可编程的条件性SIRNA及其用途

文档序号:26003671发布日期:2021-07-23 21:21阅读:206来源:国知局
优先权声明本申请要求于2018年8月10日提交的美国临时申请号62/717,686,以及于2019年2月27日提交的美国临时申请号62/811,183的优先权,其内容通过引用整体并入本文,包括附图。政府权益声明本发明部分地在国家科学基金会(nsf)授予的批准号nsfefri-odissei1332411,和cmmi-snm1120890的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。背景核酸纳米技术1-3和生物分子计算4的长期目标是开发有条件激活的寡核苷酸疗法,其可以检测和响应特定基因的细胞表达3,4。基于立足点(toehold)介导的链置换(displacement)5,6的核酸开关(switches)已经执行逻辑运算并在细菌7和哺乳动物细胞3,8中检测到rna转录物,但是尚未令人信服地证明在哺乳动物细胞中rna转录物对寡核苷酸药物的条件性激活。重大挑战包括背景药物活性抑制差,on状态药物功效弱,输入和输出序列重叠,设计复杂性高,装置寿命短(<24小时),和所需装置浓度高(>10nm)。在过去的十年中,合成的rnai触发器(如小干扰rna(sirna)10)已成为生物学研究中无处不在的工具,最近,广泛的基础和临床开发工作终于让fda批准首个rnai药物onpattro11。尽管药物开发渠道迅速发展,并且靶向配体的赋形剂和递送技术9也广泛涌现(compendium),但是将rnai药剂递送至疾病相关细胞的特定群的困难持续限制了rnai治疗的潜力。在过去的十五年中,尽管有明显的进展3,8,16-19,但对基于链置换开关12-15的可编程的,有条件激活的rnai药剂开发的反复尝试并不能令人信服地证明预期的效果。因此,本文提供了新的有条件激活的sirna(cond-sirna)以克服本领域中的问题。技术实现要素:一方面,本公开涉及处于off状态的可编程的,有条件激活的小干扰rna构建体(cond-sirna),该构建体包含传感器链,核心链,和向导链,其中该传感器链和该核心链互补结合以形成传感器双链体,该向导链和该核心链互补结合以形成rnai双链体,并且该传感器双链体和该rnai双链体彼此连接以形成单个结构。在一些实施例中,该传感器双链体和该rnai双链体经由该核心链彼此连接。在一些实施例中,该传感器链与该核心链的5’上的片段和3’上的片段互补结合以形成该传感器双链体,并且该向导链与在该核心链的中间的片段互补结合以形成该rnai双链体,并且该中间的片段不包含该核心链的任何5’或3’序列,使得该传感器双链体和rnai双链体经由该核心链的两个不同片段彼此连接。在一些实施例中,该cond-sirna构建体的该传感器结构域包含通过该传感器链与该核心链的3’和5’片段的互补结合形成的传感器双链体,以及不与该核心链配对的传感器突出端(overhang)。该传感器突出端位于该传感器链的3’端或5’端。在一些实施例中,该传感器链,核心链,和向导链经由彼此接触时的自组装形成该单个构建体。在一些实施例中,该传感器双链体包含15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,或30个碱基对。在一些实施例中,该rnai双链体包含15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,或30个碱基对。在一些实施例中,该cond-sirna被化学修饰以在与输入链接触时进一步提高该off状态的稳定性和/或打开时的分离效率。例如,该双链体区域中的该传感器链的碱基被lna修饰,2’-o-甲基修饰,或两者修饰,但是没有被硫代磷酸酯(ps)修饰;该核心链的一个或两个末端均被ps修饰,2’-o-甲基修饰,或两者进行修饰;或该传感器链的该单链突出端被lna修饰,2’-o-甲基修饰,ps修饰,或其任意组合修饰。在一些实施例中,该传感器结构域和该rnai结构域被不同的化学修饰进行修饰。通过使该off状态cond-sirna与输入链接触来激活或打开上述该off状态cond-sirna,其中该输入链的一端与该传感器链突出端形成立足点,以经由该输入链与该传感器链的互补结合,诱发该传感器链从该核心链置换,从而形成废弃(waste)双链体,由此该rnai双链体与该构建体完全分离。附图简要说明本申请包含至少一张彩色绘制的附图。具有一张或多张彩色附图的本申请的副本将在请求并支付必要费用后由专利商标局(theoffice)提供。图1示出了cond-sirna的概念化设计,操作,和分子动力学模拟。图1a示出了cond-sirna的概念化二级和三级结构。rnai双链体与giardiadicer的x射线晶体结构的对接(docking)示出了传感器双链体与dicer之间的巨大的位阻冲突。图1b示出了经由链置换的rnai激活。当互补的输入rna遇见cond-sirna时(i),该输入在传感器链上形成带有3’或5’单链突出端的立足点(ii),导致链置换(iii)。置换导致传感器链与rnai双链体分开(iv)。细胞核酸酶去除rnai双链体上的核心链突出端(v),为dicer加工留下有活性的rnai触发器(vi)。图1c和1d示出了构建体i.1和iii.1的分子动力学(md)优化模型。绿色框箭头表示从传感器链的3’到5’端的链置换方向。图2示出了被化学修饰的单链突出端的细胞内降解。northern印迹示出了测试构建体上硫代磷酸酯(ps)保护的5’突出端的逐步降解。将测试构建体(具有分段的过客(passenger)链和多个5’突出端的dicer底物)转染至hct116细胞24小时。提取总rna并经由northern印迹进行分析。分析了两组相似的样品,在不同的上样浓度下示出了相似的结果。图3a-3f示出了原型构建体(图3a),构建体ii变体(图3b,3c),构建体iii变体(图3d,3e),和构建体iv变体(图3f)的序列图和优化区域图。图4a-4b示出了hct116细胞中rna输入的northem印迹。northem印迹试验探测48小时后从hct116细胞获得的(recovered)tat/rev和aml输入rna。图4a示出了用匹配其共同前导序列的突变体trnalys3探测的tat/revrna转录物。泳道:(l)ambion十年标志物(decademarker);(0)模拟转染的rna的阴性对照;(1)完全匹配的输入rna;(2)5’不匹配的输入;(3)完全不匹配的输入;(4)双链体不匹配的活化剂(未使用);(5)3’不匹配的活化剂。输入rna的预期大小为145-150nt。图4b示出了cbfb-myh11rna转录物。泳道:(0)模拟转染;(1)tat/rev完全匹配输入(用于比较);(2)cbfb-myh11融合(fusion);(3)myh11亲本(parental);(4)myh11亲本。连续的小图示出了用突变体trnalys3探针,myh11探针,和cbfb探针探测的相同样品。在所有群组(cohort)中,输入rna的表达水平均相当。图5a-5k示出了构建体i,ii,和iii变体的组装,链置换,rnai活性,和rnai激活。图5a,5d示出了构建体i和ii组装的非变性page,以及于37止在1xpbs缓冲液中的等温链置换。构建体i和ii被它们各自的输入拆开(disassembled),并且不受不匹配的输入的影响。对照泳道为:i=输入,c=构建体,p=rnai双链体,w=废弃双链体。图5b,5e示出了存在不匹配的输入或空输入时构建体的rnai活性,以及存在不匹配的输入时的on状态构建体。图5c,5f示出了表达被所示的输入g和h的细胞中off状态构建体的rnai活性,表达不匹配的输入的细胞中构建体ii变体的off和on状态rnai活性。图5i,5j示出了表达不匹配的或匹配的输入的细胞中具有不同核心链修饰的off状态构建体ii和iii变体的rnai活性。图5k示出了在具有匹配的或不匹配的输入的细胞中具有不同传感器链修饰的构建体iii变体的rnai活性。图6示出了预激活的cond-sirna构建体的dicer加工。northern印迹试验探测48小时后从hct116细胞获得的cond-sirna向导链。泳道如下:(l)ambion十年标志物;(0)模拟转染的细胞的rna;(1)和(2)向导链来自本文未报道的第三个原型cond-sirna;(3)和(4)原型hiv构建体的off和on状态;(5)和(6)aml构建体的off和on状态。箭头标记dicer剪切的向导链的位置。在从用on状态cond-sirna转染的细胞中提取的rna物质中检测到dicer剪切产物(~21nt向导链片段),而从用off状态cond-sirna转染的细胞中未检测到。图7示出了使用x3dna43每5ps测量每个螺旋中23个碱基对的碱基对参数并将其绘制为热图。