的样品是血液样品。

在一个实施例中，样品是全血。因此，在一个实施例中，rna样品来自全血。

可以通过pcr对rna样品进行进一步扩增，如全基因组扩增，以增加可用于分析的起始rna模板的量。可替代地，可以通过逆转录酶(如hiv-1逆转录酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mlv)逆转录酶、amv逆转录酶和端粒酶逆转录酶)将rna样品转化为cdna。对于较小的样品体积，如从儿童获得的血液样品，可能需要这种扩增步骤。

在一个或多个实施例中，分析是离体的。

如本文所采用的，离体是指发生在体外。

在一个实施例中，基因表达数据是从微阵列(如基因芯片)产生的。

如本文所采用的，微阵列包含rna或dna阵列，如rna阵列。技术人员将知道各种不同形式的微阵列，包含但不限于固相阵列和微珠阵列。

如本文所采用的，聚合酶链反应(pcr)是指用于制备靶dna序列的多个拷贝的广泛使用的分子技术。所述方法依赖于热循环，所述热循环由重复加热和冷却反应的循环组成，以进行dna融解和dna的酶促复制。所述方法被命名为含有与靶区域互补的序列以及dna聚合酶的引物，所述引物是实现选择性和重复扩增的关键成分。随着pcr的进行，生成的dna本身将用作复制模板，从而启动了链式反应，其中dna模板呈指数扩增。

如本文所采用的，多重pcr是指使用聚合酶链反应(pcr)同时扩增两个或更多个不同的dna序列，即如同在一个反应中一起执行许多单独的pcr反应。

如本文所采用的，引物旨在指短链核酸序列，通常是化学合成的寡核苷酸，其充当dna合成反应的起点。

引物的长度通常约为15个碱基对，但长度可以在5到100个碱基之间变化。这在如pcr等过程中是必需的，因为dna聚合酶只能向现有的dna链中添加新的核苷酸或碱基对。在pcr反应过程中，引物与dna样品中的互补序列杂交。接下来，dna聚合酶在引物的3'端开始复制，并通过复制相对dna链的序列来延伸引物。

在一个实施例中，本公开的引物对rna(如mrna)具有特异性，即引物与rna序列互补。在另一个实施例中，引物对cdna具有特异性，即引物与cdna序列互补。

在一个实施例中，本公开的引物包括标记，所述标记使引物能够被检测或分离。标记的实例包含但不限于荧光标记、彩色标记以及抗体、步骤标签、his标签。

在另一个实施例中，给定引物对中的每个引物都被标记，例如其中当所述标记彼此相邻时，一个标记(也称为淬灭剂)使另一个标记的荧光猝灭。例如，这种标记在实时pcr反应中特别有用。这种标记对的实例包含6-羧基荧光素(fam)和四氯荧光素，或四甲基若丹明和四氯荧光素。

如本文所使用的，即时测试或床旁测试旨在指在护理点处或附近(即在患者护理的时间和地点)进行的医学诊断测试。这与常规诊断测试相反，所述常规诊断测试通常限于医学实验室并且涉及将标本从护理点发送到实验室进行测试。此类诊断测试通常需要数小时或数天才能收到测试结果。同时，在不了解测试结果的情况下必须继续进行患者护理。相比之下，即时测试通常是可以快速执行的简单医学测试。

基因芯片本质上是一个微阵列，也就是说，是离散区域(通常为核酸)的阵列，所述离散区域彼此分开，例如以大约100/cm²到1000/cm²的密度排列，但是可以以更大的密度(如10000/cm²)排列。

微阵列实验的原理是，使用来自给定细胞系或组织的mrna生成经标记的样品，通常为经标记的cdna或crna，其被称为“靶标”，所述经标记的样品与固定在固体表面上的大量核酸序列(通常为dna或rna序列)平行杂交。可以同时检测和定量数十万种转录本。尽管已经开发了许多不同的微阵列系统，但当今最常用的系统可以划分为两个组。

使用这种技术，可以将由30,000多个cdna组成的阵列装配到常规显微镜载玻片的表面上。对于寡核苷酸阵列，可通过在硅片上光刻(昂飞公司(affymetrix)的高密度寡核苷酸阵列)或通过喷墨技术(由罗赛特制药公司(rosettainpharmatics)开发并获得安捷伦科技公司(agilenttechnologies)授权)原位合成短的20-25聚物。

可替代地，可以将预先合成的寡核苷酸印刷在载玻片上。基于合成寡核苷酸的方法具有以下优点：由于单独的序列信息足以生成待排列的dna，因此不需要耗时的cdna资源处理。同样，可以设计探针来代表给定转录本的最独特部分，从而可以检测紧密相关的基因或剪接变体。尽管短的寡核苷酸可能导致特异性较低的杂交并降低了敏感性，但最近已开发出预合成的较长寡核苷酸(50-100聚物)的阵列来弥补这些缺点。

在一个实施例中，基因芯片是现成的可商购的芯片，例如可获自因美纳的人ht-12v4表达beadchip试剂盒、可获自罗氏(roche)、安捷伦(agilent)、艾本德(eppendorf)的nimblegen微阵列以及可获自昂飞公司的基因芯片，如hu-ul33.plus2.0基因芯片。

在另一个实施例中，本发明中采用的基因芯片是定制的基因芯片，也就是说，该芯片仅含有与所需谱相关的靶基因。可以从如罗氏、昂飞等公司购买定制芯片。在又另外的实施例中，定制的基因芯片包括最小的疾病特异性转录本集合。

在一个实施例中，芯片由用于检测表2中所列的13个基因的表达水平的探针组成。

在一个实施例中，使用以下因美纳探针id号来检测基因表达水平的调节：针对cacna1e的7510647、针对ddias的2570019、针对klhl2的1070593、针对pyroxd2的1684497、针对smox的270068或3710553、针对znf185的6840674、针对linc02035的3236239、针对clic3的5870136、针对s100p的1510424、针对ifi27的3990170、针对hs.553068的1470450、针对cd163的2680092以及针对rtn1的6860193。

在以上一个或多个实施例中，芯片可以进一步包含1个或多个(如1到10个)对照探针，如管家基因。

在一个实施例中，使用针对相关基因的合适探针在溶液中产生基因表达数据。

如本文所采用的，探针旨在指杂交探针，其是可变长度(通常为100-1000个碱基长)的dna或rna的片段，其用于dna或rna样品中以检测与探针中的序列互补的核苷酸序列(dna靶标)的存在。探针由此与单链核酸(dna或rna)杂交，所述单链核酸的碱基序列由于探针和靶标之间的互补性而允许探针-靶标碱基配对。

