真贝酵母的麦芽三糖代谢突变体的制作方法

发明领域

本发明涉及微生物学领域，尤其涉及新的酵母和酵母杂种的产生。本发明还涉及这些酵母和酵母杂种用于生产发酵啤酒产品，优选啤酒的用途。

1.发明背景

真贝酵母(saccharomyceseubayanus)被发现于巴塔哥尼亚(patagonia)，并被鉴定为拉格类型啤酒酿造巴斯德酵母(saccharomycespastorianus)杂种的非酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)亲本物种(libkind等人,2011.procnatlacadsciusa108:14539-44；sampaio,2018.microbiology164:1069-71)。尽管只从野外分离出了真贝酵母(peris等人,2014.molecol23:2031-45；bing等人,2014.currbiol24:r380-r1；gayevskiy和goddard,2016.environmicrobiol18:1137-47)，但酿酒酵母与人类生物技术密切相关，特别是用于生面团发酵、啤酒酿造和葡萄酒发酵(dequin,2001.applenvironmicrobiol56:577-88)。啤酒酿造在麦芽汁上进行，麦芽汁是一种含有60％麦芽糖、25％麦芽三糖和15％葡萄糖的可发酵糖混合物的复合培养基(zastrow等人,2001.jindmicrobiolbiotechnol27:34-8)。虽然大多数酿酒酵母菌株能够有效地利用所有三种糖，但真贝酵母菌株能够利用葡萄糖和麦芽糖，但不能利用麦芽三糖(hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005；brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786；gallone等人,2016.cell166:1397-410e16)。在酿酒酵母中，利用麦芽糖和麦芽三糖的能力与mal基因座有关，所述mal基因座是在酿酒酵母菌株中的多达5种不同染色体上存在的基因簇(naumov等人,1994.genetics136:803-12)。mal基因座由三个基因组成：编码麦芽糖质子-同向转运体的scmalx1，编码将糖水解成葡萄糖的α-葡糖苷酶的scmalx2和编码在麦芽糖存在下诱导scmalx1和scmalx2表达的调节子的scmalx3(charron等人,1989.genetics122:307-16)。虽然scmalx1也可以转运其它二糖，如松三糖和蔗糖(marques等人,2017.femsyeastres17:fox006；chang等人,1989.jbacteriol171:6148-54)，但它们不能导入三糖麦芽三糖(alves等人,2008.applenvironmicrobiol74:1494-501)。然而，位于染色体vii上的mal1基因座含有编码不同转运蛋白的scagt1基因，其仅与scmalx1转运蛋白基因具有57％的同一性(han等人,1995.molmicrobiol17:1093-107)。scagt1是一种能够摄取麦芽三糖的广泛底物特异性质子同向转运体(alves等人,2008.applenvironmicrobiol74:1494-501；stambuk等人,1999.femsmicrobiollett170:105-10)。真贝酵母利用麦芽糖的能力与存在与scmalx1基因具有高度同源性的四种转运蛋白一致：semalt1、semal2、semalt3和semalt4(baker等人,2015.molbiolevol32:2818-31)。在真贝酵母型菌株cbs12357中这些基因的缺失表明它依赖于semalt2和semalt4的表达进行麦芽糖转运(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)。semalt1和semalt3在麦芽糖存在下表达不佳，这可能是由于含有它们的mal基因座的不完整所致。然而，在模式菌株cbs12357的基因组中没有发现scagt1的同源物，并且cbs12357和衍生自其的semalt基因过表达的任何菌株都不能利用麦芽三糖(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)。

为了重建推定的巴斯德酵母的杂种祖先，将酿酒酵母和真贝酵母菌株进行交配。实验室制备的酿酒酵母x真贝酵母杂种将酿酒酵母的发酵能力和糖利用与真贝酵母在低温度下生长的能力相结合(hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005；krogerus等人,2015.jindmicrobiolbiotechnol42:769-78；mertens等人,2015.applenvironmicrobiol81:8202-14)。最可能的是，麦芽三糖利用是由于酿酒酵母亲本基因组中的scagt1基因。自相矛盾的是，巴斯德酵母分离物利用麦芽三糖的能力不是由于scagt1，因为该基因被截短(vidgren等人,2009.applenvironmicrobiol75:2333-45)。相反，麦芽三糖利用与对巴斯德酵母特异的两个基因有关：spmty1和seagt1。在多种巴斯德酵母菌株中发现了基因spmty1，基因spmty1与scmalx1基因共有90％的序列同一性，并且能够进行麦芽三糖转运，甚至具有比麦芽糖更高的亲和力(salema-oom等人,2005.applenvironmicrobiol71:5044-9；dietvorst等人,2005.yeast22:775-88)。有趣的是，spmty1显示了与semalt基因的序列相似性(cousseau等人,2013.lettapplmicrobiol56:21-9；nguyen等人,2011.plosone6:e25821)。seagt1与scagt1共有85％的序列同一性，但在真贝酵母染色体viii-xv上发现了seagt1(nakao等人，2009.dnares16:115-29)。根据其高的序列相似性，seagt1显示出与scagt1类似的转运特性，并且还实现了高亲和力的麦芽三糖导入(vidgren和londesborough,2012.jinstbrew118:148-51)。尽管麦芽三糖转运蛋白spmty1和seagt1存在于巴斯德酵母基因组中，但在真贝酵母模式菌株cbs12357的基因组测序期间没有发现麦芽三糖转运蛋白spmty1和seagt1。尽管这些麦芽三糖转运蛋白可能存在于比cbs12357与巴斯德酵母的真贝酵母祖先更密切相关的菌株中(bing等人,2014.currbiol24:r380-1)，但它们也可以在拉格啤酒酿造环境中驯化巴斯德酵母期间进化。

不论在巴斯德酵母中真贝酵母麦芽三糖转运蛋白的来源，有效的麦芽三糖利用对于拉格啤酒酿造是至关重要的。目前，进行了广泛的研究，以形成用于工业拉格啤酒酿造的新的酿酒酵母x真贝酵母杂种(krogerus等人,2017.applenvironmicrobiol101:65-78)，并且真贝酵母本身也被用于酿造(rickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)。在这个背景下，不能利用麦芽三糖对它们的工业性能是不利的，因为残留的麦芽三糖影响啤酒的风味特征和甜味，伴随地较低的乙醇产率可能限制加工盈利性(zheng等人,1994.jamsocbrewchem52:41-7)。然而，尽管利用麦芽三糖的真贝酵母菌株对于酿造业是有价值的，但由于对遗传修饰的有机体的差的顾客接受性，因此不应通过目标基因组编辑来构建该菌株(varzakas等人,2007.critrevfoodscinutr47:335-61)。实验室进化是一种常用的非gmo方法，其通过在有利于细胞发展成所需表型的条件下延长生长和选择来获得所需的特性(mans等人,2018.curropinbiotechnol50:47-56)。在酵母属酵母中，可选择的特性包括复杂多样的表型，如高温耐受性、有效的营养利用和抑制剂耐受性(yona等人,2012.procnatlacadsciusa109:21010-5；gresham等人,2008.plosgenet4:e1000303；gonzález-ramos等人,2016.biotechnolbiofuels9:173；caspeta等人,2014.science346:75-8)。成功地应用实验室进化来提高阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的糖利用率(gresham等人,2008.plosgenet4:e1000303,papapetridis等人,2018.femsyeastres18:foy056；verhoeven等人,2018.femsyeastres18:doi:10.1093/femsyr/foy062；hong等人,2011.procnatlacadsciusa108:12179-84)。在巴斯德酵母中，通过在富含麦芽三糖的培养基上进行恒化器培养，成功地改善了麦芽三糖的摄取(brickwedde等人,2017.frontmicrobiol8:1690)。

因此，需要不是通过目标基因组编辑构建的利用麦芽三糖的真贝酵母菌株。

2.发明的简要说明

在本研究中，在选择能够利用麦芽三糖的条件下，对真贝酵母模式菌株cbs12357进行uv诱变和实验室进化。由于cbs12357完全不能在麦芽三糖上生长，因此将uv诱变的突变体首先引入到具有以麦芽三糖作为唯一碳源的合成培养基的需氧摇瓶中。当观察到生长时，在相同条件下进行连续需氧批次直到生长快速且一致。然而，当在工业酿造麦芽汁上生长时，所得突变体不消耗任何麦芽三糖。因此，在富含麦芽三糖的酿造麦芽汁上，在厌氧恒化器中进一步进化所得突变体。所得突变体在工业麦芽汁中表征。使用短读和长读测序对利用麦芽三糖的突变体的基因组进行测序，并鉴定包括snp、indel和染色体重组的突变。在未进化的cbs12357菌株中引入成功地恢复麦芽三糖利用的推定的因果突变。当真贝酵母用于工业拉格啤酒发酵时，在工业条件下评价非gmo进化突变体的工业性能。

因此，本发明提供了能够发酵麦芽三糖的突变酵母属酵母。所述突变的酵母属酵母优选是突变的酿酒酵母、葡萄汁酵母(s.uvarum)、贝酵母(s.bayanus)或真贝酵母。所述突变的酵母属酵母优选包含嵌合转运蛋白基因，优选嵌合麦芽糖转运蛋白基因，其中第一编码基因序列的一部分易位至邻近第二编码基因序列的一部分，使得产生的嵌合蛋白含有所述第一基因产物的一部分和所述第二基因产物的一部分。所述突变的酵母属酵母优选包含来自semalt1、semalt2、semalt3和/或semalt4的序列元件或基因部分，优选来自semalt4/semalt1/semalt2或semalt4/semalt3的序列元件或基因部分。能够发酵麦芽三糖的突变的真贝酵母优选包含嵌合麦芽糖转运蛋白基因，其中第一编码基因序列的一部分易位至邻近第二编码基因序列的一部分，使得产生的嵌合蛋白含有所述第一基因产物的一部分和所述第二基因产物的一部分。

在一个实施方案中，所述酵母属酵母是突变的真贝酵母，其具有包含semalt4的核苷酸1-434、semalt1的核苷酸430-1122、semalt2或semalt4的核苷酸1113-1145和semalt3的核苷酸1141-1842的嵌合麦芽糖转运蛋白基因，如图3c所述。所述突变的真贝酵母优选具有降低的酚酸的脱羧活性，优选不产生4-乙烯基愈创木酚。

本发明还提供了生产杂种酵母的方法，其包括a)提供本发明的突变的真贝酵母作为第一亲本，以及提供第二酵母作为第二亲本，所述第二亲本不同于所述第一亲本，b)将来自所述第一亲本的细胞与来自所述第二亲本的细胞杂交，以及c)鉴定所得的杂种有机体。所述第二亲本是狭义酵母属(saccharomycessensustricto)复合体的酵母。

在本发明的优选方法中，在使细胞杂交之前，用荧光染料标记来自第一和/或第二亲本的细胞。在进一步优选的方法中，杂交在比第一和/或第二亲本的最佳生长温度低至少5℃的温度下进行。

本发明还提供了通过根据本发明的生产杂种酵母的方法生产的杂种酵母。所述杂种酵母包含嵌合麦芽糖转运蛋白基因，其中第一编码基因序列的一部分易位至邻近第二编码基因序列的一部分，使得所产生的嵌合蛋白含有所述第一基因产物的一部分和所述第二基因产物的一部分。