碱基对按照以下所示的方向从顶部(1)到底部(23)进行编号。碱基对参数的定义在网站x3dna.org/articles/seeing-is-understanding-as-well-as-believing中有说明。图8a-8l示出了5纳秒内传感器和sirna双链体的分子动力学模拟的碱基对参数。针对碱基对1-23定义了错切(shear)(8g),搭扣(buckle)(8k),拉伸(stretch)(8i),扭转(propeller)(8f),错位(stagger)(8h),和张开(opening)(81)参数。测量碱基对1-22与后续碱基对的滑移(shift)(8e),转角(tilt)(8j),滑移(slide)(8d),转角(roll)(8c),升高(rise)(8b),和扭角(twist)(8a)参数。每次测量的热尺度(heatscale)均以四个正常的未被修饰的rna双链体在5ns对照md轨迹上测得的平均值为中心,这些双链体的碱基序列与hiv和aml构建体的sirna和传感器双链体相同。从相同的对照轨迹测得的热尺度跨越三个标准偏差。我们观察到与正常rna值相比在扭角,升高,转角(roll),滑移(slide),滑移(shift),和扭转测量值方面存在明显偏差(8a-8f)。在这些小图中,构建体1是hiv构建体,构建体2是aml构建体。图9a-9c示出了rnai活性,传感器设计,和cbfβ-myh11感测,mcl-1靶向的cond-sirna的序列。图9a示出了表达无关的,融合活化剂,myh11,或cbfb转录物的细胞中构建体iv变体的rnai活性。图9b示出了每个转录物上的传感器链结合位置。图9c示出了iv.3的序列图。黄色高亮示出了具有优化的化学修饰基序(motifs)的区(区域a,b,c,和d)。图10a-10b示出了针对构建体i.1(图10a)和iii.1(图10b)的不同rna输入的相对rnai活性。针对用cond-sirna转染但表达完全不匹配的输入的细胞的表达水平,将图5c和5f的靶标表达数据重整化。结果表明,表达匹配的输入的细胞中的靶标表达水平低于表达不匹配的输入的细胞中的靶标表达水平。图10a:对于构建体i.1,表达5’不匹配和完全匹配的输入的细胞的靶标表达降低。图10b:对于iii.1,表达融合输入的细胞的靶标表达降低。图11示出了以1nm浓度转染至hct116细胞24小时的多种前代rnai触发器设计的northern印迹。图示的是触发器的二级结构。绿色圆点(bubbles)表示2’-o-甲基rna碱基。蓝色圆点表示dna。白色圆点表示rna。黑色箭头表示dicer产物。结果表明,带有相邻2’-o-甲基修饰的双链体的双链体rna的dicer产物减少。图12a-12c示出了本文公开的cond-sirna的示例。图12a示出了构建体的结构,其中传感器结构域和sirna结构域以灰色阴影示出,并且在框中示出了传感器双链体。图12b示出了核心链区域i,ii,和iii,以及核心链中核酸外切酶阻断区域i和ii。图12c示出了传感器链区域i,ii,和iii。发明详述本文公开了用于开发可编程的,有条件激活的小干扰rna(cond-sirna)的方法。这些简单的核糖开关可以在哺乳动物细胞溶质中保持数天的完整性,并经由立足点介导的链置换检测特定输入基因的细胞rna转录物。在检测到输入时,cond-sirna可以释放有效的rnai触发器9,使具有与输入完全独立序列的特定靶标基因沉默。如工作示例所示,在人贴壁细胞中测试了许多cond-sirna变体的切换(switching)活性,以确定必要和足够的化学修饰基序,从而可以在不同的输入:输出组合上实现良好的装置性能。一些被优化的cond-sirna在表达序列匹配的rna转录物的细胞中实现了超过90%的靶标基因沉默(蛋白质表达相对基线),并在表达不匹配的输入的细胞中强烈抑制了背景rnai活性(<25%敲除)。因此,本文提供了实质上改善活的哺乳动物细胞中链置换开关的性能的方法。cond-sirna技术为基因表达激活的rnai智能药物提供了实用且通用的平台。本文公开的cond-sirna构建体包含两个结构域,即传感器结构域和rnai结构域,通过核心链的两个片段彼此连接。这种结构通过传感器链与核心链的3’片段和5’片段的互补结合以形成传感器双链体,以及向导链与核心链的中间片段的互补结合以形成rnai双链体而获得。如图1所示,并非核心链的整个序列与传感器链或向导链互补结合。而是,核心链中与传感器链结合的3’片段和与向导链结合的中间片段之间的第一片段保持单链以形成第一“桥”,该第一“桥”将传感器结构域的第一端与rnai结构域的第一端连接。同样,核心链中与传感器链结合的5’片段和与向导链结合的中间片段之间的第二片段保持单链以形成第二“桥”,该第二“桥”将传感器结构域的第二端与rnai结构域的第二端连接。如本文所用,短语“互补结合”或“互补地结合”是指两条单链彼此碱基配对以形成双链的双链体。但是,只要可以形成稳定的双链的双链体,就允许两条单链之间的一定百分比的不匹配。例如,在一些实施例中,传感器双链体或rnai双链体具有约1%,约2%,约3%,约4%,约5%,约6%,约7%,约8%,约9%,约10%,约15%,约20%,约25%,约30%,约35%,约40%,约45%,或约50%的不匹配。a.输入链cond-sirna的输入链是开启cond-sirna的“触发器”,并且通常是细胞rna转录物,以相对高的表达水平出现在一组被靶向的细胞(例如,癌细胞)中和以相对低的表达水平出现在一组非被靶向的细胞(例如,正常细胞)中。基于所公开的cond-sirna构建体的设计,仅在被靶向的细胞中,rnai被打开;而在非被靶向的细胞中,rnai保持off状态。在被靶向的细胞中,输入链的表达水平比在非被靶向的细胞中高至少2倍,至少5倍,至少10倍,至少20倍,至少30倍,至少40倍,至少50倍,至少60倍,至少70倍,至少80倍,至少90倍,或至少100倍。替代地,在被靶向的细胞中,输入链以至少50,至少100,至少200,至少300,至少400,至少500,至少600,至少700,至少800,至少900,至少1000个转录物的水平表达;在非被靶向的细胞中,输入链以小于50,小于40,小于30,小于20,或小于10个转录物的水平表达。优选地,非被靶向的细胞不具有输入链的可检测表达。输入链包括病毒的mrna,mirna,或非编码rna,如长非编码rna,rna片段,或rna转录物。对于治疗用途,输入rna通常是在一组引起疾病进展的细胞中表达的rna转录物,并因此被靶向用于rnai治疗。非被靶向的细胞通常是一组细胞,其中rnai靶标的沉默会引起不利于治疗的副作用。为了治疗其中输入rna在被靶向的细胞中过表达的疾病或病症,设计cond-rnai,使得传感器链具有与输入rna序列互补的序列。施用cond-rnai后,传感器链与输入rna的结合诱导在被靶向的细胞中rnai双链体自传感器双链体分离,从而激活靶向疾病或病症的rnai。在非被靶向的细胞中,cond-rnai保持无活性。b.构建体设计如本文所公开的,cond-sirna构建体被设计为输入和靶标的特定配对,使用迭代(iterative)方案,示例如下:1.从先前已验证的sirna,文献资料,或sirna设计工具中获取用于rnai结构域的向导链序列。在一些实施例中,向导链的大小为21nt。2.通过在向导链的5’添加四个富含g/c的碱基,从选定的向导链中产生dicer底物。在一些实施例中,dicer底物的大小为23bp。使用nupack(rna链,mathews等人的1999年参数,并进行一些悬垂(dangle)处理)以检查rnai双链体在1nm浓度的向导链(反义链)和正义链以>95%的概率形成。3.根据输入生物标志物的序列,生成与输入链反义的所有可能传感器段的列表。在一些实施例中,传感器段的大小为31-33nt。对于cbfb-myh11融合序列,仅考虑近似满足图3b中所示参数的传感器段。4.使用ncbiblast对靶标动物的转录组中的传感器序列进行独特性(uniqueness)排序。对于人癌细胞系,使用blastn算法针对人转录物和基因组集合检查序列。在可能的情况下,消除序列互补性超过17个碱基且与已知或预测的rna转录物完全突出端互补性的传感器段。5.从最独特的传感器段开始,根据cond-sirna的想要的结构参数构建核心链序列。核心链具有形式为5’-b-c3-p-c3-a-3’的序列,其中a和b与传感器链的假定的(putative)双链体结构域的5’和3’端互补,p与假定的向导链互补,并且c3是c3接头。6.使用nupack对在传感器链段及其对应的5’和3’核心链突出端之间形成的双链体的热力学稳定性进行排序。使用mathews等人的1999年的rna链参数,并进行一些悬垂处理。理想情况下,应在1nm链浓度对>95%的链进行碱基配对。还要验证核心链不具有大量的内部二级结构。7.