优先权要求本申请要求于2018年6月26日提交的序列号为62/690,209、标题为“包括具有合成或增强的甲基营养的那些工程微生物的、具有g3p→3pg酶和/或果糖-1，6-二磷酸酶的工程微生物”的美国临时专利申请的权益，其公开内容通过引用并入本文。同时，通过引用将2019年6月25日创建的标题为“gno0088wo序列表.txt(gno0088wo_sequence_listing.txt)”、大小为29.2千字节的ascii文本文件的全部内容并入本文。本发明涉及具有合成或增强的甲基营养的工程微生物以及利用nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶和/或果糖-1，6-二磷酸酶的工程微生物。
背景技术：
：：甲基营养涉及微生物利用单碳(c1)化合物(例如甲醇和甲烷)作为能源和碳源的能力。含甲烷(甲烷可从天然气中及其氧化产物甲醇中获得)的碳原料已变得广泛可得，并且现在相对便宜。因此，与通常使用c6或c5糖的成本可能更高的传统原料相比，对于用于生产生物产品的发酵技术，使用c1原料已变得有吸引力。甲基营养型微生物通常不利于工业生产，因为许多甲基营养型微生物具有严格的需氧要求，产生的代谢中间体相对较少，因此远不适合用于简便的基因工程。因此，在工业上有用的微生物中开发合成的甲基营养是具有挑战性的。技术实现要素：在一些实施方式中，本发明提供了具有合成或改良的甲基营养的工程微生物、使用该工程微生物生产生物产品的方法、包括该微生物的组合物以及使用该微生物制备的含生物产品的组合物。本发明的工程微生物包括至少一种修饰，该修饰与导致低级糖酵解(emp)途径的酶(nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和核酮糖单磷酸(ribulosemonophosphate，rump)循环的酶有关。已经发现，不能行使甲基营养的天然生物，例如大肠杆菌，通常通过emp途径具有相对高的通量。为了实现合成的甲基营养，本发明的工程微生物利用rump循环的一种或多种酶，并且还被工程改造以有益地维持一种或多种磷酸化3碳和/或4碳物种(例如，甘油醛3-磷酸(glyceraldehyde3-phosphate，g3p)、二羟丙酮磷酸(dihydroxyacetonephohsphate，dhap)和赤藓糖4-磷酸(erythrose4-phosphate，e4p))的足够的池大小。在本发明的一个方面，已经发现这可以在工程生物中使用将甘油醛3-磷酸(g3p)转化为3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate，3pg)的酶来实现，其中该酶将nadp还原为nadph(并且还可以被称为如本文所讨论的非磷酸化酶)，例如甲醇芽孢杆菌(b.methanolicus)gapn或其功能等同物。在本发明的另一方面，这可使用果糖-1，6-二磷酸酶，例如甲醇芽孢杆菌glpn或其功能等同物在工程生物中实现。因此，本发明的实施方式提供具有合成或增强的甲基营养的工程微生物，该工程微生物包括：(a)外源酶a和(b)外源酶b，该外源酶a：(ai)能够将甘油醛-3-磷酸(g3p)转化为3-磷酸甘油酸(3pg)；(aii)与seqidno：1(甲醇芽孢杆菌gapn)具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶，或(ai)和(aii)，或(aii)和(aiii)，该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。对微生物的修饰允许通过碳重排由c1和c5化合物生成c6化合物，由c6化合物再生c5化合物，以及在c5化合物再生和较低糖酵解之间进行改善的平衡。反过来，这使得工程微生物产生足量的代谢前体(例如，乙酰辅酶a(acetyl-coa))，其可用于生物产物途径以产生目标化合物，同时在发酵方法中为生长提供良好的细胞健康。在实施方式中，工程微生物可任选地包括对生物体的较低糖酵解途径的天然基因的一种或多种修饰。例如，修饰可以是减弱或消除生物体的天然nad依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶活性(gapa)、天然磷酸甘油酸激酶活性(pgk)的修饰。连同gapn修饰一起，这种缺失可增强一种或多种磷酸化3碳和/或4碳物种的池大小，以提供如本文所述的细胞的益处。在实施方式中，工程微生物可任选地包括nad+依赖性甲醇脱氢酶(methanoldehydrogenase，mdh)，例如外源性mdh。该生物体可具有高mdh活性，这通过增强的酶活性而变为可能，例如，使用mdh变体、增强的表达、或二者。mdh活性可提供增加的c1化合物(甲醛)池，并且可提供细胞修饰用于c5化合物的生成，用于使用rump酶增加c6化合物的通量。在实施方式中，工程微生物可任选地包括一种或多种修饰以提供：(a)转酮醇酶的表达或增加的活性，以增加赤藓糖4-磷酸的池大小；(b)景天庚酮糖1,7二磷酸酶(sbpase或glpx)的表达或增加的活性，以操作工程生物体中的rump循环的sbpase变体；减弱或消除生物体的天然转醛醇酶活性(例如，talb、tala、talc)。在实施方式中，本发明提供了一种工程微生物，其包括以下修饰：i.(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；和(6)任选地外源性磷酸酮醇酶(pk)；ii.导致以下内源酶中的一种或多种内源酶的缺失或减弱的可选修饰：(7)atp依赖性6-磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，pfk)；(8)核酮糖-磷酸3-表异构酶(ribulose-phosphate3-epimerase,rpe)；(9)核糖-5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphateisomerase,rpi)；(10)转酮醇酶(transketolase，tkt)；(11)果糖-二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphatealdolase,fba)；(12)葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和可选地用外源对应酶(exogenouscounterpartenzyme)取代(7)-(11)中的任意酶，外源对应酶例如来自芽孢杆菌(bacillus)的酶；以及iii.导致以下内源酶中的一种或多种内源酶的缺失或减弱的可选修饰：(12)nad依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapa)；(13)转醛醇酶(例如，talb、tala，和/或talc)；(14)磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase，pgk)；(15)磷酸甘油酸变位酶(phosphoglyceratemutase,gpm)；(16)烯醇酶(enolase，eno)；(17)脱氧核糖磷酸醛缩酶(deoxyribosephosphatealdolase，deoc)；(18)甲基乙二醛合酶(methylglyoxalsynthase，mgsa)；和(19)atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfka和pfkb)。在其他实施方式中，本发明提供了工程微生物(其中不一定需要合成或改良的甲基营养)，其包括外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将甘油醛-3-磷酸(g3p)转化为3-磷酸甘油酸(3pg)；或(aii)与seqidno：1(甲醇芽孢杆菌gapn)具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph。当通往所需化学产物的途径利用nadph作为氧化还原源时，这种修饰在代谢工程生物体中是有用的。在实施方式中，nadph的产生可以提供作为氧化还原源的优势，因为较少的细胞反应利用nadph，并且这些电子又可被导向产物途径而不是其他细胞反应。此外，nadph与nadp+的细胞比例可高于nadh与nad+的比例，这可为产物途径提供额外的热力学驱动力。例如，包括酶a(例如，gapn或其功能等同物)的工程微生物可包括利用细胞内增加的nadph量的产物途径，例如氨基酸途径，特别是通往需要高水平的c3-磷酸盐和c4-磷酸盐，例如g3p和e4p的芳香族氨基酸途径。另外，可使用gapa减弱或缺失的gapn来改善nadph密集型产物(例如1,3bdo)的生产。在实施方式中，工程微生物可任选地包括编码促进目标产物或其中间体的产生的代谢途径的蛋白的一种或多种转基因，其中该代谢途径使用由细胞消耗甲醇产生的化合物。在一些实施方式中，一个或多个转基因可以是形成醇例如1-丁醇、异丁醇、1,4-丁二醇或1,3-丁二醇的途径的一部分。在一些实施方式中，一个或多个转基因可以是形成酸或酸酯例如甲基丙烯酸(maa)或甲基丙烯酸甲酯(mma)的途径的一部分。其他实施方式指向包括本发明的工程微生物的组合物，例如细胞培养物组合物，以及包括从工程微生物产生的一种或多种产物的组合物。例如，组合物可包括由工程微生物产生的目标产物，其中该组合物已被纯化以除去细胞或用于细胞培养的其他组分。可以对组合物进行处理以富集或纯化目标产物或其中间体。本发明的其他实施方式指向从使用工程微生物的方法获得的目标产物制成的产品。附图说明图1示出了在用外源性gapn修饰并gapa缺失的细胞中，使用gapa和pgk(在天然/亲本细胞中)通过1,3-bpg(也称为3-磷酸甘油酰基-p)将g3p转化为3pg，与使用gapn和nadp+将g3p直接转化为3pg的比较。反应1和反应2，出自大肠杆菌，标记为“亲本”。反应3，表达gapa而gapn缺失或以其他方式减弱的本发明的gapn旁路标记为“gapn且δgapa”；图2示出了在具有gapa和pgk的细胞中从甘油醛3-磷酸(g3p)开始的代谢途径。反应1由甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapa)催化；反应2由磷酸甘油酸激酶(pgk)催化；图3示出了在具有合成的甲基营养的细胞中，使用medh、hps和phi从甲醇到果糖6-磷酸的代谢途径。甲醇ex是外部甲醇，作为碳原料添加。反应1由甲醇脱氢酶(mdh)催化；反应2由己酮糖6-磷酸合酶(hps)催化；反应3由磷酸3-己酮糖异构酶催化(phospho-3-hexuloisomerase)；图4示出了可用于产物途径的替代甲醛同化途径(rump和dha)和以及各自的代谢中间体。催化反应的酶是：(1)甲醇脱氢酶，例如ec1.1.1；(2)己酮糖-6-磷酸合酶，例如ec4.1.2.43；(3)6-磷酸-3-己酮糖异构酶，例如ec5.3.1.27；(6)dha(二羟丙酮)合酶，例如ec2.2.1.3；(7)f6p(果糖-6-磷酸)醛缩酶，例如ec4.1.2；(8)dha激酶，例如ec2.7.1.121；(9)果糖-二磷酸醛缩酶，例如ec4.1.2.13。本文所述的融合物可催化两种或更多种反应；图5示出了具有合成的甲基营养的细胞中的通向各种3、4、5和6碳代谢产物的代谢途径和从各种3、4、5和6碳代谢产物开始的代谢途径，各种3、4、5和6碳代谢产物包括甘油醛3-磷酸(g3p)、二羟丙酮-磷酸、赤藓糖4-磷酸、核糖5-磷酸、核酮糖5-磷酸、木酮糖5-磷酸、果糖6-磷酸和果糖1，6-二磷酸。反应1由6-磷酸果糖激酶(pfk，优选pfkab)催化；反应2由果糖-二磷酸醛缩酶(fba，优选fbaab)催化；反应3由三糖-磷酸异构酶(tpi，优选tpia)催化；反应4由转酮醇酶(tkt，优选tktab)催化；反应5由转酮醇酶(tkt，优选tktab)催化；反应6由核糖-5-磷酸异构酶(rpi，优选rpiab)催化；反应7由核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)催化；图6示出了在具有合成的甲基营养的细胞中，通向以下和从以下开始的代谢途径：二羟丙酮-磷酸、赤藓糖4-磷酸、景天庚酮糖-1，7-二磷酸和景天庚酮糖-7-磷酸。反应1由果糖-二磷酸醛缩酶(fba)催化；反应2由果糖-1，6-二磷酸酶(glpx)催化；图7示出了示例性目标产物途径，即1，4-bdo产物途径，其可利用如本文所公开的从甲醇同化获得的乙酰辅酶a。催化生物合成反应的酶为：(1)琥珀酰辅酶a合成酶；(2)辅酶a非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(3)α-酮戊二酸脱氢酶；(4)谷氨酸：琥珀酸半醛转氨酶；(5)谷氨酸脱羧酶；(6)辅酶a依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(7)4-羟基丁酸酯脱氢酶；(8)α-酮戊二酸脱羧酶；(9)4-羟基丁酰辅酶a：乙酰辅酶a转移酶；(10)丁酸激酶；(11)磷酸转丁酰基酶；(12)醛脱氢酶；和(13)醇脱氢酶；图8示出了示例性目标产物途径，来自乙酰辅酶a/甲基丙烯酸甲酯(mma)(这可利用如本文公开的可得自甲醇同化的乙酰辅酶a)的2-羟基异丁酸和甲基丙烯酸，可通过以下酶进行2-羟基异丁酸和甲基丙烯酸的生产：a)乙酰辅酶a：乙酰辅酶a酰基转移酶；b)乙酰乙酰基辅酶a还原酶(还原酮)；c)3-羟基丁酰辅酶a变位酶；d)2-羟基异丁酰辅酶a脱水酶；e)甲基丙烯酰辅酶a合成酶、水解酶或转移酶；f)2-羟基异丁酰辅酶a合成酶、水解酶或转移酶；图9是列出了相应蛋白质的seqidno的表；图10示出了在甲醇(用于合成的甲基营养物)上的生长，并显示了生长特性(光密度为在600nm的od值；每小时特定生长)。小图a描绘了对照gapa表达菌株的生长数据，该数据表明在甲醇上没有生长。小图b描绘了gapn表达菌株的生长数据，该数据显示了在甲醇上的生长。小图c描绘了gapn表达菌株在甲醇上的生长速率。虚线是没有生长(稀释)的预期线。带有黑点的实线是实际的实验数据；图11显示了酶fba、fba2、glpx和tkt的过表达对不同细胞密度下甲醛消耗(微摩尔)的影响。使用nash分析法在没有其他碳源的情况下，对与亲本菌株相比具有从质粒表达的额外的glpx的大肠杆菌菌株的甲醛消耗进行了分析。glpx是登录号wp_003352248.1；fba是登录号eij77616.1；fba2是登录号eij80286.1；tkt是登录号eij77615.1；ev是对照。通过rump循环酶同化的甲醛消耗是衡量rump循环活性的代表。600nm光密度(od)是细胞密度的指标。具体实施方式本文中所述的实施方式并不旨在将本公开内容尽数穷举，或限制为以下详细描述中所公开的精确形式。相反，对实施方式进行了选择和描述，以便本领域技术人员可以理解和明白本说明书中的原理和实践。本文提及的所有出版物和专利在此通过引用并入本文。本文所公开的出版物和专利仅用于公开。本文中的任何内容都不应被解释为承认发明人无权早于任何出版物和/或专利，包括本文引用的任何出版物和/或专利。术语“合成的甲基营养”是指微生物细胞中使微生物细胞能够利用c1碳(例如甲醇或甲烷)作为能源的工程改造。否则，宿主细胞(被工程改造为合成的甲基营养)将无法在c1碳源上生长。对微生物进行工程改造以提供合成的甲基营养通常将涉及至少一种外源(即，“非天然”)酶在细胞中的表达，更通常地是细胞中两种或更多种，或三种或更多种外源酶在细胞中的表达。其他修饰可涉及天然基因的缺失或以其他方式导致天然基因活性减弱的修饰。可将一种或多种外源酶与一种或多种内源(即“天然”)酶掺入细胞的天然代谢途径中，其中一种或多种外源酶可将衍生自1c碳的代谢产物转化为可被细胞的天然酶所利用(例如用于细胞生长或生物产品生产)的物质。非甲基营养型的并且可用本发明的外源酶进行工程改造的微生物包括大肠杆菌以及本文所述的其他原核和真核生物。术语“增强的甲基营养”是指对甲基营养型微生物细胞进行工程改造，使得提高1c碳(例如甲醇或甲烷)作为能源的利用。具有“增强的甲基营养”的细胞可表现出比天然的甲基营养型微生物细胞增强的细胞生长或生物产品产生。非甲基营养型的并且可用本发明的外源酶进行工程改造的微生物包括大肠杆菌以及本文所述的其他原核和真核生物。本发明的方面涉及具有至少一种修饰的工程微生物(即，“酶a”)，该至少一种修饰影响通向低级糖酵解(emp)循环的产物。在一个实施方式中，酶a是将甘油醛-3-磷酸(g3p)转化为3-磷酸甘油酸(3pg)的酶，或是与seqidno：1(甲醇芽孢杆菌gapn)具有至少50％的序列同一性的酶，其中酶a能够将nadp还原为nadph。在另一个实施方式中，酶a是果糖-1，6-二磷酸酶，例如甲醇芽孢杆菌glpn或其功能等同物。工程微生物还可具有核酮糖单磷酸(ribulosemonophosphate，rump)循环的一种或多种外源酶(即，“酶b”)。一种或多种rump循环酶包括但不限于：己酮糖6-磷酸合酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、磷酸酮醇酶或这些酶的任何组合。在优选的实施方式中，工程微生物还包括外源性甲醇脱氢酶，例如与野生型序列相比具有一个或多个变体氨基酸的甲醇脱氢酶。在一些实施方式中，工程微生物包括使用nadp+至nadph的还原而能够将甘油醛3-磷酸(g3p)不可逆地转化为3-磷酸甘油酸(3pg)的酶(“酶a”)，或与seqidno：1(甲醇芽孢杆菌gapn)具有至少50％的序列同一性的酶。不同于使用辅助因子nad催化g3p氧化磷酸化为13bpg的大肠杆菌gapa(甘油醛-3-磷酸脱氢酶a；p0a9b2)，本发明的酶a使用nadp来催化g3p转化为3pg(如下所示)。利用nadp的g3p向3pg的转化，似乎不需要可检测量的磷酸盐进行转化，因此可以称为“非磷酸化”酶，这进一步将其酶促活性与相反会进行氧化磷酸化的大肠杆菌gapa区别开来。此外，基于将通过gapn的g3p向3pg的转化与通过大肠杆菌gapa的g3p向13bpg的转化相比，酶a(例如，gapn)以较低的速率转化g3p。图1示出了与使用gapn和nadp+的g3p向3pg的直接转化相比，使用gapa和pgk通过1,3-bpg的g3p向3pg的转化。例如，gapn的酶动力学为：一种示例性的酶a序列基于甲醇芽孢杆菌nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapn(基因库登录号(genbankaccessionnumber)wp_003346738，长度为481个氨基酸；seqidno：1)。本发明的工程微生物可表达具有与甲醇芽孢杆菌gapn相关的序列的酶a(例如甲醇芽孢杆菌gapn同源物)。例如，酶a可具有与seqidno：1具有50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高，或95％或更高的同一性的序列。seqidno：1的同源物可通过序列同一性搜索(例如，如本文所述的本领域技术人员众所周知的算法，例如align、blast、clustalw)来识别。示例性酶a序列包括在下表1中看到的那些，其包括来自各种芽孢杆菌物种的许多序列。表1本发明还设想了酶a变体在本发明的工程微生物中的用途，其包括一种或多种氨基酸置换、缺失或添加。变体可随机产生，或通过使用酶a序列(例如表1中所述的那些)的序列比对进行靶向置换。可以确定对于酶a的酶功能是保守的和/或重要的区域，并基于该信息对变体进行工程改造。因此，酶a可具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加，其使序列不同于天然序列，例如seqidno：1。可选地，工程微生物包括宿主细胞的低级糖酵解途径的基因的一种或多种修饰。细胞的糖酵解途径(称为埃姆登-迈耶霍夫-帕那斯(embden-meyerhof-parnas，emp)途径)具有上部分和下部分。在上部分中，葡萄糖(己糖)通过两个三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，atp)分子磷酸化而被“活化”。然后将其重新排列，以为使用果糖二磷酸醛缩酶(fructosebisphosphatealdolase，fba)裂解成两个三碳(三糖)磷酸分子做准备。在下部分中，该三碳(三糖)磷酸分子在由甘油醛脱氢酶(glyceraldehydedehydrogenase，gapdh)催化的反应中被磷酸化和氧化(通过nad+)。随后，进一步的磷酸化提供4个atp和2个丙酮酸分子。除了引入外源性gapn外，工程微生物还可包括对细胞的天然基因的修饰，该天然基因编码nad依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。参见图2。该修饰可减弱或消除nad依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性。可被修饰或缺失以减弱或消除活性的这种基因的一个例子是大肠杆菌gapa基因(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶a；p0a9b2)，该大肠杆菌gapa基因使用辅因子nad和磷酸来催化g3p向13bpg的氧化磷酸化。可将其中缺失了gapa或以其他方式使其表达降低的工程改造的大肠杆菌称为gapa，或可将降低酶促活性的任何修饰照此标记。gapa的缺失、表达降低或酶促活性降低，可使外源性gapn更有效地竞争作为底物的甘油醛-3-磷酸(g3p)。由于与g3p转化为1,3-bpg的大肠杆菌gapa相比，gapn展示出较慢的g3p向3-pg的转化，因此这可提供增加一个或多个磷酸化3碳和/或4碳物种的池大小的方法。这进而改善了c5化合物的再生与低级糖酵解之间的平衡，并使具有这些修饰的细胞中的合成的甲基营养成为可能或增强具有这些修饰的细胞中的合成的甲基营养。在本发明的一个方面，通过对细胞进行工程改造以在通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapa或gapn)的低级糖酵解与通过rump循环(fba、glpx)的c5再生之间提供所需的平衡来促进合成的甲基营养。参见图5和图6。本发明中阐述的提供所需平衡的基因修饰可在天然大肠杆菌中进行，其受nadh水平调节，并考虑使用生成nadh的外源性甲醇脱氢酶(否则会呈现其他挑战以达到该平衡)。因此，在实施方式中，gapn的使用不仅通过其动力学活性，而且还通过其将nadp还原为nadph的独特性质而促进合成的甲基营养。也可以对作为低级糖酵解途径的部分且在gapa的“下游”的一个或多个基因进行修饰，以减弱或消除其活性。例如，工程微生物可具有一种或多种修饰，该一种或多种修饰(a)减弱或消除从甘油醛-3-磷酸到磷酸烯醇丙酮酸(pep)的途径中的酶。参照图2，在一些实施方式中，工程微生物可具有一种或多种修饰，该一种或多种修饰(a)减弱或消除磷酸甘油酸激酶活性(例如，大肠杆菌pgk，uniprotp0a799)。pgk将3-磷酸-d-甘油酰磷酸转化为3-磷酸-d-甘油酸，同时通过底物水平的磷酸化由adp生成atp。在一些实施方式中，工程微生物可具有一种或多种修饰，该一种或多种修饰减弱或消除磷酸甘油酸变位酶活性。在一些方面，本发明的工程细胞还包括外源酶b，该外源酶b是：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。在甲烷氧化细菌中，由甲烷和甲醇氧化制成的甲醛被用于在导致形成细胞产物的途径中形成代谢中间体(anthony,c.(1991)biotechnology18:79-109)。丝氨酸和d-核酮糖-5-磷酸(rump)途径使用甲醛来生产含碳中间体化合物，含碳中间体化合物随后转化为其他下游产物。参照图3，rump途径己酮糖-6-磷酸合酶(hps)酶促浓缩甲醛和d-核酮糖-5-磷酸(rump)以形成己酮糖6-磷酸(hump)。6-磷酸-3-己酮糖异构酶(phi)将hump酶促转化为β-d-呋喃果糖6-磷酸(f6p)。hps和phi对于具有rump途径的天然有机体是独特的。每一个同化的甲醛分子都会产生一个fmp分子。然后可以通过两种途径中的任一种将f6p裂解为3-碳化合物。