在一个实施例中，根据本公开的方法和例如其中所采用的芯片可以包括一个或多个管家基因。

如本文所采用的，管家基因旨在指与用于识别疾病或感染的谱图不直接相关但可用于统计目的和/或质量控制目的的基因，例如这些基因可帮助标准化数据，具体地说，管家基因是组成型基因，即以相对恒定的水平转录的基因。维持细胞通常需要管家基因的产物。

管家基因的实例包含但不限于肌动蛋白、gapdh、泛素、18srrna、rpii(polr2a)、tbp、ppia、gusb、hspcb、ywhaz、sdha、rps13、hprt1和b4galt6。

在一个实施例中，如本文所采用的，最小疾病特异性转录本集合是指稳健地识别目标疾病状态所需的最小基因数量。

最小的歧视性基因集合可以与最小的疾病特异性转录本集合或最小的基因特征互换。

如本文所采用的，归一化旨在指通过将数据与控制数据(如管家基因的荧光水平)进行比较来统计地解释背景噪声，例如可以使用rma将荧光扫描数据归一化，以允许在各个芯片之间进行比较。irizarry等人在2003年描述了这种方法。

如本文所采用的，缩放是指增强以低水平表达或具有高倍数变化但仍具有相对较低荧光的特定基因的贡献，从而增加所述特定基因对诊断特征的贡献。

倍数变化通常用于微阵列和rna-seq实验中的基因表达数据分析中，用于测量基因表达水平的变化，并简单地被计算为最终值与初始值之比，即如果初始值为a，最终值为b，倍数变化为b/a。tusher等人，2001年。

在如arrayminer等程序中，可以计算基因表达的倍数变化。计算与倍数变化相关的统计值，所述统计值在不同组的受试者之间表达水平变化较小的基因中(例如在各组之间的差异较大的基因中)更为显著。

从受试者获得合适样品的步骤是常规技术，其涉及采集血液样品。此过程对捐献者的风险很小，不需要由医生执行，但可以由经过适当培训的支持人员执行。在一个实施例中，来自受试者的样品为大约2.5ml血液，但是可以使用较小体积，例如0.5-1ml。

将血液或其它组织液立即置于rna稳定缓冲液中，如pax基因管或tempus管中包含的缓冲液。

如果需要储存，则通常应在收集后3小时内于-80℃下冷冻。

在一个实施例中，基因表达数据是从样品中的rna水平产生的。

对于微阵列分析，可以使用合适的产品(如pax基因血液rna提取试剂盒(qiagen))处理血液。

也可以使用tripure方法-tripure提取(roche目录号1667165)纯化总rna。可能会遵循制造商的方案。然后可以使用rneasymini试剂盒进行纯化-用dnase处理的清理方案(qiagen目录号74106)。

rna的定量可以使用260nm处的光密度和quant-itribogreenrna分析试剂盒(英杰(invitrogen)-分子探针rl1490)完成。可以使用安捷伦生物分析仪评估28s和18s核糖体rna峰的质量。

在另一个实施例中，所述方法进一步包括扩增rna的步骤。可以使用合适的试剂盒执行扩增，例如totalpreprna扩增试剂盒(应用生物系统公司(appliedbiosystems))。

在一个实施例中，扩增方法可以与rna的标记结合用于微阵列分析。nugen3'ovation生物素试剂盒(目录号：2300-12、2300-60)。

然后将来自受试者样品的rna与相关探针杂交，例如可以定位在芯片上的探针。杂交和洗涤后，在适当的情况下，使用适当的仪器执行分析。

在执行分析以确定根据本公开的受试者是否表现出指示疾病或感染的基因特征时，执行以下步骤：从样品获得mrna并制备核酸靶标；在适当条件下与阵列杂交，通常如微阵列制造商所建议的那样(适当严格的杂交条件，如3xssc，0.1％sds，在50℃下)，以结合阵列上的相应探针；以及在必要时进行洗涤以除去未结合的核酸靶标并分析结果。

在一个实施例中，来自分析的读出的是荧光。

在一个实施例中，来自分析的读出的是比色的。

在一个实施例中，可以使用物理检测方法，如电阻抗的变化、纳米线技术或微流体技术。

在一个实施例中，提供了一种方法，所述方法进一步包括从受试者样品中定量rna的步骤。

如果需要质量控制步骤，则可以采用如genomestudio软件等软件。

如本文所采用的，数值是指从通过分析或读出基因表达(例如荧光或比色分析)获得的每个相关基因的数量。可以对从初始分析获得的数值进行操作、更正，并且如果处理结果仍为数字，则它将继续为数值。

转换是指通过将正号简单地转换成负号(反之亦然)而将负数值处理成正值或将正数值处理成负值的过程。

对受试者来源的样品的分析将针对所分析的基因给出一系列数值，其中一些为正(以+开头，在数学上被认为大于零)，而另一些为负(以–开头，在严格数学上被认为小于零)。基因表达分析中的阳性和阴性是代表被上调的基因和被下调的基因的便利机制。

在本公开的方法中，被下调并由负数表示的基因的所有数值都将被转换为相应的正数(即通过简单地改变符号)，例如-1将被转换为1；或者被上调的基因的所有正数值都被转换为相应的负数。

本发明人已经确定，使基因表达的数值为正或全部为负的步骤允许对这些值求和以获得指示疾病或感染存在或不存在的单一值。

这大大简化了对基因表达数据的处理，并代表了实际的进步，从而使所述方法适合于临床常规使用。

辨别力是指区分kd样品与细菌感染的样品、病毒感染的样品/受试者和/或之间和炎性疾病(如sle、jia和hsp)的能力。

例如，即使将其以低或较低的绝对水平表达，也可以通过对特征中更重要的基因附加更大的权重来增加根据本公开的方法的辨别力。

如本文所采用的，原始数值旨在指例如来自基因芯片的未经处理的荧光值，其是绝对荧光或相对于一个或多个管家基因。

如本文所采用的，求和旨在指添加数值的动作或过程。

如本文所采用的，复合表达评分是指通过分析针对相关基因产生的所有单个数值的总和(总数)，例如所有相关上调和下调基因的荧光数据的总和。评分可以归一化和/或不归一化和/或缩放和/或加权。

在一个实施例中，将复合表达评分归一化。

在一个实施例中，对复合表达评分进行缩放。

在一个实施例中，对复合表达评分进行加权。

如本文所采用的，加权或统计加权旨在指被调整以更适当地反映其对特征的贡献的相关值。

在一个实施例中，所述方法采用如本文的实例中所采用的简化的风险评分。

简化的风险评分也被称为疾病风险评分(drs)。

如本文所采用的，对照旨在指正(对照)样品和/或负(对照)样品，其用于例如将受试者样品与/和/或已定义的数值或数值范围进行比较，以允许受试者样品通过其参考而被指定为疾病/感染的阳性或阴性。