选择在步骤1-6中生成的最佳结构(向导,核心,和传感器序列)。8.添加本文公开的化学修饰。9.使用寡核苷酸设计工具,如“lna寡核苷酸tm预测”(www.qiagen.com/us/service-and-support/learning-hub/technologies-and-research-topics/lna/custom-lna-design-and-applications/lna-design-tools-calculators/lna-oligo-tm-prediction/)或“lna寡核苷酸优化器”(www.qiagen.com/us/service-and-support/learning-hub/technologies-and-research-topics/lna/custom-lna-design-and-applications/lha-design-tools-calculators/lna-oligo-optimizer/)以优化lna修饰的位置。向传感器链添加大约每3至4个碱基1个lna的lna修饰。使用“lna寡核苷酸优化器”工具检查所使用的lna模式不会导致分数高于60的二级结构或自配对相互作用。尽可能减少自互补性和自配对分数。与rna配对时,使用“lnatm预测”工具检查lna修饰的寡核苷酸的tm。使用“lna寡核苷酸优化器”工具选择最大化tm的位置,同时避免分数高于60的自配对相互作用和二级结构。c.核心链的设计特征如图12所示,在一些实施例中,核心链具有以下一个或多个特征:核心链的5’和3’末端具有以下一个或多个特征:a.5’上的末端碱基是2’-f,2’-o-甲基,或抵抗核酸酶剪切的其他被修饰的碱基。b.3’上的末端碱基是2’-f,2’-o-甲基,或抵抗核酸酶剪切的其他被修饰的碱基。c.5’上的三个末端碱基具有模式mrm,其中m是被修饰的碱基(2’-o-甲基,2’-f),r是rna碱基。d.3’上的三个末端碱基具有模式mrm,其中m是被修饰的碱基(2’-o-甲基,2’-f),r是rna碱基。e.3’和5’上的三个末端碱基没有连续的ps骨架修饰。f.与传感器链碱基配对的核心链部分具有交替的化学修饰模式(mr)n。g.以上,其中m是与等效的(equivalent)rna碱基相比不会降低双链体tm的被化学修饰的碱基。h.上述任何组合,其中核心链的5’和3’端均具有a-g中至少一个特征。i.与传感器链碱基配对的核心链的3’和5’区域i和iii是:(a)完全由模式(m)n构成,其中m是2’-o-甲基或2’-f修饰的碱基,或(b)该区中至少50%的碱基是2’-o-甲基或2’f并且,多达30%,50%,80%,或100%的骨架连接不是硫代磷酸酯。连接至核心链的5’末端(其中三个碱基与向导链的5’末端碱基配对)的核酸外切酶阻断区域i具有以下一个或多个特征:a.m*+*m模式,其中m是2’被修饰的碱基(例如,2’-o-甲基或2’-f),*是ps骨架连接,以及+是lna碱基或其他2’-4’桥接碱基,b.m*+*+模式,如上所定义,c.+*+*+模式,d.r*+*m模式,其中r是rna碱基,e.r*+*+模式,f.+*m*m模式,和g.a-f中的模式,其中*可以是ps骨架连接或未被修饰的(磷酸二酯)骨架连接之一。核心链的核酸外切酶阻断区域ii具有以下一个或多个特征:a.m*r模式,其中m是2’被修饰的碱基(例如,2’-o-甲基或2’-f),*是ps骨架连接,以及r是lna碱基或其他2’-4’桥接碱基,b.m*m模式,如上所定义,c.+*m模式,d.+*r模式,其中r是rna碱基,e.+*+模式,f.m*+模式,和g.a-f中的模式,其中*可以是ps骨架连接或未被修饰的(磷酸二酯)骨架连接之一。如本文所用,“lna”是指在本领域中广泛使用的锁核酸。参见,例如,www.glenresearch.com/products/dna-rna-nucleosides-analogs-and-supports/backbone-modification/locked-analog-phosphoramidites.html和en.wikipedia.org/wiki/locked_nucleic_acid。除了lna修饰,2’-o-甲基修饰,和2’-f修饰以外,其他的碱基修饰技术也是本领域已知的。参见,例如,www.glenresearch.com/browse/nucleoside-analog-phosphoramidites。在一些实施例中.可以使用乙二醇核酸61,62。d.传感器链的设计特征如图12所示,在一些实施例中,传感器链具有以下一个或多个特征。传感器链具有5’突出端,3’突出端,或两者。传感器链的碱基具有以下一个或多个特征:(1)至少25%的碱基不是rna或dna,(2)至少50%的碱基不是rna或dna,(3)至少75%的碱基不是rna或dna,(4)100%的碱基不是rna或dna,(5)至少一个碱基是lna或lna类似物,(6)至少一个3末端碱基是lna或lna类似物,(7)10%至50%的碱基是lna或lna类似物,(8)25%至100%的碱基是lna或lna类似物,(9)不是lna的碱基是以下一个或多个:(a)2’-o-甲基,(b)2’-氟,(c)2’moe,(d)乙二醇核酸61,62,和(e)在www.glenresearch.com/browse/nucleoside-analog-phosphoramidites中显示的其他变体。硫代磷酸酯骨架连接可存在于多个位置,如在末端碱基与倒数第二个碱基之间,在5’或3’末端的最后3个碱基之间,在5’或3’末端的最后5个碱基之间,在5’或3’末端的最后8个碱基之间,在50%的骨架连接上,在所有碱基之间,和/或在区域i和ii之间以及区域ii和iii之间的连接处。5’端,3’端,或两者的末端修饰包括以下一个或多个:(1)三乙二醇或六乙二醇间隔子;(2)c3间隔子;(3)反向(inverted)dt;(4)胺接头,(5)本领域已知的其他接头或末端修饰,如eu.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/oligo-modifications,和www.glenresearch.com/browse/labels-and-modifiers列出的那些,以及(6)修饰可被用于将3’和5’端连接至其他化学部分,如抗体,金,或其他金属纳米颗粒,聚合物纳米颗粒,树枝状大分子纳米颗粒,小分子,单链或支链脂肪酸,肽,蛋白质,适配体,以及其他核酸链和核酸纳米结构。如图3所示,传感器链的区域c具有以下一个或多个特征:(1)50%或更少的骨架位置是硫代磷酸酯(ps)连接,(2)50%或更多的碱基被化学修饰以抵抗核酸酶降解或提高双链体的熔点(tm),(3)100%的碱基被化学修饰以抵抗核酸酶降解并提高tm,(4)约10%~50%的碱基是lna或具有实质上提高tm的2’-4’桥接修饰的其他被化学修饰的碱基。参见,例如,www.glenresearch.com/products/dna-rna-nucleosides-analogs-and-supports/backbone-modification/locked-analog-phosphoramidites.html,和en.wikipedia.org/wiki/locked_nucleic_acid。在一些实施例中,非lna修饰包括2’-o-甲基和2’-f,以及在www.glenresearch.com/browse/nucleoside-analog-phosphoramidites中公开的其他修饰。在一些实施例中,可以使用乙二醇核酸61,62。一方面,与本领域已知的大于10nm的其他rnai分子相比,本文公开的可编程的有条件激活的rnai(如cond-sirna)在哺乳动物细胞中的转染浓度低于0.1nm。cond-sirna具有较长时间段的活性,如至少12小时,至少24小时,至少36小时,至少48小时,至少60小时,至少72小时,至少84小时,或至少96小时。在一些实施例中,cond-sirna具有多达30天,多达60天,或多达90天的活性。如本文所用,术语“可编程的”是指本文所公开的cond-rnai构建体被设计为允许改变输入链的序列而不实质上改变构建体的二级和三级结构。在us9,115,355中公开了其他设计原理,其内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中,rnai双链体与输入-传感器双链体的分离通过核心链和传感器链之间的不匹配或摆动(wobble)配对而增加。rnai触发器需要与由输入rna和传感器链形成的废弃双链体完全分离,以具有有效的rnai活性。条件性rnai的先前方案通常以被激活的rnai触发器为特征,其经由watson-crick碱基配对保持与输入信号(例如,mrna)的连接14,15,17,18,37。