这些其他途径的酶不是专属于那些表达hps和hpi的甲烷氧化细菌。在一种途径中，6-磷酸果糖激酶(ec2.7.1.11)将f6p磷酸化为果糖1,6-二磷酸(fdp)。然后果糖-二磷酸醛缩酶(ec4.1.2.13)将fdp裂解成二羟丙酮磷酸(dhap)和甘油醛3-磷酸(g3p)。在另一个途径中，葡萄糖-6-磷酸异构酶(ec5.3.1.9)使fmp异构化为葡萄糖6-磷酸(g6p)。然后葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(ec1.1.1.49)将g6p脱氢为d-葡糖酸-1,5-内酯6-磷酸，d-葡糖酸-1,5-内酯6-磷酸被6-磷酸葡糖酸内酯酶(ec3.1.1.31)进一步脱氢成6-磷酸-葡萄糖酸。接着磷酸葡糖酸脱水酶(ec4.2.1.12)将6-磷酸-葡萄糖酸转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸-d-葡萄糖酸(kdpg)。随后，kdpg醛缩酶(ec4.1.2.14)将kdpg裂解成甘油醛3-磷酸(g3p)和丙酮酸。通过该途径形成的丙酮酸和dhap可用于合成生物分子的细胞途径。3-己酮糖-6-磷酸合酶属于(ec)4.1.2.43类酶。酶3-己酮糖-6-磷酸合酶(hps)可将甲醛与核酮糖-5-磷酸(ru5p)固定以形成d-阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸(hu6p)。参见图2。一个示例性hps序列基于甲醇芽孢杆菌mgahps(基因库登录号aar39392.1；长度为211个氨基酸；seqidno：2)。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌mgahps相关的hps序列，例如甲醇芽孢杆菌mgahps同源物。例如，hps序列可与seqidno：2具有25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或多、85％或更多、90％或更多或95％或更多的同一性。seqidno：2的同源物可通过序列同一性搜索(例如，如本文所述的本领域技术人员众所周知的算法，例如align、blast、clustalw)来识别。示例性hps序列包括在下表2a和表2b中发现的那些。例如，3-己酮糖-6-磷酸合酶包括但不限于：甲醇芽孢杆菌(bacillusmethanolicus)pb1hps(eij81375.1)；鞭毛甲基小杆菌(methylobacillusflagellatus)hps(yp544362.1)；鞭毛甲基小杆菌hps(yp544363.1)；枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)hps(np_388228.1)；甲基营养型嗜甲基菌(methylophilusmethylotrophus)hps(wp_018986666.1)；甲基营养型嗜甲基菌atcc53528hps(wp_018985298.1)；aminomonasaminovorushps(aag29505.1)；嗜甲基拟无枝酸菌(amycolatopsismethanolica)239hps(aij24611.1)；地芽孢杆菌物种(geobacillussp.)ghh01hps(yp_007402409.1)；地芽孢杆菌物种m10exghps(aar91478.1)；地芽孢杆菌物种y4.1mc1hps(yp_003990382.1)；嗜热脱氮地芽孢杆菌(geobacillusthermodenitrificans)ng80-2hps(wp_008879217.1)；methylomonasaminofacienshps(baa83096.1)；葡萄糖营养型食甲基菌(methylovorusglucosetrophus)sip3-4hps(yp_003050044.1)；食甲基菌物种(methylovorussp.)mp688hps(yp_004038706.1)；和胃分枝杆菌(mycobacteriumgastri)hps(baa90546.1)。表2a表2b本发明还设想了hps酶的变体在本发明的工程微生物中的用途，其包括一种或多种氨基酸置换、缺失或添加。变体可随机产生，或通过使用hps序列(例如表2a和2b中所述的那些)的序列比对进行靶向置换。可以确定对于hps酶的酶功能是保守的和/或重要的区域，并基于该信息对变体进行工程改造。因此，hps酶可具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加，其使序列不同于天然序列，例如seqidno：2。6-磷酸-3-己酮糖异构酶属于(ec)5.3.1.27类酶。6-磷酸-3-己酮糖异构酶属于(ec)5.3.1.27类酶。6-磷酸-3-己酮糖异构酶活性(phi)可将d-阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸(hu6p)异构化为果糖6-磷酸(f6p)。一个示例性phi序列基于甲醇芽孢杆菌mga3phi(基因库登录号aar39393.1；长度为184个氨基酸；seqidno：3)。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌mga3phi相关的phi序列，例如甲醇芽孢杆菌mgaphi同源物。例如，phi序列可与seqidno：3具有30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或多、85％或更多、90％或更多或95％或更多的同一性。seqidno：3的同源物可通过序列同一性搜索(例如，如本文所述的本领域技术人员众所周知的算法，例如align、blast、clustalw)来识别。示例性phi序列包括在下表3a和表3b中发现的那些。例如，6-磷酸-3-己酮糖异构酶序列包括，但不限于：甲醇芽孢杆菌pb1phi(eij81376.1)；胃分枝杆菌pb1phi(baa90545.1)；鞭毛甲基小杆菌ktphi(yp545762.1)；枯草芽孢杆菌phi(np_388227.1)；甲基营养型嗜甲基菌atcc53528hps(wp_018985297.1)；嗜甲基拟无枝酸菌239phi(aij24609.1)；地芽孢杆菌物种ghh01phi(yp_007402408.1)；地芽孢杆菌物种y4.1mc1phi(yp_003990383.1)；嗜热脱氮地芽孢杆菌ng80-2phi(wp_011887353.1)；methylomonasaminofaciensphi(baa83098.1)；葡萄糖营养型食甲基菌sip3-4phi(yp_003051269.1)；和食甲基菌物种mp688phi(adq84715.1)。表3a表3b本发明还设想了phi酶的变体在本发明的工程微生物中的用途，其包括一种或多种氨基酸置换、缺失或添加。变体可随机产生，或通过使用phi序列(例如表3a和3b中所述的那些)的序列比对进行靶向置换。可以确定对于phi酶的酶功能是保守的和/或重要的区域，并基于该信息对变体进行工程改造。因此，phi酶可具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加，其使序列不同于天然序列，例如seqidno：3。本发明的工程细胞还可表达hps-phi融合蛋白或其变体。工程融合蛋白可包括基于天然hps-phi融合体的多肽序列，例如，来自以下的融合体：荚膜甲基球菌(methylococcuscapsulatus)(yp_115138.1)；白甲基微菌(methylomicrobiumalbum)bg8(eic30826.1)；超嗜热古生菌(pyrococcusabyssi)(np_127388.1)；强烈火球菌(pyrococcusfuriosus)(np_577949.1)；掘越氏热球菌(pyrococcushorikoshii)ot3(np_143767.1)；或超好热始原菌(thermococcuskodakaraensis)(yp_182888.1)。包括hps-phi序列的示例性融合蛋白描述于wo2017/075208(bartonetal.)中，其公开内容通过引用并入本文。工程微生物可包括为磷酸酮醇酶的外源酶(“酶b”)，例如果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶或木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶。果糖-6-磷酸和磷酸向乙酰磷酸和赤藓糖-4-磷酸(e4p)的转化可通过果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(ec4.1.2.22)来进行。果糖-6-磷酸和磷酸向乙酰磷酸和赤藓糖-4-磷酸(e4p)的转化是双歧杆菌(bifidobacterium)分流中的关键反应之一。有证据表明双歧杆菌中存在两种不同的磷酸酮醇酶(sgorbatietal,1976,antonievanleeuwenhoek,42(1-2)49-57；grilletal,1995,currmicrobiol,31(1)；49-54)。来自齿双歧杆菌(bifidobacteriumdentium)的酶似乎仅对果糖-6-磷酸具有特异性(ec：4.1.2.22)，而来自假长双岐杆菌亚种globosum(bifidobacteriumpseudolongumsubsp.globosum)的酶能够利用果糖-6-磷酸和d-木酮糖5-磷酸(ec：4.1.2.9)(sgorbatietal,1976,antonievanleeuwenhoek,42(1-2)49-57)。xfp基因编码的酶最初是在动物乳酸双歧杆菌(bifidobacteriumanimalislactis)中发现的，是双特异性酶(meileetal.,2001,jbacteriol,183,2929–2936；yinetal,2005,femsmicrobiollett,246(2)；251-257)。另外的磷酸酮醇酶可以在肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)(leeetal,biotechnollett.2005jun；27(12):853-8)、丙酮丁醇梭杆菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824(servinskyetal,journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2012,39,1859-1867)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)(kocharinetal,2013,biotechnolbioeng,110(8),2216–2224；papini,2012,applmicrobiolbiotechnol,95(4),1001-1010)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)(suzikietal,2010,actacrystallogrsectfstructbiolcrystcommun.,66(pt8):941-3)、类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)(jeongetal,2007,jmicrobiolbiotechnol,17(5),822-9)中发现。木酮糖-5-磷酸和磷酸向乙酰磷酸和甘油醛-3-磷酸的转化可通过木酮酯-5-磷酸磷酸酮醇酶(ec4.1.2.9)来进行。有证据表明双歧杆菌中存在两种不同的磷酸酮醇酶(sgorbatietal,1976,antonievanleeuwenhoek,42(1-2)49-57；grilletal,1995,currmicrobiol,31(1)；49-54)。来自齿双歧杆菌的酶似乎仅对果糖-6-磷酸具有特异性(ec：4.1.2.22)，而来自假长双岐杆菌亚种globosum的酶能够利用果糖-6-磷酸和d-木酮糖5-磷酸(ec：4.1.2.9)(sgorbatietal,1976,antonievanleeuwenhoek,42(1-2)49-57)。许多表征的酶对木酮糖-5-磷酸和果糖-6-磷酸具有双特异性。xfp基因编码的酶最初是在动物乳酸双歧杆菌中发现的，是双特异性酶(meileetal.,2001,jbacteriol,183,2929–2936；yinetal,2005,femsmicrobiollett,246(2)；251-257)。另外的磷酸酮醇酶可以在肠膜明串珠菌(leeetal,biotechnollett.2005jun；27(12):853-8)、丙酮丁醇梭杆菌atcc824(servinskyetal,journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2012,39,1859-1867)、构巢曲霉(kocharinetal,2013,biotechnolbioeng,110(8),2216–2224；papini,2012,applmicrobiolbiotechnol,95(4),1001-1010)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)(suzikietal,2010,actacrystallogrsectfstructbiolcrystcommun.,66(pt8):941-3)和类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)(jeongetal,2007,jmicrobiolbiotechnol,17(5),822-9)中发现。示例性磷酸酮醇酶包括在下表4中发现的那些。表4蛋白基因库idgi号生物体xfpyp_006280131.1386867137动物乳酸双歧杆菌xfpaav66077.155818565肠膜明串珠菌cac1343np_347971.115894622丙酮丁醇梭杆菌atcc824xpkacbf76492.1259482219构巢曲霉xfpaar98788.141056827假长双岐杆菌亚种globosumxfpwp_022857642.1551237197假长双岐杆菌亚种globosumxfpadf97524.1295314695短双岐杆菌xfpaaq64626.134333987类植物乳杆菌在一些实施方式中，工程生物体包括果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶和任选的磷酸转乙酰酶。在一些实施方式中，工程生物体包括果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶和任选的乙酰辅酶a转移酶、乙酰辅酶a合成酶或乙酰辅酶a连接酶。由乙酰磷酸形成乙酰辅酶a可以由磷酸转乙酰酶(ec2.3.1.8)来催化。来自大肠杆菌的pta基因编码将乙酰辅酶a可逆地转化为乙酰磷酸的酶(suzuki,t.,biochim.biophys.acta191:559-569(969))。其他乙酰转移酶已经在枯草芽孢杆菌(radoandhoch,biochim.biophys.acta321:114-125(1973))、克氏梭菌(clostridiumkluyveri)(stadtman,e.,methodsenzymol.1:5896-599(1955))和海栖热袍菌(thermotogamaritima)(bocketal.,j.bacteriol.181:1861-1867(1999))中进行了表征。该反应也可被一些磷酸反丁酰酶(ec2.3.1.19)催化，包括来自丙酮丁醇梭杆菌的ptb基因产物(wiesenbornetal.,app.environ.microbiol.55:317-322(1989)；walteretal.,gene134:107-111(1993))。其他ptb基因可在产丁酸盐细菌l2-50(butyrate-producingbacteriuml2-50)(louisetal.,j.bacteriol.186:2099-2106(2004))和巨大芽胞杆菌(bacillusmegaterium)(vazquezetal.,curr.microbiol.42:345-349(2001))中发现。大肠杆菌pta基因的同源物存在于其他几种生物体中，包括肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)和莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)。示例性磷酸转乙酰酶包括在下表5中发现的那些。表5可以通过具有乙酰辅酶a合成酶、连接酶或转移酶活性的酶来催化乙酸向乙酰辅酶a的酰化。可催化该反应的两种酶是形成amp的乙酰辅酶a合成酶或连接酶(ec6.2.1.1)和形成adp的乙酰辅酶a合成酶(ec6.2.1.13)。形成amp的乙酰辅酶a合成酶(acetyl-coasynthetase，acs)是将乙酸盐激活为乙酰辅酶a的主要酶。示例性acs酶在大肠杆菌((brownetal.,j.gen.microbiol.102:327-336(1977))、罗尔斯通氏菌(ralstoniaeutropha)(priefertandsteinbuchel,j.bacteriol.174:6590-6599(1992))、热自养甲烷热杆菌(methanothermobacterthermautotrophicus)(ingram-smithandsmith,archaea2:95-107(2007))、肠道沙门氏菌(gulicketal.,biochemistry42:2866-2873(2003))和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)(joglandtong,biochemistry43:1425-1431(2004))中发现。形成adp的乙酰辅酶a合成酶是具有底物范围通常广泛的可逆酶(musfeldtandschonheit,j.bacteriol.184:636-644(2002))。形成adp的乙酰辅酶a合成酶的两个同工酶在闪烁古生球菌(archaeoglobusfulgidus)基因组中由af1211和af1983编码(musfeldtandschonheit,(2002)，同上)。来自死海盐盒菌(haloarculamarismortui)的酶(注释为琥珀酰辅酶a合成酶)也接受乙酸盐作为底物，并证实了该酶的可逆性(brasenandschonheit,arch.microbiol.182:277-287(2004))。来自超嗜热泉古菌(hyperthermophiliccrenarchaeon)耐超高温热棒菌(pyrobaculumaerophilum)的由pae3250编码的acd，显示出所有已表征acd中最广泛的底物范围，与乙酸盐、异丁酰辅酶a(优选底物)和苯乙酰辅酶a反应(brasenandschonheit,(2004)，同上)。定向进化或工程改造可用于修饰该酶，以在宿主生物体的生理温度下操作。来自闪烁古生球菌(a.fulgidus)、死海盐盒菌(h.marismortui)和耐超高温热棒菌(p.aerophilum)的酶已经在大肠杆菌中进行克隆、功能表达和表征(brasenandschonheit,(2004)，同上；musfeldtandschonheit,(2002)，同上)。其他候选物包括在大肠杆菌中由succd编码的琥珀酰辅酶a合成酶(bucketal.,biochemistry24:6245-6252(1985))和来自恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)的乙酰辅酶a连接酶(fernandez-valverdeetal.,appl.environ.microbiol.59:1149-1154(1993))。前述蛋白在下表6中示出。表6在一些实施方式中，工程生物体包括外源性醇脱氢酶，例如外源性甲醇脱氢酶。醇脱氢酶(adh；ec1.1.1.1)促进醇类向醛类或酮类的转化，通常伴随着烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原(nad+至nadh)。adh在各种代谢产物的生物合成过程中协助产生具有醛基、酮基和醇基的重要化合物。甲醇脱氢酶(methanoldehydrogenase，mdh)是醇脱氢酶中的一类。mdh将甲醇(meoh)转化为甲醛(fald)，可以用于工程改造成本发明的微生物中的酶途径中，以使meoh能够作为唯一碳源或与其他原料作为共同碳源。参见图3。本发明的工程细胞可包括天然或非天然的nad+依赖性甲醇脱氢酶(mdh)，特别是ec1.1.1.244类的酶。一种示例性mdh序列是来自甲醇芽孢杆菌mga3的nad(p)+依赖性甲醇脱氢酶(基因库登录号eij77596.1，gi号：387585261；在本文中命名为mdh2315，长度为382个氨基酸；seqidno：4)。mdh2315在文献中报道为来自甲醇芽孢杆菌mga3的nad(p)依赖性甲醇脱氢酶，且其序列描述于brautasetetal.,“plasmid-dependentmethylotrophyinthermotolerantbacillusmethnolicus”,journalofbacteriology,vol.186,pp1229-1238(2004)。它还在brautaset的wo2013/110797中称为medhmga3，并在krogetal.,“methylotrophicbacillusmethanolicusencodestwochromosomalandoneplasmidbornnad+dependentmethanoldehydrogenaseparalogswithdifferentcatalyticandbiochemicalproperties”,plosone,pp.1-11,(2013)中称为medh“m”，该文献报道了其他的野生型芽孢杆菌mdh。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌mga3mdh相关的mdh序列，例如甲醇芽孢杆菌mgamdh同源物。例如，phi序列可与seqidno：4具有20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或多、70％或更多、80％或更多或90％或更多的同一性。seqidno：4的同源物可通过序列同一性搜索(例如，如本文所述的本领域技术人员众所周知的算法，例如align、blast、clustalw)来识别。示例性mdh酶包括在下表7中发现的那些。表7本发明的工程细胞还可表达mdh变体。在一些情况下，可通过seqidno：4与其他已知的甲醇脱氢酶或醇脱氢酶进行序列比对来产生与seqidno：4具有少于100％同一性的变体，以识别对于蛋白的酶促功能来说是保守的和/或重要的区域。一旦识别出这些区域，可以在这些保守区域之外的一个或多个氨基酸位置对甲醇脱氢酶进行修饰。因此，甲醇脱氢酶可具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加，其使序列与天然甲醇脱氢酶不同，同时保留某些序列特征。表8是包括甲醇芽孢杆菌mga3medh(seqidno：4)在内的各种甲醇脱氢酶的两两序列同一性的表。表81：eij77596.12：eij83020.1这种变体可以提供增加的催化活性，例如增加的甲醇向甲醛的转化。国际专利申请号pct/us2014/059135中描述了甲醇芽孢杆菌mga3medh(seqidno：1)的示例性变体，其公开内容并入本文。