经由改造的ADAR募集的RNA和DNA碱基编辑的制作方法

文档序号:25541908发布日期:2021-06-18 20:38

技术特征:

1.一种载体,包括具有编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列的核酸,其中:

(a)所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列缺少含茎环的二级结构,或

(b)所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列包括与选自以下项中的至少一个序列的至少约80%的序列同一性:alu结构域编码序列,载脂蛋白bmrna编辑催化多肽样(apobec)募集结构域编码序列,及其组合。

2.根据权利要求1所述的载体,其中所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列包括与所述alu结构域序列的至少约80%的序列同一性。

3.根据权利要求1所述的载体,其中所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列包括与所述apobec募集结构域编码序列的至少约80%的序列同一性。

4.根据权利要求1所述的载体,其中所述载体是病毒载体。

5.根据权利要求1所述的载体,其中所述载体是脂质体。

6.根据权利要求1所述的载体,其中所述载体是纳米颗粒。

7.根据权利要求1所述的载体,其中所述至少一种rna编辑实体募集结构域被配置为募集adar蛋白。

8.根据权利要求7所述的载体,其中所述adar蛋白是adar1、adar2或adar3蛋白。

9.根据权利要求7或8所述的载体,其中所述adar蛋白是人adar蛋白。

10.根据权利要求7或8所述的载体,其中所述adar蛋白是重组的adar蛋白。

11.根据权利要求7或8所述的载体,其中所述adar蛋白是经修饰的adar蛋白。

12.根据权利要求1所述的载体,其中所述至少一种rna编辑实体募集结构域被配置为募集apobec蛋白。

13.根据权利要求12所述的载体,其中所述apobec蛋白是apobec1、apobec2、apobec3a、apobec3b、apobec3c、apobec3e、apobec3f、apobec3g、apobec3h或apobec4蛋白。

14.根据权利要求12或13所述的载体,其中所述adar蛋白是人adar蛋白。

15.根据权利要求12或13所述的载体,其中所述adar蛋白是重组的adar蛋白。

16.根据权利要求12或13所述的载体,其中所述adar蛋白是经修饰的adar蛋白。

17.根据权利要求1所述的载体,其中所述至少一种rna编辑实体募集结构域缺少含茎环的二级结构。

18.根据权利要求1所述的载体,其中所述多核苷酸序列编码至少两种rna编辑募集结构域。

19.根据权利要求18所述的载体,其中所述至少两种rna编辑募集结构域中的至少一种是alu结构域。

20.根据权利要求19所述的载体,其中所述alu结构域的序列形成含至少一个茎环的二级结构。

21.根据权利要求19所述的载体,其中所述alu结构域编码序列包括多个alu重复序列。

22.根据权利要求19所述的载体,其中所述alu结构域编码序列至少部分是单链的。

23.根据权利要求18所述的载体,其中所述至少两种rna编辑募集结构域中的至少一种是apobec募集结构域。

24.根据权利要求18所述的载体,其中所述至少两种rna编辑募集结构域编码序列中的至少一种包括与glur2结构域编码序列的至少约80%的序列同一性。

25.根据权利要求24所述的载体,其中所述至少两种rna编辑募集结构域中的至少一种是glur2结构域。

26.根据权利要求18所述的载体,其中所述至少两种rna编辑募集结构域中的至少一种是cas13结构域。

27.根据权利要求19或23所述的载体,其中所述至少两种rna编辑募集结构域是alu结构域和apobec募集结构域。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的载体,进一步包括,编码与靶标rna的至少一部分互补的rna的核酸。

29.根据权利要求28所述的载体,其中所述编码与靶标rna的至少一部分互补的rna的核酸的长度为约10个碱基对(bp)至约1000bp。

30.根据权利要求28所述的载体,其中所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的核酸,和所述编码与靶标rna的至少一部分互补的rna的核酸,包括长度至少约200bp的连续核酸。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的载体,其中所述核酸是化学合成的。