在开发条件性rnai触发器的过程中,发现dicer底物与相邻被化学保护的双链体rna结构域的连接显著降低了rnai活性(图2)。对此可能的原因是dicer抑制蛋白(如pact38)与延伸的双链体的结合。无论如何,rnai双链体与输入-传感器双链体的分离对于允许同时优化off状态rnai抑制和on状态rnai功效至关重要。在一些实施例中,本文公开的cond-sirna具有包含与rnai双链体连接的传感器双链体的单构建体设计。条件性rnai触发器和其他dna电路的现有设计以单构建体14,15,39或多构建体17方案之一为特征,将输入序列翻译成独立的输出序列。从理论上讲,单构建体翻译器在信号检测和转导上本质上应该更有效率。但是,缺点是rnai触发器必须隐藏在构建体中,这就为由于构建体降解而导致的假(spurious)rnai激活创造机会。在一些实施例中,本文公开的cond-sirna被化学修饰。对于链置换传感器,传感器链的双链体结构域具有lna修饰,2’-o-甲基修饰,或两者。在一些实施例中,传感器链的双链体结构域不具有硫代磷酸酯(ps)修饰。在一些实施例中,用ps或2’-o-甲基之一修饰核心链或保护链的一个或两个末端。在一些实施例中,热力学稳定的修饰大体上改善对背景激活的抑制,而热力学不稳定的修饰(如ps骨架)当在双链体区域中广泛使用时可增加假活性。在一些实施例中,在立足点结构域中有化学修饰,包括lna修饰,2’-o-甲基修饰,ps修饰,或其组合。立足点结构域中的这些修饰提高了单链突出端的碱基配对亲和力和核酸酶抗性。如本文所用,传感器链的结合伙伴(partner)也可称为“保护链”。保护链是与输入链同源的链。保护链可以是核心链。传感器链是与输入链互补的链。与传感器链结合的输入置换了保护链。在一些实施例中,化学修饰包括:(i)用lna和2’-o-甲基修饰传感器链,其中单链立足点区域具有ps骨架修饰,而碱基配对的双链体区域不具有ps骨架修饰,(ii)保护链的一个或两个末端均具有2’-o-甲基修饰,或(i)和(ii)两者。在一些实施例中,核心链的3’和5’末端区域被ps修饰或2’-ome修饰,使得cond-sirna构建体在与传感器链碱基配对时高度稳定,而在未配对时易于降解。单链突出端的降解可以通过核酸外切酶阻断结构域在双链体的末端终止。用可响应于细胞特异性生化信号而激活rnai活性或使rnai活性失活的自调节“智能药物”补充靶向药物递送为克服当前的局限性提供了手段。例如,能够检测并响应病毒rna转录物的rnai智能药物可经由生存必需(survival-essential)宿主基因的被病毒rna激活的沉默来杀死病毒感染的细胞,从而潜在地消除顽固的(persistent)病毒感染。这种以药效学为中心的方法非常适合基于立足点介导的链置换的核酸开关的应用,因为这些开关可以感测并响应dna或rna输入中特定的碱基序列3。一方面,本文公开的cond-sirna是由传感器链,向导链,和核心链组成的自组装分子机械换能器,如图1a,1c,和1d所示。这三个链的碱基对一起形成双交叉(crossover)构建体20,该双交叉构建体由与23-bprnai双链体耦合的23-碱基对(bp)传感器双链体组成。在被组装的构型中,传感器抑制了rnai双链体的酶促过程(enzymaticprocessing),从而在哺乳动物细胞溶质中保持rnai活性为off(图1a)。在一些实施例中,通过化学修饰进一步修饰cond-sirna构建体,从而改善其切换性能。具体地,当构建体处于其off状态时,本文公开的cond-sirna的不需要的rnai活性降低,并且在存在具有正确序列的细胞rna转录物的情况下,从off到on状态的切换改善。rnai双链体的酶促过程的抑制以多种方式发生,在组合中具有协同作用。例如,在与rnai双链体结合期间,传感器双链体的位置与dicer的dsrbd和核酸内切酶结构域所需的空间有很大的重叠(图1a,右)21。在另一个示例中,dicer的paz结构域与规范的(canonical)dsrna触发器端的5’末端磷酸酯和3’双碱基突出端具有使其稳定的相互作用22。组装后的cond-sirna阻止了这些相互作用,因为核心链的5’和3’末端延伸超过rnai双链体的末端,进入传感器双链体的中间(图1c,1d)。rnai双链体长23-bp。这使得其过长,无法绕过dicer切割,以经由替代途径进行rnai装载23。此外,该构建体的异常三级结构也可能阻碍了替代装载途径(trbp和argonaute(1-4)21)所需的与rnai通路(pathway)蛋白的相互作用。另外地,为防止传感器双链体过早降解或传感器与rnai双链体意外分开,整个传感器链和构建体上的其他关键位点均通过热力学稳定化并通过广泛的化学修饰保护其免受核酸酶活性的影响24(图1c,1d)。为释放并激活rnai双链体,细胞rna转录物经由立足点介导的链置换诱导传感器链与核心链分开(图1b)。在一些实施例中,细胞rna转录物来自受试者的内部来源,如代谢产物。置换可以从在传感器链的3’或5’末端形成的立足点开始。在立足点区域由链置换动力学对立足点稳定性的强烈依赖而确保输入检测的序列特异性25,而在双链体区域则由于需要置换完全互补的核心链而确保输入检测的序列特异性。与传感器链分开后,核心链的被置换区域变为自rnai双链体延伸的3’和5’突出端。突出端被细胞溶质的核酸酶降解26(图1bv和图2),其通过被化学修饰的核酸酶阻断结构域而在rnai双链体的端终止(图3a,构建体i.1中的黄色高亮)。这为dicer加工和risc装载留下了有活性的rnai触发器(图1b,vi,sirna)。用于被化学修饰的单链突出端的细胞内降解的链组成如下:序列(5’->3’)向导a:mcmgcgucugagggaucucuaguuaccuu向导b:mcmg+cgucugagggaucucuagu+taccuu3’过客段:cccucagacgmc*mg*9sidt5’过客段0(对照):3mg*mg*muaacumagamgamu1:cgacgagcucaucac3mg*mg*muaacumagamgamu2:18s*c*g*a*c*g*a*a*g*c*u*c*a*u*c*c3mg*mg*muaacumagamgamu3:18s*c*g*a*c*g*a*a*g*c*u*c*aucc3mg*mg*muaacumagamgamu4:18s*c*g*a*cgagcucaucc3mg*mg*muaacumagamgamunothem探针:atctctagttaccl:ambion十年标志物缩写:9s:三乙二醇间隔子18s:六乙二醇间隔子c3:c3间隔子idt:反向dt*:硫代磷酸酯骨架连接。如图2所示,具有向导链a的样品具有足够的装载和曝光以使所有条带可视化。泳道0示出了没有突出端的对照链的位置(15个核苷酸)。过客1的全长过客链的数量减少,在~15nt有一个可检测的条带,表明突出端的快速进行性降解。过客2和3在15到27nt的大小范围内有多个条带和条痕(streaks),表明核苷酸的缓慢,非进行性丢失,与整个突出端ps骨架连接的存在一致。与0相比,过客4示出了更高量的全长产物,在15nt附近可见两个条带,表明端保护导致初始降解速率较慢,而后一旦5’末端保护失去,突出端就会进行快速进行性丢失。设计了几种具有化学修饰基序的cond-sirna,与用于保护反义寡核苷酸(aso)和其他寡核苷酸疗法的化学修饰基序相似24。对构建体i.1(图3a)进行编程以检测保守hiv(tat/rev)mrna基因序列27。下表1中示出了构建体i和ii的活化剂序列。将应与传感器链对齐(align)的区域进行加粗和斜体;将应与立足点对齐的区域加下划线;将与传感器链互补的段大写;将与传感器链不匹配的段小写。对构建体iii.1(图3a)进行编程以检测急性髓系白血病(aml)相关的融合致癌基因序列(cbfb-myh11)28,29。下表2中示出了构建体iii和iv的活化剂序列。将应与传感器链对齐的区域进行加粗和斜体;将应与立足点对齐的区域加下划线;将与传感器链互补的段大写;将与传感器链不匹配的段小写。为了允许直接读出rnai活性,构建体i.1和iii.1均靶向了在其3’utr(来自hiv的u5区域)中具有生物学无关靶标序列的海肾荧光素酶mrna。为了预测实际的分子构象,i.1和iii.1的原子分子动力学(md)模拟30在显式溶剂中使用杂(hybrid)琥珀色力场进行,该力场使用先前公布的参数31-33的组合描述我们设计中使用的化学修饰。两个构建体的md优化模型(图1c,1d)示出,与理想的a型rna螺旋参数相比,传感器和rnai双链体存在结构变形(图4)。该变形归因于(1)广泛使用的化学修饰和(2)双交叉基序固有的结构应变(图1c,1d,4,以及表3a和3b)。下表3a和3b示出了在5纳秒的分子动力学轨迹的传感器和sirna双链体的平均碱基对参数。根据图4示出的数据计算每个被标示的双链体的每个碱基对参数的均值和标准偏差值。