用丙酮酸激酶激活化合物治疗镰状细胞病的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求于2018年9月19日提交的美国临时申请第62/733,558号、于2018年9月19日提交的美国临时申请第62/733,562号、于2018年12月20日提交的美国临时申请第62/782,933号、于2019年1月8日提交的美国临时申请第62/789,641号和于2019年2月28日提交的美国临时申请第62/811,904号的权益，以上每篇通过引用以其整体并入本文。本公开涉及镰状细胞病(scd)的治疗，包括通过施用激活丙酮酸激酶r(pkr)的化合物来治疗诊断有scd的患者。
背景技术：
：镰状细胞病(scd)是由血红蛋白(hgb)的突变形式镰状hgb(hgbs)的遗传引起的慢性溶血性贫血。其是最常见的遗传性溶血性贫血，影响了70000至80000名美国(us)患者。scd的特征在于，当hgbs处于脱氧状态(脱氧hgbs)时，红细胞(rbc)中的hgbs聚合，导致镰状变形。镰状细胞聚集在毛细血管中，引起血管闭塞事件，其通常表现为急性和疼痛危象，导致组织缺血、梗死和长期组织损伤。由于镰状化(sickling)和其他因素，scd患者的rbc往往很脆弱，并且循环的机械损伤引起溶血和慢性贫血。最后，损伤的rbc具有贴附到血管内皮并损伤血管内皮的异常表面，引起增生性/炎性反应，其是大血管中风和潜在的肺动脉高压的基础。总体来说，这些导致了与该疾病相关的显著发病率和增加的致死率。目前，scd的治疗性疗法还有不足。唯一已知的针对scd的治疗是造血干细胞移植，该方法有严重风险，通常仅推荐用于最严重的病例，并且主要指提供给有同胞匹配供体的儿童。基因治疗也在调查中，初步结果颇有前途；然而，存在市场准入障碍，主要是高成本和治疗复杂性，这可能会限制其在近期的广泛应用。在过去二十年间，scd疗法几乎没有进展。羟基脲(hu)诱导阻断hgbs聚合的hgbf，因此具有降低scd血管闭塞危象和病理后遗症的作用。虽然hu广泛用作scd的主要疗法，但其仅部分有效，并且与毒性(如骨髓抑制和致畸性)有关。接受hu的患者仍经历溶血、贫血和血管闭塞危象，显示需要更有效的疗法，无论是作为hu的替代还是与之组合。除了hu之外，治疗性干预主要是支持性护理，旨在控制scd的症状。例如，输血通过增加正常rbc的数量来帮助贫血和其他scd并发症。然而，反复输血会导致铁超载并且需要螯合疗法以避免随之而来的组织损伤。除这些方法外，也使用止痛药来控制疼痛。鉴于现行的scd护理标准，对具有适当安全性和有效性的非侵入性疾病改善疗法有明确的医学需求。技术实现要素：本公开的一个方面涉及治疗scd的方法，包括对有需要的诊断有scd的患者施用治疗有效量的丙酮酸激酶r(pkr)激活剂。丙酮酸激酶r(pkr)是在rbc中表达的丙酮酸激酶的同种型，并且是糖酵解的关键酶。本发明部分基于以下发现：pkr的激活既能够通过减少脱氧hgbs而靶向镰状化，又能够靶向溶血。靶向溶血(targetinghemolysis)可以通过改进rbc膜完整性来实现。本公开的一个方面是认识到pkr的激活可以减少2,3-二磷酸甘油酯(2,3-dpg)(其导致脱氧hgbs减少(因此，减少镰状化))，并且可以增加atp(其促进膜健康并减少溶血)。本公开的另一方面是认识到pkr的激活可以减少2,3-二磷酸甘油酯(2,3-dpg)(其抑制hgbs脱氧/增加hgbs的氧亲和力并导致脱氧hgb减少(因此，减少镰状化))，并且可以增加atp(其促进膜健康并减少溶血)。因此，在一个实施方式中，pkr激活(例如，通过向诊断有scd的患者施用治疗有效量的pkr激活化合物)通过降低2,3-二磷酸甘油酯(2,3-dpg)的水平来减少rbc镰状化，进而减少了镰状hgb(hgbs)聚合为使细胞变形的刚性聚集体。此外，在一些实施方式中，pkr激活可通过增加三磷酸腺苷(atp)的水平来促进整体rbc膜完整性，预计这会减少引起scd患者急性疼痛危象和贫血的血管闭塞和溶血事件。优选地，用化合物来治疗诊断有scd的患者，所述化合物是pkr激活化合物。pkr激活剂可以是鉴定为pkr激活化合物的化合物或者鉴定为pkr激活组合物的组合物或其可药用盐和/或其他固体形式，所述化合物或组合物使用如实施例2中所述的发光测定检测具有小于1μm的ac50值。例如，pkr激活化合物可以为化合物(s)-1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(化合物1)：或其可药用盐。化合物1是一种选择性的口服可生物利用的pkr激活化合物，其可以减少2,3-dpg，增加atp，并在疾病模型中具有抗镰状化作用，相对于临床前毒性具有广阔的治疗利益。pkr激活化合物可以容易地鉴定为式i化合物：或其可药用盐(例如化合物1及化合物1与其立体异构体的混合物)，其使用如实施例2中所述的发光测定具有小于1μm的ac50值。在其他实施方式中，pkr激活化合物可以是图1中列出的任何化合物或其可药用盐。pkr激活化合物，例如1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其可药用盐，在用于治疗诊断有scd的患者的药物组合物中是可用的。pkr激活化合物，例如图1中列出的任何化合物或其可药用盐，在用于治疗诊断有scd的患者的药物组合物中是可用的。包含式i化合物(例如，化合物1)或其可药用盐的的组合物可以通过也在本文中提供的某些方法获得。包含图1中列出的任何化合物或其可药用盐的组合物可以通过也在本文中提供的某些方法获得。本文提供的治疗scd的方法与现有的和新兴的疗法相比，可以对血管闭塞危象和溶血性贫血提供更大保护。因此，使用pkr激活化合物，如化合物1，提供了新颖的和改进的治疗方法，无论是单独还是与通过另一种机制发挥作用的药物(如羟基脲(hu))组合使用。此外，使用pkr激活化合物，例如图1中列出的任何化合物，提供了新颖的和改进的治疗方法，无论是单独还是与通过另一种机制发挥作用的药物(如羟基脲(hu))组合使用。附图说明图1是pkr激活化合物的表格。图2是显示pkr激活与镰状细胞病(scd)临床后果减少的关系的示意图。图3是通过绘制血红蛋白饱和度(百分比)与氧分压(mmhg)之间的关系来显示氧合血红蛋白解离曲线和调节因子的图表。图4a是式i化合物的化学合成方案，包括化合物1的合成(在图4b中单独提供)。图4b是化合物1的化学合成方案。图4c是图1列出的化合物的一般化学合成。图5是显示用化合物1激活重组pkr-r510q的图表，绘制了标准化速率对磷酸烯醇式丙酮酸(pep)浓度(实施例3)。图6是显示在实施例3的酶测定法中通过化合物1激活重组pkr-r510q的数据图。图7是显示用化合物1治疗的人红细胞中的pkr激活的数据图(实施例4)。图8a和8b是显示用化合物1治疗对scd患者的rbc中的氧合血红蛋白解离的影响的数据表(实施例5)。图8a以灰度显示每个数据点，而图8b以程式化线条显示同样的数据。图9是显示scd患者的红细胞在不同氧张力下的血红蛋白饱和度的δ曲线的数据图(实施例5)。测量间隔为1mmhg。图10是显示化合物1在缺氧条件下对人scd细胞的镰状化的影响的数据图(实施例5)。图11a(研究1)和图11b(研究2)各自是显示在用化合物1每日一次(qd)口服治疗7日后观察到的小鼠血液中2,3-dpg水平的变化的图表(实施例6)。图12是显示在用化合物1每日一次(qd)口服治疗7日后观察到的小鼠血液中2,3-dpg水平的变化的图表(实施例6，研究2)。图13a(研究1)和图13b(研究2)是在用化合物1每日一次(qd)口服治疗7日后测量小鼠红细胞中atp浓度的数据图(实施例6)。图14a和图14b各自是显示在scd小鼠模型中用化合物1口服治疗7日后rbc中的氧饱和度的数据图(实施例7)。图15a和图15b各自是显示在scd小鼠模型中用化合物1口服治疗7日后rbc中的氧饱和度变化的数据图(实施例7)。图16是显示在用化合物1口服治疗7日后scd小鼠模型中的镰状细胞百分比的数据表(实施例7)。图17是显示在用化合物1口服治疗7日后scd小鼠模型中的细胞中网织红细胞计数的数据表(实施例7)。图18是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中随时间测量的血液2,3-dpg水平的图表。图19是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中在给药后24小时测量的血液2,3-dpg水平的图表。图20是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中在给药后24小时测量的p50值的图表。图21是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中在给药前和给药后24小时测量的p50值的图表。图22是在持续14日接受化合物1或安慰剂的每日剂量的健康志愿者中随时间测量的血液2,3-dpg水平的图表。图23是在持续14日接受化合物1或安慰剂的每日剂量的健康志愿者中在第14日测量的血液2,3-dpg水平的图表。图24是在持续14日接受化合物1或安慰剂的每日剂量的健康志愿者中在第14日测量的p50值的图表。图25是在持续14日接受化合物1或安慰剂的每日剂量的健康志愿者中在给药前和在第14日测量的p50值的图表。图26是在持续14日接受化合物1或安慰剂的每日剂量的健康志愿者中在第14日测量的血液atp水平的图表。图27是显示在接受化合物1或安慰剂的健康受试者中在给药前和给药后24小时(sad组)以及在第14日给药后24小时(mad组)测定的p50值的差值的图表。