如本文所采用的，阳性对照样品是已知对所分析的病原体或疾病(如细菌感染)呈阳性的样品。

如本文所采用的，阴性对照样品旨在指已知对所分析的病原体或疾病呈阴性的样品。

在一个实施例中，对照是样品，例如阳性对照样品或阴性对照样品，如阴性对照样品。

在一个实施例中，对照是数值，如数值范围，例如从充足的样品大小获得的统计学上确定的范围，其定义了用于准确区分疾病病例与对照的截止值。

将多基因转录本疾病特征转换为单一疾病评分

一旦通过变量选择确定了疾病的rna表达特征，就可以根据转录本相对于比较组的上调或下调来分离转录本。分别选择两组转录本并进行整理。

对被上调和下调的rna转录本进行求和

为了确定任何单个患者的单一疾病风险评分，对与疾病相关的所有被上调的rna转录本的原始强度，例如荧光强度(绝对强度或相对于管家标准)，进行求和。通过结合相对于未改变的管家基因标准的每个转录本的原始值(例如荧光)，可以实现每个个体的所有被下调的转录本的类似求和。由于转录本具有不同的表达水平，并且其倍数变化也分别不同，因此无需对原始表达值进行求和，就可以在0，1之间对其进行缩放和归一化。可替代地，可以对其进行加权，以使重要的基因发挥更大的作用。然后，对于每个样品，分别针对被上调和下调的转录本，对特征的转录本的表达值进行求和。

通过将被下调的转录本的累加评分(转换为正数后)与被上调的转录本的累加评分相加，计算出包含被上调和下调的基因的累加荧光的总疾病评分，以给出单一数字复合表达评分。该分数最大程度地区分了病例和对照，并反映了被上调和下调的转录本对这种区分的贡献。

对病例和对照中疾病风险评分进行比较

可以比较患者和对照组的复合表达评分，以得出各组的均值和方差，从中定义统计截止值，以便准确区分病例与对照。使用疾病受试者和比较人群，可以使用例如支持向量机和内部弹性网分类来计算疾病风险评分的敏感性和特异性。

如本文所采用的，疾病风险评分是将患者的复合表达评分与比较者组的复合表达评分进行比较时，表明患者感染细菌的可能性的指标。

将疾病风险评分发展为用于疾病严重程度或疾病风险预测的简单临床测试

上文概述的方法，其中将疾病或疾病过程的复杂rna表达特征转换为可预测疾病风险的单一评分，可用于开发用于疾病诊断或风险预测的简单的、便宜的且可在临床上应用的测试。

程序如下：对于基于病例与对照(或病例的不同类别，如严重程度)之间的差异基因表达的测试，可以将识别为相关的被上调和下调的转录本印刷在合适的固体表面上，如微阵列载玻片、微珠、试管或孔。

被上调的转录本可以与被下调的转录本分别位于单独的孔或单独的试管中的同一位置。还可以单独印刷一组未改变的管家基因，以将结果归一化。

使用标准回收和定量方法(有或没有扩增)从单个患者中回收的rna与被上调和下调的转录本以及未改变的管家转录本的库进行杂交。

对照rna与相同的被上调或下调的转录本的库平行杂交。

然后读取总值，例如受试者样品的荧光，然后任选地读取对照样品的被上调和下调的转录本，并结合结果以给出患者和对照的复合表达评分，然后将其与适当数量的健康对照或比较受试者的参考范围进行比较。

校正检测到的受试者样品中rna种类的相对丰度的信号

上文的细节解释了如何将许多转录本的复杂特征降低到最小集合，所述最小集合能够最大程度地区分患者和其它表型。例如，在被上调的转录本集合中，存在一些转录本的总表达水平比其它转录本的总表达水平低许多倍。然而，尽管表达水平总体较低，但这些转录本可能具有很高的辨别力。从弹性净系数得出的权重可以通过多种不同方式包含在测试中。首先，测定法中包含的单个转录本的拷贝数可以变化。其次，为了确保来自稀有的重要转录本的信号不会被来自较高水平表达的转录本的信号所淹没，一个选项是选择一种既不过度表达也不弱表达的探针进行测试，以使多个探针的作用最大化。可替代地，可以通过缩放因子来调整来自低丰度转录本的信号。

尽管可以使用当前的转录组学技术在分析阶段完成此操作，因为每个信号都是单独测量的，但在简单的比色测试中，仅会测量总的颜色变化，因此无法从选定的转录本中缩放信号。可以通过逆转通常与阵列相关的化学反应来解决这个问题。在常规阵列化学中，将探针偶联至固体表面，并测量经生物素标记的、患者来源的结合靶标的量。相反，我们建议将来自患者的经生物素标记的crna偶联至抗生物素蛋白包被的表面，然后通过适配器系统添加与生色酶偶联的dna探针。在设计和制造阶段，针对低丰度但重要的转录本的探针与更大数量或更有效形式的生色酶偶联，从而使这些转录本的信号在最终的单通道比色法中被“放大”读出。该方法将用于使试剂盒的上调、下调和管家通道中每个探针的相对输入归一化，以便每个探针对最终读数做出适当的加权贡献，这可以考虑到其辨别力，由变量选择方法的权重暗示。

用于测量多个被上调或下调的基因的检测系统也可以适用于使用rtpcr来检测包括诊断特征的转录本(其中对被上调和下调的转录本的单独合并值进行求和)或物理检测方法(如电阻抗变化)。在这种方法中，将所讨论的转录本印刷在纳米线表面上或微流体药筒内，并且通过阻抗或其它物理检测系统的变化来检测每个转录本的相应配体的结合。

在一个实施例中，基因芯片是荧光基因芯片，也就是说读出的是荧光。

如本文所采用的，荧光是指已吸收光或其它电磁辐射的物质发出的光。

因此，在替代实施例中，基因芯片是比色基因芯片，例如比色基因芯片使用微阵列技术，其中使用抗生物素蛋白将酶(如过氧化物酶或其它生色底物)附着至当前用于将荧光标志物附着至dna的生物素探针。本公开扩展到微阵列芯片，所述微阵列芯片适于通过比色分析来进行读取，并且适于将患有细菌感染的受试者与患有病毒感染或炎性疾病的受试者辨别开。本公开还扩展到比色芯片用于分析受试者样品以将患有细菌感染的受试者与患有病毒感染或炎性疾病的受试者辨别开的用途。

如本文所采用的，比色法是指其中输出处于人类可见光谱中的测定法。

在替代性实施例中，可以通过包含纳米线技术、电阻抗变化或微流体学的物理检测方法来检测用于将患有细菌感染的受试者与患有病毒感染或炎性疾病的受试者辨别开的基因集合或探针集合。