为了进行比较,还计算了与hiv和aml构建体(两个构建体在sirna双链体中具有相同的序列)中的sirna和传感器双链体具有相同序列组成的未连接的rna双链体的均值和标准偏差。表3a表3b尽管存在变形,但在整个模拟中所有预期的碱基对均得以保持,并且两个模型中传感器和rnai双链体的相对位置(dispositions)与dicer剪切的位阻保护一致。为了对构建体进行实证测试,从商业来源购买了成分链,并在1xpbs中使用热退火组装了cond-sirna。非变性聚丙烯酰胺凝胶(page)分析示出,两个高纯度组装的构建体,均能够对输入rna进行序列特异性检测,并且可以于37℃在1xpbs缓冲液中经由等温链置换释放rnai双链体(图5a,5d)。使用双重荧光素酶试验测量了off(向导链,核心链,和传感器链)和on(仅向导链和核心链)状态cond-sirna的rnai活性。将不同量的构建体与固定量的dna载体共转染至hct116细胞,该dna载体编码(a)双重荧光素酶报告子(reporter)和(b)短rna输入与传感器链互补(匹配)或非互补(不匹配)的序列(表1和表2)。在表达无效或完全不匹配的输入的细胞中,off状态cond-sirna具有显著降低的rnai活性,而on状态构建体被证明是有效的rnai触发器(图5b,5e由图6的northern印迹试验结果证实)。对于rnai激活,将off状态构建体转染至表达匹配或不匹配的输入的细胞(图5c,5f)。使用northern印迹评估了输入rna的表达水平(图4)。尽管当将数据以无转染sirna的细胞中的靶标表达标准化时,背景(off状态)rnai活性水平的波动降低了表观(apparatent)统计显著性(图5c和5f),但另一种直接比较匹配和不匹配的输入的分析表明,在匹配的输入下rnai活性显著增加(图10)。i.1和iii.1的不同传感器设计似乎导致rnai激活的某些功能性差异。构建体i.1具有5个核苷酸的5’和3’传感器链突出端。rnai激活不受与5’突出端输入不匹配的影响,但被与3’突出端的不匹配完全消除(图5c,5f,和10)。因此,只有3’传感器突出端作为链置换的立足点。在md模拟中,从构建体i.1的5’立足点的链置换将首先向构建体的内部进行,而从3’立足点的置换将向外部进行(图1c,1d)。因此,空间位阻可能在防止从5’立足点的链置换中发挥作用。其他因素,如rna输入上的结合位点可及性或5’和3’立足点之间碱基配对稳定性的差异,也可能有助于防止从5’立足点的链置换。尽管构建体iii.1具有效力相近的on状态rnai触发器(图5b,5e),但其比构建体i.1(图5c)示出了更强的rnai激活(图5f)。一个似合理的解释是,iii.1的8个碱基3’立足点的更高的热力学稳定性导致更快的链置换动力学。在构建体的关键区中进行化学修饰的进一步优化(图3a,高亮区域)。在核心链的3’和5’末端(图3b,区域a,位于传感器双链体的中央切口侧翼)和rnai双链体的核酸外切酶阻断结构域中(图3a,区域b),通过不同模式的化学修饰测量了构建体ii变体的off和on状态rnai活性(图7,8,构建体ii.1-5)。对于区域b,结果示出了rnai双链体的端热力学稳定性可能对抑制off状态rnai活性很重要。用锁核酸(lna)修饰替换核酸酶阻断模块中心的2’-ome修饰(图9c区域c)降低了背景rnai活性,而不会损害rnai的功效(图5g,ii.1与ii.2)。对于区域a,要关闭off-状态rnai活性,核心链的3’和5’末端需要通过化学修饰进行保护,以关闭off-状态rnai活性。当ps骨架键被磷酸二酯键取代时,背景rnai活性显著增加(图5g,ii.2具有3个连续末端ps,ii.3具有2个交替ps,ii.4具有单个末端ps),而未被修饰的末端则完全失去了控制rnai活性的能力(ii.0)。在区域a中使用ps键的问题是每个ps是具有两个可能的对映体构象的立体中心。不幸的是,更具核酸酶抗性的sp构象使rna碱基配对不稳定34。为了提高传感器双链体的热力学稳定性并减少外消旋的异质性,ps骨架修饰被2’-ome碱基修饰所取代(图5h,8c构建体ii.5-7)。在每个核心链末端使用三个连续的(ii.5),两个交替的(ii.6),或一个末端(ii.7)2’-ome碱基均会显著降低背景rnai活性。此外,所有三个基序都比ps修饰的类似物增加了on状态rnai功效(图5h,ii.5-7与ii.2,on状态)。为了确定2’-ome修饰是否允许细胞rna转录物激活rnai,使用两步转染方案比较了ii.1,ii.2,ii.6,和ii.7的rnai激活(图5i)。ii.6和ii.7均示出了显著降低的背景rnai活性,不匹配的rna转录物没有激活,并在表达了传感器的序列匹配的输入的细胞中显示出海肾荧光素酶靶标的rnai敲除增加(图5i,在2nmcond-sirna浓度的靶标表达降低~50%)。为了测试区域a优化的一般适用性,创建了具有2’-ome保护的核心链末端的构建体iii的版本(图8d,iii.2),并测试了其被细胞rna转录物的激活(图5j)。与原始的ps保护的变体(iii.1)相比,iii.2在表达不匹配的输入的细胞中具有显著降低的背景rnai活性,在表达正确输入的细胞中具有更好的rnai激活(图5j,iii.1与iii.2)。值得注意的是,仅从核心链末端之一(iii.3,核心链的3’突出端)去除末端2’-ome修饰几乎消除了对rnai活性的控制(图5j,iii.3)。在对核心链进行优化后,传感器链也得到了改进。最初的构建体(i.1,ii.1,iii.1)使用了在所有区域都具有ps,lna,和2’-ome修饰的完全被修饰的传感器链。传感器双链体区域中的ps修饰可通过降低碱基配对稳定性来增加假激活。另外,其他研究人员仅使用了2’-ome修饰而不使用lna以稳定在哺乳动物细胞中操作的链置换开关8,19。测试了本文公开的一系列构建体iii变体,该构建体iii变体将2’-ome保护的核心链(区域a)与在传感器链的双链体区域中具有lna+2’-ome+ps(图5k,8e,iii.2,iii.4),lna+2’-ome(iii.5),仅2’-ome(iii.6),或没有修饰(iii.7)的传感器链结合在一起。结果示出了传感器链的rna(iii.7)和仅2’-ome(iii.6)版本无法抑制非预期的rnai活性(图5k)。最优变体是iii.5,其在双链体区域中具有lna和2’-ome修饰的碱基,但没有ps修饰。在2nmcond-sirna浓度下,构建体iii.5在表达不匹配的rna输入的细胞中仅具有20%的背景rnai活性,在表达正确的rna输入的细胞中实现了海肾靶标的超过90%的敲除(匹配和不匹配之间的靶标表达降低~10x)。cond-sirna低至80pm时仍可见统计学上显著的rnai激活。利用从构建体iii的cbfb-myh11传感器优化中获得的见解,开发了构建体iv。构建体iv是cbfb-myh11感测cond-sirna,具有靶向mcl-1的rnai结构域,mcl-1是内源性凋亡抑制剂,对aml细胞35(但不是用于双重荧光素酶实验的hct116细胞)的存活至关重要。测试了三个版本的构建体iv的响应具有cbfb-myh11,cbfb,或myh11序列的转录物的rnai激活。为确保传感器在融合序列上激活,传感器链(与构建体iii中使用的相同)被设计为在其立足点形成区域中与myh11序列互补,并在其双链体区域中与cbfb序列互补(图9b)。测试了构建体iv的三个版本(图8f)。iv.1具有类似于原型构建体iii.1的修饰模式;构建体iv.2具有优化的区域a,b,和传感器链基序。iv.3使用先前发现对rnai功效影响不大的模式在向导链中进行了额外的2’-o-甲基修饰36。出乎意料的是,与iv.1相比,iv.2和iv.3都显著改善了对背景rnai活性的抑制并改善了rnai切换(图9c)。iv.2具有背景rnai,其导致在2nmcond-sirna的海肾读出靶标降低~60%,但在融合序列表达细胞中显示了海肾降低~90%。iv.3几乎没有可检测到的背景rnai,但是被激活的rnai活性也较低(在2nm的海肾降低~60%)。在一些实施例中,本文公开的cond-sirna构建体的化学修饰包括以下一个或多个:a.在图3a“用于筛选化学修饰的区域”中高亮的区域c使用的传感器链具有以下一个或多个特征:a.50%或更少的骨架位置是硫代磷酸酯(ps)连接。b.50%或更多的碱基被化学修饰以抵抗核酸酶降解或提高双链体的熔点(tm)c.100%的碱基被化学修饰以抵抗核酸酶降解并提高tmd.约10%-50%的碱基是锁核酸(lna)或具有实质上提高tm的2’-4’桥接修饰的其他被化学修饰的碱基。b.