一种用于直接分化多能性干细胞来源间充质干细胞的培养基、用其制备间充质干细胞的方法以及由此制备的间充质干细胞与流程

文档序号:25541879发布日期:2021-06-18 20:38

技术特征:

1.一种用于诱导多能性干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合物,其包括dna修复剂和rock抑制剂。

2.如权利要求1所述的培养基组合物,其中,所述dna修复剂为3-[(苄基氨基)磺酰基]-4-溴-n-(4-溴苯基)苯甲酰胺或4-溴-n-(4-溴苯基)-3-[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]-苯甲酰胺。

3.如权利要求1所述的方法,其中,所述rock抑制剂为选自法舒地尔、利帕舒地尔、4-((r)-1-氨乙基)-n-(吡啶-4-基)环己甲酰胺、4-(1-氨乙基)-n-(1h-吡咯并(2,3-b)吡啶-4-基)环己甲酰胺二盐酸盐、n-(6-氟-1h-吲唑-5-基)-1,4,5,6-四氢-2-甲基-6-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3-吡啶甲酰胺,以及1-(3-羟基苄基)-3-[4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基]脲、2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1h-1,4-二氮杂卓二盐酸盐、n-[2-[2-(二甲氨基)乙氧基]-4-(1h-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二噁烷-2-甲酰胺二盐酸盐、2-氟-n-[[4-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯基]甲基]苯甲胺二盐酸盐、n-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基)-1-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧]苯基]-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯甲酰胺、(3s)-1-[[2-(4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基)-1-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-7-基]羰基]-3-吡咯烷胺二盐酸盐、n-[(1s)-2-羟基-1-苯基乙基]-n'-[4-(4-吡啶基)苯基]-脲、氮杂吲哚-1,以及水仙环素中的任何一种。

4.如权利要求1所述的培养基组合物,其进一步包括tgf-β抑制剂。

5.如权利要求4所述的培养基组合物,所述tgf-β抑制剂为选自4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基]-吡啶-2-yl}-n-(四氢-2h-吡喃-4-基)苯甲酰胺水合物、4-[3-(2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-喹啉、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、4-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1h-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物、4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物,以及4-[4-(3,4-亚甲二氧苯基)-5-(2-吡啶烷基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物、3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酯胺、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基)-1,5-萘啶、4-[3-(2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-喹啉、2-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1h-咪唑-5-yl]-6-甲基-吡啶、2-(5-氯-2-氟苯基)-4-[(4-吡啶烷基)氨基]蝶啶、6-[2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1h-咪唑-4-基]-喹喔啉、4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基]-吡啶-2-yl}-n-(四氢-2h-吡喃-4-基)苯甲酰胺水合物、4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]苯基]-1h-吡唑-1-乙醇、3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹噁啉基)-1h-咪唑-2-基]甲基]苯甲酰胺中的任何一种。

6.如权利要求1所述的培养基组合物,其中,以5μm至20μm的浓度包括所述dna修复剂。

7.如权利要求1所述的培养基组合物,其中,以5μm至20μm的浓度包括所述rock抑制剂。

8.如权利要求4所述的培养基组合物,其中,以0.2μm至2.0μm的低浓度包括所述tgf-β抑制剂。

9.一种多能性干细胞来源间充质干细胞的制备方法,其包括:培养已分离的多能性干细胞;以及

将所述培养的多能性干细胞在含有dna修复剂和rock抑制剂的培养基中培养以诱导分化为间充质干细胞。

10.如权利要求9所述的方法,其进一步包括:在tgf-β抑制剂存在的情况下,将所述培养的胚胎干细胞分化为中胚层细胞。

11.如权利要求9所述的方法,其进一步包括:将所述诱导分化的间充质干细胞在间充质干细胞成熟培养基中培养;或者对所述成熟培养基中培养的间充质干细胞进行传代培养。

12.如权利要求9所述的方法,其中,所述培养已分离的多能性干细胞的步骤为在支持细胞不存在的情况下,在涂覆有细胞粘附功能增强剂的培养容器中培养。

13.如权利要求9所述的方法,其不包括:形成胚状体。

14.如权利要求9所述的方法,其中,所述dna修复剂为3-[(苄基氨基)磺酰基]-4-溴-n-(4-溴苯基)苯甲酰胺或4-溴-n-(4-溴苯基)-3-[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]-苯甲酰胺。

15.如权利要求9所述的方法,其中,所述rock抑制剂为选自法舒地尔、利帕舒地尔、4-((r)-1-氨乙基)-n-(吡啶-4-基)环己甲酰胺、4-(1-氨乙基)-n-(1h-吡咯并(2,3-b)吡啶-4-基)环己甲酰胺二盐酸盐、n-(6-氟-1h-吲唑-5-基)-1,4,5,6-四氢-2-甲基-6-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3-吡啶甲酰胺,以及1-(3-羟基苄基)-3-[4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基]脲、2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1h-1,4-二氮杂卓二盐酸盐、n-[2-[2-(二甲氨基)乙氧基]-4-(1h-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二噁烷-2-甲酰胺二盐酸盐、2-氟-n-[[4-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯基]甲基]苯甲胺二盐酸盐、n-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基)-1-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧]苯基]-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯甲酰胺、(3s)-1-[[2-(4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基)-1-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-7-基]羰基]-3-吡咯烷胺二盐酸盐、n-[(1s)-2-羟基-1-苯基乙基]-n'-[4-(4-吡啶基)苯基]-脲、氮杂吲哚-1,以及水仙环素中的任何一种。