本发明还提供了生产发酵啤酒产品的方法，其包括将根据本发明的发酵酵母加入到麦芽汁中，以及至少部分地发酵所述麦芽汁以生产发酵啤酒产品的步骤。

所述发酵酵母优选包含导致基因pad1和fdc1中的至少一个失活和/或编码以下蛋白的基因失活的突变：参与酚酸，优选阿魏酸摄取的蛋白或者参与脱羧酚类化合物，优选4-乙烯基愈创木酚的输出的蛋白。所述生产的发酵啤酒产品优选是啤酒，优选是拉格啤酒。在生产发酵啤酒产品的优选方法中，在发酵之后，优选通过精馏蒸发降低发酵啤酒产品的醇含量。

本发明还提供了通过本发明的方法生产的发酵啤酒产品。

本发明还提供了根据本发明的突变酵母属酵母用于生产杂种酵母的用途。

本发明还提供了根据本发明的突变酵母属酵母或杂种酵母用于生产发酵啤酒产品，优选啤酒，更优选拉格啤酒的用途。

3.附图说明

图1：在真贝酵母cbs12357中开发工业相关的麦芽三糖利用的过程的示意概述。用uv照射孢子化的真贝酵母细胞以产生新的表型。通过在含有麦芽三糖作为唯一碳源的sm上生长，富集突变体库中的消耗麦芽三糖的细胞。从富集的培养物中，使用facs制备单菌落分离物，随后在微量滴定板中筛选高od660。为了提高在工业相关条件下用于麦芽三糖消耗的获得的分离物，将7种突变体汇集，并在富含另外的麦芽三糖的改良工业麦芽汁上在碳受限的厌氧恒化器中进化。在进化之后，使用facs产生单菌落分离物，并在工业相关条件下表征。对成功的进化突变体进行全基因组测序，并且通过在cbs12357中过表达semalt413来对所得的易位反向工程化。最后，为了证明适用性和工业相关性，在工业中试规模上对进化的突变株进行检测。

图2：诱变和进化以获得消耗麦芽三糖的真贝酵母。(a)在20℃下，巴斯德酵母cbs1483(▲)、真贝酵母cbs12357(■)和ims0637(●)在smmt上的表征。ims0637的数据代表其它突变体ims0638-ims0643。从两个重复测定麦芽三糖(◆)的平均浓度和平均偏差。(b)在20℃下，巴斯德酵母cbs1483(黑色)、真贝酵母cbs12357(白色)和ims0637(灰色)在麦芽汁上的表征。从单一生物学测量中测量(■)葡萄糖、(▲)麦芽糖和((◆)麦芽三糖的浓度。(c)在富含麦芽三糖的麦芽汁上，在20℃下，在厌氧恒化器中，菌株ims0637-ims0643的实验室进化过程中，流出物中残留的麦芽三糖浓度。通过hplc测量(■)葡萄糖、(▲)麦芽糖和(◆)麦芽三糖的浓度。在技术故障(虚线)之后重新启动恒化器。(d)在12℃下，在250ml微需氧瓶中，巴斯德酵母cbs1483(黑色)、真贝酵母cbs12357(白色)、ims0750(深灰色)和ims0752(浅灰色)在麦芽汁上的表征。从三个生物学重复测定(■)葡萄糖、(▲)麦芽糖和(◆)麦芽三糖的平均浓度和标准偏差。

图3：诱变的菌株ims0637和进化菌株ims0750中突变的鉴定。(a)在uv-诱变的ims0637和进化的ims0750中发现的突变相对于野生型cbs12357的文氏图。如通过pilon所检测的，表明了单核苷酸多态性(snp)、小的插入和缺失(indel)和拷贝数变异(cnv)。(b)ims0637和ims0750中的重组染色体结构，如通过使用minion技术的全基因组测序和从头基因组组装所检测的。示意性地表示了chrii和chrxvi的左臂的前15000个核苷酸。对于chrii，序列的起点用黑色表示；对于chrviii，标记序列的起点；对于chrxiii，序列的起点用浅灰色表示；对于chrxvi，序列的起点用深灰色表示。另外，序列上存在的semalt转运蛋白基因用箭头表示。尽管chrii和chrviii的重组存在于ims0637和ims0750中，但chrxvi的两个拷贝的重组仅在ims0750中发现，而在ims0637中没有发现。chrxvi上的重组产生了嵌合的semalt413转运蛋白。(c)semalt413的1842个核苷酸相对于semalt1、semalt3和semalt4的序列相似性的概述。比对基因的开放阅读框并鉴定具有100％序列同一性的区域。对于序列同一性低于100％的区域，指示每个semalt基因的实际序列同一性。对于chrii，序列的起点用黑色表示；对于chrviii，标记序列的起点；对于chrxiii，序列的起点用浅灰色表示；对于chrxvi，序列的起点用深灰色表示。(d)semalt413的蛋白结构的预测，其中左侧是跨膜视图，右侧是转运通道视图。源自真贝酵母semalt转运蛋白的结构域由深灰色(semalt4染色体xvi)、黑色(semalt1染色体ii)和浅灰色(semalt3染色体xiii)表示。

图4：cbs12357中semalt413的反向工程和sm中转运蛋白功能的表征。(a)与cbs12357中的sesga1基因座结合的crispr-cas9grna复合物(在来自表达的grna的5’锤头状核酶和3’肝炎-δ病毒核酶自切割之后)的图示。用引物13559/13560从pud814(semalt413)扩增具有转运蛋白盒sctef1p-semalt413-sccyc1t的修复片段，并且该修复片段含有具有用于重组的sesga1基因座的突出端。用sctef1p-semalt413-sccyc1t盒代替sesga1。使用sesga1基因座上游和下游的引物12635/12636检查正确的转化体。使用sanger测序来验证菌株。(b,c,d)(■)cbs12357、(▲)ims0750、imx1941、(◆)imx1942在sm葡萄糖(b)、麦芽糖(c)和麦芽三糖(d)上的表征。在20℃下培养菌株并通过hplc测量培养物上清液。数据代表三个生物学重复的平均值和标准偏差。

图5：在7l中试规模的高比重麦芽汁(17°p)中的真贝酵母菌株cbs12357(黑色)和ims0750(白色)的细胞外代谢物分布。(a)糖消耗和乙醇生产。以％(m/v)表示的糖时程数据表示如下：葡萄糖(■)、麦芽糖(▲)、麦芽三糖(◆)。以％(v/v)表示的乙醇生产曲线表示为(●)。

4.发明详述

4.1定义

如本文所用的术语“发酵啤酒产品”是指通过发酵例如农作物及其产物如谷物，大米，葡萄和其它水果，坚果和/或来自例如龙舌兰、丝兰和仙人掌的渗出物而生产的啤酒产品。

如本文所用的术语“醇降低的发酵啤酒产品”是指在与相应的正常发酵啤酒产品相比时，具有降低的乙醇水平的发酵啤酒产品。例如，醇降低的啤酒优选包含小于5体积％，如0.5-1.2体积％的乙醇作为醇。

如本文所用的术语“无醇发酵啤酒产品”是指其中不存在乙醇或其中存在小于0.03vol％的发酵啤酒产品。注意，无醇啤酒的最大百分比在各国之间可能不同。例如，在美国和一些欧洲国家中，无醇啤酒(alcohol-freebeer)(也称为“不含酒精的啤酒(non-alcoholicbeer)”)可以含有小于0.5vol％，但在英国，不超过0.05vol％。然而，如本文所用，术语“无醇发酵啤酒产品”是指其中不存在乙醇或其中存在小于0.03vol％的发酵啤酒产品。

如本文所用，术语“麦芽三糖”是指由通过α-1,4糖苷键连接的三个葡萄糖分子组成的三糖。

如本文所用的术语“酚酸的脱羧活性”是指转化成其脱羧形式的酚酸的量，优选酶促转化成其脱羧形式的酚酸的量。酶促转化优选由编码苯基丙烯酸脱羧酶(pad1)和/或阿魏酸脱羧酶(fdc1)的基因编码的两种蛋白质中的至少一种或两种催化。已经表明，这两种基因之一的失活足以干扰酚酸的脱羧。酚酸的脱羧活性，即转化成其脱羧形式的酚酸的量可以通过本领域已知的任何方法测定。例如，阿魏酸和4-vg在200至400nm显示出很强的光吸收光谱差异。阿魏酸在300nm以上显示出高吸收值，而转化成4-vg导致在300nm以上的吸收值降低。该差异可以用于估计阿魏酸向4-vg的转化能力，作为酚酸的脱羧活性的估计。例如，在阿魏酸存在下在合成麦芽汁中生长的例如微量滴定板培养物的上清液可以通过离心收集，例如在4℃下以2500xg离心5分钟，转移至微量滴定板，并且可以测定96孔微量滴定板的250nm至400nm的吸收光谱。作为另一个实例，可以通过在底物，即酚酸如阿魏酸或肉桂酸存在下孵育酵母细胞或酵母细胞培养物，以及通过质谱或高效液相色谱(hplc)测定酚酸向其脱羧形式的转化来测定脱羧活性。

如本文所用的术语“酚酸的脱羧活性降低”是指酵母的脱羧活性的百分比，其与对照，优选未修饰的对照相比降低。可以例如在预定时间段内测定酚酸的转化，并将其与在相同时间段内对照酵母细胞或酵母细胞培养物中酚酸的转化进行比较。作为另一个实例，可以通过测定在肉桂酸存在下培养的酵母细胞的增殖与在肉桂酸不存在下培养的酵母细胞的增殖的比率以更间接的方式测定脱羧活性。由于肉桂酸比其脱羧形式的苯乙烯对酵母细胞的毒性更大，因此与参照相比，在酵母细胞或酵母细胞培养物中肉桂酸存在下，酵母细胞的增殖降低意味着脱羧活性降低。例如，可以通过测定在肉桂酸存在下培养的酵母细胞的增殖比率来测定降低百分比。可选地，可以测定在肉桂酸存在或不存在下酵母细胞的增殖，并且可以测定在肉桂酸存在下培养的酵母细胞的增殖与在肉桂酸不存在下培养的酵母细胞的增殖的比率作为脱羧活性的量度。作为参照，常规用于发酵过程的正常酵母菌株，例如用于啤酒发酵的喜力a级酵母(heineken-ayeast)和/或喜力d级酵母(heinekend-yeast)，可以用作测定酚酸的脱羧活性降低的参照。与常规用于指定发酵方法的正常酵母菌株相比，所述降低优选是至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。这意味着酚酸的脱羧活性降低的酵母具有的脱羧活性是参照的脱羧活性的至多40％，更优选是所述参照的脱羧活性的至多30％，更优选是至多25％，更优选是至多20％，更优选是至多15％，更优选是至多10％，更优选是至多5％，最优选是至多1％。

如本文所用的术语“突变”是指酵母基因组dna的改变，包括但不限于点突变、一个或多个核苷酸的插入或缺失、一个或多个核苷酸的取代、移码突变和单链或双链dna断裂，如染色体断裂或易位，以及它们的任何组合。

如本文所用的术语“易位”是指染色体区段从一个位置移动到同一染色体内的另一个位置或移动到另一染色体。易位可以是相互的，意味着片段在两个染色体位置之间，如在两个染色体之间相互交换。

如本文所用的术语“基因”是指确保由基因编码的产物表达的任何和所有顺式作用基因组序列，包括增强子和启动子序列、外显子和内含子序列。所述产物可以是rna分子，如mrna分子或sirna分子，和/或蛋白质。