核心链的5’和3’末端具有以下一个或多个特征:a.5’上的末端碱基是2’-f,2’-o-甲基,或抵抗核酸酶剪切的其他被修饰的碱基b.3’上的末端碱基是2’-f,2’-o-甲基,或抵抗核酸酶剪切的其他被修饰的碱基c.5’上的三个末端碱基具有模式mrm,其中m是被修饰的碱基(2’-o-甲基,2’-f),r是rna碱基d.3’上的三个末端碱基具有模式mrm,其中m是被修饰的碱基(2’-o-甲基,2’-f),r是rna碱基e.3’和5’上的三个末端碱基没有连续的ps骨架修饰f.与传感器链碱基配对的核心链部分具有交替的化学修饰模式(mr)ng.以上,其中m是与等效的rna碱基相比不会降低双链体tm的被化学修饰的碱基h.任何组合,其中核心链的5’和3’端均具有a-g中至少一个特征i.与传感器链碱基配对的核心链的3’和5’区域是:(a)完全由模式(m)n构成,其中m是2’-o-甲基或2’-f修饰的碱基,或(b)该区中至少50%的碱基是2’-o-甲基或2’f,并且,多达30%,50%,80%,或100%的骨架连接不是硫代磷酸酯。c.三个碱基与向导链的3’末端碱基配对的核心链具有以下一个或多个特征:a.m*+*m模式,其中m是2’被修饰的碱基(例如,2’-o-甲基或2’-f),*是ps骨架连接,以及+是lna碱基或其他2’-4’桥接碱基b.m*+*+模式,如上所定义c.+*+*+模式d.r*+*m模式,其中r是rna碱基e.r*+*+模式f.+*m*m模式g.a-f中的模式,其中*可以是ps骨架连接或未被修饰的(磷酸二酯)骨架连接之一d.向导链具有以下一个或多个特征:a.30%至95%的碱基是被化学修饰的碱基(2’-o-甲基,2’-f,lna,2’-4’桥接碱基)b.其中5’上的两个末端碱基被化学修饰c.其中5’上的两个末端碱基具有至少一个lnad.其中5’上的两个末端碱基通过ps骨架连接e.其中3’上的两个末端碱基均被化学修饰f.其中~5%至50%的骨架连接是psg.其中位于dicer剪切的被表明的位点侧翼的碱基未被化学修饰。总之,本文公开的是可编程的,有条件激活的小干扰rna(cond-sirna)。仅在检测到来自不同输入基因的rna转录物时,装置才会输出针对靶标基因的有活性的rna干扰触发器。链置换传感器性能的改善和有条件激活的rnai的实现部分归因于五个关键设计原则。首先,rnai触发器需要与由输入rna和传感器链形成的废弃双链体完全分离以具有有效的rnai活性。条件性rnai的现有方案通常以被激活的rnai触发器为特征,经由watson-crick碱基配对保持与输入信号(例如,mrna)的连接15,17,18,37,60。在开发上一代条件性rnai触发器的过程中,发现dicer底物与相邻2’-o-甲基修饰的双链体rna结构域的连接显著降低了rnai活性(图11)。可能的原因是dicer抑制蛋白(如pact)38与延伸的双链体的结合。然而,rnai双链体与输入-传感器双链体的分离是实现off状态rnai抑制和on状态rnai功效的同时优化所必需的。用于图11中构建体的序列如下:其次,过去的条件性rnai触发器和其他dna电路的设计以单构建体15,16或多构建体17方案之一为特征,将输入序列翻译成独立的输出序列。从理论上讲,单构建体翻译器在信号检测和转导上本质上应该更有效率。但是,缺点是rnai触发器必须隐藏在构建体中,这就为由于构建体降解而导致的假rnai激活创造机会。所公开的cond-sirna设计的成功表明,可以利用单构建体翻译器的优势,同时有效地控制假激活的风险。第三,广泛的化学修饰是链置换传感器乃至cond-sirna正常运作的关键。优化实验的工作示例示出:1)传感器链的双链体结构域需要具有lna和2’-o-甲基修饰二者,但不具有ps修饰;2)保护链的末端需要用ps或2’-o-甲基之一进行修饰;3)热力学稳定的修饰大体上改善对背景激活的抑制,而热力学不稳定的修饰(如ps骨架)在双链体区域广泛使用时实际上可以增加假活性;4)虽然未在立足点结构域中测试化学修饰,但lna,2’-o-甲基,和ps修饰的组合是有益的,因为它们改善单链突出端的碱基配对亲和力和核酸酶抗性。第四,内源性rna降解机制可以是构建体切换的有效工具。如工作示例所示,与传感器链碱基配对时,核心链的被化学修饰的3’和5’末端区域高度稳定,但在不配对时易于降解。这种对核酸酶活性的差异敏感性可以通过ps修饰的末端来实现,但在2’-ome修饰时似乎更有效。如本文所证明,单链突出端的降解可以通过核酸外切酶阻断结构域在双链体的末端终止。使用该方案对所公开的rnai双链体进行修剪(trimming)得到来自dx二级结构的有效的rnai触发器。类似的方案在其他核酸纳米结构的动态重配置中可能有用。最后,两个不同的双链体中传感器和rnai结构域的分开对于细胞内稳定性,可编程性,和工程开发的简易性很重要。首先,两个结构域之间没有碱基配对重叠,也没有竞争的二级结构构象。这确保了大幅度的热力学稳定性,并简化了新输入和输出序列的编程。其次,双链体的尺寸和交叉点处的键合化学被配置为使三级结构中的应变最小化(图1c)。这进一步提高了热力学稳定性。第三,由于双链体不重叠,因此可以将化学修饰应用于传感器结构域而不损害rnai结构域的兼容性。提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明,并且不应将其解释为限制本发明的范围。就提及特定材料的程度而言,其仅出于说明的目的,并不旨在限制本发明。对于本领域技术人员将明显的是,可以做出多种等同,改变,和修改而不脱离本发明的范围,并且应当理解,此类等同实施例将被包括在本文中。此外,本公开中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文,如同在本文完全阐述。示例1:构建体设计cond-sirna被设计用于使用迭代方案的输入和靶标的特定配对。用于rnai结构域的合适的21-nt向导链序列从先前已验证的sirna,文献资料,或sirna设计工具中获取。通过在向导链的5’添加四个富含g/c的碱基,从选定的向导链中产生23-bp的dicer底物。nupack(rna链,mathews59公开的参数,并进行一些悬垂处理)被用于确认rnai双链体在1nm的向导链(反义链)和正义链以>95%的概率形成。根据输入生物标志物的序列,生成了(与输入反义的)所有可能的31至33nt传感器段的列表。对于cbfb-myh11融合序列,仅考虑近似满足图9b中所示参数的传感器段。使用ncbiblast对靶标动物的转录组中的传感器序列进行独特性排序。对于人癌细胞系,使用blastn算法针对人转录物+基因组收集检查了序列。在可能的情况下,消除了序列互补性超过17个碱基且与已知或预测的rna转录物完全突出端互补性的传感器段。从最独特的传感器段开始,根据cond-sirna的想要的结构性参数选择核心链序列。例如,核心链具有形式为5’-b-c3-p-c3-a-3’的序列,其中a和b与传感器链的假定的双链体结构域的5’和3’端互补,p与假定的向导链互补,并且c3是c3接头。使用nupack对在传感器链段及其对应的5’和3’核心链突出端之间形成的双链体的热力学稳定性进行排序。使用具有mathews等59公开的参数的rna链并进行一些悬垂处理。理想情况下,应在1nm链浓度对>95%的链进行碱基配对。还要检查核心链以确认其不具有大量的内部二级结构。选择具有以上设计的向导链,核心链,和传感器链序列的最佳构建体,并对其进行化学修饰。exiqon的寡核苷酸设计工具(www.exiqon.com/oligo-tools)用于优化lna修饰的位置。向传感器链添加大约每3至4个碱基1个lna修饰。使用lna寡核苷酸优化器工具检查lna模式不会导致分数高于60的二级结构或自配对相互作用。对自互补性和自配对分数进行了最大程度的优化。示例2:链的合成具有lna碱基的链由exiqoninc(现为qiagen的一个部门)合成。没有lna的链由ge生命科学dharmacon(现为地平线发现集团(horizondiscoverygroup)的一个部门)合成。根据制造商的建议,订购的所有链均进行了page或hplc纯化。示例3:cond-sirna的组装通过在1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)中进行热退火来组装cond-sirna。构建体可以在纯化或不纯化的情况下组装。组装质量可以于4℃在1xtbe中10%至15%page上使用非变性凝胶电泳进行评估。对于不纯化的组装,将传感器链,核心链,和向导链在1xpbsph~7.0中以50nm或100nm的浓度,1.1至1.00至1.1的摩尔比混合。使用略微过量的传感器链和向导链有助于防止组成型rnai有活性的向导+核心双链体的产生。使用具有以下程序的pcr热循环仪:·将盖子加热至105℃·在85℃保持30秒以使链变性·以0.1℃/秒的速率冷却至50℃·在50℃保持45分钟·以0.02℃/秒的速率冷却至37℃·以最大速度冷却至4℃并保持。对于要纯化的组装,使用上述退火方案将传感器链,核心链,和向导链以1um标称浓度在1xpbs中混合并组装。