刺激HANK和NK92MI细胞的靶向IL-12治疗和方法与流程

本申请要求2018年9月7日提交的序列号为62/728510的我们的美国临时专利申请的优先权，将其通过引用并入本文中。

本发明的领域是使用天然杀伤细胞和免疫刺激细胞因子并且尤其是活化的nk细胞和il-12的癌症治疗和方法。

背景技术：

背景描述包括可用于理解本发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明有关，也不是承认明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。

本文中所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请均被明确地和单独地指出通过引用并入一样。在并入的参考文件中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用而在该参考文件中该术语的定义不适用。

最近，由于阳性治疗结果，用经基因修饰的nk细胞的基于细胞的癌症治疗受到关注，特别是在其中使用nk92衍生细胞，例如活化的nk细胞(ank细胞)、具有高亲和力cd16受体的经基因修饰的nk细胞(hank细胞)、或嵌合抗原受体(tank细胞)。尽管此类基于细胞的治疗在概念上是有吸引力的，肿瘤微环境和其他患者特异性因子将通常降低其细胞毒素活性，并且已经进行了各种尝试来调节nk92细胞中的细胞毒性。

白介素-2(il-2)和白介素-12(il-12)细胞因子通过刺激未经修饰的免疫细胞(包括t细胞和自然杀伤(nk)细胞)引发强烈的抗肿瘤作用。尽管细胞因子刺激t细胞增殖，但nk细胞的干扰素-γ(ifn-γ)产生，以及最终地通过il-2和il-12刺激作用的细胞溶解活性、幅度、和谱均不同(参见，例如，j.leukoc.biol.[白细胞生物学杂志]58:225-233；1995)。例如，尽管il-2是增殖和细胞溶解活性的更强刺激物，但il-12是来自未经修饰的nk细胞和活化的t细胞的ifn-γ的更强的诱导物。ifn-γmrna在用il-2和il-12共刺激的nk细胞中具有增加的稳定性(参见，例如，molecularandcellularbiology[分子和细胞生物学],2002年3月,第1742-53页)。然而，体外使用的il-2和il-12浓度可能不一定反映体内可实现的或甚至是所希望的水平。实际上，il-2的il-2全身施用与相对高的毒性和毛细血管渗漏综合征相关联，而若干例死亡归因于il-12的全身施用。此外，原代nk细胞对各种细胞因子的应答不一定与经基因修饰的nk92细胞的应答相同。

因此，尽管已知各种用于活化nk细胞的组合物和方法，但仍有使用nk细胞治疗癌症的组合物和方法的需要，以临床安全的方式用il-12刺激nk细胞的情况下尤其如此。

技术实现要素：

本文披露了基于nk细胞的治疗的各种组合物和方法。特别地，本披露描述了表达并在细胞内保留il-2的nk细胞，其中nk细胞使用包含癌细胞靶向部分和il-12部分的嵌合蛋白进行刺激。有利地，这种嵌合蛋白基本上减少了全身毒性，并以靶向的方式有益地诱导ifn-γ分泌。出乎意料地，与天然的nk细胞相比，这种嵌合蛋白显著增加了表达并在细胞内保留il-2的nk细胞中ifn-γ的分泌。

在本发明主题的一个方面，本发明人预期了在nk细胞中诱导ifnγ分泌的方法，该方法包括提供nk细胞的一个步骤，其中该nk细胞是il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞；以及使该nk细胞与包含il-12部分和癌细胞靶向部分的嵌合蛋白接触的另一个步骤以诱导该nk细胞分泌干扰素γ(ifnγ)。

在一些实施例中，该il-2敏化的nk细胞是之前且组成性地暴露于il-2的nk细胞或组成性地暴露于至少100iu/mlil-2的nk细胞。在其他实施例中，该经基因修饰的nk细胞也可以是ank细胞、自体nk细胞或从前体细胞体外衍生的nk细胞，而在仍另外的实施例中，该经基因修饰的nk细胞组成性地表达并在细胞内保留il-2(例如hank细胞或nk92mi细胞)。

进一步预期到该嵌合蛋白的il-12部分包含il-12α链和il-12β链，但il-12α链的同源二聚体和其他异源二聚体也认为是合适的。在一些实施例中，该癌细胞靶向部分包含igg抗体部分、fab部分、f(ab’)2部分、fab2部分、或scfv部分。最典型地，该癌细胞靶向部分靶向坏死标记物(例如dna、rna、组蛋白等)或癌症相关的抗原或癌症新表位以提供关于il-12作用的位点特异性。例如，合适的癌细胞靶向部分可能包含hu51-4抗体或其部分。

虽然不限于本发明的主题，预期离体进行使该nk细胞与该嵌合蛋白接触的步骤，且该nk细胞是hank细胞，或体内进行使该nk细胞与该嵌合蛋白接触的步骤，并且其中该nk细胞是hank细胞或nk92mi细胞。

因此，从不同的角度来看，本发明人也预期一种治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用nk细胞的步骤，其中该nk细胞是il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞；并且施用包含il-12部分和癌细胞靶向部分的嵌合蛋白的另外的步骤从而诱导该nk细胞分泌干扰素γ(ifnγ)。