如本文所用的术语“参与另一基因的转录控制的基因”是指编码调节另一基因表达的转录调节剂或因子的基因。

如本文所用的术语“失活基因”表示不能执行其正常功能的基因。例如，对于编码蛋白质的基因，“失活”意指该基因不翻译成蛋白质，编码无活性的蛋白质或编码活性降低的蛋白质。例如，所述失活可能是由于启动子序列的改变，使得启动子不能启动基因的转录；由于内含子的剪接位点的改变，所述改变干扰转录的前体mrna(pre-mrna)的正确剪接；或者由于基因编码区的改变，使得编码的蛋白质的活性降低或甚至失活。与非失活基因相比，所述失活优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。

如本文所用的术语“启动子”是指被认为是启动基因转录所需的该基因的调控区的基因组序列。它通常位于基因的5'部分，通常但不排它地位于转录起始位点的前面。

如本文所用的术语“杂种”或“杂种酵母”是指这样的酵母，其是将不同品种或物种的两种酵母的基因组进行组合的结果。杂种优选是有性杂交的结果，这意味着杂种酵母是不同性别的两种细胞，如不同交配类型的两种细胞，优选两个配子融合的结果。

如本文所用的术语“种间杂种”是指这样的酵母，其是将不同物种或属的两种有机体的基因组进行组合的结果。

如本文所用的术语“第一亲本”和“第二亲本”是指不同品种或物种的两种酵母。所述两种酵母是杂交相容的。

如本文所用的术语“杂交相容的”是指可以杂交，优选有性杂交的两种酵母。可以使用术语“交配相容的”，其等于术语“杂交相容的”。

术语“染料a”和“染料b”是指可用于对酵母细胞进行染色的不同荧光染料。

如本文所用的术语“最佳生长温度”是指来自第一亲本有机体和第二亲本有机体的酵母细胞最佳生长的温度，这意味着细胞最快地完成完整的细胞周期。大多数酵母的最佳生长温度是10-40℃，优选15-30℃，如18℃-25℃，更具体地20℃-22℃。

如本文所用的术语“营养缺陷型标志物”是指编码指向用于生物合成的必需代谢物，特别是单体的代谢途径中的关键酶的标志物基因。一个实例是ura3基因，其编码酿酒酵母中嘧啶生物合成中的必需酶乳清苷-5'-磷酸脱羧酶。类似地，his3、leu2、trp1和met15标志物基因分别编码用于从头合成氨基酸组氨酸、亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的必需酶。营养缺陷型标志物的存在允许细胞在不存在相应的必需代谢物的情况下生长。

如本文所用的术语“二倍体”是指包含两组染色体的细胞或有机体。一组染色体从一个亲本获得，而第二组染色体通常从第二亲本获得。术语“二倍体”用于将具有两组染色体的细胞和有机体，与称为单倍体的具有一组染色体的细胞和有机体，以及称为多倍体的具有多组染色体的细胞和有机体分开。多倍体细胞和有机体包括三倍体、四倍体、五倍体、六倍体和八倍体细胞和有机体。

如本文所用的术语“非整倍体”是指其中不是所有染色体都以相同拷贝数存在的细胞或有机体。因此，如本领域技术人员已知的，染色体组(chromosomecomplement)不能表示为确定数量的完整染色体组，例如n、2n、3n或4n。术语非整倍性是指与整倍体细胞相反，在细胞或有机体中存在异常数量的染色体。非整倍体细胞可能缺失或具有额外的染色体部分，或者可能缺失一个或多个染色体或者具有额外的一个或多个染色体。

如本文所用的术语“萌发”是指种子或配子恢复植物性(vegetatatively)生长能力，从而通过有丝分裂生长导致多细胞结构或导致细胞复制的过程。萌发的最常见实例是从种子发芽成幼苗。另外，从孢子如来自真菌孢子的菌丝孢子形成孢苗的生长，也被称为萌发。另外，真菌孢子脱落其孢子壁并恢复正常代谢活性，如在酵母中发生的过程也被称为萌发。萌发通常取决于诸如温度、湿度、氧气供应以及有时光或黑暗的条件。

如本文所用的术语“酵母”和“发酵酵母”是指被分类为真菌界成员的真核单细胞微生物。优选的酵母是狭义酵母属复合体的酵母，包括其任何杂种。狭义酵母属复合体目前涵盖9种不同的物种：酿酒酵母、奇异酵母、里约酵母、葡萄汁酵母、米卡塔酵母、库德里阿兹威酵母(s.kudriavzevii)、s.arboricola、真贝酵母和最近发现的s.jurei[hittinger,2013.trendsgenet29:309-317；naseeb等人,2017.intjsystevolmicrobiol67:2046-2052]。

如本文所用的术语“发酵酵母”是指狭义酵母属复合体的酵母，优选酿酒酵母或真贝酵母和/或其杂种，如巴斯德酵母，也称为卡尔斯伯酵母(s.carlsbergensis)。

4.2利用酵母选择利用麦芽三糖的非麦芽三糖的突变体的方法

酵母属酵母的诱变可以使用本领域已知的任何方法进行，包括常规的随机诱变方法(如辐射和化学处理)和重组dna技术(如定点诱变或靶向诱变)。因此，酵母细胞可以进行随机诱变，包括用uv照射、x射线照射、γ射线照射和诱变剂处理，或进行基因工程。

术语“随机诱变”是指这样的诱变技术，其中突变的确切位点是不可预测的，并且可以在酵母细胞或孢子的染色体中的任何地方发生。通常，这些方法包括使用化学试剂或辐射来诱导至少一种突变。使用易错pcr可以进一步实现随机诱变，其中pcr在dna聚合酶的拷贝精度低的条件下进行，导致pcr产物中相对高的突变率。

“基因工程”是本领域众所周知的，是指使用生物技术方法改变酵母的基因组，从而引入酵母基因组dna的改变，优选在预定位点并且预定改变，称为定点诱变。

靶向诱变，也称为定点诱变，可以使用寡核苷酸定向诱变在目的基因组dna序列中产生定点突变来实现。靶向诱变是指在体内改变特定基因，导致针对特定位点的基因结构改变的诱变方法，如通过可编程rna引导的核酸酶，如talen、crispr-cas、锌指核酸酶或兆核酸酶技术。

所述诱变优选通过用辐射，如uv照射、x射线照射、γ射线照射和/或诱变剂，优选化学剂如ntg(n-甲基-n'-硝基-n-亚硝基胍)或ems(甲磺酸乙酯)处理酵母来进行。特别优选的诱变程序包括uv照射，例如10秒至3分钟，优选大约1-2分钟。优选的方法包括在253,7nm的辐射峰处暴露于uv光(tuv30wt8,philips,eindhoven,thenetherlands)0.1-10分钟，优选0.5-5分钟，如约90分钟。

所述诱变，优选随机诱变，优选进行两轮或更多轮。每轮优选包括诱变步骤，优选温和的诱变步骤，优选uv介导的诱变步骤，其导致20-60％，优选40-50％的中等存活率。

在第一轮中，突变的酵母可以接种在含有麦芽三糖作为唯一碳源的合成培养基中，这将富集能够消耗麦芽三糖的突变体。

第二轮诱变优选包括在富含麦芽三糖的啤酒用的麦芽汁上生长。在这些条件下，对在麦芽三糖上生长具有提高的亲和力或更高的转运率的突变体将受到较少的营养限制，从而与未突变的酵母相比产生选择性优势。为此，麦芽汁可以稀释2-10倍，例如6倍。所述稀释的麦芽汁可以补充麦芽三糖，例如1-20gl^-1，如10gl^-1麦芽三糖，以增加麦芽三糖的相对浓度。可以补充麦角固醇(例如1-100mgl^-1)、80(例如100-1000mgl^-1)以及硫酸铵(例如1-20mgl^-1)以防止氧和氮限制。

所述在富含麦芽三糖的啤酒用的麦芽汁上的生长优选通过连续培养进行。所述连续培养可以以0.001-0.2h^-1，优选0.01-0.1h^-1，如0.03h^-1的稀释率操作。在麦芽三糖浓度降低的时间点，优选例如通过facs分选来分离来自培养物的单细胞。可以将分离的细胞铺板在含有麦芽三糖作为唯一碳源的合成培养基上，和/或铺板在如上所述的富含麦芽三糖的啤酒用的麦芽汁上，以进一步选择可以利用麦芽三糖的酵母突变体，优选真贝酵母突变体。

另外，不能利用麦芽三糖的酵母属酵母包括一些酿酒酵母菌株、葡萄汁酵母和贝酵母。除了真贝酵母之外，利用酵母选择利用麦芽三糖的非麦芽三糖的突变体的上述方法也适用于葡萄汁酵母和贝酵母。

4.3利用麦芽三糖的突变酵母属酵母

真贝酵母首次分离自西北部巴塔哥尼亚的假山毛榉树和cyttariaharioti的子座(libkind等人,2011.procnatlacadsci108:14539-44)。后来还从北美(peris等人,2014.molecol23:2031-45)、亚洲(bing等人,2014.currbiol24:r380-1)和大洋洲(gayevskiy和goddard,2016.environmicrobiol18:1137-47)的地点分离出了真贝酵母菌株。巴塔哥尼亚的真贝酵母菌株cbs12357^t的初步生理学表征揭示其在低于10℃的温度下比酿酒酵母长得快(hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005)，显示了差的絮凝(krogerus等人,2015.jindmicrobiolbiotechnol42:769-78)以及消耗麦芽糖而不是麦芽三糖(gibson等人,2013.yeast30:255–266).gibson等人,2017.femsyeastres17:fox038；hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005)。

大多数真贝酵母菌株不能转运麦芽三糖和/或将麦芽三糖转化为乙醇。

真贝酵母的基因组含有被注释为己糖易化子(hxt)转运蛋白直向同源物的9个基因(baker等人,2015.molbiolevol32:2818–2831；hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005)。除了这些不依赖能量的己糖易化子之外，果糖/h+同向转运体存在于真贝酵母中(pengelly和wheals,2013.femsyeastres13:156–161)。真贝酵母模式菌株cbs12357的基因组还含有四个semalt麦芽糖转运蛋白，称为semalt1、semalt2、semalt3和semalt4，然而，尚未对其进行功能分析(baker等人,2015.molbiolevol32:2818–2831)。它们均未显示出转运麦芽三糖，因为真贝酵母cbs12357不能在这种三糖上生长(hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005)。尽管已经报道了与来自酿酒酵母的agt1通透酶具有81％同源性的基因(cousseau等人,2012.lettersinappliedmicrobiology56:21—29)，但真贝酵母似乎没有编码与酿酒酵母麦芽三糖转运蛋白scagt1，或者与巴斯德酵母麦芽三糖转运蛋白spmty1和seagt1具有高相似性的任何转运蛋白(baker等人,2015.molbiolevol32:2818–2831；hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005)。