图28是绘制了在施用单剂量化合物1(400mg)之后在第一(左)轴上的健康志愿者(hv)患者中测量的化合物1的血液浓度(ng/ml)和在第二(右)轴上的这些hv患者中测量的2,3-dpg浓度(毫克/ml)的图表。图29是在sad组和mad组中的健康志愿者中观察到的2,3-dpg水平和p50值的散点图。具体实施方式治疗scd的方法优选包括施用治疗有效量的减少hgbs聚合(例如通过增加hgbs的氧亲和力)的化合物(例如，化合物1)。治疗scd的方法还优选包括施用治疗有效量的减少hgbs聚合(例如通过增加hgbs的氧亲和力)的化合物(例如，图1中列出的任何化合物)。在人rbc中减少2,3-dpg水平和/或增加atp水平的方法包括施用pkr激活化合物，如化合物1。在人rbc中减少2,3-dpg水平和/或增加atp水平的方法还包括施用pkr激活化合物，如图1中列出的任何化合物。总体上，这些作用与提供减少hgbs镰状化和改善rbc膜健康的疗法相一致，呈现了用于治疗scd的独特的疾病改善机制。pkr激活化合物，如化合物1，可以用于促进糖酵解途径中的活性。pkr激活化合物，如图1中列出的任何化合物，也可以用于促进糖酵解途径中的活性。作为催化糖酵解最后一个步骤的酶，pkr直接影响rbc的代谢健康和主要功能。pkr激活化合物(例如，化合物1)，可以用于减少2,3-dpg和增加atp。pkr激活化合物(例如，图1中列出的任何化合物)，可以用于减少2,3-dpg和增加atp。pkr激活化合物(例如，化合物1或图1中列出的任何化合物，优选化合物1)也可以用于增加rbc中的hgb氧亲和力。本公开部分地基于以下发现：pkr激活是scd的治疗方法，其中通过减少2,3-dpg水平和增加atp水平来减少hgbs聚合和rbc镰状化。scd是最常见的遗传性血液病，临床表现为与显著的物理、情绪和经济负担相关的潜在严重的病理学状况。例如，急性血管闭塞疼痛危象会使人虚弱，并且需要迅速的医疗响应。慢性溶血性贫血导致疲劳，并且经常需要输血和支持性护理。随时间推移，通过微血管的氧转运受损会导致器官和组织损伤。尽管有许多可以用于治疗症状的选择，但整体疾病控制将受益于靶向预防血管闭塞和溶血的上游过程的疗法。所描述的临床症状主要可以归因于因hgbs分子聚集所致的rbc膜性质和功能的紊乱。与正常hgb不同，hgbs在处于脱氧状态时会聚合，最终导致不能通过小血管的变形的、刚性的膜，从而阻断通过微血管的正常血流。膜弹性的丧失也会增加溶血，减少rbc的寿命。此外，细胞atp减少和氧化性损伤导致了镰状rbc膜，其与正常rbc的膜相比更为刚性和更弱。损伤的膜有贴附到血管上的更大倾向，导致溶血、镰状rbc聚集增加和与血管闭塞危象相关的凝血和炎症增加。镰状化的根本原因是刚性脱氧hgbs聚集体的形成，这种聚集体改变了细胞形状，并且因此影响细胞生理和膜弹性。这些聚集体是脱氧hgbs的高度结构化的聚合物；氧合形式不发生聚合。从氧合的松弛(r)态到未结合的紧张(t)态的细微构象变化促进了聚合。在后者中，hgbs的β链内的某些残基能以特定和重复的方式相互作用，有利于聚合。脱氧hgbs的浓度取决于若干因素，但主要因素是氧分压(po2)。氧可逆地结合到hgb分子的血红素部分。当氧合血流通过毛细血管流到主动消耗氧的周围组织和器官中时，po2降低并且hgb释放氧。氧与hgb的结合是协作性的，并且与po2水平的关系符合s型曲线(图3)。这一关系可以受温度、ph、二氧化碳和糖酵解中间体2,3-dpg影响。2,3-dpg结合在hgb四聚体的中央空腔内，导致变构性变化，并且降低hgb的氧亲和力。因此，增加hgbs的氧亲和力(即，减少脱氧)的治疗方法可能会减少聚合物形成、细胞膜改变以及与scd相关的临床后果。本公开的一个方面是根据pkr在控制rbc中糖酵解速率的作用靶向pkr激活以减少2,3-dpg水平。已在临床前研究中和在健康志愿者及丙酮酸激酶缺乏症患者中证实了用pkr激活减少2,3-dpg。另外地，预期pkr激活将会增加atp，并且在相同研究也已观察到这一点。鉴于atp在维持健康的rbc膜和保护免受氧化性应力中的作用，提高其水平可能有广泛的有益作用。因此，pkr的激活提供了2,3-dpg效应的可能性(即，减少因hgbs聚合所致的细胞膜损伤)，该作用通过atp对膜完整性的支持而被增强。通过这些变化，pkr激活剂能对导致scd临床病理学的生理变化有积极影响(图2)。在另一方面，本公开涉及在患有hgbss或hgbsb0地中海贫血的scd患者(例如，≥12岁年龄)中改善贫血和与贫血相关的并发症的方法。化合物1是一种选择性的、口服可生物利用的pkr激活化合物，已证实了其减少2,3-dpg，增加atp，并在疾病模型中具有抗镰状化作用，相对于临床前毒性具有广阔的治疗利益。治疗方法可以包括对有需要的受试者施用治疗有效量的(i)pkr激活化合物(例如，本文公开的化合物)或其可药用盐；或(ii)pkr激活组合物(例如，包含本文公开的化合物或其可药用盐以及可药用载体的药物组合物)。药物组合物可以以任何口服可接受剂型进行口服施用。在一些实施方式中，为增加红细胞寿命，将本文所述的化合物、组合物或药物组合物直接地加入到全血或在体外加入浓缩细胞中或直接提供给受试者(例如，患者)。可以通过以下方式选择用于使用本文所述的化合物治疗的患者和/或受试者：首先评价患者和/或受试者以确定该受试者是否需要pkr激活，如果确定该受试者需要pkr激活，则对该受试者以可药用组合物形式施用pkr激活化合物。可以通过以下方式选择用于使用本文所述的化合物治疗的患者和/或受试者：首先评价患者和/或受试者以确定该受试者是否诊断有scd，如果确定该受试者诊断有scd，则对该受试者以可药用组合物形式施用pkr激活化合物。例如，施用治疗有效量的pkr激活化合物可以包括以单剂量或分次剂量每日施用总共约25mg-1500mg化合物1。在一些实施方式中，对诊断有scd的患者施用化合物1，每日一次(qd)总剂量为25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg和/或更高量(如果耐受的话)(例如，250mg、300mg、500mg、600mg、1000mg和/或1500mg)。在一些实施方式中，对有需要的患者(例如，诊断有scd的患者)每日一次(qd)施用80至130mg化合物1的人类剂量。在一些实施方式中，以每日400mg的量(例如，400mgqd或200mgbid)的量施用pkr激活化合物。在一些实施方式中，以每日400mg的量(例如，400mgqd或200mgbid)施用化合物1或其可药用盐。在一些实施方式中，以每日400mg的量(例如，400mgqd或200mgbid)施用图1中列出的任何化合物或其可药用盐。在一些实施方式中，以每日700mg的量(例如，700mgqd或350mgbid)施用pkr激活化合物。在一些实施方式中，以每日700mg的量(例如，700mgqd或350mgbid)的量施用化合物1或其可药用盐。在一些实施方式中，以每日700mg的量(例如，700mgqd或350mgbid)施用图1中列出的任何化合物或其可药用盐。在一些实施方式中，以单剂量或分次剂量以每日100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量施用pkr激活化合物。在一些实施方式中，以单剂量或分次剂量以每日100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量施用化合物1或其可药用盐。在一些实施方式中，以单剂量或分次剂量以每日100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量施用图1中列出的任何化合物或其可药用盐。治疗诊断有scd的患者的方法可以包括对有需要的患者施用靶向减少脱氧hgbs的治疗性化合物，该化合物可能或不可能直接地改善rbc膜完整性。已证实化合物1减少2,3-dpg和增加atp，并且已在疾病模型中验证了细胞镰状化减少。因此，在一些实施方式中，治疗方法不仅能解决镰状化，还能解决溶血和贫血。治疗诊断有镰状细胞病的患者的方法及用于此类方法中的pkr激活化合物可以包括对患者施用pkr激活化合物(例如，包含一种或多种式i化合物(如化合物1或者化合物1和化合物2的混合物)的组合物)，该pkr激活化合物的量足以减少患者红细胞中的2,3-dpg水平。在一些实施方式中，该量足以在24小时之后将2,3-dpg水平减少至少30％或更多(例如，在24小时之后将患者红细胞中的2,3-dpg水平减少至少40％)。在一些实施方式中，该量足以在24小时之后将2,3-dpg水平减少30-50％。在一些实施方式中，该量足以在24小时之后将2,3-dpg水平减少40-50％。在一些实施方式中，该量足以在12小时之后将2,3-dpg水平减少至少25％。在一些实施方式中，该量足以在12小时之后将2,3-dpg水平减少25-45％。在一些实施方式中，该量足以在6小时之后将2,3-dpg水平减少至少15％。在一些实施方式中，该量足以在6小时之后将2,3-dpg水平减少15-30％。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将2,3-dpg水平减少至少40％。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将2,3-dpg水平减少40-60％。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将2,3-dpg水平减少至少50％。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将2,3-dpg水平减少50-60％。