该测定法的读数可以从当前微阵列技术中使用的荧光读数转换为简单的比色格式，或使用物理检测方法(如阻抗变化)进行转换，可以用最少的设备读取该读数。例如，这可以通过利用当前用于将荧光标志物附着至dna的生物素来实现。生物素对亲和素具有很高的亲和力，所述亲和素可用于连接酶，如过氧化物酶或其它生色底物。该过程将允许使用生色过程而非荧光来定量与靶转录本结合的crna数量。然后，可以通过将转录本的上调和下调库的颜色强度与对照颜色标准进行比较，开发出提供是/否疾病状态指示的简化检测方法。类似的方法可以使用物理方法(如电阻抗变化)检测多个基因特征。

本发明的该方面对于在远程或资源贫乏的环境中使用或在“附近患者”测试中进行快速诊断可能是特别有利的。例如，在非洲的一些地方，因为读取芯片所需的设备可能会更简单。

如本文所采用的，多重测定法是指一种测定法，其在测定法的单个运行/循环中同时测量几种分析物(通常是几十种或更多种)。所述测定法区别于一次测量一种分析物的程序。

在一个实施例中，提供了一种用于该方法的定制基因芯片，具体地说，如本文所述。

在一个实施例中，提供了一种已知的基因芯片在本文所述的方法中的用途，具体地说，用于识别本文所述的一个或多个基因特征。

在一方面，提供了一种方法，所述方法通过采用本文公开的方法来确定是否向受试者(如疑似患有kd的受试者，例如表现出患有kd症状的受试者)施用kd治疗，并在所述方法表明所述受试者患有kd时向所述受试者施用治疗。用于kd的合适治疗的实例包含但不限于γ球蛋白(ivig)、阿司匹林或其它抗炎药剂，如类固醇和英夫利昔单抗，包含其组合。

基因特征、基因转录本特征、基因集合、疾病特征、诊断特征和基因谱在全文中可互换使用，并且应被解释为意味着基因特征。

在本说明书的上下文中，“包括”应被解释为“包含”。

包括某些要素的本发明的方面还旨在扩展到相关要素的“由……组成(consisting)”或“基本上由……组成(consistingessentially)”的替代性实施例。

在技术上适当时，可以组合本发明的实施例。

本文将实施例描述为包括某些特征/要素。本公开还延伸到分开由所述特征/要素组成或基本由所述特征/要素组成的实施例。

如专利和申请等技术参考文献通过引用并入本文。

本文具体地且明确地叙述的任何实施例可以单独或与一个或多个另外的实施例组合形成免责声明的基础。

附图说明

图1示出了用于将患者分配到诊断组的诊断算法。kd＝川崎病；aha＝美国心脏协会；caa＝冠状动脉瘤；jia＝青少年特发性关节炎；hsp＝过敏性紫癜；crp＝c反应蛋白。

图2示出了总体研究流程，该流程示出了样品处理、测试和训练数据集的推导、数据处理和分析流程。

^a请参见方法(实例1)；^b健康对照用于模型构建，但未包括在模型准确性评估中；^c对72名患者进行了诊断性能评估(患病的第2-7天)。缩略语：kd＝川崎病；db＝确诊的细菌；dv＝确诊的病毒；u＝细菌或病毒病因不确定的感染；jia＝青少年特发性关节炎；hsp＝过敏性紫癜；hc＝健康对照；pdms＝并行确定性模型搜索；sde＝显著差异表达；fc＝倍数变化。

图3示出了发现测试集和验证集上的13个转录本特征的性能。发现测试集(包括患有川崎病(kd)的患者和患有其它疾病的患者)中13个转录本特征的分类(a)和接受者操作特性(roc)曲线(b)，使用疾病风险评分(drs)。验证集(包括三个具有不同诊断确定性的kd临床亚组和患有其它疾病的患者)中13个转录本特征的分类(c)和roc曲线(d)。在盒形图中，水平线代表中位数；下边缘和上边缘代表四分位间距；晶须代表范围，或四分位间距的1.5倍，以较小者为准。图上的水平线表示drs阈值，该阈值将被预测为患有kd的患者(直线上方)或未患有kd的患者(下方)分开，如roc曲线中的点所确定的，该点使发现训练组中的敏感性和特异性最大化。kd＝川崎病；db＝确诊的细菌；dv＝确诊的病毒；u＝细菌或病毒病因不确定的感染；jia＝青少年特发性关节炎；hsp＝过敏性紫癜；kd＝def确诊的kd；kd-hp＝极有可能的kd；kd-p＝可能的kd。

图4示出了在验证集中在样品收集时按患病天数划分的13个转录本的性能。x轴显示与患病的第一天(即发烧开始)有关的样品的收集天数。黑点＝确诊的kd，灰点＝极有可能的kd，带箭头的黑点＝验证集中可能的kd临床亚组。

图5示出了本底调整和归一化后，发现队列中pc1和pc2的主成分分析(pca)图。从后续分析中除去来自kd患者的样品(箭头)。每个点都是来自阵列的数据。kd＝川崎病，db＝确诊的细菌，dv＝确诊的病毒，hc＝健康对照，u＝细菌或病毒病因不确定的感染，jia＝青少年特发性关节炎，hsp＝过敏性紫癜。

图6示出了(a)验证队列的初次合并和(b)使用combat合并的pca图。每个点代表来自阵列的数据；kd-acute＝急性川崎病，kd-conv＝恢复期川崎病，db＝确诊的细菌，dv＝确诊的病毒，u＝细菌或病毒病因不确定的感染，hc健康对照。图片(b)包含来自30名kd患者在发烧后第7天后样品的数据，这些数据未包含在诊断性能计算中。

图7示出了来自13个转录本特征的基因网络。该网络是使用ingenuitypathwaysanalysis生成的。13个转录本中有12个被映射到数据库。该网络含有7个焦点分子，是分析中最重要的网络。每个分子根据kd中的表达方向着色。实线表示直接相互作用，虚线表示间接相互作用。该网络的图例位于：http://ingenuity.force.com/ipa/articles/feature_description/legend.