所述突变酵母优选是包含所述的编码活化转运蛋白的基因和与酵母基因组中的这些转运蛋白旁系同源的和同源的任何嵌合基因的狭义酵母属复合体。

根据本发明的优选的突变真贝酵母是在随机诱变之后，优选在uv诱变之后获得的。

真贝酵母的诱变可导致一种或多种转运蛋白基因的活化，所述转运蛋白基因在活化之后能够转运麦芽三糖；和/或一种或多种细胞内α-葡糖苷酶的活化。

所述活化的转运蛋白基因可以包括酿酒酵母中已知的麦芽糖转运蛋白基因，或它们在真贝酵母中的同源物，如mph2、mph3和malx1基因，包括mal21、mal31、mal41、mal61、agt1(也称为mal11)。所述活化可以进一步或另外包括来自真贝酵母中的巴斯德酵母的mty1同源物(也称为mtt1)和/或真贝酵母的agt1和malt基因，包括semalt1、semalt2、semalt3、semalt4的活化。

真贝酵母的诱变可导致一个或多个转运蛋白基因的改变，包括9个hxt基因，果糖/h+同向转运体和/或4个semalt麦芽糖转运蛋白，和/或导致一个或多个改变，从而导致例如尚未知的麦芽三糖转运蛋白的活化、上游转录活化剂的活化和/或一种或多种上述已知或未知的转运蛋白基因的转录阻抑物的失活。

类似地，真贝酵母的诱变可导致一个或多个基因的改变，其中编码的产物参与麦芽三糖分解为葡萄糖。麦芽三糖水解成葡萄糖由细胞内α-葡糖苷酶(也称为麦芽糖酶)促进，其水解末端1,4-连接的α-d-葡萄糖残基，从而释放α-d-葡萄糖。已经从啤酒酵母中分离出三种不同的α-葡糖苷酶，其中两种蛋白质能够水解麦芽三糖(matsusaka等人,1977.agricbiolchem41:1917-1923)。先验地，导致一种或多种细胞内α-葡糖苷酶活化的基因的改变可导致能够发酵麦芽三糖的突变的真贝酵母。导致一种或多种细胞内α-葡糖苷酶活化的所述突变可以与导致真贝酵母中至少一种麦芽三糖的转运蛋白活化的一个或多个突变分开，或者除了导致真贝酵母中至少一种麦芽三糖的转运蛋白活化的一个或多个突变之外。

另外，细胞表面葡萄糖传感器rgt2和/或snf3，和/或下游核转录因子rgt1的改变可用于抑制编码葡萄糖转运蛋白的基因(roy等人,2016.molbiolcell27:862-871)。本领域技术人员将理解，优选通过随机诱变对真贝酵母中编码麦芽三糖的摄取、发酵和/或需氧降解中的关键酶的一个或多个基因的改变，可产生能够将麦芽三糖转化为乙醇，优选能够将例如麦芽汁中存在的麦芽三糖完全转化为乙醇的发酵性真贝酵母。

因此，本发明提供了能够发酵麦芽三糖的突变的真贝酵母。

所述突变的真贝酵母优选包含嵌合基因，其中第一编码基因序列的一部分易位至邻近第二编码基因序列的一部分，使得产生的蛋白质含有所述第一基因产物的一部分和所述第二基因产物的一部分。例如，所述嵌合基因可以编码semalt4的第一部分和semalt1的第二部分。所述嵌合蛋白优选包含semalt1和semalt4氨基酸序列的组合，表示为semalt1/semalt4蛋白，其中n末端部分由semalt1提供，并且c末端部分由semalt4提供；或者semalt1/semalt2蛋白、semalt1/semalt3蛋白、semalt2/semalt1蛋白、semalt2/semalt3蛋白、semalt2/semalt4蛋白、semalt3/semalt1蛋白、semalt3/semalt2蛋白、semalt3/semalt4蛋白、semalt4/semalt1蛋白、semalt4/semalt2蛋白或semalt4/semalt3蛋白。

所述嵌合蛋白可以包含三个semalt氨基酸序列的组合，包括例如semalt1/semalt2/semalt3、semalt1/semalt3/semalt3、semalt1/semalt2/semalt4、semalt1/semalt3/semalt4、semalt2/semalt1/semalt3、semalt2/semalt1/semalt4、semalt2/semalt3/semalt1、semalt2/semalt3/semalt4、semalt2/semalt4/semalt1、semalt2/semalt4/semalt3、semalt3/semalt1/semalt2、semalt3/semalt1/semalt4、semalt3/semalt2/semalt1、semalt3/semalt2/semalt4、semalt3/semalt1/semalt2、semalt3/semalt1/semalt4、semalt4/semalt1/semalt2、semalt4/semalt1/semalt3、semalt4/semalt2/semalt1、semalt4/semalt2/semalt3、semalt4/semalt3/semalt1或semalt4/semalt3/semalt2。

因为已知semalt2和semalt4在真贝酵母中表达，所以嵌合蛋白的n-末端部分优选来自semalt2或semalt4。因此，进一步优选的嵌合蛋白包括，例如，semalt2/semalt1/semalt3、semalt2/semalt1/semalt4、semalt2/semalt3/semalt1、semalt2/semalt3/semalt4、semalt2/semalt4/semalt1、semalt2/semalt4/semalt3、semalt4/semalt1/semalt2、semalt4/semalt1/semalt3、semalt4/semalt2/semalt1/semalt3、semalt4/semalt2/semalt3、semalt4/semalt3/semalt1/semalt3、semalt4/semalt3/semalt2/semalt3、semalt2/semalt1/semalt4/semalt3、semalt2/semalt3/semalt1/semalt3、semalt2/semalt3/semalt4/semalt3、semalt2/semalt4/semalt1/semalt3、semalt4/semalt1/semalt2/semalt3、semalt4/semalt2/semalt1/semalt3、semalt4/semalt3/semalt1/semalt3、semalt4/semalt3/semalt2/semalt3、semalt4/semalt3/semalt1/semalt3、semalt4/semalt3/semalt2/semalt3、semalt2/semalt1/semalt3/semalt1、semalt2/semalt1/semalt4/semalt1、semalt2/semalt3/semalt4/semalt1、semalt2/semalt4/semalt3/semalt1、semalt4/semalt1/semalt2/semalt1、semalt4/semalt1/semalt3/semalt1、semalt4/semalt2/semalt3/semalt1、semalt4/semalt3/semalt1/semalt1、semalt4/semalt3/semalt2/semalt1、semalt2/semalt1/semalt3/semalt2、semalt2/semalt1/semalt4/semalt2、semalt2/semalt3/semalt1/semalt2、semalt2/semalt3/semalt4/semalt2、semalt2/semalt4/semalt1/semalt2、semalt2/semalt4/semalt3/semalt2、semalt4/semalt1/semalt2/semalt4、semalt4/semalt1/semalt3/semalt4、semalt4/semalt2/semalt1/semalt4、semalt4/semalt2/semalt3/semalt4、semalt4/semalt3/semalt1/semalt4、semalt4/semalt3/semalt2/semalt4或这些转运蛋白的其它组合。

根据本发明的进一步优选的突变的真贝酵母具有嵌合麦芽糖转运蛋白基因，其包含semalt2和/或semalt4的n-末端部分和c-末端部分。

根据本发明的最优选的突变的真贝酵母具有嵌合麦芽糖转运蛋白基因，其包含semalt4/semalt1/semalt2或semalt4/semalt3。所述最优选的嵌合基因优选包含semalt4的核苷酸1-434、semalt1的核苷酸430-1122、semalt2或semalt4的核苷酸1113-1145和semalt3的核苷酸1141-1842，如图3所述。

优选改变，优选通过随机诱变改变的其它基因是参与酚酸的脱羧活性，优选产生4-乙烯基愈创木酚，更优选将阿魏酸脱羧成4-乙烯基愈创木酚的基因。其中酚类化合物通常被认为是异味的发酵饮料包括啤酒，更优选选自拉格啤酒、野生拉格啤酒、比尔森啤酒、淡色艾尔啤酒(paleale)和赛松啤酒(saison)的啤酒。

在啤酒中，一些酚类的异味直接源自麦芽汁，其它是酵母的酶促转化的结果，或由于氧和温度(例如在麦芽汁煮沸或在瓶中陈化期间)而导致的化学转化的结果。在啤酒发酵过程中，存在于麦芽汁中的阿魏酸通过酶促脱羧转化为酚类异味4-vg。最初认为仅涉及编码苯基丙烯酸脱羧酶的pad1，但来自mukai等人(mukai等人,2010.jbiosciebioeng109:564-569)的结果表明pad1和编码阿魏酸脱羧酶的fdc1对于脱羧是必需的。顶部发酵酵母通常含有pad1和fdc1的活性组，而底部发酵酵母不能将酚酸转化成相应的酚类异味。

优选的发酵酵母在基因pad1和fdc1中的至少一个，和/或参与至少一个所述基因的转录控制的基因，和/或编码参与酚酸，优选阿魏酸的摄取的蛋白或参与脱羧酚类化合物，优选4-乙烯基愈创木酚的输出的蛋白的基因，和/或参与所述基因的转录控制的基因中包含突变。

所述酚酸优选是可以由pad1编码的蛋白质和/或由fdc1编码的蛋白质转化的酚酸，更优选选自阿魏酸、4-羟基苯甲酸酯、芥子酸、咖啡酸、肉桂酸、3,4-二羟基苯甲酸、阿魏酸、没食子酸、对香豆酸、4-甲氧基肉桂酸、对羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、原儿茶酸、水杨酸、丁香酸、鞣酸和/或香草酸。特别优选的底物是阿魏酸，在本发明的方法中使用的优选的发酵酵母中，阿魏酸的摄取优选被降低或甚至被抑制。

参与pad1编码的蛋白质和/或fdc1编码的蛋白质的产物输出的蛋白质的实例是pdr16/ynl231c、pdr8/ylr266c、pdr12/ypl058c、pdr10/yor328w、pdr5/yor153w、pdr18/ynr070w、pdr3/ybl005w、pdr15/ydr406w、pdr17/ynl264c和pdr11/yil013c。所述产物优选是脱羧的酚类化合物，更优选4-vg、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、愈创木酚和丁子香酚。特别优选的产物是4-vg。

因此，本发明提供了根据本发明的突变的真贝酵母，其具有降低的酚酸脱羧活性，优选不产生4-乙烯基愈创木酚。

根据本发明的优选的突变的真贝酵母可以另外包含一种或多种基因组改变，其选自染色体viii右臂的重复；转录因子基因sef1的改变；参与内吞和细胞形状控制的棕榈酰转移酶基因akr1的改变；葡萄糖感测信号途径mth1的阻抑物的改变；编码终止密码子蛋白1旁路(bypassofstopcodonprotein1，bsc1)的基因的改变，所述终止密码子蛋白1旁路是具有未确认功能的蛋白，类似于细胞表面絮凝素flo11p；铵通透酶调节基因par32的改变；孢子形成负调节子mds3的改变；麦角固醇生物合成基因erg25的改变；编码参与饥饿反应的转录因子的基因zpr1的改变；编码参与饥饿反应的转录因子的基因stp2的改变；编码在低温下发酵所需的蛋白质的基因csf1的改变；编码参与甾醇生物合成调控的蛋白质的基因nsg1的改变。

所述另外的一种或多种基因组改变优选包括转录因子基因sef1中的l895p改变；棕榈酰基转移酶基因akr1中的s50p改变；mth1的dna启动子区的改变，优选g(-753)a改变；bsc1中的l469s改变；par32的dna启动子区的改变，优选g(-1266)a、g(-1265)a、g(-1237)a和/或g(-1236a)；mds3中的p727h改变；erg25的核酸终止区的改变，优选g(+165)a改变；zpr1的一个或两个锌指结构域(aa52-210和293-486)的改变，优选s327p改变；转录因子stp2的s181l改变；csf1中的s2708p改变；和/或nsg1中的g163a改变。