如上所述，预期了该nk细胞可以是组成性地表达并在细胞内保留il-2的经基因修饰的nk细胞(例如hank细胞或nk92mi细胞)，和/或该嵌合蛋白的il-12部分包含il-12α链和il-12β链。在其他实例中，该癌细胞靶向部分可以包含igg抗体部分、fab部分、f(ab’)2部分、fab2部分、或scfv部分，并且通常优选的是癌细胞靶向部分靶向坏死标记物(例如dna、rna、组蛋白等)或癌症相关的抗原或癌症新表位。例如，该癌细胞靶向部分可以包含hu51-4抗体或其部分。

在另外的实施例中，预期在施用该nk细胞前至少12小时施用该嵌合蛋白，或在施用该nk细胞后至少12小时施用该嵌合蛋白，或该嵌合蛋白与nk细胞同时施用。在其他选择中，也预期了嵌合蛋白与nk细胞结合。

在本发明主题的又另一方面，发明人还预期了包含il-12部分和靶向坏死标记物(例如dna、rna、组蛋白等)的癌细胞靶向部分的嵌合蛋白，和/或该癌细胞靶向部分包含hu51-4抗体或其部分。在其他实施例中，癌细胞靶向部分包含igg抗体部分、fab部分、f(ab’)2部分、fab2部分、或scfv部分。

例如，il-12部分可以共价偶联至癌细胞靶向部分，和/或il-12部分可以通过肽接头共价偶联至癌细胞靶向部分。典型地，但非必需地，嵌合蛋白的il-12部分包含il-12α链和il-12β链，和/或癌细胞靶向部分包含hu51-4抗体或其部分。当希望时，嵌合蛋白可以非共价地与nk细胞的cd16受体结合。

因此，本发明人还预期了包含本文所预期的嵌合蛋白的药物组合物。此类药物组合物可以进一步包含如上所述的nk细胞。因此，本发明人也预期一种包含以下的试剂盒：(a)nk细胞，其中该nk细胞是il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞；以及(b)包含il-12部分和癌细胞靶向部分的嵌合蛋白。关于nk细胞和嵌合蛋白，应用与以上提供的相同的考虑。

因此，从不同的角度来看，本发明人还预期了嵌合蛋白和nk细胞在治疗癌症中的用途，其中该nk细胞是il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞，且其中该嵌合蛋白包含il-12部分和癌细胞靶向部分，诱导该nk细胞分泌干扰素γ(ifnγ)。关于nk细胞和/或嵌合蛋白，应用与上述相同的考虑。

根据以下对优选实施例的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的附图标记表示相同的组件。

附图说明

图1显示了示例性图，其表明所测试的nk细胞需要组成性il-2表达/暴露以实现显著的il-12介导的ifn-γ分泌。

图2为示例性图，其显示了相对于il-12介导的ifn-γ分泌，il-12以及包含il-12部分的所选嵌合蛋白的生物活性。

图3为示例性图，其显示了所选嵌合蛋白的结合，该选择性嵌合蛋白包含与暴露于细胞死亡的抗原相连的il-12部分。

图4显示了包含il-12部分的示例性嵌合蛋白的序列。

具体实施方式

发明人现在发现包含il-12部分的所选嵌合分子可以以有效的和靶向的方式使用以在il-2敏化的nk细胞中或在组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞中诱导ifnγ分泌从而在目标组织中提升细胞毒性nk细胞活性。有利地，包含il-12部分的嵌合分子有助于避免全身施用il-12时另外产生的毒性。另外，由于嵌合分子也包含癌症靶向部分(例如靶向一种或多种坏死标记物)，诱导nk细胞分泌ifnγ可以特异于癌症部位，且特别地特异于缺氧和/或坏死肿瘤核心实现。因此，由于靶向特定的ifnγ分泌，预期的组合物和方法将增加肿瘤中抗原的呈递以及免疫感受态细胞(且尤其是cd4+和/或cd8+t细胞)的mhc-i/ii表达，并使肿瘤中的免疫应答偏向th1应答。

有利地，本文所述嵌合分子的用途不仅避免全身施用il-12时另外产生的毒性，也能在靶向肿瘤位点提供浓缩的治疗有效量的il-12。另外，应当理解坏死标记物在本文的上下文中的使用将有利地允许肿瘤抗原非依赖性抗原在肿瘤微环境中扩散，因为嵌合分子将无差别地靶向坏死组织而不是癌症或肿瘤相关抗原。在更进一步的有益方面，本文中的嵌合分子保留il-12异源二聚体(如下文更详细讨论的)的生物活性。

另外，应该特别认识到各种nk细胞无法应答il-12，即使在使用提供到培养基中的il-2繁殖的情况下。然而，值得注意的是，本发明人还发现当把il-2以组成性的或连续的方式提供到相同细胞中时，这些细胞对il-12信号传导敏感。以此方式处理的nk细胞产生显著量的ifnγ且具有增加的细胞毒性，推测是由于细胞内浓度增加和/或il-2量波动减少。