治疗诊断有镰状细胞病的患者的方法及用于此类方法中的pkr激活化合物还可以包括对患者施用pkr激活化合物(例如，包含一种或多种式i化合物(如化合物1或化合物1和化合物2的混合物)的组合物)，其每日量足以增加患者的atp血液水平。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将atp血液水平增加至少40％或更多(例如，在治疗第14日增加至少50％)。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将atp血液水平增加40-65％。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将atp血液水平增加至少50％或更多(例如，在治疗第14日增加至少50％)。在一些实施方式中，该量足以在治疗第14日将atp血液水平增加50-65％。在一些示例中，包含化合物1的药物组合物可以用于治疗诊断有镰状细胞病的患者的方法，该方法包括对患者每日一次(qd)施用400mg化合物1：在一些示例中，包含化合物1的药物组合物可以用于治疗诊断有镰状细胞病的患者的方法，该方法包括对患者每日两次(bid)施用200mg化合物1：在一些实施方式中，本公开提供了式i的pkr激活化合物：或其可药用盐。在一些实施方式中，pkr激活化合物是1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。式i化合物优选地是化合物1：或其可药用盐。在一些实施方式中，式i化合物是(s)-1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。在一些实施方式中，本公开提供了pkr激活化合物，其是图1中列出的任何化合物或其可药用盐。本公开还提供了包含式i化合物的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方式中，所提供的包含式i化合物的组合物包括化合物1和化合物2的混合物：或其可药用盐。本公开还提供了包含图1中列出的任何化合物或其可药用盐的组合物(例如药物组合物)。药物组合物(包括包含式(i)化合物的pkr激活组合物)可以配制用于口服施用(例如，作为胶囊或片剂)。例如，化合物1可以与合适的药典赋形剂结合形成包含目标剂量的化合物1的口服单位剂型，如胶囊或片剂。药物产品可以通过如下方式制成：首先制备化合物1作为活性药物成分(api)，随后与粒内赋形剂一起碾压/研磨并与额外的颗粒赋形剂掺合。药物产品可以在具有理想的化合物1的剂量强度的片剂(例如，由表1中的药物组合物形成的25mg或100mg片剂)中包含表1中的化合物1api和赋形剂组分。将掺合后的材料压制形成片剂，随后进行薄膜包衣。药物组合物优选地在口服剂型中包含约30-70重量％的(s)-1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮和可药用赋形剂。表1.用于口服施用的化合物1的示例性药物组合物在一些实施方式中，所提供的含有式i化合物的组合物包含(s)-1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮和(r)-1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮的混合物。在一些实施方式中，所提供的包含式i化合物的组合物是作为pkr激活组合物的一部分的化合物1和化合物2的混合物。在一些实施方式中，式i化合物是外消旋的。在一些实施方式中，式i化合物由约50％的化合物1和约50％的化合物2组成。在一些实施方式中，式i化合物不是外消旋的。在一些实施方式中，式i化合物不由约50％的化合物1和约50％的化合物2组成。在一些实施方式中，式i化合物包含约99-95％、约95-90％、约90-80％、约80-70％或约70-60％的化合物1。在一些实施方式中，式i化合物包含约99％、98％、95％、90％、80％、70％或60％的化合物1。在一些实施方式中，pkr激活组合物包含化合物1和化合物2的混合物。在一些实施方式中，pkr激活组合物包含化合物1和化合物2的混合物，其中该pkr激活组合物包含治疗有效量的化合物1。包含式i化合物的组合物可如图4a和图4b中所示的制备。式i化合物可通过图4a的一般化学合成方案获得。化合物1可通过图4a或图4b的化学合成途径获得。简言之，式i化合物(图4a)和/或化合物1(图4b)可从市售起始材料通过一系列四个反应步骤获得。将市售的7-溴-2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶用正丁基锂和二丁基镁处理，随后用硫酰氯处理，得到磺酰氯3。用1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-甲酸叔丁酯在三乙胺(tea)存在下处理3得到boc-保护的单磺酰胺4。随后将化合物4在三氟乙酸(tfa)存在下脱保护以得到5，单磺酰胺的游离碱。产生化合物1(图4b)或化合物1和化合物2(图4a)的最后一个步骤是5与莨菪酸在1-[二(二甲氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶六氟磷酸盐3-氧化物(hatu)存在下的酰胺偶联。图1中列出的化合物可如图4c中所示和如2018年9月27日公开的国际公开wo2018/175474中所述制备。通常，图1中列出的化合物可通过六氢吡咯并吡咯6的仲胺基团的酰化和磺酰化来制备。例如，用合适的磺酰氯7将6磺酰化提供了磺酰基六氢吡咯并吡咯8，随后将其用合适的羧酸9在酰胺偶联试剂(例如，hatu)存在下处理以得到化合物10(路径1)。可替代地，将6用合适的羧酸9在酰胺偶联试剂存在下酰化得到酰基六氢吡咯并吡咯11，随后将其用合适的磺酰氯7处理以得到化合物10(路径2)。如本领域技术人员将会理解的，公知的保护机体、官能化反应和分离技术可与路径1和2结合使用以得到图1中列出的具体化合物。治疗scd的方法还包括施用治疗有效量的减少hgbs聚合(例如通过增加hgbs的氧亲和力)的生物活性化合物(例如，小分子、核酸或抗体或其他疗法)。在一些实施方式中，治疗scd的方法包括对有需要的患者施用如下的生物活性化合物，在用该化合物口服治疗7日之后，该化合物减少了本文实施例7中提供的镰状细胞病小鼠模型中镰状细胞的百分比。在一些实施方式中，生物活性化合物是如下的任何化合物(包括小分子、核酸、蛋白质或抗体)，该化合物在实施例7中提供的镰状细胞病小鼠模型中显示以下一种或多种特性：(a)增加低氧条件下对hgb的氧亲和力；(b)减少低氧条件下的p50；(c)减少在低氧压下镰状化的rbc的百分比；(d)增加细胞镰状化的时间；和/或(e)使hgb增加至少约1g/dl。在其他实施方式中，本公开涉及以下编号实施方式中的每一个：1.包含式i的pkr激活化合物或其可药用盐的组合物：2.实施方式1的组合物，其中式i化合物是化合物1或其可药用盐：3.实施方式2的组合物，其中所述组合物包含化合物1和化合物2的混合物或其可药用盐：4.实施方式1的组合物，包含以下化合物：1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。5.实施方式1-4中任一项的组合物，配制为口服单位剂型。6.治疗诊断有镰状细胞病(scd)的患者的方法，该方法包括对有需要的患者施用治疗有效量的包含(s)-1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其可药用盐的药物组合物。7.实施方式6的方法，其中所述方法包括口服施用包含(s)-1-(5-((2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮作为药物组合物中唯一pkr激活化合物的药物组合物。8.治疗诊断有镰状细胞病(scd)的患者的方法，该方法包括对有需要的患者施用治疗有效量的包含化合物1的药物组合物：或其可药用盐。9.包含式i化合物的组合物，其可通过包含在如步骤4所述的反应中将化合物5转化为式i化合物的步骤的方法获得：10.实施方式9的组合物，其中所述方法还包括首先通过包含步骤3的方法从化合物4获得化合物5：11.实施方式10的组合物，其中所述方法还包括首先通过包含步骤2的方法从化合物3获得化合物4：12.实施方式11的组合物，其中所述方法还包括首先通过包含步骤1的方法获得化合物3：13.治疗诊断有镰状细胞病的患者的方法(scd)，该方法包括对有需要的患者施用治疗有效量的pkr激活化合物，使用实施例2中所述的发光测定，该pkr激活化合物具有低于1μm的ac50值。14.实施方式13的方法，其中所述pkr激活化合物是化合物1。15.实施方式13-14中任一项的方法，其中所述pkr激活化合物口服施用给有需要的患者。16.化合物1：或其可药用盐在用于治疗诊断有镰状细胞病(scd)的患者中的用途。17.pkr激活化合物在治疗诊断有镰状细胞病的患者中的用途，所述pkr激活化合物使用实施例2中所述的发光测定法具有低于1μm的ac50值。18.实施方式6-8或13-15中任一项的方法，包括每日一次施用化合物1。19.实施方式6-8或13-15中任一项的方法，包括每日施用总共25mg-1500mg化合物1。20.实施方式18-19中任一项的方法，包括每日施用总共25mg-130mg化合物1。21.