seqidno：4的示例性氨基酸置换包括但不限于如下的那些：s11t、d38n、h42q、e48d、n53i、e56k、d60e、v61a、i63f、p65q、d70n、p71i、p71t、p71v、t74s、d81g、k84r、e86k、n87k、i94v、s99p、s99t、a103v、i106l、g107s、l108v、l108w、v109y、n112k、n112r、r115h、i116f、n117d、n117q、n117y、q120h、q120r、g121a、g121d、g121e、g121l、g121m、g121r、g121s、g121t、g121v、g121w、g121y、v122a、v122p、n123d、n123i、n123l、n123r、n123y、s124i、s124l、s124r、v125c、v125g、v125w、e126g、e126v、k127c、k127r、p128a、p128r、p128s、v129a、v129m、v129p、v129s、v130f、v130i、v130y、a134t、s143t、t145m、t146n、s147r、l148a、l148f、l148g、l148i、l148t、l148v、l148w、a149l、a149m、a149t、a149v、v150a、v150i、t152m、a155v、k157n、v158e、v158h、v158k、v158w、p161a、p161g、p161q、p161s、p161v、i163f、i163n、i163q、i163t、d164g、d164n、e165g、k181r、a184t、l186m、t190a、t190s、i199v、q217k、l226m、g256c、q267h、g269s、g270m、g270s、g270y、t296s、r298h、a300t、i302v,g312v、a316v、i323m、f333l、p336l、s337c、g343d、v344a、v344g、k345e、e350k、k354m、n355d、n355i、n355k、e358g、v360a、v360g、v360k、v360r、v360s、c361n、c361r、q363k和k379m。seqidno：1的其他示例性氨基酸置换包括：d38n、d60e、p71i、p71v、n87k、s99t、a103v、g107s、l108v、l108w、v109y、r115h、i116f、n117d、n117q、g121d、g121e、g121l、g121m、g121r、g121s、g121t、g121v、g121w、g121y、v122p、n123d、n123i、n123l、n123r、n123y、s124i、s124l、v125c、v125g、v125w、e126g、k127c、k127r、p128a、p128r、p128s、v129a、v129m、v129p、v129s、v130f、v130i、v130y、a134t、s143t、t146n、a149l、a149m、a149t、a149v、v150a、k157n、v158e、v158h、v158k、v158w、i163q、d164n、q267h、g270m、g270s、g270y、k345e、n355d、v360g、v360k、v360r、v360s、c361r。本发明的工程细胞还可表达medh激活蛋白。medh激活蛋白可通过提供nad辅因子的烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide，nmn)部分的水解去除来激活medh酶。medh激活剂在镁离子存在下具有活性并且也能够使用adp-核糖(kloosterman,h.,etal.(2002)jbiolchem.277:34785-34792)。工程融合蛋白可包括基于medh激活蛋白的多肽序列，例如甲醇芽孢杆菌mga3(wp_004435441.1)和甲醇芽孢杆菌pb1(wp_004437560.1)的激活剂。本发明的工程细胞还可表达融合蛋白，该融合蛋白包括甲醇脱氢酶活性和至少一种促进甲醛固定的其他活性。例如，融合可包括促进甲醇转化为甲醛然后从甲醛转化为酮糖磷酸(例如己酮糖6-磷酸或果糖-6-磷酸)的活性。或者，例如，融合可包括促进甲醇转化为甲醛然后从甲醛转化为二羟丙酮(dha)和甘油醛-3-磷酸(g3p)，然后转化为果糖-6-磷酸的活性。包含medh的融合蛋白，其包含以下序列中的一个或多个序列：hps序列、phi序列，和/或medh激活序列(act)。这种融合的使用可促进甲醇吸收，例如通过融合将甲醛固定在酮糖磷酸化合物中的固定效率提高。示例性融合蛋白包括命名为medh-act-phi、medh-act-hps、hps-medh-act、act-medh-phi-hps、act-medh-hps-phi、hps-phi-medh-act、phi-hps-medh-act和act-medh(p1)-hps-medh(p2)的那些。这种融合蛋白描述于wo2017/075208(bartonetal.)中，其公开内容通过引用并入本文。参照图4，涉及由甲醇氧化产生的甲醛的解毒和同化的另一个示例性途径通过二羟丙酮进行。二羟丙酮合酶是转酮醇酶，它首先将糖醛基团从木酮糖-5-磷酸转移到甲醛中，从而形成二羟丙酮(dha)和甘油醛-3-磷酸(g3p)(糖酵解的中间体)。然后可通过dha激酶将从dha合酶获得的dha进一步磷酸化形成dha磷酸。dhap可被同化进入糖酵解，例如通过异构化为g3p，以及其他几种途径。或者，dha和g3p可由果糖-6-磷酸醛缩酶转化成果糖-6-磷酸(f6p)。博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)中的二羟丙酮合酶使用硫胺素焦磷酸和mg2+作为辅因子并且位于过氧化物酶体中。来自甲醇-生长羧基歧乳杆菌(分枝杆菌物种(mycobactersp.)菌株jc1dsm3803)的酶，也被发现具有dha合酶和激酶活性(roetal.,1997,jbac179(19):6041-7)。来自该生物体的dha合酶也具有与来自博伊丁假丝酵母(c.boidinii)的酶类似的辅因子要求。甲醛和木酮糖5-磷酸的kms据报道分别为1.86mm和33.3microm。其他几种分枝杆菌(仅结核分支杆菌(mycobacteriumtuberculosis)除外)可使用甲醇作为碳和能量的唯一来源，并且据报道使用二羟丙酮合酶(partetal.,2003,jbac185(1):142-7)。表9果糖-6-磷酸醛缩酶(f6p醛缩酶)可催化二羟丙酮(dha)和甘油醛-3-磷酸(g3p)的组合以形成果糖-6-磷酸。最近在大肠杆菌中发现了这种活性，并且相应的候选基因被称为fsa(schurmannandsprenger,j.biol.chem.,2001,276(14),11055-11061)。该酶具有狭窄的底物特异性，并且不能利用果糖、果糖1-磷酸、果糖1，6-二磷酸或二羟丙酮磷酸。然而，它可以使用羟基丁酮和丙酮醇来代替dha。纯化的酶显示出果糖6-磷酸裂解的vmax为7单位/mg蛋白质(在30摄氏度、50mm双甘氨肽缓冲液中ph为8.5)。对于醛醇缩合反应，发现vmax为45单位/mg的蛋白质；关于底物的km值，果糖6-磷酸为9mm，二羟丙酮为35mm，以及甘油醛3-磷酸为0.8mm。该酶优先进行醛醇形成而不是裂解反应。大肠杆菌酶对dha的选择性可通过引入点突变来提高。例如，就kcat/km而言，突变a129s将对dha的反应性提高了超过17倍(gutierrezetal.,chemcommun(camb),2011,47(20),5762-5764)。与野生型酶相比，相同的突变使对羟丙酮的催化效率降低了多于3倍，对糖醛的亲和力降低了多于3倍(castilloetal.,advancedsynthesis&catalysis,352(6),1039–1046)。通过序列同源性已经在其他基因组中发现了与fsa类似的基因。一些示例性基因候选物已在下表10中列出。表10如下所述，在dha途径中使用f6p醛缩酶具有能量优势。通过甲醇氧化形成的甲醛的同化，可通过二羟丙酮(dha)途径或核酮糖单磷酸(rump)途径进行。在rump途径中，甲醛与核酮糖-5-磷酸结合形成f6p。然后f6p通过糖酵解代谢，或用于核酮糖-5-磷酸再生，以使进一步的甲醛同化成为可能。值得注意的是，通过rump途径从甲醛和核酮糖-5-磷酸形成f6p不需要atp水解。相比之下，在dha途径中，甲醛与木酮糖-5-磷酸(x5p)结合形成二羟丙酮(dha)和甘油醛-3-磷酸(g3p)。dha和g3p中的一些必须被代谢为f6p，以使木酮糖-5-磷酸能够再生。在标准dha途径中，dha和g3p通过三种酶转化为f6p：dha激酶、果糖二磷酸醛缩酶和果糖二磷酸酶。如下所述，dha和g3p到f6p的净转化，需要atp水解。首先，以atp为代价，通过dha激酶使dha磷酸化以形成dha磷酸(dhap)。然后，将dhap和g3p通过果糖二磷酸醛缩酶合并，以形成果糖-1，6-二磷酸(fdp)。fdp通过果糖二磷酸酶转化为f6p，从而消耗高能磷酸键。如果dha合酶与f6p醛缩酶组合起作用，而不是与dha激酶、果糖二磷酸醛缩酶和果糖二磷酸酶组合，则能够实现更加atp有效的反应顺序。f6p醛缩酶使直接将dha和g3p转化为f6p成为可能，从而避免atp水解的需要。总的来说，当与f6p醛缩酶组合时，dha合酶在能量需求方面与rump途径相同。在atp需求方面，这两种甲醛同化选项(即rump途径、dha合酶+f6p醛缩酶)优于dha合酶与dha激酶、果糖二磷酸醛缩酶和果糖二磷酸酶(外源性glpx)组合。转醛醇酶(ec2.2.1.2)在戊糖-磷酸途径的代谢产物平衡中发挥作用。在大肠杆菌中有两个密切相关的由tala和talb编码的转醛醇酶基因。在大肠杆菌中，talb(转醛醇酶b；uniprotp0a867)催化景天庚酮糖7-磷酸和d-甘油醛3-磷酸向d-赤藓糖4-磷酸+d-果糖6-磷酸的相互转化。这些基因的同源物可在其他微生物中发现，包括谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)、酿酒酵母(s.cerevisiae)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。在本发明的实施方式中，用于合成甲基营养的自动催化rump循环的组成部分包括以景天庚酮糖7-磷酸(s7p)和c3甘油醛-3-磷酸(g3p)的形式从c7再生c5。根据c7化合物s7p如何生成，rump循环可能存在变体。一种是rump循环的转醛醇酶变体，其中使用转醛醇酶基因tala、talb和/或talc生成s7p。另一种变体是景天庚酮糖二磷酸酶(sbpase)变体，其中使用果糖二磷酸醛缩酶(fba)将dhap和e4p缩合为景天庚酮糖1,7-二磷酸(sbp)，然后使用由基因glpx编码的sbpase酶将其去磷酸化为s7p。参见图5和图6。尽管rump循环的转醛醇酶变体提供了超过rump循环的sbpase变体的能量优势，但sbpase变体提供了显著的热力学优势，即glpx反应具有高热力学优势。rump循环的sbpase变体的示例性候选物包括来自甲醇芽孢杆菌的fba(eij77593.1、eij77616.1)和glpx基因(zp_11548894、wp_003352248.1)。由于这种热力学优势，并且在本发明的优选方面，工程微生物包括rump循环的sbpase变体，其中外源性fba和glpx基因被过度表达，而天然的转二羟丙酮基酶基因(tala、talb、talc)被减弱或消除。参见图5和图6。这也可以与在细胞中表达的外源性gapn的引入和活性，以及任选地gapa活性的缺失或减弱相结合。在这种工程细胞中，gapn的引入可以改善rump循环代谢产物的池大小，并且以外源性fba和glpx的形式且tala、talb、talc缺失或减弱的rump循环的sbpase变体提供了热力学驱动力以实现自动催化的rump循环。在实施方式中，工程微生物可包括减弱或消除果糖-二磷酸醛缩酶的内源活性并结合有外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba2)的过表达的修饰。果糖-二磷酸醛缩酶催化果糖1，6-二磷酸转化为两种c3磷酸化合物，它们是二羟丙酮磷酸(dhap或甘油酮-磷酸)和甘油醛3-磷酸(g3p)。在大肠杆菌中，该活性由两个基因fbaa或fbab中的任一个基因催化。已知大肠杆菌fbaa和fbab被其高水平的c3产物g3p和dhap抑制。然而，根据本发明，对于合成的甲基营养，期望保持高的g3p和dhap的池大小。为了达到该平衡，工程微生物的实施方式可包括修饰以使天然果糖-二磷酸醛缩酶活性缺失或减弱和引入外源性果糖-二磷酸醛缩酶，例如来自芽孢杆菌的果糖-二磷酸醛缩酶。例如，可将来自甲醇芽孢杆菌pb1的果糖-二磷酸醛缩酶fba2或其同源物或变体引入工程微生物中。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌pb1fba2相关的fba序列，例如甲醇芽孢杆菌pb1fba2同源物或变体。例如，fba序列可与甲醇芽孢杆菌pb1fba2(seqidno：9)具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或多、90％或更多或95％或更多的同一性。这可与具有外源性gapn和减弱/缺失的gapa活性的微生物结合。可引入工程微生物中的其他示例性果糖-二磷酸醛缩酶基因列于下表11中：表11wp_003346852.1wp_066310121.1wp_042354391.1wp_098260191.1wp_003351726.1wp_095243208.1wp_019153989.1wp_045515920.1wp_101661177.1wp_079506262.1wp_101178886.1wp_076759362.1wp_038537846.1wp_066205853.1wp_098571546.1wp_063254575.1wp_057772794.1wp_053433445.1wp_070877989.1wp_044392746.1wp_053368407.1wp_101548883.1wp_066073012.1wp_088090227.1wp_026585103.1wp_102264606.1wp_090634787.1wp_016202508.1wp_102273593.1wp_063389040.1wp_029283302.1wp_098932372.1wp_101665800.1wp_053403739.1wp_066056862.1wp_098795425.1wp_066367433.1wp_066389558.1wp_071393265.1wp_046130283.1wp_101579374.1wp_009792596.1wp_069938500.1wp_075983208.1wp_077215087.1wp_066234213.1wp_047940761.1wp_078432014.1wp_053478524.1wp_053597680.1wp_107920563.1wp_071461009.1wp_027323492.1wp_009332285.1wp_098527749.1wp_031538951.1wp_066398310.1wp_101581996.1wp_066235121.1wp_026563084.1wp_075686757.1wp_090832678.1wp_059352025.1wp_006639440.1wp_024031049.1wp_046588513.1wp_046179059.1wp_006837435.1wp_080843816.1wp_043930083.1wp_102230461.1wp_050183379.1wp_057760136.1wp_015596100.1wp_066267408.1wp_046174604.1wp_066296675.1shp69806.1wp_044894355.1wp_095312127.1wp_058005248.1wp_101567317.1wp_048827259.1wp_095371563.1wp_101356082.1wp_059171825.1wp_072578145.1wp_066248707.1wp_066093948.1wp_090762628.1wp_059283615.1wp_048009440.1wp_066189121.1wp_041964633.1wp_019380596.1wp_007087445.1wp_023613550.1wp_066442299.1wp_095301761.1wp_101648384.1在实施方式中，工程微生物包括减弱或消除果糖-二磷酸醛缩酶的内源活性并引入外源性果糖-二磷酸醛缩酶的修饰。在实施方式中，工程微生物可包括引入三糖-磷酸异构酶(tpi，例如tpia)的外源活性的修饰。可引入工程微生物中的示例性三糖-磷酸异构酶基因列于下表22中：表22甲基乙二醛合酶(ec4.2.3.3)，也称为甘油酮磷酸磷酸裂解酶，是一种催化由二羟丙酮磷酸形成甲基乙二醛和磷酸的酶。在大肠杆菌中，甲基乙二醛合酶由mgsa(uniprotp0a731)编码。可选地，工程微生物可包括可减弱或消除甲基乙二醛合酶，例如大肠杆菌mgsa的活性的修饰。反过来，这可能导致二羟丙酮磷酸的池增加，而二羟丙酮磷酸又可以转化为g3p或景天庚酮糖1，7，其可以补充细胞中表达的外源性gapn的引入和活性，以及可选地gapa活性的缺失或减弱。脱氧核糖磷酸醛缩酶(ec4.1.2.4)催化乙醛与d-甘油醛3-磷酸之间的可逆醛醇缩合反应，生成2-脱氧-d-核糖5-磷酸。在大肠杆菌中，脱氧核糖磷酸醛缩酶由deoc(uniprotp0a6l0)编码。可选地，工程微生物可包括可减弱或消除脱氧核糖磷酸醛缩酶，例如大肠杆菌deoc的活性的修饰。反过来，这可能导致g3p的池增加，其可以补充细胞中表达的外源性gapn的引入和活性，以及可选地gapa活性的缺失或减弱。参照图5，在实施方式中，工程微生物可包括减弱或消除atp依赖性6-磷酸果糖激酶的内源活性的修饰。该酶可通过atp催化d-果糖6-磷酸磷酸化为果糖1，6-二磷酸。在大肠杆菌中，atp依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1由pfka编码，可以对其进行修饰以删除或减弱磷酸果糖激酶的酶活性。在实施方式中，工程微生物可包括引入外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(例如来自芽孢杆菌的atp依赖性6-磷酸果糖激酶)的修饰。例如，可将来自甲醇芽孢杆菌mga3的atp依赖性6-磷酸果糖激酶pfk2或其同源物或变体引入工程微生物中。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌mga3pfk2相关的pfk序列，例如甲醇芽孢杆菌mgapfk2同源物或变体。例如，pfk序列可与甲醇芽孢杆菌mga3pfk2(seqidno：5)具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或多、90％或更多或95％或更多的同一性。可引入工程微生物中的其他示例性atp依赖性6-磷酸果糖激酶基因列于下表12中：表12基因生物体ncbi登录号pfk嗜甲基拟无枝酸菌239aij24607.1pfk嗜热脱氮地芽孢杆菌ng80-2wp_008880861.1pfk2甲醇芽孢杆菌mga3wp_003347446.1pfkb大肠杆菌k-12mg1655np_416237.3在实施方式中，工程微生物包括减弱或消除atp依赖性6-磷酸果糖激酶的内源活性以及引入外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶的修饰。可选地，这些修饰可与外源gapn的过表达和gapa的减弱/缺失结合。参照图5，在实施方式中，工程微生物可包括减弱或消除核酮糖-磷酸3-表异构酶的内源活性的修饰。该酶可催化d-核酮糖5-磷酸向d-木酮糖5-磷酸的可逆差向异构。在大肠杆菌中，核酮糖-磷酸3-表异构酶由rpe编码，rpe可被修饰以使核酮糖-磷酸3-表异构酶活性缺失或减弱。在实施方式中，工程微生物可包括引入外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(例如来自芽孢杆菌的核酮糖-磷酸3-表异构酶)的修饰。例如，可将来自甲醇芽孢杆菌pb1的核酮糖-磷酸3-表异构酶rpe或其同源物或变体引入工程微生物中。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌mga3rpe相关的rpe序列，例如甲醇芽孢杆菌mgarpe同源物或变体。例如，rpe序列可与甲醇芽孢杆菌mga3rpe(seqidno：6)具有30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或多、85％或更多、90％或更多或95％或更多的同一性。可引入工程微生物中的示例性核酮糖-磷酸3-表异构酶基因列于下表13中：表13基因生物体ncbi登录号rpe嗜甲基拟无枝酸菌239aij24612.1rpe嗜甲基拟无枝酸菌239aij24222.1rpe甲醇芽孢杆菌mga3质粒pbm19wp_003349832.1rpe甲醇芽孢杆菌pb1wp_003352245.1rpe嗜热脱氮地芽孢杆菌ng80-2wp_008878632.1rpe鞭毛甲基小杆菌abe50737.1rpe甲基营养型嗜甲基菌atcc53528wp_018987244.1在实施方式中，工程微生物包括减弱或消除核酮糖-磷酸3-表异构酶的内源活性以及引入外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶的修饰。参照图5，在实施方式中，工程微生物可包括减弱或消除核糖-5-磷酸-异构酶的内源活性的修饰。该酶可催化核糖-5-磷酸向核酮糖5-磷酸的可逆转化。在大肠杆菌中，核糖-5-磷酸异构酶a酶由rpia编码，核糖-5-磷酸异构酶b酶由rpib编码，并且rpia和/或rpib中的一个或二者均可被修饰以使核糖-5-磷酸异构酶活性缺失或减弱。在实施方式中，工程微生物可包括引入外源性核糖-5-磷酸异构酶(例如来自芽孢杆菌的核糖-5-磷酸异构酶)的修饰。例如，可将来自甲醇芽孢杆菌pb1的核糖-5-磷酸异构酶rpib或其同源物或变体引入工程微生物中。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌mga3rpib相关的rpi序列，例如甲醇芽孢杆菌mgarpib同源物或变体。例如，rpi序列可与甲醇芽孢杆菌mga3rpib(seqidno：7)具有30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或多、85％或更多、90％或更多或95％或更多的同一性。可引入工程微生物中的示例性核糖-5-磷酸异构酶基因列于下表14中：表14基因生物体ncbi登录号rpi嗜甲基拟无枝酸菌239aij26616.1rpi嗜热脱氮地芽孢杆菌ng80-2wp_008880705.1rpi鞭毛甲基小杆菌abe48400.1rpi甲基营养型嗜甲基菌atcc53528wp_018987608.1rpib嗜甲基拟无枝酸菌239aij24621.1rpib甲醇芽孢杆菌mga3wp_003346829.1rpib甲醇芽孢杆菌pb1wp_003351746.1rpib鞭毛甲基小杆菌abe49230.1在实施方式中，工程微生物包括减弱或消除核糖-5-磷酸异构酶的内源活性以及引入外源性核糖-5-磷酸异构酶的修饰。参照图5，在实施方式中，工程微生物可包括减弱或消除转酮醇酶的内源活性的修饰。该酶可催化二碳酮醇基从景天庚酮糖-7-磷酸到甘油醛-3-磷酸的可逆转移，从而产生木酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸。在大肠杆菌中，转酮醇酶1由tkta编码，转酮醇酶2由tktb编码，并且tkta和/或tktb中的一个或二者均可被修饰以使转酮醇酶活性缺失或减弱。在实施方式中，工程微生物可包括引入外源性转酮醇酶(例如来自芽孢杆菌的转酮醇酶)的修饰。例如，可将来自甲醇芽孢杆菌pb1的转酮醇酶tkt2或其同源物或变体引入工程微生物中。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌pb1tkt2相关的tkt序列，例如甲醇芽孢杆菌pb1tkt2同源物或变体。