除非另有说明，否则改变是指在所示位置处的第一个命名的单字母氨基酸残基氨基酸改变为第二个命名的单字母氨基酸残基。例如，akr1中的s50p改变是指第50位的丝氨酸交换为akr1中的脯氨酸。核酸启动子和终止区中的位置分别指相对于转录起始或相对于终止密码子的核苷酸位置。

4.4由突变的真贝酵母产生的杂种酵母

此外，本发明提供了用于生产杂种酵母的方法，其包括a)提供根据本发明的突变的真贝酵母作为第一亲本，以及提供第二酵母作为第二亲本，所述第二亲本不同于所述第一亲本，b)将来自第一亲本的细胞与来自第二亲本的细胞杂交，以及c)鉴定所得的杂种有机体。

在驯养环境中最常见酵母杂种，并用于各种工业发酵过程[boynton和greig,2014.yeast,31:449-462；gorterdevries等人,2017.appliedenvironmmicrobiol83:e03206-16]。例如，用酿酒酵母和真贝酵母之间的杂种巴斯德酵母进行拉格啤酒酿造[libkind等人,2011.pnas108:14539-14544]，其将酿酒酵母的发酵能力和糖利用与真贝酵母的耐冻性相结合[hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005]。已经从葡萄酒发酵中分离出酿酒酵母、库德里阿兹威酵母和葡萄汁酵母之间的各种双交种和三交种，并且其似乎在香味产生中起重要作用[gonzález等人,2006.femsyeastres6:1221-1234]。

所述第二亲本优选是狭义酵母属复合体的酵母。更优选的酵母是酿酒酵母、卡尔斯伯酵母、巴斯德酵母、真贝酵母和/或其杂种，优选酿酒酵母。

杂种中两种或更多种酵母基因组的组合通常导致协同效应——一种称为“杂种优势(heterosis)”或“杂种活力(hybridvigor)”的现象，其使得杂种在特定环境中比其亲本中的任一种表现得更好[shapira等人,2014.heredity113:316]。因此，酵母属酵母的靶向杂交通常被用于产生具有用于工业应用的新的或改进的表型的菌株。例如，相比其亲本菌株，实验室制备的酿酒酵母×真贝酵母杂种显示出更高的耐寒性和低聚糖消耗[hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005]、不同的风味特征[steensels等人,2014.appliedenvironmentmicrobiol80:6965-6975]、更高的发酵速率和更高的乙醇滴度[krogerus等人,2015.jindustrialmicrobiol&biotechnol42:769-778]。

杂种优势是一种复杂的现象，尚未得到充分的理解；它最可能是由多种因素的组合引起的，包括染色体拷贝数的量[gorterdevries等人,2017.appliedenvironmmicrobiol83:e03206-16；krogerus等人,2016.applmicrobiolbiotechnol100:7203-7222]、不同显性和隐性等位基因之间的相互作用，以及上位性相互作用[shapira等人,2014.heredity113:316]。所得表型并不总是模糊的：显性表型和通常更复杂的表型如耐冻性或絮凝通常完全遗传自亲本菌株之一[hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005；coloretti等人,2006.foodmicrobiol23:672-676]，而对于风味化合物和其它次生代谢物，杂种通常产生的浓度为约其亲本菌株产生的浓度的平均值[krogerus等人,2015.jindustrialmicrobiol&biotechnol42:769-778；bellon等人,2011.applmicrobiolandbiotechnol91:603-612]。杂种优势不仅依赖于用于种间杂交的亲本物种，而且依赖于所使用的特定菌株，使得更难以预测异交的表型。

可以类似于种内交配获得没有合子前屏障的物种种间杂种：通过交配相反交配类型的单倍体菌株，或者通过不具有相反交配类型的、在交配类型位点中经历了杂合性的自发损失的菌株之间的稀有交配形成杂种[steensels等人,2014.femsmicrobiolreviews38:947-995]。种间杂交的发生率相对较低；据报道，杂交频率范围从孢子与孢子交配的1.5％-3.6％[krogerus等人,2016.applmicrobiolbiotechnol100:7203-7222；mertens等人,2015.applenvironmentalmicrobiol81:8202-8214]至稀有交配的低至1×10^-6至1×10^-7的频率[krogerus等人,2017.microbialcellfactories16:66；gunge和nakatomi,1972.genetics70:41-58]。

为了增强杂种产物的鉴定，尤其是稀有交配事件的鉴定，用于生产杂种酵母的优选方法包括在使细胞杂交之前用荧光染料标记来自第一和/或第二亲本的细胞。

第一亲本酵母的细胞可以用第一染料(下文称为染料a)标记，而第二亲本酵母的细胞可以用第二染料(下文称为染料b)标记。染料a和染料b是荧光染料，其中染料a不同于染料b。另外，用染料a标记的细胞优选可以与用染料b标记的细胞区分开；例如通过采用具有不同激发和/或发射光谱的染料。可用于本发明方法的合适染料可以由单色光源，优选激光，更优选由紫外激光(约355nm)、紫色激光(约405nm)、蓝色激光(约488nm)或红色激光(约640nm)激发。例如，染料a可以是用约630nm的红光激光激发并在约661nm发射的染料，而染料b是用约492nm的蓝光激光激发并在约517nm发射的染料。

标记优选是直接的。标记优选通过标记蛋白质的伯胺(r-nh2)、胺修饰的寡核苷酸和其它含胺分子来进行。

为此，染料优选包含琥珀酰亚胺基，优选琥珀酰亚胺酯，以将染料偶联到胞内赖氨酸残基和其它胺源上。进一步优选的染料包括硫醇反应性染料，其中荧光标记物与例如碘乙酰胺、马来酰亚胺、苄基卤化物或溴甲基酮偶联。另外，可以使用可以通过全细胞膜片钳、离子电渗、胞饮囊泡的渗透溶解引入细胞中的包含极性染料，如荧光黄ch、级联蓝酰肼、alexafluor酰肼和生物胞素的可微注射的染料；和/或可以通过侵入性技术如显微注射、全细胞膜片钳、划痕负载(scrapeloading)、微粒轰击、电穿孔或渗透休克加载到细胞中的荧光葡聚糖缀合物或荧光微球，来对本发明方法中的细胞进行染色。

所述荧光标记物优选选自abz(邻氨基苯甲酰基(anthranilyl)，2-氨基苯甲酰基)、n-me-abz(n-甲基-邻氨基苯甲酰基，n-甲基-2-氨基苯甲酰基)、fitc(异硫氰酸荧光素)、5-fam(5-羧基荧光素)、6-fam(6-羧基荧光素)、tamra(羧基四甲基罗丹明)、mca(7-甲氧基香豆素基-4-乙酰基)、amca或amc(氨基甲基香豆素乙酸酯(盐))、丹酰基(5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰基)、edans(5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-磺酸)、atto(例如atto465、atto488、atto495、atto550、atto647)、花青(cy)染料，包括cy3(1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e)-3-(1,3,3-三甲基二氢吲哚-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-3h-吲哚-1-鎓氯化物)、cy5(1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-2-((1e,3e,5e)-5-(1,3,3-三甲基二氢吲哚-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-3h-吲哚鎓氯化物)，包括三磺化cy5和cy7(1-(5-羧基戊基)-2-[7-(1-乙基-5-磺基-1,3-二氢-2h-吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3h-吲哚鎓-5-磺酸盐(酯))、alexafluor(例如alexafluor647、alexa488、alexa532、alexa546、alexa594、alexa633、alexa647)、bodipy(例如fl)、dylight(例如dylight488、dylight550)、荧光黄(乙二胺或6-氨基-2-(2-氨基-乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1h-苯并[de]异喹啉-5,8-二磺酸)及以上的衍生物。

本领域技术人员将清楚的是，优选的染料组合包括可以优选通过没有光谱重叠的两个发射滤光片，优选不需要荧光补偿而被清楚地测量的染料，更优选可以被两个不同的激光激发以最小化光谱重叠的染料，如用紫色激光(约405nm)、蓝色激光(约488nm)或红色激光(约640nm)。允许鉴定用染料a染色的细胞并允许将其与用染料b染色的细胞分离的优选组合是可以用紫色激光和蓝色激光；用紫色激光和红色激光，或用蓝色激光和红色激光激发的荧光染料。

染料a和染料b优选是还允许鉴定含有染料a和染料b的细胞并将其与仅含有染料a和仅含有染料b的细胞分离的染料。为此，优选的染料包括用约630nm的红色激光激发并在约661nm处发射的染料，以及用约492nm的蓝色激光激发并在约517nm处发射的染料。

标记的细胞的杂交优选在黑暗中进行以防止荧光染料的漂白，这对于本领域技术人员来说是清楚的。

为了增强杂交产物的鉴定，尤其是稀有交配事件的鉴定，标记的或未标记的亲本酵母细胞的杂交优选在比第一和/或第二亲本酵母的最佳生长温度低至少5℃的温度下进行。

杂交优选在低于亲本酵母的最佳生长温度的温度下进行，以防止过度的细胞增殖。通过降低温度，细胞分裂花费更长时间，而杂交的影响较小。因此，当与较高温度下的杂交相比时，较高比例的所得细胞是杂种细胞。发现杂交温度比亲本酵母的最佳生长温度低至少5℃可以限制染料的染色损失并导致鉴定出由第一亲本酵母和第二亲本酵母之间的杂交产生的稀有种间杂种。

比第一和/或第二亲本有机体的最佳生长温度低至少5℃的温度优选低于18℃，优选为5℃-15℃，更优选为10℃-13℃，最优选为约12℃。本领域技术人员无疑能够确定具有异常最佳生长温度的酵母的最佳生长温度，例如通过在不同温度下使酵母的细胞生长。

本发明还涉及杂种酵母，其包含能够发酵麦芽三糖的突变真贝酵母的基因组拷贝。所述杂种酵母优选通过根据本发明的用于生产杂种酵母的方法产生的。

4.5生产发酵啤酒产品的方法

自从长久以来，酵母被用于烘焙、酿造和蒸馏，如用于面包生产以及啤酒和葡萄酒发酵。

啤酒用的麦芽汁包含可发酵的糖，包括麦芽糖(50-60％)、麦芽三糖(15-20％)和葡萄糖(10-15％)。本发明的方法优选使用能够发酵麦芽三糖的突变真贝酵母和/或其杂种。使用根据本发明的能够发酵麦芽三糖的突变的真贝酵母和/或根据本发明的杂种酵母将影响所得发酵啤酒产品的感官特性。

所述酵母还可以包含一个或多个天然存在的突变，和/或基因pad1和fdc1中的至少一个，参与至少一个所述基因的转录控制的基因，和/或编码参与酚酸，优选阿魏酸的摄取或参与脱羧酚类化合物，优选4-乙烯基愈创木酚的输出的蛋白的基因，和/或参与所述基因的转录控制的基因的诱变引起的突变。

所述用于生产发酵啤酒产品的方法包括在水溶液中，优选在水中提供捣碎的谷物，优选大麦，以释放麦芽糖。该制作麦芽糖步骤之后是在酒花存在下煮沸所得麦芽汁，并在冷却之后发酵所得的煮沸的麦芽汁。当发酵完成时，可以过滤啤酒并装瓶。