治疗诊断有scd的患者的方法，包括对患者施用治疗有效量的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物在实施例10中提供的镰状细胞病的小鼠模型中显示以下一种或多种特性：(a)增加低氧条件下对hgb的氧亲和力；(b)减少低氧条件下的p50；(c)减少在低氧压下镰状化的rbc的百分比；(d)增加细胞镰状化的时间；和/或(e)使hgb增加至少约1g/dl。22.实施方式21的方法，其中所述pkr激活化合物是抗体。23.实施方式21的方法，其中所述pkr激活化合物是蛋白质。24.实施方式21的方法，其中所述pkr激活化合物是核酸。25.实施方式21的方法，其中所述pkr激活化合物是dna核酸。26.实施方式21的方法，其中所述pkr激活化合物是rna核酸。在其他实施方式中，本公开涉及以下编号实施方式中的每一个：1.pkr激活化合物，该化合物用于治疗诊断有镰状细胞病的患者的方法(scd)，包括对患者施用治疗有效量的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是式i化合物：或其可药用盐，使用在实施例2中所述的发光测定法，该化合物具有小于1μm的ac50值。2.实施方式1的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：或其可药用盐。3.实施方式1的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：4.实施方式3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日25-1500的量施用。5.实施方式3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日250mg、300mg、500mg、600mg、1000mg或1500mg的量每日一次施用。6.实施方式3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日100mg的量每日施用一次。7.实施方式3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日600mg的量每日施用一次。8.实施方式3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每日施用一次。9.实施方式3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物经口服施用给患者。10.实施方式3所述的pkr激活化合物，其中化合物1是施用给患者的唯一pkr激活化合物。11.pkr激活化合物，所述化合物用于治疗诊断有镰状细胞病的患者的方法，所述方法包括对患者施用所述pkr激活化合物，其量足以在24小时后将患者红细胞中的2,3-dpg水平降低至少30％，其中所述pkr激活化合物是式i化合物：或其可药用盐，使用在实施例2中所述的发光测定法，该化合物具有小于1μm的ac50值。12.实施方式11的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：或其可药用盐。13.实施方式1的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：14.实施方式13所述的pkr激活化合物，其中化合物1是施用给患者的唯一pkr激活化合物。15.实施方式11-14中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物经口服施用给患者。16.实施方式11-15中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每日施用一次。17.实施方式11-16中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以如下量施用：该量足以在24小时后将患者红细胞中的2,3-dpg水平减少至少40％。18.实施方式11-17中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以如下量施用：其每日剂量足以在治疗第14日将患者的atp血液水平增加至少40％。19.实施方式11-15中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量施用。20.实施方式11-15中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日200mg的量施用。21.实施方式20所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日一次(qd)200mg的量施用。22.实施方式20所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日两次(bid)100mg的量施用。23.实施方式11-15中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日400mg的量施用。24.实施方式23所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日一次(qd)400mg的量施用。25.实施方式23所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日两次(bid)200mg的量施用。26.实施方式11-15中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日600mg的量施用。27.实施方式26所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日两次(bid)300mg的量施用。28.实施方式11-15中任一项的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日700mg的量施用。29.实施方式28所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日一次(qd)700mg的量施用。30.实施方式28所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每日两次(bid)350mg的量施用。本公开使本领域技术人员能根据多个不同实施方式制备和使用本文提供的发明。本领域技术人员容易想到的本发明的各种改变、修改和改进，包括某些改变、修改、替换和改进也是本发明的一部分。因此，上述描述和附图是通过举例的方式来说明本文提供的发现。实施例作为催化糖酵解最后一个步骤的酶，pkr是直接地影响rbc的代谢健康和主要功能的反应的基础。以下实施例显示了通过化合物1进行的pkr激活如何影响rbc。化合物1对rbc的主要影响是减少2,3-dpg(这被认为会减少hgb镰状化)以及其对rbc和组织氧输送的影响。化合物1还增加atp，这可提供代谢源以支持细胞膜完整性并提供保护以防止可变性形丧失和scd中溶血水平增加。通过化合物1对rbc的影响组合，有可能减少镰状hgb的临床后遗症并为scd患者提供治疗利益。指定为化合物1的pkr激活化合物如实施例1中所述制备，并且在实施例2的生物活性测定法中检测其pkr激活活性。分别如实施例3和实施例4中所述，用化合物1在酶和细胞测定法中评价pkr的生物酶活性(即，atp和/或丙酮酸的形成)。酶测定法的结果显示化合物1是重组野生型pkr和突变pkr(例如r510q，其是北美最普遍的pkr突变之一)的激活剂。pkr以二聚体和四聚体状态存在，但作为四聚体最有效地发挥影响。化合物1是pkr的变构性激活剂，其被证实使prk的四聚体形式稳定，从而降低了对pep的km(michaelis-mentenconstant，米-曼二氏常数)。类似地，用人类scd患者的rbc所做的测定的结果显示，用化合物1治疗导致p50(50％血红蛋白饱和度下的po2)变化，这种变化与在化合物1存在下氧亲和力增加相关(实施例5)。此外，化合物1降低了严重缺氧条件下的镰状化。总体来看，数据显示，化合物1能通过降低细胞镰状化来减少镰状细胞的临床后果，这种降低细胞镰状化是通过来自pkr激活所致的氧亲和力增加得到的。小鼠体内测试(实施例6和7)验证了野生型小鼠中的pkr激活，并且提供了对scd小鼠模型中的rbc和hgb的影响的评价。化合物1在所测试的最高剂量下耐受良好，暴露量以与剂量成比例的方式增加。剂量≥120mg/kg的化合物1(从0到24小时的auc(auc0-24)>5200hr·ng/ml)的2,3-dpg水平降低了>30％，剂量≥60mg/kg的化合物1(auc0-24>4000hr·ng/ml)的atp水平升高了>40％。在用scd小鼠模型进行的两项研究中，在7日口服(咀嚼)施用化合物1之后在体外rbc中观察到氧亲和力增加、镰状化减少和hgb增加。总的来说，数据支持了用化合物1治疗scd的暴露相关治疗益处。在一些实施方式中，对人施用每日剂量在100mg至1500mg之间的pkr激活化合物。在一些实施方式中，对人施用每日剂量在100mg至1500mg之间的化合物1。在一些实施方式中，对人施用每日剂量在100mg至1500mg之间的图1所示任何化合物。具体地，可对人施用总日剂量为100mg–600mg的pkr激活化合物(包括，例如，每日100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg的剂量，以单剂量或分次剂量施用)。