例如，tkt序列可与甲醇芽孢杆菌pb1tkt2(seqidno：8)具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或多、90％或更多或95％或更多的同一性。可引入工程微生物中的其他示例性转酮醇酶基因列于下表15中：表15基因生物体ncbi登录号tkt嗜甲基拟无枝酸菌239aij24610.1tkt2甲醇芽孢杆菌mga3wp_003349240.1tkt甲醇芽孢杆菌mga3质粒pbm19wp_003349838.1tkt2甲醇芽孢杆菌pb1wp_003350079.1tkt甲醇芽孢杆菌pb1质粒pbm20wp_003352246.1tkt嗜热脱氮地芽孢杆菌ng80-2wp_008879527.1tkt鞭毛甲基小杆菌abe50516.1tkt甲基营养型嗜甲基菌atcc53528wp_018987341.1tkt巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)gs115xp_002490261.1tkta嗜甲基拟无枝酸菌239aij24184.1tkta1嗜甲基拟无枝酸菌239aij22337.1tkta2嗜甲基拟无枝酸菌239aij22338.1在实施方式中，工程微生物包括减弱或消除转酮醇酶的内源活性并引入外源性转酮醇酶的修饰。在一种途径中，6-磷酸果糖激酶(ec2.7.1.11)将fmp磷酸化为果糖1，6-二磷酸(fdp)。然后果糖二磷酸醛缩酶(ec4.1.2.13)将fdp裂解为二羟丙酮磷酸(dhap)和甘油醛3-磷酸。在另一途径中，葡萄糖-6-磷酸异构酶(ec5.3.1.9)将fmp异构化为葡萄糖6-磷酸(gmp)。然后葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(ec1.1.1.49)将gmp脱氢为d-葡糖酸-1，5-内酯6-磷酸，d-葡糖酸-1，5-内酯6-磷酸被6-磷酸葡糖酸内酯酶(ec3.1.1.31)进一步脱氢成6-磷酸-葡糖酸。然后磷酸葡糖酸脱水酶(ec4.2.1.12)将6-磷酸-葡萄糖酸转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸-d-葡萄糖酸(kdpg)。随后，kdpg醛缩酶(ec4.1.2.14)将kdpg裂解为甘油醛3-磷酸和丙酮酸。通过该途径形成的丙酮酸和dhap可用于合成生物分子的细胞途径。可选地，工程微生物可包括可减弱或消除khg/kdpg醛缩酶的活性的修饰。在大肠杆菌中，khg/kdpg醛缩酶由eda基因(uniprotp0a955)编码。可选地，工程微生物可包括可减弱或消除葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的活性的修饰。在大肠杆菌中，葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶由zwf基因(uniprotp0ac53)编码。由于gnd反应催化的脱羧作用，zwf基因编码的葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶反应可提供异化途径，并进而导致从甲醇的生物合成途径的未达最佳标准的收率。然而，通过zwf的异化rump途径可以为甲醛解毒提供一条途径，以平衡经由同化rump进行的甲醛同化。除了经由戊糖磷酸途径(zwf)进行甲醛异化外，细菌还具有线性甲醛异化途径，其中甲醛被氧化成甲酸，然后再到co2。该途径由大肠杆菌中的内源基因frmr、frma、frmb编码。另外，一些甲基营养菌还具有诸如fold、fhs和fdha的基因来编码用于该线性异化途径。通过戊糖磷酸途径进行甲醛异化的优势在于，其使用于rump循环的核酮糖-5-磷酸再生，并依赖rump途径(hps和phi活性)。可以通过rump循环来平衡甲醛异化和同化以促进合成的甲基营养。这可通过使由大肠杆菌中内源基因frmr、frma、frmb编码的甲醛异化的线性途径缺失或减弱或引入由来自甲醇芽孢杆菌的fold、fhs和fdha编码的外源甲醛异化途径来实现。可选地，修饰可包括大肠杆菌中内源性zwf基因的减弱或缺失。大肠杆菌中的内源性zwf被高的nadh水平和高的f6p池大小抑制。抑制可以通过用非天然调节的且对甲醛浓度有反应的外源性zwf2取代大肠杆菌的内源性zwf来解决。示例性外源基因候选物是来自甲醇芽孢杆菌pb1和mga3的zwf2。该工程微生物可表达与甲醇芽孢杆菌pb1或mga3zwf2相关的tkt序列，例如甲醇芽孢杆菌pb1或mga3zwf2同源物或变体。例如，zwf序列可与甲醇芽孢杆菌pb1或mga3zwf2(seqidno：10)具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或多、90％或更多或95％或更多的同一性。可选地，工程微生物可包括可减弱或消除内源性zwf的活性并引入来自甲醇芽孢杆菌的外源性zwf2的活性的修饰。这也可以与gapn的引入和内源性gapa活性的减弱或缺失相结合。表16zwf2甲醇芽孢杆菌mga3fba2zwf2甲醇芽孢杆菌pb1wp_003350053.1为了平衡甲醛异化和同化而引入的候选外源基因包括表17中的那些。表17基因生物体ncbi登录号fdha甲醇芽孢杆菌mga3wp_004434290.1fdhd甲醇芽孢杆菌mga3wp_004434293.1fhs甲醇芽孢杆菌mga3wp_004435057.1fold甲醇芽孢杆菌mga3wp_004435562.1乙酸激酶催化由乙酸和atp形成乙酰磷酸。大肠杆菌乙酸激酶由acka编码(skarstedtandsilverstein,j.biol.chem.251:6775-6783(1976))，并且除乙酸外还磷酸化丙酸(hesslingeretal.,mol.microbiol.27:477-492(1998))。可选地，工程微生物可包括可减弱或消除乙酸激酶活性的修饰。例如，可以使大肠杆菌乙酸acka(uniprotp0ac53)缺失或使其活性减弱。acka的缺失或减弱在各个菌株实施方式中可能是有益的，例如当磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶过表达时。由于磷酸酮醇酶形成可以转化为乙酸的乙酰磷酸，因此acka的缺失和过表达磷酸转乙酰酶可以促进所得的乙酰磷酸转化为乙酰辅酶a。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将甘油醛-3-磷酸(g3p)转化为3-磷酸甘油酸(3pg)；或(aii)与seqidno：1(甲醇芽孢杆菌gapn)具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；(2)外源性己酮糖-6-磷酸合酶(hps)；(3)外源性6-磷酸-3-己酮糖体(phi)；(4)外源性甲醇脱氢酶(medh)；和(5)外源性果糖-1，6-二磷酸酶(glpx)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；和(6)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；和(6)外源性pk；和(7)内源性甲基乙二醛合酶(mgsa)缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；和(6)内源性nad依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapa)缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性转醛醇酶活性(talb、tala和/或talc)缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk2)；和(9)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；和(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(16)内源性zwf缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；和(6)内源性gapa缺失或减弱；和(7)内源性甲基乙二醛合酶(mgsa)缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；和(8)内源性mgsa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；和(12)内源性mgsa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；和(17)内源性mgsa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；和(20)内源性mgsa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；和(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)内源性mgsa缺失或减弱；(9)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性转醛醇酶活性(talb、tala和/或talc)缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(12)内源性mgsa缺失或减弱；和(13)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；和(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gapa缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；(20)内源性mgsa缺失或减弱；和(21)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性磷酸甘油酸激酶(pgk)缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；和(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性pgk缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；和(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性pgk缺失或减弱；(7)内源性转醛醇酶活性(talb、tala和/或talc)缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(12)内源性mgsa缺失或减弱；和(13)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性pgk缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；和(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性磷酸甘油酸激酶(pgk)缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；(20)内源性mgsa缺失或减弱；和(21)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性磷酸甘油酸变位酶(gpm)缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；和(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gpm缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)内源性mgsa缺失或减弱；(9)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gpm缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(12)内源性mgsa缺失或减弱；和(13)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gpm缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；和(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性gpm缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；(20)内源性mgsa缺失或减弱；和(21)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性烯醇酶(eno)缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；和(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性eno缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)内源性mgsa缺失或减弱；(9)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性eno缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(12)内源性mgsa缺失或减弱；和(13)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性eno缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；和(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性eno缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；(20)内源性mgsa缺失或减弱；和(21)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性脱氧核糖磷酸醛缩酶(deoc)缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(9)内源性gapa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)内源性mgsa缺失或减弱；(9)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(10)内源性gapa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(12)内源性mgsa缺失或减弱；(13)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(14)内源性gapa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(19)内源性gapa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；(20)内源性mgsa缺失或减弱；(21)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(22)内源性gapa缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性脱氧核糖磷酸醛缩酶(deoc)缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(9)内源性pgk缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)内源性mgsa缺失或减弱；(9)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(10)内源性pgk缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(12)内源性mgsa缺失或减弱；(13)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(14)内源性pgk缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(19)内源性pgk缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；(20)内源性mgsa缺失或减弱；(21)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(22)内源性pgk缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性脱氧核糖磷酸醛缩酶(deoc)缺失或减弱；(7)内源性mgsa缺失或减弱；(8)外源性磷酸酮醇酶(pk)缺失或减弱；和(9)内源性gpm缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)内源性mgsa缺失或减弱；(9)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(10)内源性gpm缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)外源性转酮醇酶(tkt)；(11)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(12)内源性mgsa缺失或减弱；(13)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(14)内源性gpm缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(8)内源性rpe缺失或减弱；(9)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(10)内源性rpi缺失或减弱；(11)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(12)外源性转酮醇酶(tkt)；(13)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(14)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(19)内源性gpm缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性deoc缺失或减弱；(7)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(8)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(9)内源性pfk缺失或减弱；(10)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(11)内源性rpe缺失或减弱；(12)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(13)内源性rpi缺失或减弱；(14)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(15)外源性转酮醇酶(tkt)；(16)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(17)内源性fba缺失或减弱；(18)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(19)内源性zwf缺失或减弱；(20)内源性mgsa缺失或减弱；(21)外源性磷酸酮醇酶(pk)；和(22)内源性gpm缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源性hps；(2)外源性phi；(3)外源性medh；(4)外源性glpx；(5)内源性转醛醇酶活性(talb、tala和/或talc)缺失或减弱；(6)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk2)；和(7)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)。在一个实施方式中，工程微生物具有以下修饰：(1)外源性hps；(2)外源性phi；(3)外源性medh；(4)外源性glpx；(5)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(6)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(7)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(8)外源性转酮醇酶(tkt)；和(9)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源性hps；(2)外源性phi；(3)外源性medh；(4)外源性glpx；(5)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(6)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(7)内源性pfk缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)内源性rpe缺失或减弱；(10)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(11)内源性rpi缺失或减弱；(12)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(13)外源性转酮醇酶(tkt)；(14)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(15)内源性fba缺失或减弱；(16)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(17)内源性zwf缺失或减弱。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源性hps；(2)外源性phi；(3)外源性medh；(4)外源性glpx；(5)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(6)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfk)；(7)内源性pfk缺失或减弱；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)内源性rpe缺失或减弱；(10)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(11)内源性rpi缺失或减弱；(12)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(13)外源性转酮醇酶(tkt)；(14)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(15)内源性fba缺失或减弱；(16)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(17)内源性zwf缺失或减弱；(18)内源性mgsa缺失或减弱；和(19)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源性hps；(2)外源性phi；(3)外源性medh；(4)外源性glpx；(5)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(6)内源性mgsa缺失或减弱；(7)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物包括以下修饰：(1)外源性hps；(2)外源性phi；(3)外源性medh；(4)外源性glpx；(5)内源性转醛醇酶活性(talb、tala和/或talc)缺失或减弱；(6)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(7)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(8)外源性转酮醇酶(tkt)；(9)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(10)内源性mgsa缺失或减弱；和(11)外源性磷酸酮醇酶(pk)。