32.根据权利要求1至30中任一项所述的载体,其中所述核酸是基因编码的。

33.根据权利要求1至30中任一项所述的载体,其中所述载体包括dna。

34.根据权利要求33所述的载体,其中所述dna是双链的。

35.根据权利要求33所述的载体,其中所述dna是单链的。

36.根据权利要求1至30中任一项所述的载体,其中所述载体包括rna。

37.根据权利要求1至30中任一项所述的载体,其中所述rna包括碱基修饰。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的载体,其中所述载体是腺相关病毒(aav)载体。

39.根据权利要求38所述的载体,其中所述aav是重组的aav(raav)。

40.根据权利要求38所述的载体,其中所述aav选自由以下项组成的组:aav1血清型,aav2血清型,aav3血清型,aav4血清型,aav5血清型,aav6血清型,aav7血清型,aav8血清型,aav9血清型,任意这些的衍生物,和这些任一种的组合。

41.根据权利要求38所述的载体,其中所述aav是aav5血清型或其衍生物。

42.根据权利要求40所述的载体,包括所述aav的衍生物,其中所述aav的衍生物包括经修饰的vp1蛋白。

43.根据权利要求3所述的载体,其中所述apobec募集结构域选自由以下项组成的组:apobec1募集结构域、apobec2募集结构域、apobec3a募集结构域、apobec3b募集结构域、apobec3c募集结构域、apobec3e募集结构域、apobec3f募集结构域、apobec3g募集结构域、apobec3h募集结构域、apobec4募集结构域和其任意组合。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的载体,其中所述至少一种rna编辑实体募集结构域募集至少两种rna编辑实体,并且其中,编码所述rna编辑实体的至少两种多核苷酸序列中的至少一种包括与apobec蛋白编码序列的至少约80%的同一性。

45.根据权利要求1至43中任一项所述的载体,其中所述至少一种rna编辑实体募集结构域募集至少两种rna编辑实体,并且其中,编码所述rna编辑实体的至少两种多核苷酸序列中的至少一种包括与adar蛋白编码序列的至少约80%的同一性。

46.根据权利要求1至45中任一项所述的载体,其中由所述核酸编码的所述rna募集结构域包括至少一个茎环。

47.根据权利要求1至46中任一项所述的载体,其中所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列包括基本上是十字形的二级结构。

48.根据权利要求1至46中任一项所述的载体,其中所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列包括至少两个基本上是十字形的二级结构。

49.根据权利要求48所述的载体,其中所述编码至少一种rna编辑实体募集结构域的多核苷酸序列,位于形成所述至少两个基本上是十字形的二级结构的多核苷酸序列之间。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的载体,其中所述十字形的二级结构包括,与所述十字形的二级结构的至少一对至少部分互补的链邻接的茎环。

51.根据权利要求1至46中任一项所述的载体,其中所述编码至少一种rna编辑募集结构域的多核苷酸序列包括基本上是立足点形的二级结构。

52.一种载体,包括编码具有基本上是十字形的二维形状的rna的核酸,其中所述rna包括编码rna编辑实体募集结构域的至少一种序列。

53.根据权利要求52所述的载体,进一步包括编码具有至少一种靶向结构域编码序列的rna的核酸,该至少一种靶向结构域编码序列与靶标rna序列的至少一部分互补。

54.根据权利要求53所述的载体,其中所述编码具有至少一种靶向结构域的rna的核酸进一步包括基本上是线性的二维结构,该至少一种靶向结构域与所述靶标rna序列的至少一部分互补。

55.一种非天然存在的rna,其由权利要求1至54中任一项所述的载体编码。

56.一种非天然存在的rna,包括:第一结构域序列,包括基本上是十字形的二维形状;和,第二结构域序列,具有与所述第一结构域序列连接的基本上是线性的二维结构,

其中所述第一结构域序列编码rna编辑实体募集结构域,且所述第二结构域序列编码靶向结构域,其中所述第二结构域序列与靶标rna的至少一部分互补。

57.根据权利要求56所述的非天然存在的rna,进一步包括附接至所述第二结构域序列的第三结构域序列。

58.根据权利要求57所述的非天然存在的rna,其中所述第三结构域序列包括rna编辑实体募集结构域编码序列,所述rna编辑实体募集结构域编码序列形成具有二维形状基本上是十字形的二级结构。