术语‘组成性暴露’或‘组成性地暴露’与如本文使用的il-2结合表示以连续的(或半连续的)方式提供或产生生物活性il-2，使得在细胞处或在细胞内的生物活性il-2浓度(或il-2刺激)的变化将在48小时内变化不超过20％。因此，在一些实施例中，在细胞处或在细胞内的生物活性il-2浓度(或il-2刺激)的变化将在48小时内变化不超过15％、或在48小时内变化不超过10％、或在48小时内变化不超过7％、或在48小时内变化不超过5％、或在48小时内变化不超过1％。同样地，术语“组成性表达”或“组成性地表达”与本文所用的il-2结合使用意为il-2在细胞内从组成性启动子以连续的方式(重组)表达(即不需要诱导)。最典型地，il-2在细胞内的这类表达通过使用融合到il-2的内质网滞留序列来实现，以降低或甚至完全避免表达这种经修饰的il-2的细胞中的分泌。

虽然不限于本发明的主题并且不受理论的约束，假定在自然设定中对il-2的组成性暴露与nk细胞对il-2的暴露更为相似，导致因暴露于il-12引发的对il-12和ifnγ分泌的持久敏感性。相反，nk-92细胞对il-2的间歇性暴露—如常规nk-92细胞培养物中的情况，其中培养基每两到三天更新一次—可导致具有生物活性的il-2的失活和/或降解，这可能是由于与血清蛋白的结合或通过培养基的血清蛋白酶的蛋白水解。因此，并且不希望受任何理论或假设的束缚，本发明人认为，常规性nk-92细胞培养物条件促进间歇性或“脉冲式”il-2信号传导，其支持nk-92细胞的生长但不能支持使得nk-92细胞对il-12敏感和il-12依赖性分泌ifnγ以及增加nkg2d表达(如与非il-12刺激的细胞相比)的细胞信号传导。

关于预期的嵌合蛋白，一般认为包含至少一个具有生物活性的il-12部分的所有嵌合蛋白都是合适的。另外，通常优选的是该嵌合蛋白还包括延长血清半衰期、减少全身毒性、和/或允许在所希望的位点靶向特定的il-12的递送和/或累积的部分。因此，关于嵌合蛋白的非il-12部分，合适的非il-12部分包含各种血清蛋白和其部分，并且尤其是白蛋白、乳铁蛋白和各种球蛋白。因此，一个优选的非il-12部分包含抗体或其片段。容易理解，抗体或其片段的使用将有益地允许靶向的同时还能延长嵌合蛋白在血液中的稳定性和持久性。例如，该非il-12部分可以是抗体的重链、抗体的轻链(或其部分)、或scfv。

尽管这种抗体或其片段的任何结合特异性通常被认为是合适的，尤其优选的抗体将与肿瘤细胞的抗原特异性结合。例如，合适的抗体可以与肿瘤相关的抗原、肿瘤特异性抗原、或患者和肿瘤特异性新抗原(新表位)结合。因此，非il-12部分最优选地还用于在肿瘤位点递送和保留il-12以浓缩il-12对靶位点的生物效应。另外，应该认识到抗体的所有来源都认为是合适的，包括人类抗体和所有同种型、非人类哺乳动物形式、人源化形式和合成抗体。当非il-12部分不是抗体时，不管怎样肿瘤选择性或偏好可以通过白蛋白实现，该白蛋白优先从新生血管通过gp60介导的转胞吞作用吸收入肿瘤细胞。

关于il-12部分，应当注意il-12是异源二聚体且嵌合蛋白中的il-12部分可以是il-12的单链形式(即scil-12)或单一亚单元(即il-12α亚单元(p35)和il-12β亚单元(p40))或其活性部分。关于il-12的来源，通常优选的是，来源为人类il-12。然而，各种其他非人类(优选哺乳动物)il-12形式本文也明确预期到了。此外，应当理解剪接变体和突变体也是合适的，只要这类形式表现出至少一些生物活性(例如，如本文所述的在hank细胞中诱导ifnγ分泌)。

合适的il-12蛋白序列包括人类序列，其可以形成从il-12α亚单元(p35)和il-12β亚单元(p40)形成的二硫化物连接的异源二聚体或可以通过柔性肽接头(如下文更详细描述的)共价连接在一起。在其他合适的序列中，il-12序列包括公众可获得的蛋白质序列(例如，uniprot的p29460和p29459)，以及所有天然的及其合成变体，包括截断形式、剪接变体和突变形式。同样地，本领域已知编码il-12的dna和rna序列，并且合适的序列包括基因库中的那些(登录号ac010370用于il-12α亚单元的基因组序列以及m65271用于mrna；登录号af512686用于il-12β亚单元的基因组序列以及m65290用于mrna)。另外，应当理解其他非人类序列，优选哺乳动物序列，也被认为适用于本文。

il-12α亚单元和il-12β亚单元的异源二聚体可以通过非共价缔合，或通过柔性肽接头例如g4s接头形成，以形成单链il-12分子。此外，嵌合蛋白也可能包括寻址序列或前导序列、接头、标签、和/或标示(用于量化和/或简化纯化)。正确的选择至少部分取决于生产系统的具体选择，这在本领域是众所周知的。