在一个实施方式中，工程微生物具有以下修饰：(1)外源酶a(例如，gapn)；(2)外源性hps；(3)外源性phi；(4)外源性medh；(5)外源性glpx；(6)内源性talb、tala和/或talc缺失或减弱；(7)外源性atp依赖性6-磷酸果糖激酶(pfka和pfkb)；(8)外源性核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)；(9)内源性rpe缺失或减弱；(10)外源性核糖-5-磷酸异构酶(rpi)；(11)内源性rpi缺失或减弱；(12)内源性转酮醇酶(tkt)缺失或减弱；(13)外源性转酮醇酶(tkt)；(14)外源性果糖-二磷酸醛缩酶(fba)；(15)内源性fba缺失或减弱；(15)外源性葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(zwf)；和(16)内源性zwf缺失或减弱；(17)内源性mgsa缺失或减弱；(18)外源性磷酸酮醇酶(pk)。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，酶活性或表达可以使用公知的方法减弱。如果还原导致酶活性降至通常作用途径所需临界水平以下，则该酶的活性或量的减少可以模拟基因的完全破坏。通过各种技术降低酶活性而不使用基因破坏，对于生物的活力来说可能是重要的。导致基因破坏的相似或相同效果的降低酶活性的方法，包括但不限于：减少基因转录或翻译；使mrna、蛋白质或催化性rna失稳；以及使影响酶活或动力学的基因突变(参见，sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,thirded.,coldspringharborlaboratory,newyork(2001)；和ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwileyandsons,baltimore,md(1999))。天然的或强加的调节控制也可以实现酶的减弱，包括：启动子取代(参见wangetal.,mol.biotechnol.52(2):300-308(2012))；转录因子的缺失或改变(dietricketal.,annu.rev.biochem.79:563-590(2010)；和simicevicetal.,mol.biosyst.6(3):462-468(2010))；引入抑制性rna或肽，例如sirna、反义rna、rna或肽/小分子结合适体、核酶、核酸适配体核酶(aptazyme)和核糖开关(wielandetal.,methods56(3):351-357(2012)；o’sullivan,anal.bioanal.chem.372(1):44-48(2002)；和leeetal.,curr.opin.biotechnol.14(5):505-511(2003))；以及添加降低或破坏酶活性的药物或其他化学物质，例如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药物。本领域技术人员还将理解并认识到，酶的减弱可以在各个水平进行。例如，在基因水平上，导致部分或全部无效表型的突变，例如基因破坏，或导致掩盖基因产物活性的上位遗传效应的突变(miko,natureeducation1(1)(2008))可用于减弱酶。在基因表达水平上，减弱的方法包括：将转录偶联至内源性或外源性诱导物，例如异丙硫基-β-半乳糖苷(iptg)，然后在生产阶段期间添加少量诱导物或不添加诱导物(donovanetal.,j.ind.microbiol.16(3):145-154(1996)；和hansenetal.,curr.microbiol.36(6):341-347(1998))；引入或修饰基因的正调控因子或负调控因子；修饰整合基因的真核染色体区域中的组蛋白乙酰化/去乙酰化(yangetal.,curr.opin.genet.dev.13(2):143-153(2003)和kurdistanietal.,nat.rev.mol.cellbiol.4(4):276-284(2003))；引入转座破坏启动子或调控基因(bleykasten-brosshansetal.,c.r.biol.33(8-9):679-686(2011)；和mccueetal.,plosgenet.8(2):e1002474(2012))；翻转转座元件或启动子区域的方向，以调节相邻基因的基因表达(wangetal.,genetics120(4):875-885(1988)；hayes,annu.rev.genet.37:3-29(2003))；在二倍体生物中，缺失一个等位基因导致杂合性丧失(daigakuetal.,mutationresearch/fundamentalandmolecularmechanismsofmutagenesis600(1-2)177-183(2006))；引入增加rna降解的核酸(houseleyetal.,cell,136(4):763-776(2009))；或在细菌中，例如引入转移-信使rna(tmrna)标签，这可能导致rna降解和核糖体停滞(sunoharaetal.,rna10(3):378-386(2004)；和sunoharaetal.,j.biol.chem.279:15368-15375(2004))。在翻译水平上，减弱可以包括：引入稀有密码子以限制翻译(angov,biotechnol.j.6(6):650-659(2011))；引入阻断翻译的rna干扰分子(casteletal.,nat.rev.genet.14(2):100-112(2013)；和kawasakietal.,curr.opin.mol.ther.7(2):125-131(2005))；修饰编码序列外的区域，例如将二级结构引入非翻译区(untranslatedregion，utr)以阻断翻译或降低翻译效率(ringnéretal.,ploscomput.biol.1(7):e72(2005))；添加rna酶位点以快速降解转录物(pasquinelli,nat.rev.genet.13(4):271-282(2012)；和arraianoetal.,femsmicrobiol.rev.34(5):883-932(2010))；引入反义rna寡聚体或反义转录物(nashizawaetal.,front.biosci.17:938-958(2012))；引入rna或肽适配子、核酶、核酸适配体核酶、核糖开关(wielandetal.,methods56(3):351-357(2012)；o’sullivan,anal.bioanal.chem.372(1):44-48(2002)；和leeetal.,curr.opin.biotechnol.14(5):505-511(2003))；或引入涉及rna结构的翻译调控元件，该翻译调控元件可防止或减少翻译，这可通过存在或不存在小分子而控制(araujoetal.,comparativeandfunctionalgenomics,articleid475731,8pages(2012))。在酶定位和/或寿命水平上，酶减弱可包括：添加降解标签以加快蛋白质周转(hochstrasser,annualrev.genet.30:405-439(1996)；和yuanetal.,plosone8(4):e62529(2013))；或添加导致酶被分泌或定位到真核细胞中亚细胞区室的定位标签，在这里酶将无法与其正常底物反应(nakaietal.genomics14(4):897-911(1992)；和russelletal.,j.bact.189(21)7581-7585(2007))。在翻译后调节的水平上，酶减弱可包括：增加已知抑制剂的细胞内浓度；或修饰翻译后修饰位点(mannetal.,naturebiotech.21:255-261(2003))。在酶活水平上，酶减弱可包括：加入内源或外源抑制剂，例如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药物，以降低酶活；螯合酶活性所需的金属离子；或引入显性负突变。上述减弱技术的适用性，可取决于给定的宿主微生物有机体是否为原核生物或真核生物，并且应当理解，本领域技术人员可以容易地确定用于给定宿主的适当技术。表达载体可被构造成包括一种或多种如本文所示例的编码外源蛋白并与宿主生物体中的功能性表达控制序列可操作地连接的核酸。适用于所提供的微生物宿主生物体中的表达载体包括，例如，质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体(包括可操作用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或标记)。此外，表达载体可包括一个或多个选择性标记基因和适当的表达控制序列。也可包括选择性标记基因，其例如提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷不足，或提供培养基中不存在的重要营养物。表达控制序列可包括本领域中公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等等。外源蛋白可以与一种或多种其他可以编码用于转化中间体的酶的核酸共表达。当要共表达两个或更多个外源编码核酸时，这两种核酸可以插入到，例如，单一表达载体或分开的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列，或连接到不同的表达控制序列，例如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化可使用本领域中公知的方法来确认。这种方法包括，例如，核酸分析，如northern印迹法或mrna的聚合成酶链反应(pcr)扩增，或用于表达基因产物的免疫印迹法，或其他合适的分析方法，来测试所引入核酸序列或其对应的基因产物的表达。本领域技术人员应理解，该外源核酸表达了足够的量以产生期望的产物，且进一步理解的是，可以使用本领域中公知的和本文所公开的方法来优化表达水平，以得到充分表达。术语“外源性”意指所指的分子或所指的活性被引入到宿主微生物有机体中。可以例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质，例如通过整合入宿主染色体或作为非染色体遗传物质如质粒来引入分子。因此，该术语用于编码核酸的表达时，是指将可表达形式的编码核酸引入微生物有机体中。当用于提及生物合成活性时，该术语是指引入宿主参照生物中的活性。该来源可以是，例如，在导入宿主微生物有机体后表达所指的活性的同源性或异源性编码核酸。因此，术语“内源性”是指存在于宿主中的所指的分子或活性。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指包含在微生物有机体中的编码核酸的表达。术语“异源性”是指衍生自除所指的物种以外来源的分子或活性，而“同源性”是指衍生自宿主微生物有机体的分子或活性。相应地，编码核酸的外源表达可利用异源性或同源性编码核酸中的任一种或两种。应理解，当在微生物有机体中包括多于一种外源核酸时，该多于一种外源核酸是指所指的编码核酸或生物合成活性，如上所论述。还应理解，如本文所公开的，多于一种外源核酸可通过分开的核酸分子，或多顺反子的核酸分子或其组合引入宿主微生物有机体中，而仍然看作是多于一种外源核酸。例如，如本文所公开的，微生物可被工程改造以表达两种或更多种编码期望途径酶或蛋白质的外源核酸，例如表达本发明的外源蛋白的外源核酸，以及以及一种或多种将由甲基营养途径产生的中间体转化为所需生物产物的其他酶。在编码期望活性的两种外源核酸被引入宿主微生物有机体的情况下，应理解的是，这两种外源核酸可被引入作为单个核酸，例如在单个质粒上，在分开的质粒上，可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，而仍然被看作是两个外源核酸。类似地，应理解的是，多于两种的外源核酸可以以任何所需的组合引入宿主微生物，例如在单个质粒上，在分开的质粒上，可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，并且仍然被认为是两种或更多种外源核酸，例如三种外源核酸。因此，所指的外源核酸或生物合成活性的数目，是指编码核酸的数目或生物合成活性的数目，而不是引入宿主微生物的分开的核酸的数目。使用本领域公知的技术，包括但不限于：接合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声波转化，可以将编码外源酶的核酸序列稳定或短暂地引入宿主细胞中。可选地，对于在大肠杆菌或其他原核细胞中的外源表达，真核核酸的基因或cdna中的一些核酸序列可编码靶向信号，例如n-末端线粒体或其他靶向信号，其可以根据需要，在转化进原核宿主细胞之前去除。例如，除去线粒体前导序列，使得在大肠杆菌中的表达增加(hoffmeisteretal.,j.biol.chem.280:4329-4338(2005))。对于在酵母或其他真核细胞中的外源表达，基因可在细胞溶质中表达而无需添加前导序列，或可通过添加合适的靶向序列，例如适于宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号，来靶向线粒体或其他细胞器，或靶向用于分泌。因此，应理解的是，使核酸序列去除或包括靶向序列的适当修饰可以并入外源核酸序列中，以赋予所需性质。此外，基因可以用在本领域中公知的技术进行密码子优化，以实现蛋白质的最佳表达。术语“微生物的”、“微生物有机体”或“微生物”旨在表示作为包括在古细菌、细菌或真核生物的领域中的作为微观细胞存在的任何生物体。因此，该术语旨在涵盖具有微观尺寸的原核或真核细胞或生物体，并且包括所有种类的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物，例如酵母和真菌。该术语还包括可以培养用于生产生化产品的任何物种的细胞培养物。如本文中所讨论的，可以根据微生物有机体无法利用或能够利用诸如甲醇的c1化合物作为能量和细胞碳来源来描述微生物有机体。引入了外源酶以生成合成的甲基营养的宿主细胞可以描述为“非甲基营养型”，即未经工程改造的宿主细胞无法利用1c碳作为能源。非甲基营养型的并且可用本发明的外源酶进行工程改造的微生物包括大肠杆菌以及本文所述的其他原核和真核生物。在用于提及微生物有机体时，术语“分离的”旨在表示当所指的微生物有机体在自然界中发现时，基本上不含至少一种成分的有机体。该术语包括从其在天然环境中存在时的部分或全部成分去除的微生物。该术语还包括与其在非天然环境中存在时的部分或全部成分去除的微生物有机体。在一些方面，将编码本发明的外源酶的核酸引入受到基因破坏的细胞中。术语“基因破坏”或其语法同义表达，旨在表示使得所编码基因产物失活或减弱的基因改变。该基因改变可以是，例如，全基因的缺失、转录或翻译所需的调控序列的缺失、产生截短基因产物的基因部分的缺失，或使得编码基因产物失活或减弱的各种突变策略中的任何策略。基因破坏的一种特别有用的方法是全基因缺失，因为其降低或消除了基因回复的发生。基因破坏的表型效果可以是无效突变，这可以由许多突变类型引起，包括使点突变失活、全基因缺失和染色体片段或全染色体缺失。特异性反义核酸化合物和酶抑制剂，如抗生素，也可以产生无效突变表型，因此等效于基因破坏。代谢修饰是指从天然存在状态发生改变的生化反应。因此，微生物可以在编码代谢多肽或其功能片段的核酸上具有基因修饰。本文公开了示例性代谢修饰。本文所提供的微生物可含有稳定的基因改变，这指的是可培养超过五个世代而不丧失该改变的微生物。通常，稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰，特别是持续超过约25代的稳定修饰，更具体地，持续超过50代(包括无限期)的稳定基因修饰。本领域技术人员将理解，本文所例举的基因修饰，包括代谢修饰的描述，是相对于合适的宿主生物(如大肠杆菌及其相应的代谢反应)的合适宿主生物体或所需遗传物质(例如所需的代谢途径的基因)的合适来源微生物进行描述的。然而，鉴于各种微生物的完整基因组测序和基因组学领域的高水平技术，本领域技术人员将容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有其他微生物。例如，本文示例的大肠杆菌代谢改变可以通过从所称物种以外的物种引入相同或类似的编码核酸，而容易地应用于其他物种。这种基因改变包括例如物种同源物的基因改变，一般而言，特别是直系同源、旁系同源或非直系同源的基因替换。多种微生物可能适合并入一种或多种核酸编码蛋白，从而使细胞具有合成或增强的甲基营养。这种生物体包括原核和真核生物，包括但不限于：细菌，包括古细菌和真细菌；和真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物(包括人)。示例性的物种在美国专利公开第2014/0058056号(burgardetal.)中报道，其通过引用并入本文，包括：例如，大肠杆菌、酿酒酵母、克氏酵母(saccharomyceskluyveri)、博伊丁假丝酵母、克氏梭菌、丙酮丁醇梭杆菌、拜氏梭菌、糖多丁醇梭菌(clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、产气荚膜梭菌、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)、酪丁酸梭菌(clostridiumtyrobutyricum)、假破伤风形梭菌(clostridiumtetanomorphum)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、丙酸梭菌(clostridiumpropionicum)、氨基丁酸梭菌(clostridiumaminobutyricum)、近端梭菌(clostridiumsubterminale)、斯氏梭菌(clostridiumsticklandii)、真氧产碱杆菌(ralstoniaeutropha)、牛结核分枝杆菌(mycobacteriumbovis)、结核分支杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、arabidopsisthaliana、嗜热细菌(thermusthermophilus)、假单胞菌物种，包括绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、穴兔(oryctolaguscuniculus)、浑球红假单胞菌(rhodobacterspaeroides)、布氏热厌氧菌(thermoanaerobacterbrockii)、勤奋金属球菌(metallosphaerasedula)、肠系膜明串珠菌、橙色绿屈挠菌(chloroflexusaurantiacus)、光合玫瑰弯菌(roseiflexuscastenholzii)、赤杆菌(erythrobacter)、simmondsiachinensis，不动杆菌物种(acinetobacterspecies)，包括醋酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)和不动杆菌(acinetobacterbaylyi)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、嗜热古菌(sulfolobustokodaii)、硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、短杆菌(bacillusbrevis)、短小芽胞杆菌(bacilluspumilus)、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、小眼虫(euglenagracilis)、齿垢密螺旋体(treponemadenticola)、热醋穆尔氏菌(moorellathermoacetica)、海栖热袍菌、嗜盐菌(halobacteriumsalinarum)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)、敏捷气热菌(aeropyrumpernix)、野猪(susscrofa)、秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、发酵氨基酸球菌(acidaminococcusfermentans)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)、假丝酵母(candida)、土曲霉(aspergillusterreus)、戊糖片球菌(pedicoccuspentosaceus)、运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)、巴氏醋酸杆菌(acetobacterpasteurianus)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、巴克氏真杆菌(eubacteriumbarkeri)、多毛拟杆菌(bacteroidescapillosus)、anaerotruncuscolihominis、嗜热盐碱厌氧菌(natranaerobiusthermophilus)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、灵杆菌(serratiamarcescens)、无丙二酸柠檬酸杆菌(citrobacteramalonaticus)、黄色黏球菌(myxococcusxanthus)、具核梭杆菌(fusobacteriumnuleatum)、产黄青霉(penicilliumchrysogenum)、海洋γ-变形杆菌(marinegammaproteobacterium)、产丁酸菌(butyrate-producingbacterium)、艾阿华诺卡氏菌(nocardiaiowensis)、皮诺卡氏菌(nocardiafarcinica)、灰色链霉菌(streptomycesgriseus)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、热葡糖苷酶芽胞杆菌(geobacillusthermoglucosidasius)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、霍乱弧菌(vibriocholera)、幽门螺杆菌(heliobacterpylori)、nicotianatabacum、oryzasativa、地中海富盐菌(haloferaxmediterranei)、根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、反硝化无色杆菌(achromobacterdenitrificans)、具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)、棒状链霉菌(streptomycesclavuligenus)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、musmusculus、漆酶裂殖酵母(lachanceakluyveri)、阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis)、布氏锥虫(trypanosomabrucei)、施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)、慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、中慢生型百脉根根瘤菌(mesorhizobiumloti)、牛(bostaurus)、nicotianaglutinosa、创伤弧菌(vibriovulnificus)、反刍月形单胞菌(selenomonasruminantium)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)、闪烁古生球菌(archaeoglobusfulgidus)、死海盐盒菌、耐超高温热棒菌、包皮垢分支杆菌(mycobacteriumsmegmatis)mc2155、鸟分枝杆菌副结核亚种(mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis)k-10、海鱼分枝杆菌(mycobacteriummarinum)m、微变冢村氏菌(tsukamurellapaurometabola)dsm20162、蓝菌(cyanobium)pcc7001、盘基网柄菌(dictyosteliumdiscoideum)ax4,以及本文公开的其他示例性物种或可作为相应基因的来源生物体获得。