具体地，可对人施用总日剂量为100mg–600mg的化合物1(包括，例如，每日100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg的剂量，以单剂量或分次剂量施用)。具体地，可对人施用总日剂量为100mg–600mg的图1中列出的任何化合物(包括，例如，每日100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg的剂量，以单剂量或分次剂量施用)。在一些实施方式中，对人施用每日剂量为400mg(例如，400mgqd或200mgbid)的pkr激活化合物。在一些实施方式中，对人施用每日剂量为400mg(400mgqd或200mgbid)的化合物1或其可药用盐。在一些实施方式中，对人施用每日剂量为400mg(例如，400mgqd或200mgbid)的图1中列出的任何化合物。实施例1：式i化合物的合成通过本文所述的方法和图4a和/或图4b中所示的反应方案获得pkr激活化合物1。化合物1的分子量为457.50da。步骤1.2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰氯(3)向用惰性氮气氛净化和保持的100ml圆底烧瓶中置入n-buli在己烷中的溶液(2.5m，2ml，5.0mmol，0.54当量)和n-bu2mg在庚烷中的溶液(1.0m，4.8ml，4.8mmol，0.53当量)。所得溶液于室温(20℃)搅拌10min。在此之后逐滴添加7-溴-2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶(2g，9.26mmol，1.00当量)在四氢呋喃(16ml)中的溶液，同时于-10℃搅拌10min。所得混合物于-10℃搅拌1h。反应混合物于-10℃缓慢添加至硫酰氯的溶液(16ml)中。所得混合物于-10℃搅拌0.5h。随后通过于0℃小心地加入30ml饱和氯化铵溶液来猝灭反应。所得混合物用3x50ml二氯甲烷萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:3)洗脱。这提供了1.3g(60％)2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰氯，其是白色固体。lcmsm/z：c7h6clno4s计算为：235.64；实测为：236[m+h]+.步骤2.5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-甲酸叔丁酯(4)向100-ml圆底烧瓶中置入2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰氯(1.3g，5.52mmol，1.00当量)、1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-甲酸叔丁酯(1.16g，5.52mmol)、二氯甲烷(40ml)和三乙胺(1.39g，13.74mmol，2.49当量)。溶液于20℃搅拌2h，随后用40ml水稀释。所得混合物用3x30ml二氯甲烷萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷/甲醇(10:1)洗脱。这提供了1.2g(53％)的5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-甲酸叔丁酯，其为黄色固体。lcmsm/z：c18h23n3o6s计算为：409.46；实测为：410[m+h]+.步骤3.2-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯(5)向100-ml圆底烧瓶中置入5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-甲酸叔丁酯(1.2g，2.93mmol，1.00当量)、二氯甲烷(30ml)和三氟乙酸(6ml)。将溶液于20℃搅拌1h。将所得混合物真空浓缩。残余物溶解在10ml甲醇中，ph用碳酸氢钠(2mol/l)调节至8。所得溶液用3x10ml二氯甲烷萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷/甲醇(10:1)洗脱。这提供了650mg(72％)2-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯，其为黄色固体。lcmsm/z：c13h15n3o4s计算为：309.34；实测为：310[m+h]+.步骤4.(s)-1-(5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(1)和(r)-1-(5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(2)向100ml圆底烧瓶中置入2-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯(150mg，0.48mmol，1.00当量)、3-羟基-2-苯基丙酸(97mg，0.58mmol，1.20当量)、二氯甲烷(10ml)、hatu(369mg，0.97mmol，2.00当量)和diea(188mg、1.46mmol，3.00当量)。所得溶液于20℃搅拌过夜。反应混合物用20ml水稀释，随后用3x20ml二氯甲烷萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过制备tlc纯化，用二氯甲烷/甲醇(20:1)洗脱，并通过制备hplc进一步纯化(柱：xbridgec18obd制备柱，5μm，19mmx250mm；移动相a：水(10mmol/lnh4hco3)，移动相b：mecn；梯度：15％b至45％b，经8min；流速：20ml/min；紫外线检测器：254nm)。两个对映体通过制备级手性hplc分离(柱，daicelif，2.0cmx25cm，5μm；移动相a：dcm，相b：meoh(60％meoh保留15min)；流速：16ml/min；检测器，uv254&220nm)。这得到峰1(2，rt：8.47min)9.0mg(4％)(r)-1-(5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，其为黄色固体；和峰2(1，rt：11.83min)10.6mg(5％)(s)-1-(5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，其为黄色固体。(1)：1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ8.13(d，j＝2.0hz，1h)，7.61(d，j＝2.0hz，1h)，7.31-7.20(m，5h)，4.75(t，j＝5.2hz，1h)，4.50-4.47(m，2h)，4.40-4.36(m，1h)，4.32-4.29(m，2h)，4.11-3.87(m，8h)，3.80-3.77(m，1h)，3.44-3.41(m，1h)。lc-ms(esi)m/z：c22h23n3o6s计算为：457.13；实测为：458.0[m+h]+.(2)：1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ8.13(d，j＝2.0hz，1h)，7.60(d，j＝2.0hz，1h)，7.31-7.18(m，5h)，4.75(t，j＝5.2hz，1h)，4.52-4.45(m，2h)，4.40-4.36(m，1h)，4.34-4.26(m，2h)，4.11-3.87(m，8h)，3.80-3.78(m，1h)，3.44-3.43(m，1h)。lc-ms(esi)m/z：c22h23n3o6s计算为：457.13；实测为：458.0[m+h]+.步骤5.(s)-1-(5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(1)可替代地，化合物1可使用如步骤5中所述的程序合成。将7-((3,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1h)-基)磺酰基)-2,3-二氢-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶(130.9mg，0.423mmol)在dmf(2.5ml)中的溶液在冰浴上冷却，随后用(s)-3-羟基-2-苯基丙酸(84.8mg，0.510mmol)、hatu(195.5mg，0.514mmol)和diea(0.30ml，1.718mmol)处理，于环境温度搅拌过夜。溶液用etoac(20ml)稀释，依次用水(20ml)和盐水(2x20ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤，用硅胶处理，和减压蒸发。材料通过biotagemplc(10g硅胶柱，在dcm中的0至5％meoh)进行色谱分析，提供了白色、略粘的固体。样品重新吸附到硅胶上并进行色谱处理(10g硅胶柱，在己烷中的0至100％etoac)以提供(2s)-1-(5-[2h,3h-[1,4]二氧杂环己烯并[2,3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h,2h,3h,4h,5h,6h-吡咯并[3,4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(106.5mg，0.233mmol，55％产率)，其是白色固体。