还进一步预期具有il-12部分和非il-12部分的嵌合蛋白的生产方式可能有很大不同，且包括两部分重链的共价偶联以及非共价偶联。例如，如在下文中更详细地描述的，坏死靶向抗体hu51-4作为单链il-12(scil-12)的融合配偶体使用。同样地，nhs-il12是嵌合构建体，其包含融合到肿瘤坏死靶向人类igg1(nhs76)的il-12的两个分子。添加人类igg1部分导致nhs-il12的血浆半衰期比重组il-12的更长，且在体内能选择性靶向鼠肿瘤。使用人类pbmc的体外测定和体内灵长类动物研究的数据均显示免疫细胞的ifnγ产生在被免疫细胞因子处理后减弱，表明相比单独使用重组il-12，毒性曲线有所提高。当在三种鼠肿瘤模型中作为抗肿瘤剂进行评估时，nhs-il12也优于重组il-12(参见例如，oncotarget[肿瘤靶标]2014年4月15日；5(7):1869-84)。

如将容易理解的，此类抗体-细胞因子缀合物可通过使用可切割(例如，经由二硫键或水解区(hydrozone)或蛋白水解位点等)或不可切割的接头(例如，经由马来酰亚胺修饰的peg)的化学缀合来制备。可替代地，如下文更详细显示的，缀合物还可以使用重组克隆制得，其中重链或轻链(或其片段)的n-末端或c-末端被修饰以还在框架内编码接头部分和il-12。因此，可以制备嵌合重组蛋白，其具有优选与肿瘤细胞的组分结合的抗体部分、接头和il-12部分。值得注意的是，如下文更详细地显示，具有il-12的示例性抗体-药物缀合物保留了显著的活性。

因此，一个示例性融合蛋白可以包含具有前导肽部分、正常类型字体的小鼠scil-12部分(粗体的g4s接头)以及hu51-4抗体重链部分的嵌合蛋白(如seqidno:1所示)，其中斜体序列表示前导肽部分，下划线序列表示hu51-4抗体重链部分。

另一个示例性融合蛋白可以包含前导肽部分、正常类型字体的人类scil-12部分(粗体的g4s接头)以及hu51-4抗体重链部分的嵌合蛋白(如seqidno:2所示)，其中斜体序列表示前导肽部分，下划线序列表示hu51-4抗体重链部分。

仍另一个示例性蛋白包含前导肽部分以及hu51-4抗体轻链部分(如seqidno:3所示)，其中斜体序列表示前导肽部分，下划线序列表示hu51-4抗体轻链部分。

关于nk细胞，通常预期优选的nk细胞为il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞。在这个背景下，应当注意il-2敏化的细胞是经如上述的il-2组成性暴露处理的细胞。

尽管组成性暴露可以通过连续暴露和/或如本文所述向培养基补充il-2完成，但更优选地是通过在各个细胞中细胞内表达重组il-2来实现nk/nk92细胞和它们的衍生物对il-2的组成性暴露。典型地，细胞内表达由组成性活性启动子驱动以实现恒定的表达水平，并且以不分泌的形式表达(即，缺乏输出信号序列，并且可以包括内质网或细胞质滞留序列)。据信这种细胞内表达对细胞提供与外部提供的il-2的组成性暴露相同的功能性影响。实际上，如下文更详细显示的，本发明人发现，当nk92细胞或衍生细胞被基因工程化以表达并在细胞内保留il-2时，如通过ifnγ分泌和/或增加的nkg2d的表达所测量，细胞出乎意料地被il-12刺激敏化。如将容易理解的，il-2的重组表达和细胞内滞留可以按多种方式进行，并且所有此类方法都被认为适用于本文(参见，例如，oncotarget[肿瘤靶标]2016年12月27日；7(52):86359-86373或exphematol.[实验血液学]2005年2月；33(2):159-64)。除了其他益处之外，应当注意的是，此类重组细胞可以在体内向患者施用，而不需要向相同患者施用il-2。使此类经修饰的细胞将对il-12敏化以在il-12刺激后分泌ifnγ。实际上，通过对il-2的组成性暴露(外部或内部)的敏化提供了大量的ifnγ，其被认为在伴随免疫疗法的情况下提供治疗效果，特别是因为在此类刺激细胞中nkg2d表达也显著增加。

例如，经基因工程化的nk细胞可以是经修饰以表达高亲和力fcγ受体(cd16)的nk-92衍生物。fcγ受体的高亲和力变体的序列是本领域熟知的(参见，例如，blood[血液]2009113:3716-3725)，并且认为所有产生和表达的方式都适用于本文。据信这种受体的表达允许使用对患者的肿瘤细胞(例如，新表位)、具体的肿瘤类型(例如，her2neu、psa、psma等)特异性的抗体，或与癌症相关联的抗体(例如，cea-cam)特异性靶向肿瘤细胞。有利地，这类抗体是市场上可获得的，并且可以与细胞结合使用(例如，结合到fcγ受体)，且这类经修饰的细胞也可以作为hank细胞(高亲和力自然杀伤细胞)从南圭斯特(nantkwest)公司商购获得。可替代地，据报道nk92mi细胞(参见例如humgenether.[人类基因治疗]1999年5月20日；10(8):1359-73或us8034332)可以表达并在细胞内保留il-2，且可以从atcc商购。