在某些实施例中，合适的生物体包括鲍氏不动杆菌naval-82、不动杆菌物种adp1、不动杆菌物种(acinetobactersp.)菌株m-1、琥珀酸放线杆菌130z、酒色别样着色菌(allochromatiumvinosum)dsm180、嗜甲基拟无枝酸菌、arabidopsisthaliana、极小奇异菌(atopobiumparvulum)dsm20469、棕色固氮菌(azotobactervinelandii)dj、嗜碱芽孢杆菌(bacillusalcalophilus)atcc27647、孢杆菌(bacillusazotoformans)lmg9581、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)36d1、巨大芽胞杆菌、甲醇芽孢杆菌mga3、甲醇芽孢杆菌pb1、甲醇芽孢杆菌pb-1、还原硒酸芽胞杆菌(bacillusselenitireducens)mls10、氏芽孢杆菌(bacillussmithii)、枯草芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌(burkholderiacenocepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacepacia)、多噬伯克霍尔德氏菌(burkholderiamultivorans)、吡咯伯克霍尔德氏菌(burkholderiapyrrocinia)、稳定伯克霍尔德菌(burkholderiastabilis)、泰国伯克霍尔德菌(burkholderiathailandensis)e264、伯克氏菌目细菌(burkholderialesbacterium)joshi_001、产丁酸菌l2-50、弯曲杆菌(campylobacter)jejuni、白色念珠菌(candidaalbicans)、博伊丁假丝酵母、甲基念珠菌(candidamethylica)、生氢氧化碳嗜热菌(carboxydothermushydrogenoformans)、生氢氧化碳嗜热菌z-2901、茎菌物种(caulobactersp.)ap07、绿曲挠丝状菌(chloroflexusaggregans)dsm9485、橙色绿屈挠菌(chloroflexusaurantiacus)j-10-fl、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)、克氏柠檬酸杆菌(citrobacterkoseri)atccbaa-895、杨氏柠檬酸杆菌(citrobacteryoungae)、梭菌(clostridium)、丙酮丁醇梭菌、丙酮丁醇梭菌atcc824、尿酸梭菌(clostridiumacidurici)、氨丁酸梭菌(clostridiumaminobutyricum)、芦笋状梭菌(clostridiumasparagiforme)dsm15981、拜氏梭菌、拜氏梭菌ncimb8052、鲍氏梭菌(clostridiumbolteae)atccbaa-613、厌氧食气梭菌(clostridiumcarboxidivorans)p7、纤维梭菌(clostridiumcellulovorans)743b、艰难梭菌、clostridiumhiranonisdsm13275、clostridiumhylemonaedsm15053、克氏梭菌、克氏梭菌dsm555,永达尔梭菌(clostridiumljungdahli)、永达尔梭菌dsm13528、甲基戊糖梭菌(clostridiummethylpentosum)dsm5476、巴氏梭菌、巴氏梭菌dsm525、产气荚膜梭菌、产气荚膜梭菌atcc13124、产气荚膜梭菌菌株13、厌氧梭菌(clostridiumphytofermentans)isdg、糖丁基梭菌(clostridiumsaccharobutylicum)、糖多丁醇梭菌、糖多丁醇梭菌n1-4、破伤风梭菌、谷氨酸棒杆菌atcc14067、谷氨酸棒杆菌r、棒状杆菌物种u-96、变异棒杆菌(corynebacteriumvariabile)、钩虫贪铜菌n-1、蓝菌pcc7001、食烯烃脱硫酸菌(desulfatibacillumalkenivorans)ak-01、哥本哈根脱亚硫酸菌(desulfitobacteriumhafniense)、金属还原脱亚硫酸菌(desulfitobacteriummetallireducens)dsm15288、还原脱硫肠状菌(desulfotomaculumreducens)mi-1、非洲沼脱硫弧菌菌株walvisbay、食果糖脱硫弧菌jj、普通脱硫弧菌菌株(desulfovibriovulgarisstr.)hildenborough、脱硫弧菌菌株“miyazakif”、盘基网柄菌ax4、大肠杆菌、大肠杆菌k-12、大肠杆菌k-12mg1655、霍氏真杆菌(eubacteriumhallii)dsm3353、嗜冷黄杆菌(flavobacteriumfrigoris)、具核梭杆菌亚种polymorphumatcc10953、地芽孢杆菌物种y4.1mc1、嗜热脱氮地芽孢杆菌ng80-2、geobacterbemidjiensisbem、硫还原地杆菌(geobactersulfurreducens)、硫还原地杆菌pca、嗜热脂肪土芽孢杆菌dsm2334、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜热氢杆菌(hydrogenobacterthermophilus)、嗜热氢杆菌tk-6、脱氮生丝微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)atcc51888、查氏生丝微菌(hyphomicrobiumzavarzinii)、克雷伯氏菌、克雷伯氏菌亚种肺炎链球菌mgh78578、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)atcc367、肠系膜明串珠菌、梭形赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、中慢生型百脉根根瘤菌maff303099、勤奋金属球菌、乙酸甲烷八叠球菌(methanosarcinaacetivorans)、乙酸甲烷八叠球菌c2a、巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)、马氏甲烷八叠球菌(methanosarcinamazei)tuc01、海洋甲基细菌(methylobactermarinus)、扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)、扭脱甲基杆菌am1、荚膜甲基球菌、methylomonasaminofaciens、热醋穆尔氏菌、分枝杆菌物种jc1dsm3803菌株、鸟结核分支杆菌亚种类结核k-10、牛结核分枝杆菌bcg、胃分枝杆菌、海鱼分枝杆菌m、包皮垢分支杆菌、包皮垢分支杆菌mc2155、萨拉里拉氨氧化古菌(nitrosopumilussalaria)bd31、加尔加亚氨氧化古菌(nitrososphaeragargensis)ga9.2、皮诺卡氏菌ifm10152、艾阿华诺卡氏菌(物种nrrl5646)、念珠藻物种pcc7120、ogataeaangusta、ogataeaparapolymorphadl-1(多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)dl-1)、皮奥里亚芽孢杆菌(paenibacilluspeoriae)kctc3763、脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)、产黄青霉、发光菌3tck、phytofermentansisdg、巴斯德毕赤酵母、灼热嗜酸古菌(picrophilustorridus)dsm9790、牙龈卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌w83、p绿脓杆菌pa01、脱氮假单胞杆菌(pseudomonasdenitrificans)、pseudomonasknackmussii、恶臭假单胞菌、假单胞菌物种、丁香假单胞菌pv.syringaeb728a、冰岛热棒菌(pyrobaculumislandicum)dsm4184、超嗜热古生菌、强烈火球菌、掘越氏热球菌ot3、真氧产碱杆菌、真氧产碱杆菌h16、荚膜红细菌(rhodobactercapsulatus)、类球红细菌(rhodobactersphaeroides)、类球红细菌atcc17025、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、沼泽红假单胞菌cga009、沼泽红假单胞菌dx-1、深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)、深红红螺菌atcc11170、卵形瘤胃球菌(ruminococcusobeum)atcc29174、酿酒酵母、酿酒酵母s288c、肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌菌株菌株lt2、肠道沙门氏鼠伤寒菌(salmonellaentericatyphimurium)、鼠伤寒沙门氏菌、粟酒裂殖酵母、sebaldellatermitidisatcc33386、奥奈达希瓦式菌mr-1、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)1021、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌亚属灰色nbrc13350、嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)、硫磺矿硫化叶菌p-2、集胞藻菌株pcc6803、甲酸氧化互营杆菌(syntrophobacterfumaroxidans)、thaueraaromatica、高温厌氧杆菌物种(thermoanaerobactersp.)x514、超好热始原菌、嗜热高温球菌(thermococcuslitoralis)、嗜酸热原体(thermoplasmaacidophilum)、中性热变形菌(thermoproteusneutrophilus)、海栖热袍菌、桃红荚硫菌(thiocapsaroseopersicina)、tolumonasauensisdsm9187、阴道毛滴虫g3、布氏锥虫、微变冢村氏菌dsm20162、霍乱弧菌、哈氏弧菌(vibrioharveyi)atccbaa-1116、自养黄色杆菌(xanthobacterautotrophicus)py2以及中间耶尔森菌(yersiniaintermedia)。因此，具有合成或增强的甲基营养的工程细胞(该工程细胞包括：(a)外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将甘油醛-3-磷酸(g3p)转化为3-磷酸甘油酸(3pg)；(aii)与seqidno：1(甲醇芽孢杆菌gapn)具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；和(b)外源酶b，该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合)可包括期望增加一种或多种中间体或其产物的水平的一种或多种进一步的基因改变，例如插入的转基因、缺失、减弱、突变等，并且包括如美国专利公开第2014/0058056号(burgardetal)中所述的那些基因修饰，以及包括在wo2009/135074(burketal.)中所述的那些基因修饰，其公开内容通过引用并入本文。特别感兴趣的是使用丙酮酸和乙酰辅酶a作为其产物途径的入口点或前体的目标产物，部分是因为使用该新型酶的甲醇代谢途径能够使甲醇的碳固定到通向丙酮酸和乙酰辅酶a的途径中。目标产物包括：(a)1，4-丁二醇及其中间体，例如4-羟基丁酸(4-羟基丁酸酯、4-羟基丁酸盐、4-hb)；(b)丁二烯及其中间体，如1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)和3-丁烯-1-醇；(c)1，3-丁二醇及其中间体，例如2，4-戊二烯酸酯、巴豆醇或3-丁烯-1-醇；(d)己二酸、6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺和乙酰丙酸及其中间体，例如4-氨基丁酰基辅酶a；(e)甲基丙烯酸(2-甲基-2-丙烯酸)及其酯，其共同称为甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸和/或2-羟基异丁酸及其中间体；(f)1，2-丙二醇(丙烯乙二醇)、正丙醇、1，3-丙二醇和甘油及其中间体；以及(g)琥珀酸及其中间体。在一些方面，具有合成或增强的甲基营养的工程细胞(该工程细胞包括(a)外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；和(b)外源酶b，该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合)与提高1，4-丁二醇(bdo)或羟基丁酸(4-hb)的水平的产物途径一起使用。因此，本领域技术人员将理解，将本文提供的教导和指导应用于特定种类，则代谢修饰的识别可包括对直系同源物的识别和包含或失活。在编码催化相似或基本类似代谢反应的酶的参考微生物中存在旁系同源基因和/或非直系同源基因置换的情形中，本领域技术人员也可以利用这些进化相关基因。使用现在可获得的包括395种微生物基因组和各种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组的超过550种物种的完整基因组序列(其中超过一半可在公共数据文库如ncbi上找到)，对于近缘物种或远缘物种中的一个或多个基因，识别编码必要bdo或4-hb生物合成途径以及识别编码其他已知的1，3-丁二醇(13bdo)、丁二烯、6-氨基己酸(6aca)、己二胺(hmda)、己二酸或其衍生物、巴豆醇、甲基乙烯基甲醇、3-丁烯-1-醇、琥珀酸或其衍生物、正丙醇、异丙醇、丙烯、甲基丙烯酸或其衍生物的生物合成途径的基因、甲醇代谢和/或甲醛同化活性，包括例如同源物、直系同源物、旁系同源物和已知基因的非直系基因替换，以及生物体之间的基因改变的交换，这在本领域中都是常规和公知的。因此，本文参照特定生物体(例如大肠杆菌)所描述的允许生物合成各种目标产物、甲醇的代谢和/或甲醛的同化的代谢改变可容易地应用于其他微生物，同样包括原核和真核生物，该目标产物包括1，3-丁二醇(13bdo)、1，4-丁二醇(bdo)、4-hb、丁二烯、6-氨基己酸(6aca)、六甲基二胺(hmda)、己二酸或其衍生物、巴豆醇、甲基乙烯基甲醇、3-丁烯-1-醇、琥珀酸或其衍生物、正丙醇、异丙醇、丙烯、甲基丙烯酸或其衍生物。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将知晓，以一种生物体举例说明的代谢改变可同样适用于其他生物体。示例性的醇代谢途径基因，例如在美国专利公开第2014/0058056号中描述的，编码选自由以下组成的组的蛋白质：甲酸脱氢酶、甲醛活化酶、甲醛脱氢酶、s-(羟甲基)谷胱甘肽合酶、谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶、s-甲酰谷胱甘肽水解酶、甲酸氢裂解酶和氢化酶，任何酶或更多酶可以与(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达在工程细胞中，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。其他示例性醇代谢途径基因，例如在美国专利公开第2014/0058056号中描述的，编码醇代谢途径基因，该醇代谢途径基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：琥珀酰辅酶a还原酶(形成醛)、4-羟基丁酸(4-hb)脱氢酶、4-hb激酶、磷酸反式4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰辅酶a还原酶(形成醛)、1，4-丁二醇脱氢酶；琥珀酸还原酶、琥珀酰辅酶a还原酶(形成醇)、4-羟基丁酰辅酶a转移酶、4-羟基丁酰辅酶a合成酶、4-hb还原酶和4-羟基丁酰辅酶a还原酶(形成醇)、琥珀酰辅酶a转移酶和琥珀酰辅酶a合成酶，任何酶或更多酶可以与(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达在工程细胞中，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。1，4-丁二醇及其中间体，例如4-羟基丁酸(4-羟基丁酸酯、4-羟基丁酸盐、4-hb)是可以通过以本文以及以下文件中所描述的产物途径使本文所描述的(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得的目标产物，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。合适的产物途径和酶、筛选方法和分离方法可以在本文和以下文件中找到，在此引入作为参考：2008年9月25日公布的标题为“compositionsandmethodsforthebiosynthesisof1,4-butanediolanditsprecursors”的wo2008115840a2；2010年12月9日公布的标题为“processofseparatingcomponentsofafermentationbroth”的wo2010141780a1；2010年12月9日公布的标题为“microorganismsfortheproductionof1,4-butanediolandrelatedmethods”的wo2010141920a2；2010年3月18日公布的标题为“microorganismsfortheproductionof1,4-butanediol”的wo2010030711a2；2010年6月24日公布的标题为“microorganismsandmethodsforconversionofsyngasandothercarbonsourcestousefulproducts”的wo2010071697a1；2009年7月30公布的标题为“methodsandorganismsforutilizingsynthesisgasorothergaseouscarbonsourcesandmethanol”的wo2009094485a1；2009年2月19日公布的标题为“methodsandorganismsforthegrowth-coupledproductionof1,4-butanediol”的wo2009023493a1；2008年9月25日公布的标题为“compositionsandmethodsforthebiosynthesisof1,4-butanediolanditsprecursors”的wo2008115840a2；以及2013年8月27日提交的标题为“microorganismsanmethodsforenhancingtheavailabilityofreducingequivalentsinthepresenceofmethanol,andforproducing1,4-butanediolrelatedthereto”的国际申请pct/us13/56725号。丁二醇及其中间体，例如1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)和3-丁烯-1-醇，是可以通过以下文件中所描述的产物途径使本文所描述的(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得的目标产物，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。除了直接发酵生产丁二烯外，1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)和3-丁烯-1-醇可以被分离、纯化(用于任何用途)，然后在涉及基于金属的催化的第二步骤中脱水为丁二烯。合适的产物途径和酶、筛选方法和分离方法可以在以下文件中找到，在此引入作为参考：2011年11月10日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofbutadiene”的wo2011140171a2；2012年2月9日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofaromatics,2,4-pentadienoateand1,3-butadiene”的wo2012018624a2；2011年11月10日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofbutadiene”的wo2011140171a2；2013年3月21日公布的标题为“microorganismsandmethodsforproducingalkenes”的wo2013040383a1；2012年12月27日公布的标题为“microorganismsforproducingbutadieneandmethodsrelatedthereto”的wo2012177710a1；2012年8月9日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofbutadiene”的wo2012106516a1；2013年2月28日公布的标题为“microorganismsandmethodsforproducing2,4-pentadienoate,butadiene,propylene,1,3-butanediolandrelatedalcohols”的wo2013028519a1；以及美国专利公布第2015/0050708号。