实例1–13个转录本基因特征的识别

患者研究组

kd的鉴别诊断包含多种传染性和炎性病症，因此，我们建立了一个病例-对照研究组，研究患有kd以及一系列临床症状与kd重叠的其它传染性和炎性疾病的儿童。如果患者患有发热性疾病并需要血液测试以进行临床研究，则应在英国、荷兰、西班牙和美国的儿科中心预先招募患者，作为以下研究的一部分：呼吸、炎性和传染性疾病免疫病理学研究(immunopathologyofrespiratory,inflammatoryandinfectiousdiseasestudy)[20]、西班牙的gendres研究、美国的川崎疾病研究中心计划(kawasakidiseaseresearchcenterprogram)或荷兰的川崎研究。

招募的患有kd的儿童代表直接向研究中心急诊科就诊的儿童，以及从地区中心转介的患者。然而，我们的研究仅包含在开始使用ivig进行kd治疗之前以及患病的前7天进行过血液采样的患者。在确认临床诊断之前，用早期采集的血液样品招募发热对照，以获取尽可能接近呈递的样品，包含由社区内的从业者转介评估可能的kd的患者，这些患者代表了诊断测试将与其极为相关的真实人群。

一旦所有调查的结果均可用，便将发热对照按照预定义的标准分配给诊断组(补充附录和图1)。排除患有可能影响基因表达的合并症的儿童，如免疫抑制治疗或骨髓移植。包含了患有炎性疾病的比较儿童组：过敏性紫癜(hsp)和青少年特发性关节炎(jia)。

就像先前已经描述过的那样，类似地招募了验证研究组的患者，作为对到医院就诊并需要进行血液测试的发热儿童进行的生物标志物研究的一部分[21，22]。招募了在发热性疾病发作后十天内到医院就诊的患者，并在常规诊断研究的同时收集了血液样品进行基因表达分析，以评估儿童的病因。作为发现和验证研究的一部分，招募了没有近期(2周)发烧或免疫史的健康对照儿童，以及kd和发热对照患者。来自健康对照的数据用于对在不同微阵列实验中获得的数据进行归一化，但不用于评估特征的性能。

kd案例定义

根据美国心脏协会(aha)的标准诊断kd[14]。确诊为kd的患者在就诊后以及发病后两周和六周接受2d超声心动图检查。如果在患病期间任何时候左前降支或右冠状动脉的最大冠状动脉z评分(zmax)(相对于平均体表面积的平均内径的标准偏差单位)≥2·5，或具有少于经典标准中四个标准的患者满足aha指南中不完全kd的算法，则将所述患者包含为不完全kd。将患者分为正常的冠状动脉(zmax<2·5)或扩张的冠状动脉(zmax≥2·5<5·0)或caa(zmax≥5·0)。由于操作者之间在确切的冠状动脉尺寸方面存在差异，我们设置了较高的阈值(zmax≥5.0)来定义患有动脉瘤的患者，以减少分类错误。

通过诊断确定性对kd进行进一步分类

由于尚无用于诊断kd的“黄金”标准，因此某些患者可能符合kd的标准，但患有其它病症，如葡萄球菌或链球菌感染、病毒感染或炎性疾病。因此，我们根据临床诊断的确定性将kd患者进一步分为验证研究组。所有的临床记录、实验室结果、超声心动图报告、对治疗的反应以及后续的临床笔记均由独立的儿科传染病专家和kd专家(作者mpg–对分析不知情)进行了审查。发病后持续六周记录有caa(zmax≥5·0)的患者被认为患有确诊的kd，因为在儿童期不存在其它可导致caa的自解决性炎性疾病。其余的患者(临床团队对所有其余的患者进行了针对疑似kd的ivig治疗)被专家审查者归为极有可能、可能或不太可能患有kd。这项审查没有发现“不太可能的kd”病例。

患有感染或其它炎性综合征的发热对照儿童

使用图1所示和补充附录中所述的标准，将出现发热性疾病的儿童确定为患有确诊的细菌感染、确诊的病毒感染、疑似的细菌或病毒感染、hsp或jia。

伦理批准和同意书

在ucsd研究伦理委员会(人类研究保护计划#140220)、西班牙(加利西亚临床研究伦理委员会，ceic参考2010/015)、阿姆斯特丹(nl41023.018.12和nl34230.018.10)以及英国(圣玛丽医院09/h0712/58，13/lo/0026)的批准下招募患者。

监督和进行研究

由至少两名不参与患者护理的独立临床医生(作者jah、jcb、jk、mpg、amb)评估所有结果后，将患者分类为疾病组(图1)。所有样品均被匿名化。仅在完成临床任务并派出独立核实(补充附录)后，才对转录组学数据集进行分析。

基因表达特征的发现和验证

总体研究设计和特征发现流程如图2所示。在招募时(对kd病例进行ivig治疗之前)将全血收集到paxgene血液rna管(preanalytix，德国)中，冷冻，提取并在人ht-12v.4beadchip阵列(因美纳)上进行分析。在验证研究组的子集中，使用了早期的因美纳beadchip阵列(ht-12v.3)，该阵列具有大量重叠的探针。实验室方法的细节在补充附录中提供。

统计分析

转录本特征的发现

使用统计计算的“r”语言和环境(r)3.2.2(补充方法)对转录组学数据进行分析。如图2所示，发现研究组被随机划分为80％的“训练”集和20％的“测试集”。在训练集中确定特征，并在测试集以及使用先前报道的急性和恢复期kd患者[21]和急性细菌和病毒患者[22](补充方法)建立的第二个研究组(验证研究组)中进行验证。经过质量控制和过滤(补充方法)后，在训练集中确定了与所有其它疾病相比，kd患者中显著差异表达(sde)的转录本。

使用并行确定性模型搜索(pdms)进行小型特征发现

一种新颖的方法pdms可基于最少的转录本数量和最高的辨别准确性来识别和排列转录本特征，所述方法被用于识别包括最小数量的转录本的简约基因表达特征，所述最小数量的转录本最佳地将kd与其它疾病区分开来。所述方法首先根据所有sde转录本评估将kd与对照疾病区分开的所有可能的单基因和双基因模型，并在将另外一个基因添加到模型中时，将100个最合适的双基因模型带入下一轮，并再次评估所有组合。此过程如下继续进行：一次性地向最佳的100个模型中逐渐添加一个另外的基因。通过watanabe-akaike信息准则对每个模型排序后，选择给定数量的转录本(模型大小)的最佳特征，所述信息准则是样品外误差的贝叶斯估计[23]。通过交叉验证确定最佳模型大小。进一步的细节在补充统计方法中。

疾病风险评分和模型准确性评估

我们应用了先前报道的疾病风险评分(drs)方法，所述方法根据诊断特征中包含的转录本来分配个体疾病风险[15]。drs结合了被上调的转录本的荧光强度，并减去了被下调的转录本的合并荧光强度[15]，这可能有助于复杂特征的测试开发。健康对照用于模型构建，但不包括在模型准确性的评估中，而是通过接受者操作员曲线(auc)下的面积、敏感性和特异性进行评估。