实施例2：用于鉴定pkr激活活性的生物活性测定法可用实施例2的生物化学发光测定法来鉴定pkr激活化合物。使用下面的发光测定法评价一系列化合物的pkr激活活性，包括指定为化合物1、化合物2的化合物，以及下面的化合物6、7和8和图1中列出化合物。对于每个测试的化合物，使用以下的发光测定法确定激活pkr的能力。通过激酶gloplus测定法(promega)在存在或不存在fbp(d-果糖-1,6-二磷酸；bocsciences，cas：81028-91-3)的情况下按如下测定pkr对腺苷-5’-二磷酸(adp)磷酸化的影响。除非另有说明，所有试剂购自sigma-aldrich。所有试剂在如下的缓冲液中制备：该缓冲液含有50mmtris-hcl，100mmkcl，5mmmgcl2，和0.01％tritonx100，0.03％bsa，和1mmdtt。将2x的酶和pep(磷酸烯醇丙酮酸)添加到准备好进行测定的板的所有孔中，这些孔中含有测试化合物的系列稀释液或dmso载体。pkr(wt)、pkr(r510q)和pkr(g332s)的最终酶浓度分别为0.8nm、0.8nm和10nm。最终pep浓度为100μm。将酶/pep混合物与化合物一起在室温下温育30分钟，随后通过添加2xadp和激酶gloplus开始测定。adp的最终浓度为100μm。激酶gloplus的最终浓度是12.5％。对于含有fbp的测定，在反应开始时添加30μm的该试剂。在室温下使反应进行45分钟，直到通过bmgpherastarfsmultilabel读取器记录到发光。以42.5μm至2.2nm范围内的浓度在0.83％二甲亚砜中一式三份地测试该化合物。通过activitybasexerunner的标准四参数拟合算法(最大、最小、斜率和ac50)获得ac50测量值。化合物的ac50值是如下的浓度(μm)：在该浓度下，沿着四参数对数曲线拟合的活性介于最小活性和最大活性之间。如下表2和3中和图1中所述，ac50值如下定义：≤0.1μm(+++)；>0.1μm和≤1.0μm(++)；>1.0μm和≤40μm(+)；>40μm(0)。表2.发光测定数据表3.其他发光测定数据本文所述的化合物和组合物是野生型pkr和与野生型相比具有较低活性的某些pkr突变体的激活剂。pkr中的此类突变可影响酶活性(催化效率)、调节性质和/或酶的热稳定性。prk突变的一个示例是g332s。pkr突变的另一个示例是r510q。实施例3：pkr激活化合物的酶测定针对野生型pkr和pkr-r510q，评价2μm化合物1对最大速度(vmax)和pepkm(米-曼二氏常熟，即，v＝1/2vmax时的pep浓度)的影响。在存在或不存在果糖-1，6-二磷酸盐(fbp)(一种已知的pkr变构性激活剂)的情况下进行测试。在室温下进行至多60min的评估，计算vmax和pepkm。化合物1对vmax的影响从无影响至适度增加范围内(参见图5中的代表性曲线)。化合物1在存在或不存在fbp的情况下，持续降低了野生型pkr和pkr-r510q的pepkm，通常为～2倍(表4)，表明化合物1可以在pep的生理浓度下提高pkr的速率。表4.化合物1对pkr酶动力学参数的影响a表4中的所有值均相对于同一行中的其他值标准化到1.00。评价不同浓度的化合物1对野生型pkr和pkr-r510q的激活，以确定在km或km以下的pep浓度。化合物1增加了atp形成速率，ac50值在<0.05至<0.10μm范围内，最大倍数激活在<2.0至<3.0范围内(即，<200％至<300％)(表5)。来自pkr-r510q的代表性数据显示该影响是浓度依赖性的(图6)。表5.化合物1对pkr野生型和突变型的激活pk酶最大倍数激活ac50(μm)野生型pkr<2.0<0.05pkrr510q<3.0<0.10实施例4：pkr激活化合物的细胞测定在购自researchbloodcomponents的纯化rbc中评价体外成熟人红细胞中化合物1对野生型pkr的激活。将在含葡萄糖的培养基中用化合物1处理3小时的细胞洗涤，溶解，并使用biovision丙酮酸激酶测定法(k709-100)测定。将该测定重复多次以解释供体间的变异性和相对窄的动态范围。平均最大激活增加(max-min)为<100％，平均50％有效浓度(ec50)为<125nm(表6)。野生型pkr以浓度依赖性方式激活(图7)。表6.用化合物1处理的人红细胞中的野生型pkr激活复制max-min(％)ec50(nm)1<125<2502<150<1503<100<504<50<50平均<100<125用ficoll梯度法从全血中新鲜分离小鼠rbc，并用与人rbc分析相似的方法进行分析。最大激活增加，ec50值与人rbc的影响相当(表7)。表7.在小鼠红细胞中化合物1对pkr激活的影响实施例5：pkr激活化合物的体外药理学来自scd患者的红细胞用于评价化合物1对hgb氧亲和力(即，氧亲和力)和缺氧条件下镰状化的影响。细胞在37℃与hepes缓冲盐水(hbs)(未处理)、hbs+二甲亚砜(dmso)(载体)或10μm化合物1一起温育1、2和3小时。为评估氧解离，在脱氧过程中收集hgb氧平衡曲线。血红蛋白饱和度在用化合物1处理的细胞中向左变化，在未处理或0.5％dmso-处理的细胞中则不会(图8a和8b)。增加的氧亲和力对应于p50在1小时后从29毫米汞柱显著(但有限)变化到25毫米汞柱，并维持至少3小时，即最后评估的时间点(表8)。值得注意的是，在温育的前2小时中氧亲和力不受二甲亚砜影响。表8.化合物1对血红蛋白饱和度的影响aa表8中的所有值均相对于其他值标准化到1.00。b未处理细胞是在40％红细胞压积下在培养基中未经温育的洗涤rbc。在每个po2下，用化合物1处理的细胞中hgb饱和度的平均变化在25mmhg时最显著，相比之下在正常po2下为26.7mmhg(图9)。因此，氧亲和力变化在与镰状化相关的氧张力下发生。在2hr时，hgb饱和度与dmso处理的细胞相比高约10％。在较低po2下(在1％到2％氧气下约10mmhg),在用化合物1处理的细胞与用dmso处理的细胞之间甚至在1hr时也有明显的差异。化合物1(10μm)在2％氧气(po2<20mmhg)的严重缺氧条件下使细胞镰状化减少长达20分钟(表9)。保护百分比(即，处理细胞中的活性水平，标准化为暴露于严重缺氧条件后的未处理细胞的活性水平)在缺氧条件下15分钟时达到最大16％(图10)，并在最后测量的时间点保持在15％。表9.化合物1对缺氧条件下人scd细胞镰状化的影响实施例6：化合物1在野生型小鼠中的药代动力学/药效学研究在balb/c小鼠中进行两项药代动力学(pk)/药效学(pd)研究，对所述小鼠通过经口灌胃每日一次施用化合物1(在10％cremophorel/10％pg/80％di水中配制)，持续7日(qd×7)，剂量为：0(载体)，3.75，7.5，15，30，60mg/kg(研究1)；0(载体)，7.5，15，30，60，120，或240mg/kg(研究2)。在第7日，在给药之后24小时收集全血并速冻。随后将样品解冻并通过lc/ms分析2,3-dpg和atp水平。在两项试验中，化合物1耐受良好。未观察到不良的临床迹象，与载体组相比体重变化没有区别。用化合物1处理降低了2,3-dpg的水平(图11a和11b(研究1和2)以及图12(研究2))。一般来说，15mg/kg化合物1的减少量>20％，120和240mg/kg化合物1的减少量>30％。总之，最高剂量的结果提供了2,3-dpg随着pkr激活而减少的体内证据。在这些研究中对atp水平的评价表明，用化合物1处理增加了atp的水平。在研究1中，与载体相比，使用30和60mg/kg化合物1，atp分别增加了21％和79％，在研究2中，当暴露于至多120mg/kg化合物1的剂量时，atp水平增加，与载体相比，最大增加为～110％(图13a和图13b)。在最高剂量240mg/kg化合物1下，atp水平增加了45％。在两项研究中，atp水平以相似方式与化合物1暴露相关。实施例7：在berkeleyss小鼠模型中测试pkr激活化合物berkeleyss小鼠模型中的靶向基因缺失和人类转基因导致小鼠几乎完全表达人hgbs(pásztyc.transgenicandgeneknock-outmousemodelsofsicklecellanemiaandthethalassemias.curropinhematol.1997mar；4(2):88-93)并模拟人类scd的遗传、血液学和组织病理学特征。这些包括不可逆地镰状化的rbc、贫血和多器官病理学。在berkleyss小鼠中评估化合物1对hgb氧亲和力、镰状细胞百分比和/或hgb的影响。进行了两项研究，其中小鼠随意服用在鼠粮中的0或1000ppm化合物1，持续7日。在第7日抽取血液，在缺氧条件下进行分析。通过advia法测定rbc参数。两项研究的结果相对一致。缺氧条件下的hgb氧亲和力增加，p50降低(图14a、图14b、图15a和图15b)。观察到对镰状化的积极影响，即化合物1处理降低了在低氧压下镰状化的rbc百分比(图16)，并增加了镰状化的时间。此外，hgb增加了≈1g/dl。总之，这些变化支持化合物1将减少细胞镰状化的假设，并对镰状rbc的下游临床并发症产生积极影响。化合物1还降低了被治疗小鼠的网织红细胞水平(图17)，表明红细胞溶解减少。实施例8：评估化合物1在健康志愿者和镰状细胞病患者中的安全性、药代动力学和药效学的sad/mad研究化合物1将在随机、安慰剂对照、双盲、单递增和多递增剂量研究中进行评价，以评估化合物1在健康志愿者和镰状细胞病患者中的安全性、药代动力学和药效学。本文公开了化合物1用于治疗人类镰状细胞病的用途。