1，3-丁二醇及其中间体，例如2，4-戊二烯酸酯、巴豆醇或3-丁烯-1-醇是可以通过以本文以及以下文件中所描述的产物途径使本文所描述的(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得的目标产物，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。合适的产物途径和酶、筛选方法和分离方法可以在本文和以下文件中找到，在此引入作为参考：2011年1月16日公布的标题为“methodsandorganismsforconvertingsynthesisgasorothergaseouscarbonsourcesandmethanolto1,3-butanediol”的wo2011071682a1；2011年3月17日公布的标题为“microorganismsandmethodsfortheco-productionofisopropanolwithprimaryalcohols,diolsandacids”的wo2011031897a；2010年11月4日公布的标题为“organismsfortheproductionof1,3-butanediol”的wo2010127319a2；2013年5月16日公布的标题为“eukaryoticorganismsandmethodsforincreasingtheavailabilityofcytosolicacetyl-coa,andforproducing1,3-butanediol”的wo2013071226a1；2013年2月28日公布的标题为“microorganismsandmethodsforproducing2,4-pentadienoate,butadiene,propylene,1,3-butanediolandrelatedalcohols”的wo2013028519a1；2013年3月14日公布的标题为“eukaryoticorganismsandmethodsforproducing1,3-butanediol”的wo2013036764a1；2013年1月24日公布的标题为“methodsforincreasingproductyields”的wo2013012975a1；2012年12月27日公布的标题为“microorganismsforproducing1,3-butanediolandmethodsrelatedthereto”的wo2012177619a2；以及美国专利公布第2015/0050708号。己二酸、6-氨基己酸、己内酰胺、六亚甲基二胺和乙酰丙酸，及它们的中间体，例如4-氨基丁酰辅酶a，是用于例如制造尼龙聚合物的目标产物，该目标产物可以通过以本文以及以下文件中所描述的产物途径使本文所描述的(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。合适的产物途径和酶、筛选方法和分离方法可以在本文和以下文件中找到，在此引入作为参考：2010年11月11日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofadipate,hexamethylenediamineand6-aminocaproicacid”的wo2010129936a1；2013年1月24日公布的标题为“methodsforincreasingproductyields”的wo2013012975a1；2012年12月27日公布的标题为“microorganismsforproducing6-aminocaproicacid”的wo2012177721a1；2012年7月26日公布的标题为“methodsforincreasingproductyields”的wo2012099621a1；以及标题为“microorganismsanmethodsforenhancingtheavailabilityofreducingequivalentsinthepresenceofmethanol,andforproducingadipate,6-aminocaproate,hexamethylenediamineorcaprolactamrelatedthereto”的美国专利公布第2014/0329916号。甲基丙烯酸(2-甲基-2-丙酸；用于制备其酯，其酯统称为甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯，其在聚合物制造中最为突出)、甲基丙烯酸酯(例如甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸和/或2-羟基异丁酸)及它们的中间体是用于例如制造聚合物的目标产物，该目标产物可以通过以本文以及以下文件中所描述的产物途径使本文所描述的(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。合适的产物途径和酶、筛选方法和分离方法可以在本文和以下文件中找到，在此引入作为参考：2012年10月4日公布的标题为“microorganismsforproducingmethacrylicacidandmethacrylateestersandmethodsrelatedthereto”的wo2012135789a2；2009年11月5日公布的标题为“microorganismsfortheproductionofmethacrylicacid”的wo2009135074a2；以及标题为“microorganismsanmethodsforenhancingtheavailabilityofreducingequivalentsinthepresenceofmethanol,andforproducing3-hydroxyisobutyateormethacrylicacidrelatedthereto”的美国专利公布第2014/0288254号。图8示出了示例性目标产物途径，2-羟基异丁酸和甲基丙烯酸来自乙酰辅酶a/甲基丙烯酸甲酯(mma)，这可利用如本文公开的可得自甲醇同化的乙酰辅酶a，可通过以下酶进行2-羟基异丁酸和甲基丙烯酸的生产：a)乙酰辅酶a：乙酰辅酶a酰基转移酶；b)乙酰乙酰基辅酶a还原酶(酮还原)；c)3-羟基丁酰辅酶a变位酶；d)2-羟基异丁酰辅酶a脱水酶；e)甲基丙烯酰辅酶a合成酶、水解酶或转移酶；f)2-羟基异丁酰辅酶a合成酶、水解酶或转移酶。1，2-丙二醇(丙烯乙二醇)、正丙醇、1，3-丙二醇和甘油，以及它们的中间体是用于制造聚合物的目标产物，该目标产物可以通过以本文以及以下文件中所描述的产物途径使本文所描述的(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。合适的产物途径和酶、筛选方法和分离方法可以在本文和以下文件中找到，在此引入作为参考：2009年11月9日公布的标题为“primaryalcoholproducingorganisms”的wo2009111672a1；2011年3月17日公布的标题为“microorganismsandmethodsfortheco-productionofisopropanolwithprimaryalcohols,diolsandacids”的wo2011031897a1；2012年12月27日公布的标题为“microorganismsforproducingn-propanol1,3-propanediol,1,2-propanediolorglycerolandmethodsrelatedthereto”的wo2012177599a2；以及标题为“microorganismsanmethodsforenhancingtheavailabilityofreducingequivalentsinthepresenceofmethanol,andforproducing1,2-propanediol,n-propanol,1,3-propanediol,orglycerolrelatedthereto”的美国专利公布第2014/0302575号。琥珀酸及其中间体(用于生产产品，包括聚合物(例如pbs、1，4-丁二醇、四氢呋喃、吡咯烷酮)、溶剂、涂料、除冰剂、塑料、燃料添加剂、织物、地毯、颜料和洗涤剂)是目标产品，该目标产品可以通过以本文以及以下文件中所描述的产物途径使本文所描述的(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)，其中酶a能够将nadp还原为nadph；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。合适的产物途径和酶、筛选方法和分离方法可以在本文和以下文件中找到，在此引入作为参考：2008年7月2日公布的标题为“methodsandorganismsforthegrowth-coupledproductionofsuccinate”的ep1937821a2；和标题为“microorganismsandmethodsforenhancingtheavailabilityofreducingequivalentsinthepresenceofmethanol,andforproducingsuccinaterelatedthereto”的美国专利公布第2014/0302575号。本文描述的从宿主细胞获得的目标产物以及适合在宿主细胞中产生的产物途径包括以下(该宿主细胞共表达(a)外源酶a和(b)外源酶b，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合)：丁二醇及其中间体，例如1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)和3-丁烯-1-醇，是可以通过以下文件中所描述的产物途径使(a)外源酶a和(b)外源酶b共表达制得的目标产物，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。除了直接发酵生产丁二烯外，1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)和3-丁烯-1-醇可以被分离、纯化(用于任何用途)，然后在涉及基于金属的催化的第二步骤中脱水为丁二烯。合适的产物途径和酶，筛选方法和分离方法，可以在以下文件中找到：2011年11月10日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofbutadiene”的wo2011140171a2；2012年2月9日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofaromatics,4-pentadienoateand1-butadiene”的wo2012018624a2；2011年11月10日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofbutadiene”的wo2011140171a2；2013年3月21日公布的标题为“microorganismsandmethodsforproducingalkenes”的wo2013040383a1；2012年12月27日公布的标题为“microorganismsforproducingbutadieneandmethodsrelatedthereto”的wo2012177710a1；2012年8月9日公布的标题为“microorganismsandmethodsforthebiosynthesisofbutadiene”的wo2012106516a1；2013年2月28日公布的标题为“microorganismsandmethodsforproducing2,4-pentadienoate,butadiene,propylene,1,3-butanediolandrelatedalcohols”的wo2013028519a1；以及美国专利公布第2015/0050708号。用于将从乙酰辅酶a、琥珀酸盐和琥珀酰辅酶a到各种产物(例如bdo)的途径工程改造到微生物中的酶、基因和方法是目前本领域公知的(参见，例如，美国公布第2011/0201089号)。一组bdo途径酶代表一组可将琥珀酸盐或α-酮戊二酸转化为bdo的酶，如图7所示。例如，bdo可以从琥珀酰辅酶a通过以前公开的途径产生(参见例如，burketal.,wo2008/115840)。图7示出了可以使用如本文所述的通过使用甲醇作为碳源可制备的初级代谢产物(例如乙酰辅酶a)的示例性途径。如图7所示，生物体包含至少一种编码表达量足以生产bdo的bdo途径酶的外源核酸。在某些实施方式中，bdo途径酶选自由以下组成的组：(1)琥珀酰辅酶a合成酶；(2)辅酶a非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(3)α-酮戊二酸脱氢酶；(4)谷氨酸：琥珀酸半醛转氨酶；(5)谷氨酸脱羧酶；(6)辅酶a依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(7)4-羟基丁酸酯脱氢酶；(8)α-酮戊二酸脱羧酶；(9)4-羟基丁酰辅酶a：乙酰辅酶a转移酶；(10)丁酸激酶；(11)磷酸转丁酰基酶；(12)醛脱氢酶；和(13)醇脱氢酶。优选的途径包括从α-酮戊二酸开始的途径，例如，步骤8、7、9、12和13；步骤3、6、7、9、12和13；以及步骤1、6、7、9、12、13。或者，单个蛋白可包含步骤12和步骤13的活性。例如，可在wo2008115840中找到具体的酶、酶的种类和酶的来源及其基因。在一些实施方式中，本发明提供生物体，该生物体包括：(a)外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；和(b)外源酶b，该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合，并且该生物体被工程改造以提高还原当量的可用性，其可用于生产目标产物分子。本领域技术人员将知晓，任何在其生产中利用还原当量的产物分子均可以通过其他生物合成途径显示出增加的产量。在许多工程改造的途径中，基于碳水化合物原料实现最大产物产量，因还原当量不足或还原当量损失为副产物而受到阻碍。甲醇是相对廉价的有机原料，其可通过使用(a)外源酶a和(b)外源酶b，以及一种或多种代谢酶，来用于产生还原当量，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。通过甲醇代谢产生的还原当量随后可用于驱动葡萄糖进入bdo生产途径，例如，如图7所示。图7示出了可以使用如本文所述的通过使用甲醇作为碳源可获得的初级代谢产物(例如乙酰辅酶a)的示例性途径。如图7所示，生物体包含至少一种编码表达量足以生产bdo的bdo途径酶的外源核酸。在某些实施方式中，bdo途径酶选自由以下组成的组：(1)琥珀酰辅酶a合成酶；(2)辅酶a非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(3)α-酮戊二酸脱氢酶；(4)谷氨酸：琥珀酸半醛转氨酶；(5)谷氨酸脱羧酶；(6)辅酶a依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(7)4-羟基丁酸酯脱氢酶；(8)α-酮戊二酸脱羧酶；(9)4-羟基丁酰辅酶a：乙酰辅酶a转移酶；(10)丁酸激酶；(11)磷酸转丁酰基酶；(12)醛脱氢酶；和(13)醇脱氢酶。优选的途径包括从α-酮戊二酸开始的途径，例如，步骤8、7、9、12和13；步骤3、6、7、9、12和13；以及步骤1、6、7、9、12、13。或者，单个蛋白可包含步骤12和步骤13的活性。例如，可在wo2008115840a2中找到具体的酶、酶的种类和酶的来源及其基因。用于将从琥珀酸盐和琥珀酰辅酶a到各种产物(例如bdo)的途径工程改造到微生物中的酶、基因和方法是目前本领域公知的(参见，例如，美国公布第2011/0201089号)。一组bdo途径酶代表一组可以将琥珀酸盐或α-酮戊二酸转化为bdo的酶，如图7所示。如本文所公开的从medh途径获得的额外还原当量，在利用基于碳水化合物的原料时，提高所有这些产物的产量。例如，bdo可以从琥珀酰辅酶a通过以前公开的途径产生(参见例如，burketal.,wo2008/115840)。在其他实施方式中，本文提供的生物体单独或与bdo或甲基丙烯酸途径组合可以进一步包括第二甲醛同化途径(formaldehydeassimilationpathway，fap)，该生物体包括：(a)外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；和(b)外源酶b，该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合。第二fap还可以利用甲醛(例如未被主要途径利用的甲醛)形成可用于例如生物质形成的某些中心代谢途径的中间体。参考图4，在第二甲醛同化途径中，生物体包含至少一种编码甲醛同化途径酶的外源核酸，该甲醛同化途径酶不同于gapn、己酮糖-6-磷酸合酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶和磷酸酮醇酶蛋白。第二甲醛同化途径的酶可以以足量表达以产生可用于形成生物质的糖酵解和/或代谢途径的中间体。在一个实施方式中，第二甲醛同化途径酶足量表达以产生糖酵解中间体。在另一个实施方式中，第二甲醛同化途径酶足量表达以产生可用于形成生物质的代谢途径的中间体。在一些实施方式中，第二甲醛同化途径包含二羟丙酮(dha)合酶或dha激酶。优选的dha途径是图4中的dha途径1，其是dha(二羟丙酮)合酶的组合，例如ec2.2.1.3(步骤6)和f6p(果糖-6-磷酸)醛缩酶(步骤7)。在一个实施方式中，中间体是dha、dha磷酸盐或其组合。在某些实施方式中，生物体包含两种外源核酸，各自核酸编码第二甲醛同化途径酶。除了这样的酶的工程微生物细胞外，细胞还可以具有通过二羟丙酮(dha)进行的途径：具有(a)外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；和(b)外源酶b，该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合)。rump途径和dha途径的酶都可以用于甲醛的解毒和同化。如图4所示，转酮醇酶首先将糖醛基团从木酮糖-5-磷酸转移到甲醛中(步骤6，图4)，导致形成dha和g3p，该dha和g3p是糖酵解中的中间体。然后将从dha合酶获得的dha进一步磷酸化以通过dha激酶形成dha磷酸(dhap)。dhap可被同化进入糖酵解以及其他几种途径。可选地，dha和g3p可由果糖-6-磷酸醛缩酶转化成果糖-6-磷酸(f6p)(图4，步骤7)。在一些实施方式中，除了这样的细胞，细胞还可以具有如图4中所描绘的通过己糖-6-磷酸(h6p)进行的途径：具有(a)外源酶a，该外源酶a：(ai)能够将g3p转化为3pg；(aii)与seqidno：1具有至少50％的序列同一性，其中酶a能够将nadp还原为nadph；或(aiii)是果糖-1，6-二磷酸酶；或(ai)和(aii)；或(aii)和(aiii)；和(b)外源酶b，该外源酶b为：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任意组合)。通过己糖-6-磷酸(h6p)进行的途径可任选使用medh。例如，本发明的工程细胞可包括dha途径的medh酶和rump途径的medh酶，其可以用于甲醛的解毒和同化。本领域技术人员将理解，可以对生物体进行工程改造使该得在碳源(例如单独的甲醇或与其他碳水化合物组合)上生长时分泌生物合成的化合物。这种化合物包括，例如，甲基丙烯酸、bdo，以及甲基丙烯酸或bdo途径中的任何中间代谢产物。所需要的只是对一个或多个所需的酶或蛋白质的活性进行工程改造，以实现所需的化合物或其中间体的生物合成，包括，例如，包括甲基丙烯酸或bdo生物合成途径中的一些或全部途径。因此，本文提供的是一种生物体，该生物体在碳水化合物或其他碳源上生长时产生和/或分泌甲基丙烯酸或bdo，和/或在碳水化合物或其他碳源上生长时产生和/或分泌在产物途径中所示的任何中间代谢产物。本文所提供的产生甲基丙烯酸或bdo的微生物有机体可从中间体开始合成。这同样适用于甲醛同化中的中间体。在一个实施方式中，碳源为甲醇或甲酸盐。在某些实施方式中，使用甲醇作为碳源。在其他实施方式中，使用甲酸盐作为碳源。在特定的实施方式中，在本文所提供的生物体中，单独使用甲醇作为碳源，或甲醇与本文所提供的产物途径组合作为碳源。在一个实施方式中，碳源包括甲醇，和糖(例如，葡萄糖)或含糖生物质。在另一个实施方式中，碳源包括甲酸盐、和糖(例如，葡萄糖)或含糖生物质。在一个实施方式中，碳源包括甲醇、甲酸盐，和糖(例如，葡萄糖)或含糖生物质。在特定的实施方式中，在发酵原料中，提供甲醇或甲酸盐或两者，与糖(例如，葡萄糖)或含糖生物质作为混合物。在某些实施方式中，提供糖用于菌株充分生长。在一些实施方式中，以200：1至1：200的甲醇：糖的摩尔浓度比来提供糖(例如，葡萄糖)。在某些实施方式中，碳源包括甲酸盐和糖(例如，葡萄糖)。在一些实施方式中，以200：1至1：200的甲酸盐：糖的摩尔浓度比来提供糖(例如，葡萄糖)。在某些实施方式中，碳源包括甲醇和甲酸盐、以及糖(例如，葡萄糖)的混合物。在某些实施方式中，提供糖用于菌株充分生长。在一些实施方式中，以200：1至1：200的甲醇：甲酸盐的摩尔浓度比来提供糖(例如，葡萄糖)。可以使用公知的方法进行合适的纯化和/或试验，以测试例如甲基丙烯酸或bdo的生产。对于每一种待测试的工程菌株，可以使合适的重复样(例如一式三份的培养物)生长。例如，可以监控工程化生产宿主中的产物和副产物的形成。最终产物和中间体，以及其他有机化合物，可通过如hplc(高效液相色谱)、gc-ms(气相色谱-质谱)和lc-ms(液相色谱-质谱)或其他使用在本领域中公知的常规程序的合适分析方法来进行分析。还可以用培养物上清液来测试产物在发酵液中的释放。副产物和残余的葡萄糖可以通过hplc来量化，例如，对于葡萄糖和醇使用折光率检测器，以及对于有机酸使用uv检测器(linetal.,biotechnol.bioeng.90:775-779(2005))，或在本领域中公知的其他合适的试验和检测方法。来自外源dna序列的各个酶或蛋白质活性，也可以使用本领域中公知的方法测定。甲基丙烯酸或bdo或其他目标分子可以使用多种本领域中公知的方法从培养物的其他成分中分离。这种分离方法包括，例如，萃取程序，以及包括连续液-液萃取、渗透蒸发、蒸发、过滤、膜过滤(包括反渗透、纳米过滤、超滤和微滤)、膜透滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、萃取蒸馏、反应性蒸馏、共沸蒸馏、结晶和重结晶、离心、萃取过滤、离子交换层析、尺寸排阻层析、吸附层析、碳吸附、氢化和超滤在内的方法。所有上述方法在本领域中是公知的。目标分子隔离工艺的实施例包括：对于13bdo、14bdo、丁二烯、甲基乙烯基甲醇、3-丁烯-1-醇、正丙醇、异丙醇、丙烯和巴豆醇使用蒸馏；对于6aca(可选地，其可转化为己内酰胺，然后以通过蒸馏进行纯化作为最终步骤)、hmda、己二酸或其衍生物、琥珀酸或其衍生物使用结晶；或对于甲基丙烯酸或其衍生物使用结晶、蒸馏或萃取中的任一种。目标分子例如13bdo、14bdo、丁二烯、甲基乙烯基甲醇、正丙醇、异丙醇、丙二醇、巴豆醇；3-丁烯-1-醇、6aca、hmda、己二酸或其衍生物、琥珀酸或其衍生物，或甲基丙烯酸或其衍生物，是在商业和工业应用中使用的化学品。在一些实施方式中，bdo和/或4-hb用于各种商业和工业应用中。这种应用的非限制性实施例包括生产塑料、弹性纤维、聚氨酯、聚酯(包括聚羟基脂肪酸酯，例如p4hb或其共聚物)、ptmeg和聚氨酯-聚脲共聚物(称为氨纶(spandex))、弹性纤维或者lycratm、尼龙等。