在发酵过程中，可发酵糖被转化成醇(如乙醇)、co2和风味化合物，如酯，例如乙酸异戊酯。如本领域技术人员已知的，将影响所得产品的外观和味道的因素包括但不限于谷物的烘焙温度和烘焙时间，谷物的浸泡、发芽和烘烤的温度和时间，谷物的碾磨和捣碎以及将所得麦芽浆过滤以产生麦芽汁的温度和时间，麦芽汁沸腾的温度和时间，加入酒花的时间和量，使用的具体酒花，发酵的温度和时间，酵母的类型，酵母的机械过滤或加入过滤剂以去除酵母以及最后，啤酒的碳酸化和包装。在可以在发酵之后但在过滤之前开始的调理步骤期间，给予数天到数周的酵母，以吸收与调理不佳(under-conditioned)或“绿色”啤酒(包括硫磺、黄油和青苹果)相关的常见异味。

在本发明的方法中，发酵过程在正常温度，优选6-25℃，优选7-20℃，更优选8-13℃，下进行。拉格啤酒发酵通常在7-13℃的温度下进行。

在一个实施方案中，醇的量在发酵之后减少。为了减少最终啤酒产品中醇的量，将醇浓度高于4vol％的所得啤酒产品进行物理过程，包括例如精馏和/或透析，包括反渗透。

精馏通常在减压下进行以实现挥发性乙醇在不导致其它成分如蛋白质和糖分解的温度下的沸腾。所述精馏优选在发酵之后在减压下于20-50℃的高温下进行。例如，narziss等人,1993.brauwelt133:1806–1820,和kern1994.alimentacionequiposytecnologia13:37–41已经描述了alfalaval,lund,swedenandosmonicsinc.,minnetonka,minnesota用于真空精馏以降低醇水平的方法。其它合适的方法包括降膜精馏(zufall和wackerbauer,2000.monatsschriftfuerbrauwissenschaft53:124–137)。合适的大规模精馏系统可从例如kmxchemicalcorporation,newchurch,virginia,popescientific,inc.,saukville,wisconsin,m&lengineeringgmbh,hofheimamtaunus,germany,centec,maintal,germany和apischmidtbrettengmbh&co.kg,bretten,germany获得。

降低发酵饮料的醇含量的透析包括使饮料通过半透膜(德国专利第2145298号和第2413236号)。优选的透析方法是将饮料分离成浓缩物和滤液的单一反渗透方法(比利时专利第717847号，德国专利第2323094号，德国专利第2339206号)。其它变型包括反渗透(美国专利第4,317,217号)和全蒸发(欧洲专利申请332,738)。所用膜的阈值特征决定了哪些低分子量分子如盐、酯和醛与醇一起从发酵饮料中去除。另外，在该过程中施加的高压可引起分子变性，导致物理化学特性的改变，如增加的浊度、絮凝等，以及感官特性的改变，如改变的风味和味道。合适的大规模透析系统可从例如alfalaval,lund,sweden和osmonicsinc.,minnetonka,minnesota获得。

5.实施例

实施例1

材料和方法

菌株与维持

真贝酵母模式菌株cbs12357(libkind等人,2011.procnatlacadsciusa108:14539-44)获自韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(westerdijkfungalbiodiversityinstitute)(utrecht,thenetherlands)。本研究中使用的所有菌株列于表1和表3中。真贝酵母菌株的储用培养物在ypd(10gl-1酵母提取物、20gl-1蛋白胨和20gl-1葡萄糖)中生长直至指数期后期，用无菌甘油补充至30％(v/v)的最终浓度，并储存在-80℃直至进一步使用。

培养基和培养

在37℃下，在含有10gl-1蛋白胨、5gl-1细菌酵母提取物、5gl-1nacl和100mgl-1氨苄青霉素的10mllb培养基中，在大肠杆菌xl1-blue细胞中繁殖质粒过夜。合成培养基(sm)含有3.0gl-1kh2po4、5.0gl-1(nh4)2so4、0.5gl-1mgso4、7h2o、1mll-1微量元素溶液和1mll-1维生素溶液(verduyn等人,1992.yeast8:501-17)，并且通过加入高压灭菌的50％溶液来补充20gl-1葡萄糖(smg)、麦芽糖(smm)或麦芽三糖(smmt)。使用纯度为95.8％的麦芽三糖(glenthamlifesciences,corsham,unitedkingdom)。工业麦芽汁由heineken供应链b.v.,zoeterwoude,thenetherlands提供。通过加入七水硫酸锌向麦芽汁中补充1.5gl-1的zn2+，在121℃下高压灭菌30分钟，并使用nalgene0.2μmsfca瓶顶过滤器(thermoscientific)过滤，然后使用。对于用稀释的麦芽汁进行的实验，将无菌脱矿物质水(demiwater)以适当的体积加入到过滤的麦芽汁中。需氧培养物在含有100ml培养基的500ml摇瓶中生长。为了在固体培养基上培养，培养基中补充了20gl-1的琼脂。将摇瓶和瓶培养物在newbrunswickinnova43/43r摇床(eppendorfnederlandb.v.,nijmegen,thenetherlands)中以200rpm孵育。用质粒pudp052(grnasesga1)转化的真贝酵母菌株的选择在smaceg:smg培养基上进行，其中(nh4)2so4被5gl-1k2so4和10mm乙酰胺代替，如前所述(solis-escalante等人,2013.femsyeastres13:126-39)。

需氧摇瓶培养

从稳定期需氧预培养物接种需氧摇瓶培养物。在smmt和smm上的生长研究在smm上预培养，在smg上的生长研究在smg上预培养，以及在三倍稀释的麦芽汁上的生长研究在三倍稀释的麦芽汁上预培养。在含有100ml培养基的500ml摇瓶中进行生长实验，并接种至od660为0.1。将摇瓶在20℃和200rpm下孵育，并定期取样以测定细胞外代谢物浓度。

微需氧瓶表征

在250ml气锁盖的瓶中进行瓶培养，在工作体积为200ml的三倍稀释的麦芽汁上补充0.4mll-1普朗尼克(pluronic)以防止起泡(sigma-aldrich)。盖的膜配备有顶端装有0.2μm过滤器的短针以防止压力积聚，并且用3ml注射器通过针无菌地进行取样。在12℃下孵育4天之后，在含有30ml相同培养基的50ml需氧greiner反应器管中，从稳定期预培养物接种瓶至od660为0.1。将瓶在12℃和200rpm下孵育，并将3,5ml样品收集在24深孔板中，使用液体处理器liha(tecan,switzerland)定期测量od660和外部代谢物。对于每个样品，在96孔板中将30μl稀释5倍至150μl，使用magellaninfinite200pro分光光度计(tecan,switzerland)测量od660，并将剩余样品过滤灭菌用于hplc测量。

表1：在本研究期间使用的酵母菌株

uv诱变和选择

在20℃下，将cbs12357在smg上需氧生长直到稳定期并用milliq稀释至od660为1.0。将50ml该溶液在4816g下旋转减慢5分钟并重悬于milliq水中两次。将25ml洗涤过的细胞倒入不带盖的100mm×15mm培养皿中，用uv灯(tuv30wt8,philips,eindhoven,thenetherlands)在253,7nm的辐射峰处照射。保留25ml非诱变的和5ml诱变的细胞以确定存活率。从两个样品制备100倍稀释液，从其制备连续的10倍稀释液至100,000倍稀释液。然后，将100μl的每种稀释液铺板在ypd琼脂上，并在室温下孵育48小时之后对菌落数进行计数。在10,000倍稀释之后，非诱变细胞形成了182个菌落，诱变细胞形成了84个菌落，表明存活率为46％。将剩余的20ml诱变细胞在4816g下旋转减慢5分钟并重悬于1mlmilliq水中。将诱变的细胞加入到含有9mlsmmt的50ml摇瓶中，并在20℃和200rpm下孵育21天。在第0天、第19天和第21天记录麦芽三糖浓度。在第21天，将100μl生长的培养物两次转移至具有smmt的新鲜摇瓶中，并孵育直至稳定期。在第二次转移结束时，使用配备有355nm、445nm、488nm、561nm和640nm激光器和70μm喷嘴，并且与过滤的facsflow^tm(bdbiosciences)一起操作的bdfacsaria^tmiisorp细胞分选仪(bdbiosciences,franklinlakes,nj)获得单细胞分离物。在每个实验之前通过用cs&tbeads(bdbiosciences)运行cst循环来评价细胞计数器性能。通过用accudropbeads(bdbiosciences)运行autodropdelay循环来测定用于分选的液滴延迟。通过绘制前向散射(fsc)相对于侧向散射(ssc)来分析细胞形态。使用对应于0的产量掩膜，32的纯度掩膜和16的相位掩膜的“单细胞”分选掩膜，将门控单细胞分选到含有smmt的96孔微量滴定板中。将96孔板在geniospro微板分光光度计(tecan,switzerland)中在室温下孵育96小时，并通过od660监测生长。最后，将生物质重悬并测量最终od660。挑选具有最高最终od660的7个分离物，重新划线并储存为ims0637-643。

麦芽三糖受限的恒化器培养

恒化器培养在配备有水平传感器的multifors2小型发酵罐(inforsht,velp,thenetherlands)中进行，以保持100ml的恒定工作体积。将培养温度控制在20℃，并通过控制培养基流入速率将稀释速率设定在0.03h^-1。使培养物在补充有10gl^-1另外的麦芽三糖(glenthamlifesciences)、0,2mll^-1消泡乳液c(sigma-aldrich,zwijndrecht,thenetherlands)、10mgl^-1麦角固醇、420mgl^-180和5gl^-1硫酸铵的六倍稀释的麦芽汁上生长。如前所述，将和麦角固醇作为溶液加入(verduyn等人,1992.yeast8:501-17)。使ims0637-ims0643在20℃和200rpm下在单独的摇瓶中在三倍稀释的麦芽汁上生长过夜。测量每个菌株的od660，并将来自每个菌株的od660为20的7ml当量汇集在50ml的总体积中。为了接种反应器，使用20ml合并的培养物。过夜生长之后，打开培养基流入泵，用20mlmin^-1的氮气喷淋发酵罐，并以500rpm搅拌。不调节ph。每周取样。由于在第63天的技术故障，对恒化器进行高压灭菌、清洁并使用在同一天采集的样品重新启动。在总共122天之后，停止恒化器，对于ims0637-ims0643，使用facs将单菌落分离物分选到smmt琼脂上。随机挑取三个菌落，重新划线并储存为ims0750-752。

基因组分离和全基因组测序

在20℃下，将酵母培养物在含有液体ypd培养基的50mlgreiner管中在设置为200rpm的定轨摇床上孵育，直到菌株达到od660为12至20的稳定期。使用qiagen100/g试剂盒(qiagen,hilden,germany)根据制造商的说明分离用于全基因组测序的基因组dna并使用fluorometer2.0(thermofisherscientific,waltham,ma)定量。

使用无pcr的文库制备，菌株cbs12357、ims0637-ims0643和ims0750-ims0752的基因组dna由novogenebioinformaticstechnologyco.,ltd(yuenlong,hongkong)在hiseq2500测序仪(illumina,sandiego,ca)上以150bp的配对末端读取测序。所有的读取都可以在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)以生物项目登记号prjna492251获得。