然后将组装后的构建体上样到tbe缓冲液中的bio-rad小型垂直电泳槽(miniprotean)10%天然page凝胶上,并在125v于4℃运行(run)~45分钟。在紫外灯照明下可视化对应于cond-sirna的条带并切除。根据制造商的说明,使用harvardapparatuselectroprep系统通过电洗脱提取被切除的条带。将凝胶片放置在由100kmwco滤膜和2kmwco滤膜密封的0.5ml腔室中。通过100kmwco膜洗脱构建体,并捕获在相邻的由100kmwco膜和第二个2kmwco膜形成的0.5ml腔室中。在0.1mna2hop4缓冲液(~ph7.0)中于4℃洗脱~45分钟。电源被设置为保持15ma的恒定电流,截止电压为65v。在非变性page上使用sybrgold染色并使用bio-radchemidocxrs+成像仪进行定量,通过与已知浓度的cond-sirna标准品进行比较,计算出被纯化的构建体的浓度。组装后的构建体最好在组装或纯化后立即使用。也可以将构建体于-80℃无限期地等分储存。然而,冻融循环损害了构建体质量并导致了构建体拆卸。可以通过在试验前立即重复热退火来重新组装已拆开的构建体。未纯化的构建体被用于多种测试,因为组装产率已经很高,并且纯化并不总是改善构建体的性能。示例4:链置换试验预组装的构建体以50nm标称浓度制备,并与50nm寡核苷酸活化剂(或用于对照的pbs)于37℃在pbs缓冲液中1∶1组合,以获得具有25nm输入信号和构建体的混合物。然后将构建体-输入组合在pcr热循环仪中于恒定37℃温育4小时。在指定的时间点收集样品,并立即将其在1x天然page上样染料中于-80℃冷冻。实验结束后,将所有样品快速解冻,并使用非变性page分析。示例5:双重荧光素酶报告子和活化剂质粒的产生使用标准分子生物学方案产生所有克隆,通过退火特定插入物的dna寡核苷酸,然后连接至亲本载体的指定位点。通过dna测序验证了所有构建体的准确性。示例6:psicheck双重荧光素酶报告子将下面所表示的dna寡核苷酸退火,并连接至psicheck2(promega)双重荧光素酶报告子的xhoi和noti位点。粗体字的核苷酸构成正义靶标序列。小写的核苷酸表示限制性位点5’突出端。hivu5区域靶标mcl-1靶标示例7:用于信号激活实验的rna输入转录物活化剂序列表达为嵌合trna转录物的一部分。第一部分由具有3’末端cca的被修饰的5trnalys3组成,其成熟序列完整地如下所示。cca阻止trna前体(pre-trna)加工酶(trnasez)进行内切核苷酸的剪切。trnapoliii启动子是内部的,并包含在trnadna的编码序列内。为了克隆包含trnalys3的前69个核苷酸的亲本质粒,在nrni限制性位点进行终止48。用nrni消化亲本质粒,紧接着核苷酸trna69产生钝端(bluntend)。退火后的重叠寡核苷酸编码其余被修饰的trna核苷酸,然后是指定的激活序列。每个激活序列终止于12-碱基的四环(ggcgcaagcc),然后是编码poliii终止序列u4+rna转录物序列的t6运行(run),如下所示。对于构建体i和ii,trnalys3前导序列,5’->3’:-活化剂序列。粗体的序列是northern印迹探针的结合位点。活化剂序列列于表1和表2中。下表5列出了northern印迹探针。示例8:组织培养所有分析均利用hct116结直肠癌细胞。使用补充有10%胎牛血清(fbs),1.5mml-谷氨酰胺(美国irvinescientific),和10mm丙酮酸(美国irvinescientific)且不含抗生素的mccoy的5a基础培养基(美国irvinescientific)维持细胞,并保存在37℃,5%co2湿培养箱中。示例9:nothern印迹分析在6孔板中使用2μg质粒dna在250μloptimem和250μl1∶50稀释的lipofectamine2000中进行活化剂表达分析。根据制造商的说明允许脂质体形成,并添加至具有2ml新鲜完全培养基的细胞中。在18小时更换培养基,且取决于转染的长短,随后的每一天至少更换一次,并且在rna收获前6小时更换。类似地对off和预激活(on)c-sirna进行分析;但是,将指定量的rnai复合物添加到2μgpbluescript质粒中,作为250μloptimem中的载体。使用1000μlrnastat-60(tel-test,inc)收获总rna,并根据制造商的说明进行处理,并在沉淀前使用1∶1苯酚:氯仿提取的第二次有机提取;将rna团块(pellets)用70%乙醇洗涤两次,然后蒸发掉多余的乙醇,将其重新悬浮在无rnase的te(ph6.8)中。对于northern分析,将15μg总rna在带有32p标记的ambion十年标志物的8%(对于活化剂)或12%(对于c-sirna)尿素-page凝胶(15em)上运行。将凝胶电印迹至hybondxl(ge医疗生命科学),使用sigmaperfecthybplus于37℃预杂交和杂交,并与5-10皮摩尔p32-5’端标记的寡核苷酸探针杂交。于37℃用2xssc/1%sds洗涤印迹4-5次。进行系列杂交时,除非另有说明,否则根据制造商的说明将旧的寡核苷酸探针从膜上去除,并在再杂交之前通过再曝光进行检查。u6snrna的杂交用于上样对照。表中列出了克隆程序,寡核苷酸,和所有探针序列。示例10:双重荧光素酶试验根据制造商的说明,使用promega双重荧光素酶报告子试验系统进行双重荧光素酶试验。将rnai靶标序列克隆到psicheck-2(promega)载体上的海肾荧光素酶基因的3’utr中,并将萤火虫荧光素酶用作参考对照。温育细胞并在48孔簇板中转染。转染前一天接种细胞,并以50%汇合度(confluency)转染。每个实验至少要完整重复三次,以获得生物学重复。图5b-5h的单步转染方案,图5i-5k和图9a的两步转染方案。单步共转染方案:对于每个实验,产生了opti-mem(赛默飞世尔科技(thermofisherscientific))中psicheck(普洛麦格公司(promegacorporation))报告质粒的预混物(mix)。将该预混物分成等份,并添加pbluescript(安捷伦(agilent))对照或一种活化剂质粒。然后将新混合物再次分开以添加不同浓度的cond-sirna复合物。最后,以1∶1的体积比将1∶50稀释的lipofectamine2000(l2k)添加至质粒+cond-sirna混合物中,以达到制造商建议的1∶100稀释l2k,并根据制造商的建议在室温下温育。对于每个实验条件(特定浓度的活化剂和c-sirna的组合),制备足够的混合物(需要3.3x的量)以转染3个单独的孔作为技术重复。因此,48孔板中的每个孔接受40μl转染混合物,由16μl(optimem中的psicheck和活化剂质粒),4μl(1xpbs缓冲液中的50xcond-sirna),和20μl(1∶50稀释l2k)组成。pbs为不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水,用depc(焦碳酸二乙酯)处理以去除任何rnase活性。即将转染前,用160μl新鲜培养基替换每个孔中的培养基,然后添加40μl转染混合物,最终体积为200μl/孔,含有:40纳克(ng)psicheck-2双重荧光素酶报告质粒,120ngpbluescript或活化剂表达质粒,和指定浓度的condsirna复合物。两步转染方案该方案被用于生成图5i-5k和图9a的数据。靶标和活化剂质粒转染1,时间-8小时对于两步转染,产生了opti-mem(赛默飞世尔科技)中psicheck(普洛麦格公司)报告质粒的预混物。将该预混物分成等份,然后添加pbluescript(安捷伦)对照或一种活化剂质粒。以1∶1的体积比将1∶50稀释的lipofectamine2000(l2k)与质粒混合物一起添加,以达到制造商建议的1∶100稀释l2k,并根据制造商的建议在室温下温育以形成脂质体复合物(lipoplexes)。对于每个实验条件,制备足够的混合物以转染3个单独的孔作为技术重复。因此,48孔板中的每个孔均接受40μl转染混合物,由20μl(opti-mem中的psicheck和活化剂质粒),和20μl(1∶50稀释l2k)组成。即将转染前,用160μl新鲜培养基替换每个孔中的培养基,然后添加40μl转染混合物,最终体积为200μl/孔,含有:40纳克(ng)psicheck-2双重荧光素酶报告质粒,和120ngpbluescript或活化剂-表达质粒。去除转染混合物,并在6小时后用培养基轻轻洗涤约2小时。向每个孔中添加160ul新鲜培养基,并继续细胞温育直到第二次转染。cond-sirna复合物转染2,时间-0转染1后8小时,使用rnaimax试剂(赛默飞)以实验中规定的不同浓度转染cond-sirna。