如上所述，在进一步预期的方面，关于nk细胞，预期到nk细胞被认为在本文中使用是合适的，只要这类细胞组成性地暴露于il-2并在细胞内表达(及保留)il-2。因此，合适的可替代的nk细胞包括来自患者的自体nk细胞(例如，分离自全血，或使用本领域已知的方法从前体或干细胞培养)和各自同种异体nk细胞。然而，在本发明主题的优选方面，nk细胞被基因工程化以获得一种或多种所希望的性状，并且特别包括nk-92细胞及其衍生细胞。例如，适合的基因工程化的nk细胞包括被修饰以降低或消除至少一种杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的表达的nk-92衍生细胞，kir使得此类细胞被组成性地活化(经由缺乏或减少的抑制)。

因此，合适的nk细胞可以具有一个或多个修饰的kir，该修饰的kir被突变以减少或消除与mhci类分子的相互作用。当然，应当注意，还可以使一个或多个kir缺失或抑制其表达(例如，通过mirna、sirna等)。最典型地，多于一个kir将被突变、缺失或沉默，并且特别预期的kir包括具有两个或三个结构域、具有短或长的胞质尾区的那些。从不同的角度来看，经修饰的、沉默的或缺失的kir将包括kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、kir2ds5、kir3dl1、kir3dl2、kir3dl3、和/或kir3ds1。可以使用本领域熟知的方案制备此类经修饰的细胞。可替代地，此类细胞还可以作为ank细胞(‘活化的自然杀伤细胞’)从南特圭斯特公司(nantkwest)(参见urlwww.nantkwest.com)商购获得。

nk-92细胞表现出不寻常的受体表达谱，表达相对大量的活化受体(例如，nkp30、nkp46、2b4、nkgd、cd28)。相反，nk-92细胞还表达很少的抑制性受体(例如，nkga/b、低水平的kir2dl4、ilt-2)，并缺少正常nk细胞上克隆表达的大多数杀伤抑制性受体(kir)。此外，nk-92表达相对高水平的参与穿孔素-颗粒酶细胞溶解途径的分子以及另外的细胞毒性效应分子(包括肿瘤坏死因子(tnf)-超家族成员fasl、trail、tweak、tnf-α)，表明经由可替代的机制杀伤的能力。而且，nk-92细胞还表达关于免疫效应细胞调节的其他分子(cd80、cd86、cd40l、trance)，这些分子在nk杀伤方面的相关性尚不清楚。

因此，本发明人预期nk-92细胞及其衍生物可以被il-12敏化并通过将细胞组成性地暴露于il-2表现出il-12依赖性ifnγ分泌表型。例如，在一个实施例中，可以通过向培养基中连续或半连续的添加il-2进行组成性暴露，从而保持生物活性il-2的浓度基本恒定。因此，预期培养基中生物活性il-2的浓度在48小时内变化不超过15％、或不超过10％、或不超过7％、或不超过5％、或不超过3％。可以使用已知方法定量il-2的生物活性，例如使用ctll-2细胞增殖测定(jimmunolmethods.[免疫方法杂志]2009年8月31日；348(1-2):83-94)。

连续或半连续添加il-2可以按多种方式(包括使用蠕动泵或计量注射器)进行。可替代地，并且在较不优选的方面，可以通过以频繁的方式(例如，每两小时、每四小时、每八小时等)更新介质进行连续或半连续添加il-2。当多次或连续添加是非优选时，本发明人还预期使用以相对慢的方式释放il-2的配制品也可以实现组成性暴露。例如，il-2的延迟释放(或增加的针对抗蛋白质结合和/或蛋白酶消化的稳定性)可以通过如已知来自nktr-214(内克塔治疗公司(nektartherapeutics)；455米逊湾大道南；旧金山，加利福尼亚州，ca94158)的il-2的聚乙二醇化来完成。在此，据信聚乙二醇化的il-2是生物活性il-2的前药形式，其随时间释放peg链以产生生物活性的il-2(plosone[公共科学图书馆期刊].2017年7月5日；12(7):e0179431)。有利地，这种聚乙二醇化的il-2可以被全身给予，并因此允许nk/nk92细胞及其衍生细胞在体内对il-2的组成性暴露，而同时il-2的全身副作用减少，或甚至完全避免。有利地，连续暴露进行至少6小时、或至少12小时、或至少24小时、或至少36小时、或至少48小时。

可替代地，或另外地，应当注意，使用抗体缀合的il-2也可以实现组成性暴露，因为此类缀合物已经显示出增加的稳定性，这可能是由于与血清蛋白的结合降低和降低的通过血清蛋白酶的蛋白水解。再一次，此类抗体-药物缀合物将被有利地在体内给予患者。然而，在该实施例中(并且与nktr-214相反)，就考虑的位置而言，以高特异性和选择性进行il-2的递送和用其活化nk细胞是可能的。例如，此类抗体-药物缀合物可以靶向肿瘤标记物，其是患者和肿瘤特异性的(即，肿瘤新表位)、癌症相关联的、癌症特异性的、或对肿瘤微环境中常见的坏死组织特异性的。当然，应当理解，此类抗体-药物缀合物中的抗体部分可以是完整igg抗体，或其任何适合的片段(例如，scfv、fab、fab’、f(ab’)2等)。