16.如权利要求9所述的方法,所述tgf-β抑制剂为选自4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基]-吡啶-2-yl}-n-(四氢-2h-吡喃-4-基)苯甲酰胺水合物、4-[3-(2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-喹啉、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、4-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1h-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物、4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物,以及4-[4-(3,4-亚甲二氧苯基)-5-(2-吡啶烷基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物、3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酯胺、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基)-1,5-萘啶、4-[3-(2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-喹啉、2-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1h-咪唑-5-yl]-6-甲基-吡啶、2-(5-氯-2-氟苯基)-4-[(4-吡啶烷基)氨基]蝶啶、6-[2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1h-咪唑-4-基]-喹喔啉、4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基]-吡啶-2-yl}-n-(四氢-2h-吡喃-4-基)苯甲酰胺水合物、4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]苯基]-1h-吡唑-1-乙醇、3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹噁啉基)-1h-咪唑-2-基]甲基]苯甲酰胺中的任何一种。

17.如权利要求10所述的方法,其中,所述在tgf-β抑制剂存在的情况下分化为中胚层细胞的步骤包括:在含有tgf-β抑制剂的培养基中培养2天至7天。

18.如权利要求9所述的方法,其中,所述在培养基中诱导分化的步骤包括:在含有dna修复剂、rock抑制剂和tgf-β抑制剂的培养基中诱导分化1天至2天。

19.如权利要求11所述的方法,其中,所述在成熟培养基中培养的步骤包括:处理胰蛋白酶;在dmem/f12成熟培养基中培养;以及对所述成熟培养基中培养的细胞进行离心分离。

20.如权利要求11所述的方法,其中,所述传代培养的步骤为在胰蛋白酶存在的情况下,在涂覆有细胞粘附功能增强剂的培养容器中进行传代培养。

21.如权利要求20所述的方法,其中,所述传代培养进行1代至10代。

22.如权利要求11所述的方法,其中,所述传代培养包括:去除已脱落的非中胚层干细胞,并分离出中胚层干细胞。

23.如权利要求9所述的方法,所述多能性干细胞为核移植人多能性干细胞、孤雌生殖体来源多能性干细胞、诱导多能性干细胞或胚胎干细胞。

24.如权利要求9所述的方法,其中,在所述诱导分化为间充质干细胞的步骤中,所述间充质干细胞为未成熟间充质干细胞,并且经过所述未成熟间充质干细胞制备间充质干细胞。

25.如权利要求24所述的方法,其中,相对于作为成血管细胞的标志物vegfr2,所述未成熟间充质干细胞表达为细胞群的10%或更少,并不经过成血管细胞。

26.如权利要求9所述的方法,其中,在所述制备的间充质干细胞中,70%以上的细胞群对标志物cd29、cd44、cd90或cd105呈阳性,10%以下的细胞群对标志物tra-160、cd34或vefgr2呈阴性。

27.如权利要求9的方法,其中,所述间充质干细胞具有选自造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、泌尿系统细胞、肾细胞、血管细胞、视网膜细胞和神经元细胞中的至少一种分化能。

28.一种在dna修复剂和rock抑制剂的存在下诱导分化的多能性干细胞来源间充质干细胞。

29.如权利要求28所述的细胞,其中,在所述间充质干细胞中,70%以上的细胞群对标志物cd29、cd44、cd90或cd105呈阳性,10%以下的细胞群对标志物tra-160、cd34或vefgr2呈阴性。

30.一种包括间充质干细胞的细胞治疗剂的制备方法,其包括:对根据权利要求9所述的方法制备的间充质干细胞进行传代培养至少3代,其中,应用于细胞治疗剂的从多能性干细胞的诱导分化和培养期间为20天至40天。


技术总结
本发明涉及一种用于直接分化胚胎干细胞来源间充质干细胞的培养基、用其制备间充质干细胞的方法、由此制备的间充质干细胞以及包括其的细胞治疗剂,根据一方面的培养基组合物和方法,不仅可以在短时间内以高产率制备间充质干细胞,而且由于没有胚状体形状的步骤,因此制备工艺简单,并且可以获得具有均质性的细胞,从而具有可以在比现有方法更短的时间内提供细胞治疗剂的效果。

技术研发人员:李东律;李定恩;郑寿敬;朴卿顺;朴志勋
受保护的技术使用者:车比奥泰有限公司
技术研发日:2019.09.06
技术公布日:2021.06.18
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