补充方法

rna样品的提取和处理

将全血(2.5ml)收集到paxgene血液rna管(preanalytix，德国)中，孵育2小时，在收集后6小时内在-20℃下冷冻，然后在-80℃下储存。根据制造商的说明，使用paxgene血液rna试剂盒(preanalytix，德国)提取rna。使用agilent2100生物分析仪和nanodrop1000分光光度计评估总rna的完整性和产量。发现队列中所使用的样品来自美国(ucsd)、西班牙、荷兰和英国。除来自美国的样品外，所有样品均在英国提取。经过定量和质量控制后，使用因美纳totalpreprna扩增试剂盒(应用生物系统公司)由500ngrna制备经生物素标记的crna。将经标记的crna与人ht-12v.4表达beadchip阵列(因美纳)杂交过夜。清洗、封闭和染色后，根据制造商的说明使用因美纳beadarrayreader扫描阵列。使用genomestudio软件检查微阵列图像的伪像，并评估qc参数。此阶段没有排除任何阵列。

病原诊断

使用免疫荧光(rsv、腺病毒、副流感病毒、a+b流感)和巢式pcr(rsv、腺病毒、1-4副流感、a+b流感、博卡病毒、间质肺病毒、鼻病毒/肠病毒)对鼻咽抽吸物进行病毒诊断。细菌培养物包含血液、csf、尿液和组织部位。测量血液和尿液中的肺炎球菌抗原，并通过脑膜炎球菌和肺炎球菌pcr检测细菌dna。

发热对照的诊断过程

根据临床团队的指示，对患者进行了诊断检查，包含血液计数、血液化学、c反应蛋白(crp)、尿液和咽拭子培养物；在适当的地方执行了脑脊液分析和胸部x光片检查。使用多重pcr检测鼻咽抽吸物或咽拭子中的常见呼吸道病毒以及血液中的常见病毒。一旦获得所有调查的结果，便可以按照以下预定标准(图1)将患者分配到诊断组中。

细菌感染：

分配到细菌病原体组的患者在来自无菌部位(血液、csf、胸膜腔、关节、尿液)的样品中通过培养或通过分子技术被识别出具有细菌病原体(革兰氏阳性球菌或革兰氏阴性杆菌)，以及与已识别的细菌种类一致的临床综合征。该组包含患有和未患有病毒共感染的患者。被诊断患有其它细菌感染(例如支原体、百日咳、分枝杆菌)的儿童不包含在该组中。该组没有设置炎性标志物的阈值，因为无菌部位样品中细菌的识别被用作确诊细菌感染的确凿证据。

病毒感染：

病毒感染组的患者具有经识别的病毒、与病毒感染一致的临床综合征，并且没有细菌疾病的微生物学或临床特征。为了避免将隐匿性细菌感染的儿童包含在病毒组中，排除了炎性标志物升高的儿童。最大阈值设置为crp为60mg/l，中性粒细胞计数为12x10⁹/l。在94名儿童中，最常见的病原体是rsv(27名儿童)、a/b流感和腺病毒(各自有23名儿童)。

不确定的细菌或病毒感染：

如果不能肯定地将患有急性发热性疾病和感染特征的儿童归入上述组中的一组中，则将其标记为“不确定的细菌或病毒”。该组儿童具有细菌或病毒感染的不确定性特征、阴性的微生物学发现或缺乏病毒学检查、与微生物学发现不一致的综合征、与疾病的其它临床特征不一致的炎性标志物或缺乏足够的临床数据来在另一组中进行可靠的编码。该组患者在无菌部位未发现细菌感染，而有些患者确实具有可检测到的病毒。

其它炎性综合征：

a)在患有明显紫癜的儿童中诊断出过敏性紫癜(hsp)，通常出现在臀部和伸肌表面，伴有腹痛、关节痛或肾脏异常(血尿和蛋白尿)；b)根据国际风湿病协会联盟定义了青少年特发性关节炎(jia)[37]。患有jia的患者包含：i)初次治疗；和ii)主动加重/郁积。

统计方法

微阵列预处理-发现数据集

使用r软件包lumi将本底减法和稳健样条归一化(rsn)应用于原始表达数据[38]。通过主成分分析(pca)对样品异常值进行评估。来自川崎患者的一个样品在pc1上明显是异常值，并将其从分析中删除(图5)。

将发现数据集中的样品随机分配给十个不同的折叠，条件是每个比较组的数量相等(kd川崎病，db确诊的细菌，dv确诊的病毒，u细菌或病毒病因不确定的感染，jia青少年特发性关节炎，hsp过敏性紫癜，hc健康对照)。保留两个折叠(20％)作为测试集，而其余八个折叠组成训练集。由于kd的诊断测试在疾病早期最为重要，因此我们仅使用发现队列中来自发烧7天或更短时间的患者的样品开发了特征。

微阵列预处理-验证数据集

通过合并两个基因表达数据集来构建验证数据集：一个具有急性和恢复期川崎样品[39]，而另一个具有细菌和病毒感染[40]。所有恢复期样品的esr(红细胞沉降率)水平均低于40毫米/小时，所有急性样品均在发病后十天内采集。在r软件包lumi中将本底减法和rsn归一化分别应用于两个数据集[38]。在这一阶段，不同队列之间存在差异。从pca曲线可以明显看出这一点，该曲线表明pc1清楚地按批次区分了样品(图6a)。因此，我们采用了combat[41]方法来消除批次效应。将两个二元协变量传递给combat，后者将样品分为三组-健康、kd和其它疾病。川崎恢复期样品被定为健康。combat之后的pca显示，两个批次的样品在pc1相对于pc2的图中重叠，没有明显的批次效应(图6b)。

模型估计

在模型估计之前，对探针进行预过滤，以识别在相关疾病组之间log2倍数变化≥1的稳健表达的转录本。这是通过在训练数据中选择满足以下所有条件的探针来实施的：

1.同时在v3和v4因美纳beadchips上测量的探针

2.稳健表达的转录本：对于每种探针，我们计算了每个比较组中检测阈值p值<0.01的样品的比例，并在至少一个疾病组中选择了该比例大于80％的探针

3.大部分川崎患者均入选ucsd。为确保探针选择不会因ucsd产生的批次效应而产生偏差，我们排除了以月龄为条件的线性模型中在p<0.05时与ucsd招募相关的探针，以及也包含从ucsd招募的非kd患者的所有疾病组(dv、u、kd和hsp)

4.计算川崎和其它比较组之间的log2倍数变化(取决于年龄)；我们针对这些比较中的至少一个比较提出了log2倍数变化|>1的探针

使用r软件包limma中的函数lmfit和ebayes[42]计算上述步骤(3)和(4)中使用的探针关联统计

使用并行确定性模型搜索(pdms)进行发现

我们使用了一种内部方法pdms来获得简约的基因表达特征，所述方法可以平衡较小的转录本数量和准确的辨别。所述方法迭代估计基因表达水平(协变量)的选定子集的逻辑回归系数。回归系数被分配零中心的高斯先验分布，其精度参数为τ(其中τ＝1/方差，并且等于罚分)，以将系数缩小为零。所述方法搜索尽可能多的模型并选择“最佳”模型，每个模型均包括所选协变量的唯一子集及其各自的逻辑回归系数。