无论il-2的具体形式如何，通常预期nk/nk92细胞和其衍生细胞对il-2(和il-2的经修饰的形式)的组成性暴露将处于在约10-50iu/ml之间、或在约50-150iu/ml之间、或在约150-300iu/ml之间、或在约300-500iu/ml之间、或在约500-1000iu/ml之间，或甚至更高(如通过ctll-2扩增测验测定的)的浓度。而且，通常预期il-2浓度在至少有限的时间段内保持基本恒定。例如，通常优选，如测量在72小时的时间段内、或在60小时的时间段内、或在48小时的时间段内、或在36小时的时间段内、或在24小时的时间段内、或在18小时的时间段内iu/ml的％变化，生物活性il-2的浓度波动小于25％、或小于20％、或小于15％、或小于10％、或小于7％、或小于5％、或小于3％。因此，从不同的角度来看，生物活性il-2的适合的浓度将在整个细胞培养物中保持在50-70iu/ml之间、或在70-100iu/ml之间、或在100-120iu/ml之间、或在120-150iu/ml之间、或在150-200iu/ml之间、或在200-230iu/ml之间、或在230-250iu/ml之间、或在250-280iu/ml之间，或更高。

在本发明主题的又另外的方面，基因工程化的nk细胞还可以被基因工程化以表达嵌合t细胞受体。在尤其优选的方面，嵌合t细胞受体将具有scfv部分或其他针对肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原和癌症新表位具有结合特异性的胞外结构域。如前所述，存在许多基因工程化nk细胞表达这种嵌合t细胞受体的方式，并且认为所有方式均适用于本文。可替代地，此类细胞还可以作为tank细胞(‘靶标-活化的自然杀伤细胞’)从南圭斯特(nantkwest)公司商购获得。

在将细胞工程化以具有对癌症相关抗原的亲和力或具有对癌症相关抗原具有特异性的抗体(例如，经由car的表达)的情况下，预期所有已知的癌症相关抗原被认为适合使用。例如，癌症相关抗原包括cea、muc-1、cypb1等。同样地，在将细胞工程化以具有对癌症特异性抗原的亲和力或具有对针对癌症特异性抗原具有特异性的抗体的情况下，预期所有已知的癌症特异性抗原被认为适合使用。例如，癌症特异性抗原包括psa、her-2、psa、brachyury等。在将细胞工程化以具有对癌症新表位的亲和力或具有针对癌症新表位具有特异性的抗体情况下，预期所有已知的鉴定新表位的方式将产生适合的靶标。例如，可以通过肿瘤活组织检查(或淋巴活组织检查或转移部位的活组织检查)和匹配的正常组织(即，来自同一患者的非患病组织)的全基因组分析，经由同步比较如此获得的组学信息，在第一步中从患者肿瘤中鉴定新表位。然后可以进一步过滤所鉴定的新表位用于匹配患者的hla类型，以增加新表位抗原呈递的可能性。最优选地，这种匹配可以经由电脑模拟完成。此外，本文预期的所有nk细胞还可以被基因修饰以表达非分泌的il-2(例如，保留在er区室中)。

因此，在本发明主题的又另一个方面，可以将因此刺激的nk细胞用于药物组合物或试剂盒中(如本文所述的)，典型地配制成具有10⁴-10¹¹个的细胞，并且更典型地10⁵-10⁹个细胞/剂量单位的无菌可注射组合物。在需要时，可以按适合的辐射剂量照射这些细胞，以防止在施用后进一步增殖。然而，替代性配制品也被认为适用于本文，并且本文预期了所有已知的施用途径和方式。如本文所使用的，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物典型地通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物以用于直接施用(例如，经由注射到肿瘤中、输注、口服递送、局部递送等)。另外地，或可替代地，如本文所述，预期药物组合物和试剂盒可以包括包含il-12部分和癌细胞靶向部分的嵌合蛋白。

因此，本发明人尤其预期了一种治疗癌症的方法，其中将本文预期的组成性刺激的自然杀伤细胞和嵌合蛋白共同施用。如将容易理解的，这种施用可以遵循各种方案。例如，当nk细胞包含高亲和力cd16受体(例如，hank细胞)时，嵌合蛋白可以通过该受体偶联至nk细胞。另一方面，例如，当nk细胞是自体nk细胞时，可以通过如本文所述的组成性暴露于il-2来刺激该nk细胞，然后接着从嵌合蛋白中分别(共同)向患者施用。因此，可以先施用嵌合蛋白，12-24小时或更久之后，接着施用经刺激的nk细胞。另一方面，当患者已经接受过组成性表达il-2的nk细胞(例如，hank细胞、nk92mi细胞)输注时，可以在用nk细胞处理后施用嵌合蛋白。