菌株ims0637和ims0750的基因组dna在nanoporeminion(oxfordnanoporetechnologies,oxford,unitedkingdom)上测序。如前所述使用1d连接(sqk-lsk108)制备文库(salazar等人,2017.femsyeastres17:doi:10.1093/femsyr/fox074)，并将其在连接到minionmk1b单元(oxfordnanoporetechnology)的flo-min106(r9.4)流动池上进行分析。minknow软件(版本1.5.12；oxfordnanoporetechnology)用于活性孔的质量控制和测序。由minknow生成的原始文件使用albacore(版本1.1.0；oxfordnanoporetechnology)进行基础调用。所有的读取都可以在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以生物项目登记号prjna492251获得。

基因组分析

对于菌株cbs12357、ims0637-ims0643、ims0750-ims0752和ims0760-ims0762，使用burrows–wheeler对齐工具(bwa)，将原始illumina读取与真贝酵母模式菌株cbs12357的染色体水平参考基因组(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)进行比对，并且使用samtools和pilon进一步处理用于变体调用(li和durbin,2010.bioinformatics26:589-95；li等人,2009.bioinformatics25:2078-9；walker等人,2014.plosone9:e112963)。忽略cbs12357中杂合的杂合snp和indel。使用breakdancer检测染色体易位(chen等人,2009.natmethods6:677)。仅考虑由在该基因座对齐的至少10％的读取支持的易位。使用γ设置为“无”的magnolya(nijkamp等人,2012.bioinformatics28:3195-202)以及使用k-mer大小为29的汇编程序abyss(v1.3.7)(simpson等人,2009.genomeres19:1117-23)估计染色体拷贝数变异。通过使在integrativegenomicsviewer(igv)软件中生成的.bam文件可视化来手动确认所有snp、indel、重组和拷贝数变化(robinson等人,2011.natbiotechnol29:24)。

对于菌株ims0637和ims0750，使用canu(版本1.3)从头组装纳米孔测序读取(koren等人,2017.genomeres27:722-736)，基因组大小设置为12mbp。使用pilon评估组装正确性(walker等人,2014.plosone9:e112963)以及对测序/组装误差的进一步校正“修正(polishing)”是通过仅使用snp和短indel(-固定碱基参数)的校正将illumina读取与bwa(lianddurbin,2010.bioinformatics26:589-95)来进行。使用minimap2将ims0637和ims0750的长测序读取与获得的参考基因组和cbs12357的参考基因组比对(li,2018.bioinformatics34:3094-3100)。所有的读取都可以在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以生物项目登记号prjna492251获得。

分子生物学方法

对于菌落pcr和sanger测序，通过在10μl0.02mnaoh中煮沸5分钟来制备基因组dna。为了验证属于真贝酵母物种的分离物，通过使用引物8572和8573(pengelly和wheals,2013.femsyeastres13:156-61)的pcr扩增来测试真贝酵母特异性基因sefsy1的存在，以及通过使用引物8570和8571(muir等人,2011.femsyeastres11:552-63)的pcr扩增测试酿酒酵母特异性基因scmex67的不存在。为了进一步证实真贝酵母的性质，使用引物10199和10202扩增its区，并对扩增的片段进行sanger测序(schoch等人,2012.procnatlacadsciusa109:6241-6)。将所得序列与可用的its序列进行比较，并将其分类为扩增区域与之具有最高序列同一性的物种。通过使用以下基因特异性引物的pcr证实semalt基因的存在：对于semalt1，10491和10492；对于semalt2和semalt4/2，10632和10633；对于semalt3，10671和10672；对于semalt13，10491和10671以及对于semalt413，10633和10671。对扩增的片段进行凝胶纯化，并使用用于扩增它们的引物进行sanger测序。

质粒构建

本研究中使用的所有质粒和引物列于表2和表3中。根据供应商的说明，使用phusion高保真dna聚合酶(thermofisherscientific)进行质粒的dna扩增和菌株构建。用引物对10633/10671从ims0750的基因组dna扩增semalt413的编码区。每种引物携带与p426-tef-amds的质粒骨架互补的40bp延伸(marques等人,2017.femsyeastres17:fox006)，其使用引物7812和5921进行pcr扩增。使用nebuilderhifidnaassembly(newenglandbiolabs,ipswich,ma)，将片段与p426-tef-amds骨架片段进行“gibson”组装(gibson等人,2009.natmethods6:343)，得到质粒pud814。

菌株构建

为了在真贝酵母cbs12357中整合和过表达semalt2和semalt413orf，用引物13559/13560分别从pud480和pud814扩增semalt2和semalt413，引物13559/13560携带与位于真贝酵母染色体ix上的sesga1基因的每个侧翼同源的40bp区域。为了促进整合，pcr片段与表达spcas9^d147yp411t的质粒pudp052(bao等人,2014.acssynthbiol4:585-94；gorterdevries等人,2017.microbcellfact16:222)和靶向sesga1的grna(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)共转化。通过用1μg扩增的semalt2表达盒和500ng质粒pudp052通过如前所述的电穿孔(gorterdevries等人,2017.microbcellfact16:222)转化cbs12357来构建菌株imx1941。在smaceg平板上选择转化体。类似地，通过用针对semalt413而非semalt2的1μg扩增的semalt413表达盒转化cbs12357构建imx1942。用引物对12635/12636通过诊断pcr验证正确的整合。所有pcr扩增的基因序列都是sanger测序的(baseclear,leiden,thenetherlands)。

蛋白质结构预测

使用swiss-model服务器(https://swissmodel.expasy.org/)进行semalt413转运蛋白的同源性建模(biasini等人,2014.nucleicacidsres42(w1):w252-w8)。翻译semalt413并将其用作输入。选择木糖质子同向转运体xyle(pdb:4gby)的模型作为模板(lam等人,1980.jbacteriol143:396-402)。使用promod3基于靶标-模板比对建立模型。将靶标和模板之间保守的坐标从模板复制到模型。使用片段文库重塑插入和删除。然后重建侧链。最后，通过使用力场对所得模型的几何形状进行规则化。在使用promod3的环路建模失败的情况下，使用promod-ii建立替代模型(guex等人,2009.electrophoresis30:s162-s73)。使用pymolpymol(thepymolmoleculargraphicssystem,version2.1.1llc.)对3d模型进行评估和着色。

表2：在本研究期间使用的质粒

分析学

使用高压液相色谱(hplc)agilentinfinity1260系列(agilenttechnologies,santaclara,ca)，使用65℃下的bio-radaminexhpx-87h柱和流速为0.8ml/分钟的5mm硫酸的流动相，测量乙醇和糖(葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖)的浓度。使用rid在35℃下测量化合物。将样品旋转减慢(13.000xg持续5分钟)以收集上清液或通过无菌的0.2μm过滤器，然后分析。

结果

诱变和进化使真贝酵母能够利用麦芽三糖

真贝酵母模式菌株cbs12357确实消耗麦芽糖而不是麦芽三糖，麦芽三糖是酿酒用的麦芽汁中的主要可发酵糖之一(hebly等人,2015.femsyeastres15:fov005)。在获得能够利用麦芽三糖的突变体的尝试中，应用了实验室进化(参见图1)。为了增加最初的遗传多样性，对菌株cbs12357进行轻度的uv诱变，导致46％的存活率。将突变体池接种在含有20gl-1麦芽三糖(smmt)作为唯一碳源的sm培养基中，并在20℃孵育以富集消耗麦芽三糖的突变体。在两周的迟缓期之后，观察到生长，在21天之后，麦芽三糖浓度降至10.48gl-1。在smmt培养基中进行两次随后的转移之后，使用facs将96个单细胞分选到微量滴定ypd板中。在孵育后，将所得的单细胞培养物印迹(replica-plated)到微量滴定smmt板中，并基于od660监测生长。选择最终od660最高的7个分离物，并将其命名为ims0637-ims0643。对真贝酵母特异性sefsy1基因的pcr扩增和its区的测序证实了所有7个分离物都属于真贝酵母物种(数据未显示)。为了表征它们在麦芽三糖上的生长，野生型cbs12357、突变体ims0637-ims0643和消耗麦芽三糖的巴斯的酵母菌株cbs1483在20℃下在含有smmt的摇瓶中表征(图2a)。尽管cbs12357在187小时之后没有显示出任何麦芽三糖消耗，但对于ims0637-ims0643在91小时之后和对于cbs1483在43小时之后麦芽三糖的残留量下降到低于50％。尽管麦芽三糖利用较慢，但ims0637-ims0643突变体的最终麦芽三糖衰减达到92.7±1.6％，与通过消耗麦芽三糖的参考cbs1483达到的92.1％的最终衰减相当。

表3：本工作中使用的引物

虽然这些结果表明在合成培养基中利用了麦芽三糖，但麦芽三糖在啤酒用的麦芽汁中的利用是工业实用性所必需的。在含有三倍稀释的麦芽汁的摇瓶中表征菌株。虽然巴斯德酵母cbs1483在145小时之后消耗了50％的麦芽三糖，但突变体ims0637-ims0643在361小时之后没有消耗任何麦芽三糖，就像真贝酵母野生型cbs12357一样(图2b)。因此，为了提高在酿造条件下利用麦芽三糖的能力，使突变体ims0637-ims0643在富含麦芽三糖的酿造用的麦芽汁上在碳受限的恒化器中进行实验室进化。在这些条件下，对在麦芽三糖上生长具有提高的亲和力或更高的转运率的突变体将受到较少的营养限制，导致强的选择性优势。为此，细胞在补充了10gl^-1麦芽三糖的六倍稀释的麦芽汁中生长，导致2gl^-1葡萄糖、15gl^-1麦芽糖和15gl^-1麦芽三糖的最终浓度。为了防止氧和氮限制，补充了10mgl^-1麦角固醇、420mgl^-180和5gl^-1硫酸铵。将uv-突变体ims0637-ims0643汇集并用于接种反应器。在最初的批次中，所有的葡萄糖和麦芽糖被消耗，留下麦芽三糖作为唯一的碳源。连续培养以0.03h^-1的稀释速率操作，流出物最初含有13.2gl^-1的麦芽三糖。在121天内，麦芽三糖浓度逐渐降低至7.0gl^-1(图2c)。在那时，将来自培养物的10个单细胞在smmt琼脂板上进行facs分选，并在20℃孵育。对真贝酵母特异性sefsy1基因的pcr扩增和its区的测序证实了所有测试的分离物均属于真贝酵母物种(数据未显示)。分离了三个单细胞系，命名为ims0750、ims0751和ims0752，并且在12℃下在含有三倍稀释的麦芽汁的微需氧培养物中与野生型cbs12357和巴斯德酵母cbs1483一起表征(图2d)。尽管cbs12357和ims0751仅能够消耗葡萄糖和麦芽糖，但进化的分离物ims0750、ims0752和cbs1483消耗麦芽三糖。在263h之后，对于ims0750和ims0752，麦芽三糖浓度从20降低到4.3gl^-1麦芽三糖；对于cbs1483，降低到2.0gl^-1。由于ims0751不能在麦芽汁中利用麦芽三糖，因此没有进一步对其进行研究。这些结果证实了进化的菌株ims0750和ims0752几乎与巴斯的酵母参考cbs1483一样能在麦芽汁中消耗麦芽三糖，而诱变的菌株ims0637-ims0643仅在合成培养基(smmt)中作为唯一碳源提供时才能够利用麦芽三糖。