此外，bdo和/或4-hb也在广泛产物生产中用作原料，该广泛产物包括塑料、弹性纤维、聚氨酯、聚酯(包括聚羟基脂肪酸酯，例如p4hb或其共聚物)、ptmeg和聚氨酯-聚脲共聚物(称为氨纶)、弹性纤维或者lycratm、尼龙等。因此，在一些实施方式中，提供了生物基的塑料、弹性纤维、聚氨酯、聚酯(包括聚羟基脂肪酸酯，例如p4hb或其共聚物)、ptmeg和聚氨酯-聚脲共聚物(称为氨纶)、弹性纤维或者lycratm、尼龙等，其包含一种或多种由本文所提供的生物体或使用本文所公开的方法而产生的生物衍生bdo和/或4-hb或其生物衍生bdo和/或4-hb中间体。如本文所用的术语“生物衍生”，意指衍生自生物有机体或由生物有机体合成，并可以看作是可再生的资源，因为其可以由生物有机体产生。这种生物有机体，特别是本文所公开的微生物有机体，可利用原料或生物质，例如，从农业、植物、细菌或动物来源获得的糖或碳水化合物。可选地，生物有机体可利用大气中的碳。如本文中所使用的术语“生物基”意指全部或部分由本发明的生物衍生化合物组成的产物。生物基或生物衍生的产物与石油衍生的产物相反，其中石油衍生的产物衍生自或合成自石油或石化原料。在一些实施方式中，本文提供了包含生物衍生bdo的培养基。在一些实施方式中，生物衍生bdo是通过培养本文所提供的生物体产生的，该生物体具有：酶a，该酶a能够将nadp还原为nadph；和(b)外源酶b，该外源酶b是：(bi)己酮糖-6-磷酸合酶；(bii)6-磷酸-3-己酮糖异构酶；(biii)磷酸酮醇酶；或(bi)、(bii)和(biii)的任何组合；以及bdo途径。在某些实施方式中，生物衍生bdo的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率反映了大气二氧化碳摄取源。在一个实施方式中，培养基分离自具有融合蛋白和bdo途径的生物体。在其他实施方式中，本文提供了一种生物衍生bdo。在一些实施方式中，该生物衍生bdo是通过培养本文所提供的具有融合蛋白和bdo途径的生物体产生的。在一些实施方式中，该生物衍生bdo的fm值为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。在某些实施方式中，该生物衍生bdo是培养基的组分。在某些实施方式中，本文提供了包含本文所提供的生物衍生bdo的组合物，例如，通过培养本文所提供的具有mdh融合蛋白和bdop(bdo途径)的生物体产生的生物衍生bdo。在一些实施方式中，该组合物进一步包括除所述生物衍生bdo以外的化合物。在某些实施方式中，除所述生物衍生bdo以外的化合物是微量的本文所提供的具有融合蛋白和bdo途径的生物体的细胞部分。在一些实施方式中，本文提供包含本文提供的生物衍生bdo的生物基产物。在某些实施方式中，该生物基产物是塑料、弹性纤维、聚氨酯、聚酯、聚羟基脂肪酸酯、聚-4-hb、聚-4-hb共聚物、聚(四亚甲基醚)二醇、聚氨酯-聚脲共聚物、氨纶、弹性纤维、lycratm或尼龙。在某些实施方式中，该生物基产物包含至少5％的生物衍生bdo。在某些实施方式中，该生物基产物为：(i)聚合物，thf或thf衍生物，或gbl或gbl衍生物；(ii)塑料、弹性纤维、聚氨酯、聚酯、聚羟基脂肪酸酯、聚-4-hb、聚-4-hb共聚物、聚(四亚甲基醚)二醇、聚氨酯-聚脲共聚物、氨纶、弹性纤维、lycratm或尼龙；(iii)聚合物，树脂、纤维、珠粒、颗粒、丸粒、薄片、塑料、聚酯、热塑性聚酯、模塑制品、注射模塑制品、注射模塑部件、汽车部件、挤出树脂、电气部件和外壳；并且可选地其中对生物基产物进行增强或填充，以及进一步地，其中对生物基产物进行玻璃增强或填充或矿物增强或填充；(iv)聚合物，其中该聚合物包括pbt；(v)聚合物，其中该聚合物包括pbt，并且该生物基产物为树脂、纤维、珠粒、颗粒、丸粒、薄片、塑料、聚酯、热塑性聚酯、模塑制品、注射模塑制品、注射模塑部件、汽车部件、挤出树脂、电气部件和外壳；并且可选地其中对该生物基产物进行增强或填充，以及进一步地，其中对生物基产物进行玻璃增强或填充或矿物增强或填充；(vi)thf或thf衍生物，其中thf衍生物是聚四亚甲基醚二醇(ptmeg)、聚酯醚(cope)或热塑性聚氨酯；(viii)thf衍生物，其中thf衍生物包括纤维；或(ix)gbl或gbl衍生物，其中gbl衍生物是吡咯烷酮。在某些实施方式中，生物基产物包含至少10％的生物衍生bdo。在一些实施方式中，生物基产物包含至少20％的生物衍生bdo。在其他实施方式中，生物基产物包含至少30％的生物衍生bdo。在一些实施方式中，生物基产物包含至少40％的生物衍生bdo。在其他实施方式中，生物基产物包含至少50％的生物衍生bdo。在一个实施方式中，生物基产物包括所述生物衍生bdo的一部分作为重复单元。在另一个实施方式中，本文提供了通过模制本文提供的生物基产物而获得的模制产品。在其他实施方式中，本文提供的是用于生产本文提供的生物基产物的方法，包括使所述生物衍生bdo与自身或另一种化合物，在产生所述生物基产物的反应中发生化学反应。在某些实施方式中，本文提供包含生物衍生bdo或通过转化生物衍生bdo得到的聚合物。在其他实施方式中，本文提供了一种用于生产聚合物的方法，包括将生物衍生bdo化学地或酶促地转化为聚合物。仍在其它实施方式中，本文提供包含生物衍生bdo或其细胞裂解物或培养物上清液的组合物。bdo是用于生产高性能聚合物、溶剂和精细化学品的宝贵化学品。它是用于生产其他高价值化学品，例如四氢呋喃(thf)和γ-丁内酯(gbl)的基础。该价值链由三个主要部分组成，包括：(1)聚合物；(2)thf衍生物；和(3)gbl衍生物。在聚合物的情形中，bdo是用于生产聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)的共聚单体。pbt是用于汽车、电器、供水系统以及小家电的中等性能的热塑性工程塑料。转化为thf，并随后转化为聚四亚甲基醚二醇(ptmeg)，提供了用于制造氨纶产物，例如纤维的中间体。在特种聚酯醚(cope)的生产中，ptmeg还与bdo结合。cope是具有优异的机械性能和油/环境抗性的高模量弹性体，能够在高温和低温极限下操作。ptmeg和bdo也使得热塑性聚氨酯在标准的热塑性挤出、压延和成型设备中加工，并且其具有出色的韧性和耐磨性特征。从bdo产生的gbl为制备吡咯烷酮以及服务于农用化学品市场提供了原料。吡咯烷酮作为高性能溶剂用于使用越来越多的提取工艺中，包括例如在电子工业和制药生产中。因此，本文中提供的是根据本文描述的方法产生的生物衍生bdo和包括生物衍生bdo或使用生物衍生bdo而获得的生物基产物。在一些实施方式中，碳质原料及其他细胞摄取源，例如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物及其他卤素，可以选择为改变存在于bdo和/或4-hb或任何bdo和/或4-hb途径中间体中的原子的同位素分布。如上列举的各种碳原料和其他摄取源，将在本文中统称为“摄取源”。摄取源可以为任何存在于产物bdo和/或4-hb或bdo和/或4-hb途径中间体中的原子，或为偏离bdo和/或4-hb途径的反应中产生的副产物，提供同位素富集。可以在任何目标原子中实现同位素富集，例如，碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯或其它卤素。这同样适用于本文所提供的mmp和fap，及其中间体。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变碳-12、碳-13、碳-14的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氧-16、氧-17和氧-18的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氢、氘和氚的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氮-14和氮-15的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变硫-32、硫-33、硫-34，以及硫-35的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变磷-31、磷-32和磷-33的比率。在一些实施方式中，可以选择摄取源以改变氯-35、氯-36和氯-37的比率。在一些实施方式中，目标原子的同位素比率可以通过选择一个或多个摄取源来改变为所需的比例。摄取源可以从天然来源得到，如在自然界中发现，或从人造来源得到，且本领域技术人员可选择天然来源、人造来源，或其组合，以得到所需的目标原子同位素比率。人造摄取源的一个例子包括，例如，至少部分衍生自化学合成反应的摄取源。这种同位素富集的摄取源，可商购获得，或在实验室中制备和/或可选地与天然来源的摄取源混合，以获得所需的同位素比率。在一些实施方式中，可通过选择自然界中发现的摄取源的期望来源，来获得摄取源的目标同位素比率。例如，如本文所讨论的，天然来源可以是从生物有机体或来源(例如基于石油的产品或大气)衍生或合成得到的生物基。在一些这种实施方式中，碳的来源，例如，可选自化石燃料碳源(其碳-14可以相对贫乏)，或环境或大气碳源，例如co2，其可具有比其石油衍生对应物更多的碳-14。同位素富集容易通过使用本领域中已知的技术进行质谱分析来评估，例如稳定同位素比率质谱法(stableisotoperatiomassspectrometry，sirms)和核磁共振位点特异性天然同位素分馏(site-specificnaturalisotopicfractionationbynuclearmagneticresonance，snif-nmr)。这种质谱技术可以与分离技术，例如液相色谱(liquidchromatographylc)和/或高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)组合使用。因此，在一些实施方式中，提供了bdo和/或4-hb或bdo和/或其4-hb途径中间体，其具有的碳-12、碳-13、碳-14比率，其反映出大气中的碳(也称环境碳)摄取源。此外，本发明部分涉及如本文所公开的生物产生的bdo和/或4-hb或其bdo和/或4-hb中间体，以及由此衍生的产物，其中该bdo和/或4-hb或其bdo和/或4-hb中间体的碳-12、碳-13、碳-14同位素比率与环境中出现的co2具有大约相同的值。本领域技术人员将理解，可以对生物体进行工程改造使得在碳源(例如单独的甲醇或与其他碳水化合物组合)上生长时分泌生物合成的化合物。这种化合物包括，例如，bdo和任何bdop中间代谢产物。所需要的只是对所需的酶或蛋白质活性中的一个或多个进行工程改造，以实现所需的化合物或其中间体的生物合成，包括，例如，包括bdo生物合成途径中的一些或全部途径。因此，本文提供的是一种生物体，该生物体在碳水化合物或其他碳源上生长时产生和/或分泌bdo，和/或在碳水化合物或其他碳源上生长时产生和/或分泌在bdop中所示的任何中间代谢产物。本文所提供的产生bdo的微生物有机体可从中间体开始合成。这同样适用于甲醛同化中的中间体。实施例1-gapn与gapa动力学对比对大肠杆菌gapa和甲醇芽孢杆菌gapn的催化常数进行了测定并在表18中示出。表18.实施例2-由于gapn表达获得细胞内代谢产物谱大肠杆菌菌株的细胞内代谢产物谱，其中甲醇芽孢杆菌gapn酶(登录号wp_003351798；与seqid：1具有95％id)与己酮糖-6-磷酸合酶(hps)(seqid：2)共同表达，将6-磷酸-3-己酮糖异构酶(phi)(seqid：3)与表达gapa并表达相同hps和phi酶的菌株进行比较。该菌株也缺失gapa，表达甲醇脱氢酶，并表达来自甲醇芽孢杆菌的fba、glpx、rpe和tktt。与具有gapa表达而无gapn的菌株相比，gapn的表达导致相关rump循环代谢产物的代谢产物水平增加。这表明gapn表达对于rump循环活性和甲基营养的益处。表19示出了与甲基营养有关的并甲基营养所需要的关键rump循环代谢产物增加的倍数变化。表19：与gapa菌株相比，gapn菌株的rump循环代谢产物的倍数变化增加代谢产物与gapa菌株相比，gapn菌株的倍数变化增加果糖-6-磷酸1.83果糖-1，6-二磷酸14.86甘油醛-3-磷酸1.41二羟丙酮磷酸1.41景天庚酮糖-1，7-二磷酸13.93景天庚酮糖-7-磷酸2.07核酮糖-5-磷酸1.85实施例3-在培养物中示出合成的甲基营养大肠杆菌菌株(gapn的过表达(登录号wp_003351798；与seqid：1具有95％id)，gapa缺失，表达其他酶，甲醇脱氢酶，hps(seqid：2)，phi(seqid：3)，fba，glpx，tkt)及其表达gapa的亲本菌株在含有葡萄糖和甲醇的恒化培养基中培养。恒化生物反应器以分批培养模式启动，并在有氧条件下操作，以葡萄糖为碳源，温度控制在35摄氏度，溶氧控制在20％以上，同时改变气流并且搅拌。通过在必要时自动添加碱或酸将ph恒定控制在6.95。通过以0.1h-1的稀释率作为目标，以含有甲醇作为唯一碳源的培养基进行给料，连续操作发酵罐，来进行向甲醇生长期的转变。在葡萄糖耗尽之前开始甲醇进料，并且仅在残留葡萄糖被完全消耗之后才测量甲醇生长动力学。通过使用分光光度计测量培养物的600nm光密度来监测发酵过程中的细胞生长。当进料转变为唯一甲醇碳源时，具有gapa但没有gapn的菌株没有显示出生长，而表达gapn的菌株展示出在甲醇上生长了30小时。具有gapa的菌株的稀释模式符合无生长的预期(图10a)，而gapn菌株展示出合成的甲基营养(图10b)。该菌株的观察到的生长速率在图10c中示出。此外，通过13c-甲醇计算的细胞内通量分布通过存在多个完全13c-标记的rump循环代谢产物而证实了完整的rump循环的活性(数据未显示)。另外，上述表达可选的hps(与seqid：2具有41％id；登录号为wp_054009748.1)和phi(与seqid：3具有33％id；登录号wp_012298822.1)的gapn表达大肠杆菌菌株也由甲醛消耗以及来自13c-甲醇的完全标记的rump循环代谢产物证明了完整的rump循环活性。实施例4-fba、fba2、glpx的过表达图11示出了glpx(登录号：wp_003352248.1)过表达对合成的甲基营养的影响，其中与亲本菌株相比，质粒上表达了另外的glpx的菌株展示出在没有其他碳源的情况下甲醛消耗增加。通过fba(登录号：eij77616.1)、fba2(登录号：eij80286.1)和tkt(登录号：eij77615.1)的额外表达，进一步提高了甲醛消耗率。使用nash测定法测量的甲醛消耗可作为测量rump循环活性的代替。为了测量甲醛消耗，使细菌细胞在luria肉汤和2％葡萄糖中于35摄氏度在2ml的24深孔板中生长5.5小时。随后将细胞转移至含有2％葡萄糖和4mmmgso4的基本培养基中，并在2ml的48深孔板中生长过夜。将细胞标准化至od0.5，并将其重悬于1.2ml的24深孔板中的基本培养基(含有2％葡萄糖、4mmmgso4和1mm甲醛)中。取样并以最大rpm离心10分钟。将75ulnashb试剂添加到75ul上清液中，在96孔costar板中混合，并在37摄氏度下孵育40分钟。在412nm测量吸光度值以获得甲醛浓度。实施例5-talabc缺失如本文所讨论的，通过rump循环的碳通量存在两种可能的途径，即通过转醛醇酶(talabc)或由fba和glpx编码的sbpase。rump循环的使用转醛醇酶的变体产生了热力学上坡，以生成临界景天庚酮糖-7-磷酸，标准δg为0.7kj/mol，而相反，使用sbpase的变体使用glpx反应，该反应为景天庚酮糖-7-磷酸的生成提供了非常显著的热力学优势(标准δg为-35.3kj/mol)。为了完成rump循环并从甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸再生核酮糖5-磷酸，由fba(例如，登录号eij77616.1)和glpx(例如，登录号wp_003352248.1)提供sbpase变体的热力学优势可能是关键的。通过从天然甲基营养菌(甲醇芽孢杆菌)以及表达gapn(与seqid：1具有95％id；登录号wp_003351798)、hps(seqid：2)、phi(seqid：3)的工程化大肠杆菌中测量的细胞内代谢物水平计算的δg'进一步强调了这一点的重要性。在存在转醛醇酶(talabc)的情况下，热力学是非常不利的，而在talabc的缺失以及glpx和fba的过表达的情况下，则显示出更好的热力学(表20)。表20：从甲醇芽孢杆菌和工程化大肠杆菌的测量的细胞内代谢物水平计算的吉布斯自由能。δg’(kj/mol)甲醇芽孢杆菌具有gapn的工程化大肠杆菌经由转醛醇酶的rump1928经由fba&glpx的rump-17-2(talabc缺失)实施例6-从甲醇芽孢杆菌表达rpi、rpe、tkt、tkt2如表21所示，确定了甲醇芽孢杆菌的转酮醇酶(tkt’s)具有显著较低的米氏常数km，该米氏常数km是反应速率为最大速率一半时的底物浓度。如本文所公开的，甲醇芽孢杆菌转酮醇酶在动力学上有利于核酮糖5-磷酸再生的rump循环通量，这对于甲醇和甲醛同化是必不可少的。或者，可以进行工程改造或发现具有所需km的其他转酮醇酶。对于rump循环的其他可逆酶，例如核糖5-磷酸异构酶(rpiab)和核酮糖-磷酸3-表异构酶(rpe)，发现并应用了类似的考虑，即相应的甲醇芽孢杆菌酶比大肠杆菌同源物具有更好的动力学性能。大肠杆菌具有两个同工酶核糖5-磷酸异构酶a(rpia)和b(rpib)，其中rpia是大肠杆菌中的主要酶。其底物核糖5-磷酸的米氏常数，rpia为4.4mm，rpib为0.83mm[1]。因此，从甲醇芽孢杆菌或大肠杆菌中使rpia缺失以及rpib的过表达应在动力学上有利于产物核酮糖5-磷酸的形成。本节和表21中引用的参考文献是：[1]essenbergandcooper,“tworibose-5-phosphateisomerasesfromescherichiacolik12:partialcharacterisationoftheenzymesandconsiderationoftheirpossiblephysiologicalroles,”europeanjournalofbiochemistry,vol.55,no.2,pp.323-32,1975；[2]markertetal.,“characterizationoftwotransketolasesencodedonthechromosomeandtheplasmidpbm19ofthefacultativeribulosemonophosphatecyclemethylotrophbacillusmethanolicus,”bmcmicrobiology,vol.14,no.7,2014；和[3]sprengeretal.,“transketolaseaofescherichiacolik12,”europeanjournalofbiochemistry,vol.230,no.2,pp.525-32,1995.表21.甲醇芽孢杆菌和大肠杆菌之间的反应底物和产物的rpib转酮醇酶米氏常数km的比较。序列表<110>基因组股份公司哈里什·纳加拉让杨泰勋艾利·阔达雅里<120>包括具有合成或增强的甲基营养的那些工程微生物的、具有g3p→3pg酶和/或果糖-1，6-二磷酸酶的工程微生物<130>gno0088/wo<150>us62/690,209<151>2018-06-26<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>481<212>prt<213>bacillusmethanolicus<400>1metglnvalleuglulysaspphelyspheleuleuasnglyglutrp151015serpheserserserasnglnpheileasniletyrserproserthr202530glygluvalvalglyargvalproalametthrlysaspgluileasp354045lysalavalalaglyalaargglnalaglnlyslystrpglulysleu505560alavalsergluargalalysileleuhisalatrpalaaspgluleu65707580vallysmetileaspvalilealaprometilemetasngluvalgly859095lysasnileserthralaarglysgluvalthrargthralagluile100105110ileargtyrthralaglugluglyvalargilehisglyglupheile115120125asnglyglyserleuaspalaaspserserilelysthralaileval130135140glulyslysproleuglyvalileleualaileserpropheasntyr145150155160proileasnleualaalathrlysilealaproalaleuilealagly165170175asnalavalvalphelysproalathrglnglyalaileserglyleu180185190leumetileglnalaleugluasnalaglyleuprolysglyleuval195200205asnthrvalthrglylysglysergluileglyasptyrileilethr210215220hispropheileaspmetileserphethrglyglythrglythrgly225230235240glnasnilealaarglysalasermetileproleuvalleugluleu245250255glyglylysaspproalailevalleugluaspalaaspleugluleu260265270alaalathrgluilevalserglyalaphesertyrserglyglnarg275280285cysthralailelysargvalleuvalleulysaspvalalaalapro290295300leuileglulysilelysglulysvalglulysleuthrvalglyarg305310315320progluaspaspalaaspilethrproleuileaspgluserserala325330335aspphevalglnglyleuileaspaspalaleualalysglyalaser340345350leuilethrglyasnlysargglulysasnleuiletyrprothrval355360365leuserasnvalthrlysaspmetlysvalalatrpglugluprophe370375380glyprovalleuprocysileilevalaspservalgluglualaile385390395400gluilealaasngluserglupheglyleuglnalaservalphethr405410415serasnileglulysalaphethrilealaserserleuaspvalgly420425430servalglnileasnglyargthrgluargglyproasphisphepro435440445pheseralavallysasnserglyleuglyserglnglyilearggln450455460serileilesermetmetargasplysvalthrvalileasnleulys465470475480lys<210>2<211>211<212>prt<213>bacillusmethanolicus<400>2metgluleuglnleualaleuaspleuvalasnilegluglualalys151015glnvalvalalagluvalglnglutyrvalaspilevalgluilegly202530thrprovalilelysiletrpglyleuglnalavallysalavallys354045asp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