为了找到最佳的先验概率分布收缩参数，我们使用发现数据的多个分区的lasso交叉验证评估了每个模型的精度。使用r软件包glmnet确定具有最小样品外交叉验证偏差的lasso罚分。然后，通过在最佳lasso拟合的最大回归系数(βmax)上将lasso诱导的罚分等同于高斯先验诱导的罚分，来设置τ。用λ表示lasso罚分参数：

lasso罚分＝高斯罚分

pdms方法进行如下操作：使用预先过滤的在各组之间稳健表达的探针(log2倍数变化≥1)，根据对数似然度(模型拟合数据的程度的度量)对所有可能的单转录本模型和双转录本模型进行了评估和排名，并提出了前100个双转录本模型。在下一阶段，该算法确定了三基因模型的唯一集合，可以通过将一个基因添加到前100个双基因模型中的每个模型中来构建所述三基因模型。计算了这些模型的对数似然，然后继续进行前100个模型的构建，以构建大一个基因的模型。

对于给定大小(转录本数量)的模型，按watanabe-akaike信息标准(waic)对这些模型进行排名[43]。waic是用于估计样品外预期误差的贝叶斯信息准则，该准则会根据模型的有效参数数量对模型进行罚分，并假设根据后验分布进行推断。pdms根据后均值进行推断，因此waic适合我们的应用。关于如何估计waic的细节，请参见gelman等人[44]。尽管waic通过添加对有效参数数量的校正来针对过度拟合进行调整，但其并未解决因搜索许多模型而导致的假阳性率增加的问题。在探索的所有模型大小中，pdms均不会简单地选择waic最低的模型，而是引入一个附加的罚分，以最小化：

校正后的标准＝waic+αk

其中k是模型大小，我们取α＝1。

计算模型精度

使用r软件包proc[45]计算了roc曲线下方的面积，以及模型应用于测试和验证数据集的相应置信区间。

将每名患者的结果汇总为疾病风险评分(drs)，以通过13个转录本特征确定分类的准确性，并根据youden的j统计量，通过roc曲线中使到身份线的距离最大的点((敏感性+特异性)的最大值)确定基于训练集数据分类为kd或非kd的最佳阈值界限[46]。在验证数据的准确性计算中使用了相同的阈值。

使用杰弗里(jeffrey)方法计算敏感性和特异性的置信区间(ci)。杰弗里方法是从贝叶斯观点得出的，在该方法中，所关注的基础部分被分配给非信息性杰弗里参考先验-β(1/2，1/2)。[47]因此，敏感性的95％ci是从β(p+1/2，q+1/2)分布的2.5％和97.5％分位数中得出的，其中p是真阳性的数量，而q是假阴性的数量。

结果

每个诊断类别中的患者人数如图2所示。kd患者的临床和人口统计学特征如表1所示，患有其它炎性综合征和感染的患者的临床特征和人口统计如表3-6所示。对发现组(训练组和测试组)和验证组分别执行了归一化基因表达谱的主成分分析；图5和6绘制了这两个分析的pc1对比pc2。使用combat算法将kd与案例-对照数据合并后，研究组聚集在发现组和验证组中[24](请参见上文的补充统计方法)。表1：发现和验证研究组中的kd受试者的临床特性和在急性时间点的实验室值

所有值均显示为中位数(iqr)。发现和验证患者的特性之间没有显著差异。a：患病天数1＝发烧的第一天；b：血红蛋白按年龄归一化；c：>140被写为140；d：在102名kd患者中，排除了30名采样时患病天数≥8天的患者，并且其余72名患者用于诊断性能；e发现对比验证的p值＝0.051。

识别最小转录本特征

存在1600个通过qc的转录本在kd与所有其它疾病和健康对照之间显著差异表达(定义为在kd对比至少一个比较组中，|log2倍数变化|>1)。为了确定适合作为测试的最小特征，接下来使用pdms进行变量选择。此方法识别了13个转录本特征(表2)，当将这些转录本特征实施为drs时，其诊断性能如下：测试集中的auc为96.2％(95％ci、92.5％、99.9％)，敏感性/特异性分别为81.7％(95％ci、60.0％、94.8％)和92.1％(95％ci、84.0％、97.0％)(图3a，b)。

表2：诊断特征中包含的基因

逻辑回归系数表示基因在pdms模型中辨别kd的能力；相对于其它疾病，具有正值的基因在kd中的表达增加；具有负值的基因在kd中的表达降低。

验证集中的特征性能

当将特征应用于验证集中的72个kd病例时，auc为96.5％(95％ci、93.7％、99.3％)，敏感性为90.8％(95％ci、82.5％、96.2％)，并且特异性为89.1％(95％ci、83.0％、93.7％)。由于kd的临床特征与其它病症重叠，并且由于任何kd研究组都可能包含未患有kd的患者，因此我们评估了临床诊断的确定性是否对应于kddrs预测评分的强度。在验证集的确诊的、极有可能的或可能的kd患者中(参见方法)13个转录本特征的性能遵循诊断的临床确定性。单独分析时，在确诊的、极有可能的或可能的kd组中13个转录本pdms特征的性能遵循诊断的临床确定性，其中rocauc分别为98.1％(95％ci、94.5％、100％)、96.3％(95％ci、93.3％、99.4％)和70.0％(95％ci、53.4％、86.6％)(图3c，d)。

按患病天数的特征性能

发现组包含生病最多7天的kd患者(第1天为发烧的第一天)，并且已经在生病最多7天(包含第7天)的患者身上验证了特征。当在生病的第8-10天将特征应用于30名患者时，特征的性能会下降(图4)。

讨论

我们已经识别出可将kd与细菌疾病、病毒疾病和炎性疾病患者区分开的13个转录本特征。所述特征对kd的早期诊断具有很高的敏感性和特异性，这表明其可能构成诊断测试的基础。我们的发现扩展了先前在kd中的基因表达研究，所述研究专注于免疫发病机制[21，25-29]。对于特征中的13个转录本中的5个转录本，kd患者的表达低于非kd组(表2)。在这5个转录本中，先已曾报道过，与恢复期[30]或病毒感染[29，30]相比，s100钙结合蛋白p(s100p)在急性期的kd表达增加。s100p表达在细菌患者中最高，并且在pdms模型中该转录本的选择由kd细菌辨别的驱动。据报导，与患有急性细菌感染[31]和自身免疫性疾病[32,33]的儿童相比，干扰素诱导基因，即调节细胞凋亡的干扰素α-诱导蛋白27(ifi27)，在患有病毒感染的发热儿童中被上调。先前在急性kd与腺病毒感染的全血基因表达比较中，曾报道过由1型干扰素诱导的基因家族低转录本丰度[29]，这与在模型中加入ifi27作为kd的阴性预测指标相一致。cd163是在感染急性期参与细菌清除的巨噬细胞和单核细胞中表达的跨膜受体[34]。使用ingenuitypathwaysanalysis对特进行的网络分析表明，特征中的13个转录本中有7个在围绕tnf和il6中心枢纽的网络中连接在一起(图7)。