化合物1是口服的丙酮酸激酶红细胞同工酶(pkr)的小分子激动剂，其被开发用于治疗溶血性贫血。这一人类临床试验研究将在健康志愿者和镰状细胞病患者的1期研究背景下表征化合物1的单递增剂量和多递增剂量的安全性、耐受性和药代动力学/药效学(pk/pd)。还将在健康志愿者中评价食物对化合物1吸收的影响。研究的目的包括以下：1.评价单递增剂量和多递增剂量的化合物1在健康志愿者和镰状细胞病(scd)患者中的安全性和耐受性。2.表征化合物1的药代动力学(pk)。3.评价在单次和多次剂量的化合物1之后，健康志愿者和scd患者的红细胞(rbc)中的2,3-二磷酸甘油酸酯(dpg)和三磷酸腺苷(atp)的水平。4.评价健康志愿者中化合物1的血浆浓度与对qt间期的潜在作用之间的关系。5.评价单递增剂量的化合物1对健康志愿者其他心电图(ecg)参数(心率、pr和qrs间期及t波形态)的影响。6.探讨食物对健康志愿者中的化合物1的pk的影响。7.探讨化合物1暴露量与反应变量(如安全性、药效学(pd)、血液学参数(如适用))之间的关系。8.探讨单次和多次剂量后化合物1对rbc功能的影响。9.探讨对scd患者多次剂量后化合物1对rbc代谢、炎症和凝血的影响。这是化合物1的首次人体(fih)1期研究，其将首先在健康成人志愿者中，随后在青少年或成人镰状细胞病患者中，描述单次剂量和重复剂量后化合物1的安全性、pk和pd。在研究中采用的研究组别(studyarms)和指定干预措施总结在表10中。最初，将在健康受试者中探索化合物1在单递增剂量(sad)升级组中的剂量范围。一旦至少有两个sad组的安全性和pk可用于通报研究2周mad部分的剂量，则开始将健康受试者纳入2周多递增剂量(mad)升级组。随后，mad组将与单剂量组并行运行。计划采用单剂量组来了解食物对化合物1的pk的影响。在健康受试者的sad和fe研究完成后，随后将在镰状细胞病(scd)受试者中评价单剂量化合物1的安全性、pk和pd，该单剂量化合物1在健康受试者中被发现是安全的。在健康志愿者中完成mad研究后，将启动scd受试者的多剂量研究。化合物1将以25mg和100mg片剂经口服递送。表10.表11.剂量水平/组组片剂强度(#/日)sad1200mg100mg(2/日)sad2400mg100mg(4/日)sad3700mg100mg(7/日)sad41100mg100mg(11/日)sad51500mg100mg(15/日)表12.成果测量主要成果测量：1.根据ctcaev5.0，在成年健康志愿者和scd患者中单递增剂量和多递增剂量的化合物1的不良事件(ae)发生率、频率和严重程度。[时间范围：至多监控3周]2.最大观察血浆浓度(cmax)[时间范围：至多检测3周]3.最大观察血浆浓度的时间(tmax)[时间范围：至多检测3周]4.从时间0到24小时时间点的血浆浓度-时间曲线下方的面积(auc0-24)[时间范围：至多检测3周]5.从时间0到最后可计量时间点的血浆浓度-时间曲线下方的面积(auc0-最后)[时间范围：至多检测3周]6.从时间0到无穷大的血浆浓度-时间曲线下方的面积(auc0-无穷)[时间范围：至多检测3周]7.最终消除半衰期(t1/2)[时间范围：至多检测3周]8.表观清除率(cl/f)[时间范围：至多检测3周]9.表观分布容积(vd/f)[时间范围：至多检测3周]10.最终配制速率常数(lz)[时间范围：至多检测3周]11.肾清除率(cir)[时间范围：至多检测3周]次要成果测量：12.在单次和多次剂量的化合物1之后2,3-二磷酸甘油酸酯(dpg)和三磷酸腺苷(atp)在健康志愿者和scd患者的红细胞(rbs)中的水平相对于基线的变化。[时间范围：至多检测3周]13.在健康志愿者中给予单剂量化合物1后，使用fridericia校正公式(qtcf)和估算cmax的90％置信空间来校正基于模型的相对于基线qt间期变化的估算值。[时间范围：至多7日]14.在健康志愿者中给予单剂量化合物1后，相对于基线心率的变化。[时间范围：至多7日]15.在健康志愿者中给予单剂量化合物1后，相对于基线pr的变化。[时间范围：至多7日]16.在健康志愿者中给予单剂量化合物1后，相对于基线qrs的变化。[时间范围：至多7日]17.在健康志愿者中给予单剂量化合物1后，相对于基线t波形态的变化。[时间范围：至多7日]探索性结果测量：18.食物对cmax、auc0-24/auclast的影响19.auclast/auc0-24、cmax、最低血浆浓度(cmin)、峰谷比、剂量线性、安全性累积率、pd和目标血液学参数通过暴露-反应分析进行评估。20.在单剂量化合物1之后和长期给药化合物1之后rbc中2,3-dpg减少对氧合血红蛋白解离曲线(p50；50％血红蛋白被o2饱和的o2分压)的影响21.用渗透梯度细胞仪和氧梯度细胞仪研究长期给药化合物1对正常和scdrbc可变性形的影响22.长期给药化合物1对scd患者的scdrbc氧化应激反应(包括谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶水平的评价)的影响23.长期给药化合物1对scd患者的可测量炎症标记物(c-反应性蛋白质、铁蛋白、白介素[il]-1β、il-6、il-8和肿瘤坏死因子-α)的影响24.长期给药化合物1对scd患者的可测量高凝状态标记物(d-二聚体、凝血酶原1.2和凝血酶-抗凝血酶[tat]复合物)的影响合格标准最小年龄：18岁(健康志愿者)；12岁(scd受试者)最大年龄：60岁性别：不限基于性别：无接受健康志愿者：是入选标准：健康志愿者：受试者年龄必须在18-60岁之间；scd：受试者年龄必须在12-50岁之间受试者必须能够理解并签署书面知情同意书，该书面知情同意书必须在完成任何研究相关程序之前获得。根据病史、体检、生命体征、实验室概况和12导联心电图的结果，受试者必须总体健康状况良好。受试者的体重指数(bmi)必须在18kg/m2至33kg/m2(含)之间，最低体重为50kg(健康志愿者受试者)或40kg(scd受试者)对于scd受试者，先前通过血红蛋白电泳或基因分型证实的镰状细胞病表明以下血红蛋白基因型之一：hgbss、hgbsβ+-地中海贫血、hgbsβ0-地中海贫血或hgb-sc所有有生育潜力的男性和女性必须同意在研究期间和研究结束后90天内使用医学上接受的避孕方案。受试者必须愿意遵守所有的研究要求和限制。排除标准：具有临床上显著的医疗状况或其他可能显著干扰研究药物的吸收、分布、代谢或排泄的状况的证据，或使受试者作为本研究参与者处于不可接受的风险中有临床上显著的心脏疾病史，包括病情紊乱血液、肾和肝功能异常研究药物或酒精滥用史结果(健康志愿者)4个健康sad组分别以200、400、700和1000mg的剂量进行评价，4个健康mad组以qd或bid给药(100mgbid、200mgbid、300mgbid和400mgqd)方式接受200至600mg的每日总剂量，持续14日。在食物影响(fe)组中，10名健康受试者在有或没有食物的情况下接受200mg化合物1qd。在健康志愿者sad和mad组中没有报告严重不良事件(saes)或导致停药的ae。在pk评估中，化合物1被迅速吸收，中位tmax为剂量后1hr。当剂量≥700mg时，单剂量暴露以大于剂量比例的方式增加。在多剂量递送bid或qd中，在所有剂量水平(100-300mgbid，400mgqd)下均观察到线性pk，并且暴露在第14日之前保持稳定，没有累积效应。喂食/禁食条件下的化合物1暴露情况相似。在化合物1治疗的受试者中，在所有评价的剂量水平下验证了pd活性(表13)。表13报告了在sad和mad组中在所有剂量和时间点处的2,3-dpg、atp和p50的平均最大百分比变化。如表13所示，在sad和mad组二者中均观察到相对于基线的2,3-dpg和p50的平均减少以及atp的平均增加。在给予单剂量化合物1的24小时内，观察到2,3-dpg减少，p50相应增加。在化合物1给药14日后，这些pd效应随着atp的增加维持在基线以上。因此，在sad研究中接受化合物1的患者中，2,3-dpg的平均最大浓度降低至少约40％，在mad研究中接受化合物1的患者中，平均最大浓度降低至少约50％。表13.相对于基线的关键pd测量值的平均最大百分比变化总结在sad组中，在给药之后通过定量lc-ms/ms方法定期测量受试者的血液2,3-dpg水平以量化血液中的2,3-dpg。在所有剂量水平下在给予单剂量化合物1之后6小时观察到2,3-dpg血液水平减少(较早时间点未收集)。2,3-dpg水平的最大减少通常发生在首次剂量之后～24小时，降低在给药后持续～48-72hr。表14报告了在给予单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂后，随时间测量的健康志愿者的2,3-dpg血液水平相对于基线的中位百分比变化。因此，在单剂量施用24小时后，在测试的所有剂量水平下，2,3-dpg浓度相对于基线的中位降低为至少约30％。表14.2,3-dpg水平的中位百分比变化图18是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中随时间测量的血液2,3-dpg水平的图表。如图18所示，与接受安慰剂的受试者相比，接受化合物1的健康志愿者经历血液2,3-dpg水平降低。图19是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中，在给药后24小时测量的血液2,3-dpg水平的图表。如图19所示，与接受安慰剂的受试者相比，接受化合物1的健康志愿者在给药后24小时经历血液2,3-dpg水平降低。