此外，如所预期的方法也被认为除ifnγ分泌之外还增加各种细胞上的nkd2d表面表达，并且尤其是免疫感受态细胞(如nk细胞、cd8⁺和cd4⁺t细胞)，进一步预期治疗还可包括一个或多个增强或触发nkg2d配体表达和呈递的步骤。例如，此类步骤包括低剂量化学疗法和/或低剂量放射疗法，典型地按等于或小于50％、等于或小于30％、等于或小于20％、或等于或小于10％最大耐受剂量的剂量进行。而且，这种低剂量治疗将优选以节律方式进行，例如，交替日、或每隔三天、或每周一次持续数周等。

另外的实施例

实施例1.一种在nk细胞中诱导ifnγ分泌的方法，该方法包括：使该nk细胞与包含il-12部分和癌细胞靶向部分的嵌合蛋白接触以诱导该nk细胞分泌干扰素γ(ifnγ)，其中该nk细胞是il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞。

实施例2.根据实施例1所述的方法，其中该il-2敏化的nk细胞是之前且组成性暴露于il-2，优选至少100iu/mlil-2的nk细胞。

实施例3.根据实施例1或2所述的方法，其中下列中任何一项或多项是正确的：

·该经基因修饰的nk细胞是ank细胞、自体nk细胞、或从前体细胞体外衍生的nk细胞；

·该经基因修饰的nk细胞组成性地表达并在细胞内保留il-2；

·该经基因修饰的nk细胞是hank细胞或nk92mi细胞；以及

·该嵌合蛋白的il-12部分包含il-12α链和il-12β链。

实施例4.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该癌细胞靶向部分靶向坏死标记物或癌症相关的抗原或癌症新表位，且其中该坏死标记物优选地是dna、rna、或组蛋白，且其中该癌细胞靶向部分优选地包含hu51-4抗体或其部分。

实施例5.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该嵌合蛋白包含seqidno:1或seqidno:2，以及任选地seqidno:3。

实施例6.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中下列中任何一项或多项是正确的：

·离体进行使该nk细胞与该嵌合蛋白接触的步骤，且该nk细胞是hank细胞；以及

·体内进行使该nk细胞与该嵌合蛋白接触的步骤，且该nk细胞是hank细胞或nk92mi细胞。

实施例7.一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的组合物，该组合物包含nk细胞和嵌合蛋白，

其中该nk细胞是il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞；以及

其中该嵌合蛋白包含il-12部分和癌细胞靶向部分从而诱导该nk细胞分泌干扰素γ(ifnγ)。

实施例8.根据实施例7所述的组合物，其中该nk细胞是组成性地表达并在细胞内保留il-2的经基因修饰的nk细胞，且其中该nk细胞优选地是hank细胞或nk92mi细胞。

实施例9.根据实施例7或8所述的组合物，其中下列中任何一项或多项是正确的：

·该嵌合蛋白的il-12部分包含il-12α链和il-12β链；

·该癌细胞靶向部分包含igg抗体部分、fab部分、f(ab’)2部分、fab2部分或scfv部分；

·该癌细胞靶向部分靶向坏死标记物或癌症相关的抗原或癌症新表位；

·该坏死标记物是dna、rna、或组蛋白；

·该癌细胞靶向部分包含hu51-4抗体或其部分；

·该嵌合蛋白包含seqidno:1或seqidno:2，以及任选地seqidno:3；以及

·该嵌合蛋白与该nk细胞结合。

实施例10.一种嵌合蛋白，其包含il-12部分和靶向坏死标记物的癌细胞靶向部分，并且任选地其中下列中任何一项或多项是正确的：

·该坏死标记物是dna、rna、或组蛋白；

·该癌细胞靶向部分包含hu51-4抗体或其部分；

·该嵌合蛋白的il-12部分包含il-12α链和il-12β链；

·该嵌合蛋白包含seqidno:1，以及任选地seqidno:3；

·该嵌合蛋白包含seqidno:2，以及任选地seqidno:3，并且

·该癌细胞靶向部分包含igg抗体部分、fab部分、f(ab’)2部分、fab2部分或scfv部分。

实施例11.根据实施例10所述的嵌合蛋白，其中该il-12部分可以共价偶联至该癌细胞靶向部分，且任选地其中该il-12部分通过肽接头共价偶联至该癌细胞靶向部分。

实施例12.根据实施例10或11所述的嵌合蛋白，其中该嵌合蛋白与nk细胞的cd16结合。

实施例13.一种药物组合物，其包含根据实施例10-12中任一项所述的嵌合蛋白。

实施例14.根据实施例13所述的药物组合物，其中该组合物进一步包含nk细胞，其中该nk细胞是il-2敏化的nk细胞或组成性地表达il-2的经基因修饰的nk细胞，并且任选地其中下列中任何一项或多项是正确的：

·该nk细胞是hank细胞；

·该nk细胞是nk92mi细胞；以及

·该嵌合蛋白与nk细胞的cd16结合。

实施例15.一种包含嵌合重链的嵌合抗体，该嵌合重链包含scil-12部分和结合细胞死亡暴露性抗原的抗原结合部分，并且任选地其中下列中任何一项或多项是正确的：

·该scil-12包含通过肽接头连接到il-12β亚单元的il-12α亚单元；

·该抗体包含seqidno:1，以及任选地seqidno:3；以及

·该抗体包含seqidno:2，以及任选地seqidno:3。

实例

为调查nk细胞组成性暴露于il-2的影响，将三种nk92衍生物(ank细胞、hank细胞(从南特圭斯特公司商购获得)和nk92mi细胞(从atcc商购获得))暴露于il-12。图1的左小图比较性地描绘了未经过组成性il-2暴露的ank细胞和经过组成性il-2暴露的hank细胞的数据，而右小图描绘了包括il-2表达盒的稳定整合的nk92衍生物(不表达高亲和力cd16变体)。如从这些结果可以看出，经修饰的nk细胞不仅对il-12信号传导有应答以分泌ifnγ，而且分泌出乎意料的大量ifnγ(峰值接近200ng/ml)。

