GRAMC:顺式调节模块的基因组规模报道子测定方法

文档序号:25541952发布日期:2021-06-18 20:38阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种构建核酸分子报道子文库的方法,包括:

分离选定大小范围的多个核酸分子;

使用连接酶将选定大小范围的多个分离的核酸分子连接至至少一个线性衔接子序列,其中所述线性衔接子序列包含至少两个连续核糖核苷酸,两侧是在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸及在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸,从而产生多个包含插入物和衔接子的环状核酸分子;

在足以从所述多个环状核酸分子中去除线性核酸分子的条件下,使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核酸外切酶接触;

在足以产生多个线性核酸分子的条件下使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核糖核酸内切酶接触,所述线性核酸分子均在插入物两侧包含在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸以及在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸;及

将所述多个线性核酸分子的每一个与至少一个报道子核酸融合,以产生多个报道子构建体,从而产生核酸分子报道子文库。

2.权利要求1的方法,其中所述连接酶包括dna连接酶。

3.权利要求1或权利要求2的方法,其中所述连接酶包括t4dna连接酶。

4.权利要求1-3任一项的方法,其中选定大小范围的多个核酸分子的长度为约100-3000个碱基对。

5.权利要求4的方法,其中选定大小范围的多个核酸分子的长度为约750-850个碱基对。

6.权利要求1-5任一项的方法,其中选定大小范围的多个分离的核酸分子使用凝胶电泳或基于珠的大小选择来选择。

7.权利要求1-6任一项的方法,其中选定大小范围的多个核酸分子包括基因组dna或合成dna。

8.权利要求7的方法,其中基因组dna来自哺乳动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或古细菌细胞。

9.权利要求8的方法,其中基因组dna来自哺乳动物细胞。

10.权利要求8的方法,其中来自哺乳动物细胞的基因组dna来自心肌细胞、神经元、肝细胞、内皮细胞、胚胎干细胞、皮肤细胞、癌细胞、肾细胞、免疫细胞、骨细胞、类器官衍生的细胞或诱导的干细胞中的至少一种。

11.权利要求8的方法,其中基因组dna来自植物细胞。

12.权利要求8的方法,其中基因组dna来自细菌细胞。

13.权利要求8的方法,其中基因组dna来自真菌细胞。

14.权利要求8的方法,其中基因组dna来自古细菌细胞。

15.权利要求1-14任一项的方法,其中使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核糖核酸内切酶接触包括使所述包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与特异于dna双链体中的核糖核苷酸的核糖核酸内切酶接触。

16.权利要求15的方法,其中所述核糖核酸内切酶是rnasehii或尿嘧啶-dna糖基化酶。

17.权利要求1-16任一项的方法,其进一步包括确定多个线性核酸分子的基因组覆盖,所述线性核酸分子在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸以及所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸。

18.权利要求17的方法,其中确定基因组覆盖包括:

选择至少一个感兴趣的基因组区域;

扩增所述多个线性核酸分子,其在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸;及

确定在所述多个线性核酸分子中是否存在选择的基因组区域。

19.权利要求1-18任一项的方法,其中所述至少一个报道子核酸包含编码荧光蛋白的核酸和/或包含条形码核酸。

20.权利要求1-19任一项的方法,其进一步包括将所述多个线性核酸分子与线性载体核酸融合,从而产生多个线性载体,所述线性核酸分子在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸。

21.权利要求20的方法,其中所述线性载体核酸包含基础启动子。

22.权利要求20或权利要求21的方法,其中:

所述至少一个报道子核酸包含编码荧光蛋白的核酸,以及在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸的所述多个线性核酸分子与至少一个报道子核酸的融合包括将所述多个线性载体与荧光报道子核酸融合,从而产生多个荧光报道子构建体;或者

所述至少一个报道子核酸包括条形码核酸,以及在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸及所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸的所述多个线性核酸分子与至少一个报道子核酸的融合包括将所述多个报道子线性载体与条形码核酸融合,从而产生多个条形码报道子构建体;或者

所述至少一个报道子核酸包含条形码核酸和编码荧光蛋白的核酸,及所述多个线性载体与至少一个报道子核酸的融合包括将所述多个报道子构建体与条形码核酸和编码荧光蛋白的核酸融合,从而产生多个荧光和条形码报道子构建体。

23.权利要求20-22任一项的方法,进一步包括:

使所述多个线性载体的每一个与包含条形码报道子构建体的引物核酸接触;

进行聚合酶链反应(pcr),从而产生多个包含所述条形码报道子构建体的扩增的载体;

连接包含所述条形码报道子构建体的扩增的载体,从而产生多个包含所述条形码报道子构建体的环状载体;及

在足以从包含所述条形码报道子构建体的多个环状载体中去除线性核酸分子的条件下,使包含所述条形码报道子构建体的多个环状载体与核酸外切酶接触。

24.一种构建核酸分子报道子文库的方法,包括:

(i)分离选定大小范围的多个核酸分子;

使用连接酶将选定大小范围的多个分离的核酸分子与至少一个线性衔接子序列连接,其中所述线性衔接子序列包含至少两个连续核糖核苷酸,两侧是在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸,从而产生多个包含插入物和衔接子的环状核酸分子;

(ii)在足以从所述多个环状核酸分子中去除线性核酸分子的条件下,使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核酸外切酶接触;

(iii)在足以产生多个线性核酸分子的条件下,使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核糖核酸内切酶接触,所述线性核酸分子均在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸;

(iv)确定所述多个线性核酸分子的基因组覆盖,所述核酸分子在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸,所述确定包括:

(a)选择至少一个感兴趣的基因组区域,

(b)扩增在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸的多个线性核酸分子,及

(c)确定选择的基因组区域是否存在于多个线性核酸分子中;及

(v)将所述多个线性核酸分子与至少一个报道子核酸融合以产生多个报道子构建体,所述线性核酸分子在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸,所述融合包括:

(a)将所述多个线性核酸分子与线性载体核酸融合,从而产生多个线性载体,所述线性核酸分子在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5'末端的至少一个脱氧核糖核苷酸;

(b)使所述多个线性载体的每一个与包含条形码核酸的引物接触;和

(c)进行聚合酶链反应(pcr),产生包含条形码报道子构建体的多个环状载体,所述构建体包含在插入物两侧的所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和条形码;及

(d)在足以从包含条形码报道子构建体的多个环状载体中去除线性核酸分子的条件下,使包含条形码报道子构建体的多个环状载体与核酸外切酶接触。

25.权利要求1-24任一项的方法,其中所述核酸外切酶是核酸外切酶i、核酸外切酶iii和/或λ核酸外切酶。

26.权利要求1-25任一项的方法,其中所述至少一个线性衔接子序列包含seqidno:1和/或seqidno:2。

27.权利要求1-26任一项的方法,其中所述线性衔接子序列包含seqidno:1和seqidno:2的双链双链体。

28.使用权利要求1-27任一项的方法产生的核酸分子报道子文库。

29.一种检测功能性核酸调节元件的方法,包括:

用权利要求28的文库转染至少一种感兴趣的细胞;和

测量所述至少一种报道子。

30.权利要求29的方法,其进一步包括鉴别和/或定量所述至少一个报道子。

31.权利要求29-30任一项的方法,其进一步包括从感兴趣的细胞中分离rna,产生分离的rna。

32.权利要求29-31任一项的方法,其中测量所述报道子包括:

逆转录所述分离的rna,产生cdna;及

检测所述cdna。

33.权利要求32的方法,其中逆转录所述分离的rna包括使用重组莫洛尼鼠白血病病毒(rmomulv)逆转录酶或禽成髓细胞瘤病毒(amv)逆转录酶。

34.权利要求32或33的方法,进一步包括使用rna-和dna-依赖性dna聚合酶。

35.权利要求29-34任一项的方法,其中所述至少一种报道子是至少一种独特的条形码核酸。

36.权利要求35的方法,其中检测所述cdna包括:

扩增所述cdna;和

鉴别所述至少一种独特的核酸条形码。

37.权利要求36的方法,其中扩增所述cdna包括:

选择特异于包含至少一个独特核酸条形码的核苷酸的引物;

使所述引物与所述cdna接触;和

使用所述引物和cdna进行pcr,产生扩增的dna。

38.权利要求37的方法,其中鉴别所述至少一个独特的核酸条形码包括对扩增的dna进行测序。

39.权利要求35-38任一项的方法,其进一步包括对所述至少一个独特的核酸条形码进行定量。

40.权利要求29-39任一项的方法,其中所述至少一种细胞是哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞或古细菌细胞。

41.权利要求40的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。

42.权利要求41的方法,其中所述哺乳动物细胞是心肌细胞、神经元、肝细胞、内皮细胞、胚胎干细胞、皮肤细胞、癌细胞、肾细胞、免疫细胞、骨细胞、类器官衍生的细胞或诱导的干细胞中的至少一种。

43.权利要求40的方法,其中所述细胞是植物细胞。

44.权利要求40的方法,其中所述细胞是细菌细胞。

45.权利要求40的方法,其中所述细胞是真菌细胞。

46.权利要求40的方法,其中所述细胞是古细菌细胞。

47.权利要求29-46任一项的方法,进一步包括收集所述至少一种感兴趣的细胞,其中所述至少一种感兴趣的细胞收集自:

至少两个对象,其中所述至少两个对象包括至少一个患有疾病或状况的对象和至少一个没有疾病或状况的对象;或者

至少一个对象,其中在不同条件下从所述对象收集多个细胞。

48.权利要求29-47任一项的方法,其中所述方法是高通量的。

49.权利要求1-48任一项的方法,其中所述多个核酸分子包含选择的感兴趣的基因组的至少80%。

50.权利要求1-49任一项的方法,其中所述多个核酸分子包含选择的感兴趣的基因组中顺式调节元件的至少80%。

51.一种用于构建核酸分子报道子文库的试剂盒,其包含权利要求1-28任一项的至少一种报道子核酸。

52.权利要求51的试剂盒,其中所述报道子核酸的线性衔接子序列包括seqidno:1和/或seqidno:2。

53.权利要求51或52的试剂盒,其进一步包含至少一种连接酶、核酸外切酶、核糖核酸内切酶和/或聚合酶。

54.用于高通量鉴别和/或定量功能性核酸调节元件的试剂盒,其包含权利要求28的文库,其中所述文库覆盖感兴趣的基因组的至少80%。

55.权利要求54的试剂盒,其进一步包含至少一种逆转录酶。

56.权利要求54或55的试剂盒,其进一步包含pcr引物和高保真dna聚合酶。


技术总结
本文公开了用于功能性调节元件的报道子核酸的文库以及用于构建和使用这种文库的方法和试剂盒。示例的文库、方法和试剂盒可用于功能性调节元件的高通量检测、鉴别和/或定量。

技术研发人员:J·南
受保护的技术使用者:罗格斯新泽西州立大学
技术研发日:2019.10.30
技术公布日:2021.06.18
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