在sad组中，在给药后24小时测定受试者的p50(50％血红蛋白饱和度下的po2)。在测试的所有剂量水平下，在给予单剂量化合物1之后24小时测量的p50减少(中位减少在～3-5mmhg范围内)。表15报告了在健康志愿者中给予单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂24小时后测量的p50相对于基线的平均绝对变化。表15.p50的平均绝对变化(mmhg)组平均绝对变化安慰剂0.20200mg-2.91400mg-3.41700mg-4.851000mg-5.05图20是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中在给药后24小时测量的p50值的图表。如图20所示，与接受安慰剂的受试者相比，接受化合物1的健康志愿者经历p50降低。图21是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中在给药前和给药后24小时测量的p50值的图表。如图21所示，与基线相比，接受化合物1的健康志愿者经历p50降低，而服用安慰剂的受试者则不会。在mad组中，在给药之后通过定量lc-ms/ms方法定期测量受试者的血液2,3-dpg水平以量化血液中的2,3-dpg。在第14日，相对于基线，2,3-dpg的最大降低为55％(中位值)。2,3-dpg水平在第1日达到最低点并趋于稳定，在第14日最后一次剂量后72小时后仍未恢复到基线水平。表16报告了在接受了14天的化合物1(100mgbid、200mgbid或300mgbid)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中，在第1日和第14日的首次剂量之后随时间测量的2,3-dpg血液水平相对于基线的中位百分比变化。因此，相对于基线，2,3-dpg浓度的中位减少在第1日的首次剂量施用之后24小时测试的所有剂量水平为至少约25％，在第14日的首次剂量施用之后24小时测试的所有剂量水平下为至少约为0％。表16.2,3-dpg水平的中位百分比变化(第1日和第14日)图22是在接受了14日的化合物1(100mgbid、200mgbid、300mg或400mgqd)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中随时间测量的血液2,3-dpg水平的图表。如图22所示，与接受安慰剂的受试者相比，接受化合物1的健康志愿者经历血液2,3-dpg水平降低。图23是在接受了14日的化合物1(100mgbid、200mgbid、300mg或400mgqd)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中在第14日测量的血液2,3-dpg水平的图表。如图23所示，与接受安慰剂的受试者相比，接受化合物1的健康志愿者经历血液2,3-dpg水平降低。在mad组中，在第14日测定受试者的p50(50％血红蛋白饱和度下的po2)。在测试的所有剂量水平下，在每日两次给药之后测量的p50值减少(中位减少在～3-5mmhg范围内)。表17报告了在接受了14日的化合物1(100mgbid、200mgbid或300mgbid)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中，在第14日测量的p50相对于基线的平均绝对变化。表17.p50的平均绝对变化(mmhg)(第14日)剂量平均绝对变化安慰剂-0.38100mgbid-3.26200mgbid-4.14300mgbid-5.34图24是在接受了14日的化合物1(100mgbid、200mgbid、300mg或400mgqd)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中在第14日测量的p50值的图表。如图24所示，与接受安慰剂的受试者相比，接受化合物1的健康志愿者经历p50降低。图25是在接受了14日的化合物1(100mgbid、200mgbid、300mg或400mgqd)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中在给药前和第14日测量的p50值的图表。如图25所示，与基线相比，接受化合物1的健康志愿者经历p50降低，而服用安慰剂的受试者则不会。在mad组中，在第14日通过定量lc-ms/ms方法测量受试者的血液atp水平以量化血液中的atp。在第14日，相对于基线，atp水平升高，并且在最后一次剂量后60小时保持升高。表18报告了在接受了14天的化合物1(100mgbid或200mgbid)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中，在第14日的首次剂量之后随时间测量的血液atp水平相对于基线的中位百分比变化。表18.atp水平的中位百分比变化(第14日)图26是在接受了14日的化合物1(100mgbid、200mgbid、300mg或400mgqd)的每日剂量或安慰剂的健康志愿者中在第14日测量的血液atp水平的图表。如图26所示，与接受安慰剂的受试者相比，接受化合物1的健康志愿者经历血液atp水平降低。图27是显示在接受化合物1或安慰剂的健康受试者中在给药前和给药后24小时(sad组)以及在第14日给药后24小时(mad组)测定的p50值的差值的图表。如图27所示，与基线相比，接受化合物1的健康志愿者经历p50降低，而服用安慰剂的受试者则不会。图28是绘制了在施用单剂量化合物1(400mg)之后在第一(左)轴上的健康志愿者(hv)患者中测量的化合物1的血液浓度(ng/ml)和在第二(右)轴上的这些hv患者中测量的2,3-dpg浓度(毫克/ml)的图表。实心符号代表观察到的化合物1血浆和2,3-dpg浓度的几何平均值和标准误差。如图所示，观察到的2,3-dpg调节并不直接跟踪血浆药代动力学(化合物1的血药浓度)，其中药效学最大值(即，2,3-dpg浓度的最小值，在～24小时的时间)出现在药代动力学最大值(即，pk曲线的最大值，在～1-2小时的时间)之后近24小时。在hv中观察到的药效学反应是持久的，计算的pd半衰期为～20h，其中在血浆水平无法检出之后很久才观察到2,3-dpg抑制。综上所述，这表明单独使用药代动力学参数(cmax/cmin/auc)无法充分地进行药理活性剂量的鉴定，而是支持了如下的方法：该方法包括整合时间药代动力学/药效学关系，从而提供了qd给药在镰状细胞病患者中可能可行的证据平台。图29是在sad组和mad组中的健康志愿者中观察到的2,3-dpg水平和p50值的散点图。实心符号代表在最后一次施用剂量后24小时，在给予化合物1的健康志愿者中观察到的p50/2,3-dpg水平。基线数据代表在化合物1治疗前和从给予安慰剂的健康志愿者获得的p50/2,3-dpb数据。对于接受不同剂量的患者观察到在2,3-dpg与p50水平之间呈正相关关系。实施例9：通过lc-ms/ms分析k2edta全血中atp和2,3-dpg以下程序用于使用蛋白质沉淀提取程序和通过lc-ms/ms进行的分析进行的人全血k2edta中的atp和2,3-dpg的分析。该生物分析方法适用于以下描述的参数：检测范围25000-1500000ng/ml提取体积15.0μl物种/基质/抗凝剂水，作为人全血k2edta的替代品提取类型蛋白质沉淀样品存储80℃质谱仪api-5500采集软件analyst/ariasystem遵循以下预防措施：1.标准样品和qc样品在冰上制备并储存在塑料容器中。2.研究样品和qc样品在冰上解冻。3.在冰上进行提取。采用以下定义和缩写：crb遗留补救空白ft冷冻-解冻mpa移动相ampb移动相bna不适用nr针头冲洗rt保留时间sip进行稳定性tbd待测定使用以下化学品、基质和试剂：以下程序用于试剂制备。所列的任何适用重量和体积均为标称重量和体积，只要达到目标组成，可按比例进行调整：根据下表，使用水作为基质制备校准标准品。通过用所示基质体积稀释所示储备溶液的加标体积(spikingvolume)，制备所示标准品。根据下表，使用水作为基质制备质量控制标准品。通过用所示基质体积稀释所示储备溶液的加标体积(spikingvolume)，制备所示质量控制标准品。通过用水稀释浓度为1,000,000ng/ml的atp和2,3-dpg储备溶液，制备最终浓度为12,500ng/mlatp和2,3-dpg的内标加标溶液。用15.6ml水稀释各自为0.200ml的atp和2,3-dpg储备溶液，以产生最终浓度为12,500ng/ml的16.0ml最终体积的atp和2,3-dpg。以下程序用于在经由lc-ms/ms分析之前的样品提取。将15.0μl校准标准品、质量控制、基质空白和样品等分放入96孔板中。将50.0μl内标加标溶液添加到板上除基质空白样品外的所有样品中；将50.0μl水添加到基质空白样品中。随后，将150μl添加到板上的所有样品中。随后将板覆盖并通过涡流高速搅拌10分钟，随后向板上的所有样品中添加750μl甲醇。将板覆盖并通过涡流搅拌约1分钟。然后将板以约3500rpm在约4℃下离心5分钟。离心后，使用液体处理器将50μl的每个样品转移到新的96孔板中，并将200μl乙腈添加到板上的所有样品中。将新制备的板覆盖并通过涡流搅拌约1分钟。随后将板以约3500rpm在约4℃下离心2分钟。以下lc参数和梯度条件用于提取样品的分析：从0.08min开始收集数据，在0.70min的数据窗口长度上收集数据。以下ms参数用于使用api-5500质谱仪分析提取样品:对收集的ms数据进行分析，并使用线性1/x2回归类型的峰面积比来量化样品浓度。当前第1页12