全基因组测序揭示了新的重组嵌合semalt基因

野生型cbs12357、uv-突变体ims0637-ims0643和进化菌株ims0750和ims0752的基因组使用150bp配对末端illumina读取进行测序。将测序数据映射到野生型cbs12357的基因组的染色体水平组装中(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)以鉴定相对于cbs12357的snp、indel和cnv突变。uv-突变体ims0637、ims0640、ims0641和ims0642的基因组共有116个snp、5个indel和1个拷贝数变异的集合(图3a)。除了这些突变之外，ims0638、ims0639和ims0643还具有三个另外的snp。ims0637-ims0643中的所有突变都是杂合的，仅有3个snp除外。杂合snp的普遍性可能是由cbs12357的诱变孢子的交配引起的，这在每个突变位置产生一个野生型和一个突变等位基因。在ims0637的突变中，34个snp和所有5个indel影响基因间区域，30个snp是同义的，48个snp导致氨基酸取代，4个snp导致过早终止密码子(数据未显示)。据我们所知，52个非同义snp中没有一个影响先前与麦芽三糖利用相关的基因。唯一的拷贝数变异涉及chrviii的右侧亚端粒区的重复。读取配对物配对(read-matepairing)表明重复区连接至chrii的左臂，导致chrii的左侧亚端粒区被非相互易位代替。尽管pilon认为不是显著的，但chrii的左侧亚端粒区确实显示出较低的测序覆盖率。有趣的是，chrii的受影响的区域含有非表达的semalt1基因(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)，尽管估计其损失不太可能改善麦芽三糖利用。

由于只有在实验室进化之后才能显现在麦芽汁中利用麦芽三糖的能力，因此更详细地研究了存在于ims0750和ims0752中的突变。ims0750和ims0752与uv-突变体ims0637-643共有95个snp，3个indel和1个拷贝数变异(图3a)。ims0750和ims0752几乎相同：ims0752具有一个在ims0750中不存在的沉默snp。相对于ims0637-ims0643，杂合的16个snp和1个indel变成纯合的，并且在ims0637中杂合的21个snp和2个indel在ims0750和752中不再突变。另外，出现5个snp和4个拷贝数变异，其在ims0637-643中不存在(图3a)。5个snp由两个杂合的基因间snp、功能未知基因sebsc1中的杂合非同义snp、tor调控途径的推定成分semds3中的纯合的非同义snp以及空泡靶向基因sepep1中的杂合非同义snp组成。拷贝数的变化影响含有semalt基因的几个区域：包括semalt1的chrii的550bp的重复(坐标8950-9500)、包括semalt3的chrxiii的左臂的重复(坐标1-10275)、chrxvi的左臂的丢失(坐标1-15350)、以及包括semalt4的chrxvi的5.5kb的丢失(坐标16850-22300)。读取配对物配对的分析表明拷贝数变异是由染色体ii、xiii和xvi之间复杂的重组集合引起的。受影响的mal基因座的高度相似性及其在亚端粒区的定位使得突变的精确重建变得困难。因此，在ont的minion平台上使用长读取测序对ims0637和ims0750进行测序，并对每个菌株进行从头基因组组装。所得装配体与cbs12357的染色体水平装配体的比较表明发生了两个重组。在ims0637和ims0750中，染色体viii的右臂的最后11500个核苷酸的另外拷贝代替了染色体ii的左臂的两个拷贝之一的前11400个核苷酸(图3b)。这种重组与ims0637-ims0643、ims0750和ims0752中受影响区域的拷贝数变化一致，并导致一个含有semalt1的mal基因座的拷贝的丢失。另外，ims0750的基因组组装表明chrxvi的前22.3kbp的两个拷贝被来自chrii、chrxviii和chrxvi的复杂重排序列代替。重组区精确地由chriii左臂的前10,273个核苷酸，随后是来自chrii的693个核苷酸，来自chrxvi的1,468个核苷酸和来自chrxiii的237个核苷酸组成(图3b)。重组是非相互的，因为重组染色体上存在的区域显示出增加的测序覆盖率，而周围区域未改变。这种重组导致染色体xvi上含有semalt4的典型mal基因座的丢失。然而，重组序列含有由来自chrxvi的semalt4的开始，来自chrii的semalt1的中间和来自chrxiii的semalt3的末端组成的嵌合开放阅读框(图3c)。为了验证这种重组，使用结合在semalt4的启动子和semalt3的终止子上的引物对orf进行pcr扩增。如所预期的，对于ims0750，获得了条带，而对于cbs12357，则未获得条带。扩增片段的sanger测序证实了新等位基因开放阅读框的嵌合组织，我们将其命名为semalt413。semalt413的序列编码与semalt4的核苷酸1-434和1113-1145具有100％同一性，与semalt1的核苷酸430-1122具有100％相似性，以及与semalt3的核苷酸1141-1842具有100％相似性的全长蛋白(图3c)。由于核苷酸1123-1140仅显示与semalt1的72％的相似性和与semalt3的61％的相似性，因此这些核苷酸代表来自chrxvi的另外的基因渗入，这是先前未检测到的(图3b)。尽管由于与semalt2的核苷酸差异，前434个核苷酸可清楚地归因于semalt4，但核苷酸1123-1140在semalt2和semalt4中是相同的，因此该序列也可以来自chrv上的semalt2。值得注意的是，semalt413与原始semalt基因仅具有85-87％的序列同一性，相应的蛋白质序列表现出52-88％的相似性。因此，我们假定重组的semalt413转运蛋白可能具有改变的底物特异性，并且可能负责观察到的麦芽三糖利用。

为了研究嵌合semalt413基因的三级结构，使用swiss-model，基于与来自大肠杆菌的细菌木糖质子同向转运体xyle的结构同源性进行预测(lam等人,1980.jbacteriol143:396-402)，一篇参考文献先前用于模拟scagt1的结构(henderson和poolman,2017.scirep7:14375)。作为酵母中的麦芽糖转运蛋白，xyle是具有由属于主要易化子超家族的12个α-螺旋组成的跨膜结构域的质子同向转运体，类似于semalt413(数据未显示)。semalt413的预测结构显示1个α-螺旋仅由来自semalt4的残基形成，4个α-螺旋仅由来自semalt1的残基形成，以及5个α-螺旋仅由来自semalt3的残基形成(图3d)。另外，2个α-螺旋由来自一个以上转运蛋白的残基组成。由于木糖同向转运体参考模型中不存在类似残基，因此从模型中排除了前100个氨基酸，semalt4序列的贡献被低估。semalt413的预测结构与semalt1、semalt3和semalt4的预测结构高度相似，表明其保留了功能性麦芽糖转运蛋白的一般结构(数据未显示)。尽管鉴定了边缘结构差异，但尚不清楚这些是否可以导致转运麦芽三糖的能力，因为哪些残基决定了此类转运蛋白的底物特异性是未知的(henderson和poolman,2017.scirep7:14375)。此外，利用麦芽三糖的能力可能取决于决定底物特异性的残基的化学特性。

在野生型cbs12357中引入semalt413基因使得能够利用麦芽三糖

为了测试semalt413的功能性和底物特异性，在野生型真贝酵母cbs12357中过表达semalt413。通过pcr从ims0750扩增推定的semalt413麦芽三糖转运蛋白(数据未显示)，并通过“gibson”组装(gibson等人,2009.natmethods6:343)将其整合到组成型表达的sctef1启动子和sccyc1终止子之间的p426-tef-amds的质粒骨架中。通过sanger测序验证了所得pud814质粒，这证实了其semalt413orf与在ims0750的纳米孔组装中发现的重组orf相同(图3c)。表达cas9和靶向sesga1的grna的质粒pudp052先前成功地用于在cbs12357中的sesga1基因座处的基因整合(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)。因此，从pud814扩增修复片段，所述pud814含有侧翼为40bp同源臂的sctef1pr-semalt413-sccyc1ter表达盒以在sesga1基因座处整合(图4)。用pudp052和修复片段转化野生型真贝酵母cbs12357，导致用sesga1基因座被semalt413基因代替(图4a)。作为对照，从pud480扩增含有sctef1启动子与sccyc1终止子之间的野生型semalt2orf的修复片段，并以类似的方式整合。表征所得菌株imx1941(sctef1pr-semalt2-sccyc1ter)和imx1942(sctef1pr-semalt413-sccyc1ter)，并将其与野生型cbs12357和进化的突变体ims0750在具有不同碳源的sm上进行比较。基于定期的od660测量来确定生长速率。在葡萄糖上，imx1941和imx1942以0.25±0.01h^-1的比生长速率生长，而ims0750以0.28±0.01h^-1的比生长速率更快地生长。在33小时之后葡萄糖被完全消耗(图4b)。在麦芽糖上，cbs12357和imx1941以0.19±0.01h^-1的比生长速率生长，imx1942以0.18±001h^-1的比生长速率生长，以及ims0750以0.17±0.01h^-1的比生长速率较慢地生长。在43小时之后麦芽糖被完全消耗(图4c)。在麦芽三糖上，只有进化的突变体ims0750和反向工程菌株imx1942(sctef1pr-semalt413-sccyc1ter)能够生长和消耗麦芽三糖。然而，ims0750以0.19±0.01h^-1的生长速率指数生长并且消耗±55％的麦芽三糖，imx1942仅以0.03±0.00h^-1的生长速率生长并且在172小时之后消耗45％的麦芽三糖，表明嵌合semalt413转运蛋白的功能性(图4d)。然而，在过表达semalt413之后在麦芽三糖上的生长与进化菌株ims0750的生长不匹配。另外，ims0750显示出增加的葡萄糖摄取但降低的麦芽糖摄取，表明可能存在以麦芽糖为代价的有利于葡萄糖和麦芽三糖的进化折衷。

消耗麦芽三糖的真贝酵母菌株用于拉格啤酒酿造的适用性

由于真贝酵母菌株目前用于工业拉格啤酒酿造(brickwedde等人,2018.frontmicrobiol9:1786)，因此在7-l发酵罐中在高浓度17°plato麦芽汁上一式两份地测试进化的菌株ims0750及其亲本菌株cbs12357(图5)。没有对反向工程菌株imx1942进行测试，因为其基因修饰的性质由于客户接受的问题而阻碍了工业应用(varzakas等人,2007.critrevfoodscinutr47:335-61)。在333h之后，ims0750完全消耗了所有葡萄糖和麦芽糖，并且麦芽三糖的浓度从1.93％(m/v)降至0.47％(m/v)(图5)。麦芽三糖的这种75％的减少超过了先前在瓶子中实现的60％的减少(从10.5gl^-1到4.3gl^-1，图2d)。相比之下，cbs12357不利用任何麦芽三糖。除了提高的麦芽三糖利用之外，ims0750表现出提高的麦芽糖消耗：所有麦芽糖在不到200小时内耗尽，而cbs12357仅在333小时之后才耗尽麦芽糖(图5)。根据改进的糖利用，ims0750的最终乙醇浓度比cbs12357的最终乙醇浓度高18.5％(图5)。为了进一步探索ims0750的酿造相关特性，监测了几种香气限定的酯、高级醇和邻位二酮的浓度。酯和高级醇的最终浓度在ims750培养物上清液中显著较高，尽管只有增加的乙酸异戊酯浓度是统计学显著的(数据未显示)。另外，在ims0750中酯和醇比在cbs12357中积累更快，这可能是由于更快的糖消耗。

总之，这些结果表明ims0750能够在工业条件下利用麦芽三糖，并且表明它可能表现出更广泛范围的用于酿造的改进特性。