对于每个实验条件,制备足够的每个浓度的cond-sirna,用于pbs中每个靶标/活化剂组合的技术三次重复。将每个cond-sirna稀释与等体积的1∶50rnaimax在optimem中混合,并根据制造商的说明在室温下温育以形成脂质体复合物。具体而言,48孔板中的每个孔均接受40μl转染混合物,由10x最终浓度的20μlcond-sirna(8μlpbs+12μlopti-mem),和20μl1∶50稀释rnaimax组成。维护对于单步方案,时间0标记为向细胞中添加共转染混合物的时间,对于两步方案,时间0作为添加cond-sirna复合物(转染#2)的时间。在转染后18小时更换培养基,接着的每一天至少更换一次,并且在制备裂解物前6小时更换。裂解物制备在每个实验的指定时间点,去除48孔板。从每孔小心地吸出培养基。然后将孔用1xpbs洗涤一次并吸干。向每孔中添加100μl1xpromega被动裂解缓冲液。然后用铝箔覆盖板,并于-80℃冷冻或放置在摇床上于室温轻轻搅拌(~70rpm)~30分钟。如果被冷冻,则在双重荧光素酶试验前,细胞在摇床上轻轻搅拌至少30分钟解冻。在试验之前,对孔进行目视检查以确保细胞充分裂解。试验根据制造商的说明,使用双重荧光素酶报告子试验试剂盒(普洛麦格)对细胞裂解物进行分析。海肾荧光素酶值在每个技术重复(每孔)中标准化为萤火虫荧光素酶。将实验中的技术三次重复取平均值,以获得单个生物学重复值。所有的图都代表了至少三个独立的生物学重复实验的结果。示例11:分子动力学模拟cond-sirna的原子模型使用核酸构建器49和自定义脚本构建,并使用accelrys(现为biovia,达索系统的一个部门)cerius45包编辑以产生适当的化学修饰。通过结合先前报道的rna50,2’-o-甲基51,lna52,和硫代磷酸酯53修饰的琥珀色力场参数产生了杂力场(ff)。先前的报道没有给出lna胸苷的参数集。lna糖环的ff参数衍生自lna力场,碱基参数衍生自amber03力场。使用respesp电荷推导(red)服务器(q4md-forcefieldtools.org/redserver/)计算电荷。非dna组分,如c3接头,末端胺修饰,和末端peg接头的ff参数取自gaffff54。将所有结构放置在周期盒中,每侧的间距为15a,然后用tip3水溶解55。首先添加mg2+离子以中和一半电荷,然后添加na+以中和另一半电荷。最后,添加额外的na+和cl-离子至150mm的浓度。在nvidiak80gpu上使用lammps13gpu兼容版本(release)(2016年12月21日)运行分子动力学模拟。结构首先用最陡下降最小化,然后用共轭梯度算法进行500步最小化,然后使用nvt系综(ensemble)通过md模拟310k在10ps的过程中使用1fs时间步长进行平衡。然后,于310k,350atm对所得结构进行10ps的nptmd以放松周期盒并确保正净压力。对于nvt模拟,使用nosé-hoover恒温器,时间常数为100fs。对于npt模拟,使用nosé-hoover恒压器,时间常数为1ps。然后,平衡后的结构于310°k(nvt系综,1fs时间步长)经历20ns的md。为了获取图9所示的结构,从md轨迹中提取具有最低势能的结构,并应用共轭梯度能量最小化进行500步。使用ucsfchimera包57可视化构建体。使用x3dna从模拟轨迹计算螺旋参数58。参考文献1.seeman,n.c.dnainamaterialworld.nature421,427-431(2003).2.guo,p.theemergingfieldofrnananotechnology.natnano5,833-842(2010).3.chen,y.-j.,groves,b.,muscat,r.a.&seelig,g.dnananotechnologyfromthetesttubetothecell.natnano10,748-760,doi:10.1038/nnano.2015.195(2015).4.benenson,y.biomolegularcomputingsystems:principles,progressandpotential.natrevgenet13,455-468,doi:http://www.nature.com/nrg/journal/v13/n7/suppinfo/nrg3197_s1.html(2012).5.yurke,b.,turberfield,a.j.,mills,a.p.,simmel,f.c.&neumann,j.l.adna-fuelledmolegularmachinemadeofdna.nature406,605-608,doi:http://www.nature.com/nature/journal/v406/n6796/suppinfo/406605a0_s1.html(2000).6.srinivas,n.etal.onthebiophysicsandkineticsoftoehold-mediateddnastranddisplacement.nucleicacidsresearch,doi:10.1093/nar/gkt801(2013).7.green,a.a.etal.complexcellularlogiccomputationusingribocomputingdevices.nature548,117-121,doi:10.1038/nature23271http://www.nature.com/nature/journal/v548/n7665/abs/nature23271.html#supplementaryinformation(2017).8.groves,b.etal.computinginmammaliancellswithnucleicacidstrandexchange.natnano11,287-294,doi:10.1038/nnano.2015.278http://www.nature.com/nnano/journal/v11/n3/abs/nnano.2015.278.html#supplementaryinformation(2016).9.setten,r.l.,rossi,j.j.&han,s.p.thecurrentstateandfuturedirectionsofrnaibasedtherapeuticsnaturereviewsdrugdiscovery,inpress(2019).10.bobbin,m.l.&rossi,j.j.rnainterference(rnai)-basedtherapeutics:deliveringonthepromise?annualreviewofpharmacologyandtoxicology56,103-122,doi:10.1146/annurev-pharmtox-010715-103633(2016).11.adams,d.etal.patisiran,anrnaitherapeutic,forhereditarytransthyretinamyloidosis.newenglandjournalofmedicine379,11-21,doi:10.1056/nejmoa1716153(2018).12.benenson,y.,gil,b.,ben-dor,u.,adar,r.&shapiro,e.anautonomousmolecularcomputerforlogicalcontrolofgeneexpression.nature429,423-429,doi:http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6990/suppinfo/nature02551_s1.html(2004).13.kumar,d.,kim,s.h.&yokobayashi,y.combinatoriallyinduciblernainterferencetriggeredbychemicallymodifiedoligonucleotides.journaloftheamericanchemicalsociety133,2783-2788,doi:10.1021/ja1107436(2011).14.han,s.p.,barish,r.d.&goddard,w.a.(googlepatents,2015).15.han,s.-p.,goddardiii,w.a.,scherer,l.&rossi,j.j.signalactivatableconstructsandrelatedcomponentscompositionsmethodsandsystems.usapatentu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