目前，kd的诊断依赖于五个特征性临床标准中的四个。如果在超声心动图上检测到冠状动脉异常(扩张或动脉瘤)，则较少的标准被接受为诊断。不符合经典诊断标准但长期发烧和发炎的患有“不完全kd”的儿童患caa的风险增加[35]。不完全kd的caa风险较高的原因之一是缺乏所有临床特征的患者常常会出现诊断延迟。由于kd的临床特征与许多其它常见的儿童期病症(如葡萄球菌和链球菌毒素疾病、病毒性发热、史蒂文斯约翰逊综合征(stevensjohnsonsyndrome)、全身性青少年特发性关节炎和药物反应[36])重叠，在等待排除其它病症时，ivig的治疗可能会延迟。相反，由于在许多儿童期发热性疾病的鉴别中都考虑了kd的诊断，并且延迟治疗的后果可能很严重，因此可能发生ivig过度治疗或免疫抑制剂二线治疗。准确区分kd与其它传染性和炎性过程的诊断测试将是障碍管理的重大进步，其可以减少不必要的检查和不适当的治疗，并可以早期使用ivig和其它抗炎药剂进行治疗。

在建立发现和验证研究组时，我们旨在包含与kd具有重叠特征的多种障碍，包含传染性疾病和炎性疾病。我们已经识别的特征将kd与其它各种病症区分开。由于kd是根据一系列临床特征进行诊断的，并且不存在诊断的黄金标准，因此很难评估生物标志物或进行测试。在所有针对推定的kd接受ivig治疗的儿童队列中，很可能会包含一些临床特征重叠的非kd疾病患者。为了评估kddrs与诊断确定性水平的对应关系，我们基于对所有临床数据的独立审查，将验证集中的所有患者分类为确诊的、极有可能的或可能的kd。我们在确诊的和极有可能的组中观察到的特征比在可能的组中观察到的特征具有更高的敏感性和特异性。kd特异性特征的诊断准确性已准备就绪，可以在前瞻性研究中进行测试。

我们认识到这项研究的优点和局限性。首先，kd的流行病学在全球范围内因种族而异，东亚的流行率较高，而欧洲的流行率较低。需要进一步研究以调查kd中的基因表达是否存在种族和地理差异。我们的研究的优势在于，特征是从包含一系列种族的训练集中发展而来的。发现集中的发热对照样品来自所有中心，而多种族kd样品来自ucsd。其次，在验证实验中，通过应用combat算法[24]将来自不同因美纳微阵列版本的kd和病例-对照数据进行组合，并针对每个平台的健康对照数据进行归一化。这种归一化可以减少数据集之间差异的实验和生物学来源，因此，与从单个微阵列实验获得的验证数据集相比，诊断特征应用于验证集时的准确性(auc结果)可能被低估了。第三，使用患病不超过7天的kd患者发现了13个转录本特征。我们的特征的优势在于，其可能有助于在发烧5天之前进行早期kd诊断。然而，还需要进一步的工作来确定最佳的特征，以便对晚期“遗漏”的kd患者进行诊断。

将多转录本特征转换为用于医院诊断实验室的快速临床测试具有挑战性，但是由于我们的特征中转录本数量相对较少以及用于检测核酸的技术日新月异，因此更容易实现。此外，drs为个体疾病风险分配提供了一种新方法，而无需进行复杂的分析，并提供了一个开发平台作为测试，其中包括kd特征的被上调或下调的转录本位于同一位置并检测二者的组合信号。

我们的研究表明，kd可以与传染性和炎性病症的范围区分开来，在临床上，使用血液中的少量转录本通常会将二者混淆。基于该基因表达特征的快速测试的发展将是允许较早治疗并因此预防这种严重的儿童疾病的心脏并发症的重大进展。我们的发现代表了根据分子特征而非临床标准更好地诊断疾病的进步，因此与许多其它临床综合征相关。

数据储存库

上文讨论的数据已保存在ncbi的基因表达精选集(geneexpressionomnibus)中(edgar等人,2002)，可通过geo系列登录号gse73464(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)访问。

补充表

表3：青少年特发性关节炎队列中儿童的临床特征(发现)

^a所有值均以中位数(iqr)表示；^b初次治疗集中27名患者，主动加重/郁积集中35名患者的实验室值。esr＝红细胞沉降率，ana＝抗核抗体，anca＝抗中性粒细胞胞浆抗体。

表4：过敏性紫癜组中儿童的临床特征(发现)

^a所有值均以中位数(iqr)表示；^b血红蛋白按年龄归一化；^c可从15名患者获得实验室数据；

^d可从14名患者获得实验室数据；^e可从4个hsp获得实验室数据；^f可从8名患者获得实验室数据；esr＝红细胞沉降率

表5：患有细菌和病毒感染、细菌或病毒病因不确定的感染的儿童以及健康对照的临床特征(发现和验证)

^a所有值均显示为中位数(iqr)；^b已知种族的患者的百分比，^c直至研究血液采样，^d报道了疾病中crp的最高值。

表6：确诊的细菌和病毒组中患者的病毒和细菌致病性病原体

表7：模型性能摘要

实例2–转录本较少的基因特征的识别

使用prems软件(hoggart，2018)基于原始13个转录本的子集生成备用的较小特征(转录本较少)。

prems搜索由生物标志物的最佳子集构建的许多逻辑回归模型，从而反复增加模型的大小。将零中心的高斯先验分布分配给所有回归系数以引起收缩。所述方法估计最佳收缩参数、针对每个模型大小的最佳模型以及最佳模型大小。

下表8示出了基于来自原始13个转录本的转录本组合的较小的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个和12个转录本特征的实例。针对每个特征示出了测试和验证数据集(请参见实例1)的auc值。请注意，为简洁起见，此处示出的基因特征的样品列表并不详尽，而仅是示例性的。

表8–基于原始13个转录本的子集的较小特征的实例

因此，该实例表明，基于原始13个转录本的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个子集的较小基因特征具有良好的辨别力，并且能够可靠地识别患有kd的个体与未患有kd的个体。

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