更特别地，先前通过颗粒介导的基因转移用在逆转录病毒mfg-hil-2载体中的人il-2cdna转染nk-92细胞。该转染是稳定的。nk-92和该衍生型细胞系nk-92mi具有以下特征：表面标记物对cd2、cd7、cd11a、cd28、cd45、cd54和cd56亮(bright)呈阳性；表面标记物对cd1、cd3、cd4、cd5、cd8、cd10、cd14、cd16、cd19、cd20、cd23、cd34和hla-dr呈阴性。细胞按照标准方案生长。使用本领域熟知的传统elisa方法测量ifnγ。

在另一组实验中，将hank细胞(即表达高亲和力cd16并在细胞内保留il-2的ank细胞衍生物)在人重组il-12(rhuil-12)，和所选的具有seqidno:1和seqidno:2或seqidno:1和seqidno:3的序列的人或鼠重组il-12-ab嵌合构建体(huil-12/hu51-4和muil-12/hu51-4)存在下培养过夜。通过将2.5×10⁵个细胞接种到24孔板的含有5％人血清的x-vivo10中来培养细胞。然后收集细胞培养物上清液，并通过elisa测量人ifn-γ。值得注意的是，经由细胞内il-2表达的组成性il-2暴露使得hank细胞对il-12信号传导敏感，如可以容易地从图2的图中看出。实际上，暴露于各种形式的il-12导致鼠和人il-12的显著ifnγ分泌。如所预期的，人il-12在hank细胞中产生比鼠il-12更强的ifnγ分泌。

使用死亡的raji癌细胞(人伯基特氏淋巴瘤细胞)评估嵌合蛋白huil-12/hu51-4和muil-12/hu51-4对坏死细胞的结合特异性，示例性结果描述在图3。如所示，显示了阴性对照(nc)、阳性对照(pc)以及huil-12/hu51-4和muil-12/hu51-4的结合的结果。从图表中可以容易地看出，huil-12/hu51-4和muil-12/hu51-4贪婪地与死亡细胞中的靶抗原结合。huil-12/hu51-4和muil-12/hu51-4的示例性序列也描述在图4中。

在一些实施例中，用于描述和要求保护本发明某些实施例的表示成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施例中，书面说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例试图获得的所需特性而变化。在一些实施例中，数值参数应按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述本发明一些实施例的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可实行地精确地报告。在本发明的一些实施例中呈现的数值可以含有必然由其各自测试测量中所发现的标准偏差引起的某些误差。除非上下文指示相反，否则本文所列出的所有范围应被解释为包括其端点，并且开放式范围应被解释为包括商业实用值。类似地，除非上下文指出相反的情况，否则应将所有值的列表视为包含中间值。

如本文的说明书和随后的整个权利要求中所使用，“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”，除非上下文另有明确说明。而且，并且除非上下文另有指示，否则术语“偶联至”旨在包括直接偶联(其中两个彼此偶联的元件彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的元件位于两个元件之间)。因此，术语“偶联至”和“与……偶联”同义使用。

此外，如本文所使用，短语“a和b中的至少一个”旨在指‘a’和/或‘b’，而与‘a’和‘b’的性质无关。例如，在一些实施例中，‘a’可以是单一不同物种，而在其他实施例中，‘a’可以表示称为‘a’的属内的单一物种。同样地，在一些实施例中，‘b’可以是单一不同物种，而在其他实施例中，‘b’可以表示称为‘b’的属内的单一物种。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，更多修改是可能的。因此，本发明主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含/包括”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书权利要求书提及选自由a、b、c……和n组成的组的某物的至少一种的情况下，该文字应当被解释为只需要该组中的一个要素，而不是a加n、或b加n等。

<110>南特生物公司（nantbio）

<120>刺激hank和nk92mi细胞的靶向il-12治疗和方法

<130>102719.0016pro

<160>3

<170>patentin版本3.5

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<223>前导肽/小鼠scil-12/hu51-4重链的嵌合序列

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885890895

proserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleu

900905910

vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn

915920925

glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser

930935940

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945950955960

trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu

965970975

hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

980985990

<210>3

<211>236

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>前导肽/hu51-4轻链的嵌合序列

<400>3

metasppheglnvalglnilepheserpheleuleuileseralaser

151015

valalametserargglygluilevalleuthrglnserproalathr

202530

leuserleuserproglygluargalathrleusercysargalaarg

354045

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505560

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65707580

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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180185190

serthrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyr

195200205

glulyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuser

210215220

serprovalthrlysserpheasnargglyglucys

225230235