59.根据权利要求56至59中任一项所述的非天然存在的rna,其中所述非天然存在的rna中的至少一个碱基包括化学修饰。

60.根据权利要求56至59中任一项所述的非天然存在的rna,其中所述非天然存在的rna中的至少一个糖包括化学修饰。

61.一种包括rna编辑实体募集结构域和反义结构域序列的核酸,其中,如通过对靶标核酸进行桑格法测序所确定的,当所述核酸与rna编辑实体和与所述反义结构域的至少一部分互补的靶标核酸接触时,以比与cas13b蛋白或其活性片段复合的可比较核酸高至少约4倍的效率,修饰所述靶标核酸的至少一个碱基对。

62.一种核酸,包括rna编辑实体募集结构域和反义结构域,其中,如通过对靶标核酸进行桑格法测序所确定的,所述核酸在与rna编辑实体和与所述反义结构域的至少一部分互补的靶标核酸接触时,以比与glur2结构域和所述反义结构域复合的可比较核酸高至少约4倍的效率,修饰所述靶标核酸的至少一个碱基对。

63.根据权利要求61或62所述的核酸,其中所述核酸包括rna。

64.根据权利要求51至63中任一项所述的核酸,其中所述靶标核酸包括rna。

65.根据权利要求64所述的核酸,其中所述rna是mrna。

66.根据权利要求65所述的核酸,其中所述mrna编码蛋白或其部分。

67.根据权利要求66所述的核酸,其中所述蛋白或其部分的功能失调与疾病或病症相关。

68.根据权利要求67所述的核酸,其中所述疾病或病症选自由神经退行性障碍、肌肉障碍、代谢障碍、眼部障碍、细胞增殖障碍及其任意组合所组成的组。

69.根据权利要求64所述的核酸,其中所述rna是小干扰rna(sirna)。

70.根据权利要求61至69中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体募集结构域包括与glur2结构域的至少约80%的同一性。

71.根据权利要求61至69中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体募集结构域包括与alu结构域的至少约80%的同一性。

72.根据权利要求61至69中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体募集结构域包括与apobec募集结构域的至少约80%的同一性。

73.根据权利要求61至72中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体募集结构域被配置为募集adar蛋白。

74.根据权利要求73所述的核酸,其中所述adar蛋白是adar1、adar2或adar3蛋白。

75.根据权利要求73或74所述的核酸,其中所述adar蛋白是人adar蛋白。

76.根据权利要求73或74所述的核酸,其中所述adar蛋白是重组的adar蛋白。

77.根据权利要求73或74所述的核酸,其中所述adar蛋白是经修饰的adar蛋白。

78.根据权利要求61至72中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体募集结构域被配置为募集apobec蛋白。

79.根据权利要求78所述的核酸,其中所述apobec蛋白是apobec1、apobec2、apobec3a、apobec3b、apobec3c、apobec3e、apobec3f、apobec3g、apobec3h或apobec4蛋白。

80.根据权利要求78或79所述的核酸,其中所述adar蛋白是人adar蛋白。

81.根据权利要求78或79所述的核酸,其中所述adar蛋白是重组的adar蛋白。

82.根据权利要求78或79所述的核酸,其中所述adar蛋白是经修饰的adar蛋白。

83.根据权利要求61至82中任一项所述的核酸,其中所述核酸是化学合成的。

84.根据权利要求61至82中任一项所述的核酸,其中所述核酸是基因编码的。

85.一种包括序列的核酸,所述序列包括反义结构域、第一茎环形成序列和第二茎环形成序列,其中所述核酸在与以下项接触时,修饰靶标核酸的至少一个碱基对:(a)第一多肽,包括rna编辑实体的第一部分,和被配置为与所述第一茎环形成序列结合的第一多核苷酸结合结构域;和,(b)第二多肽,包括rna编辑实体的第二部分,和被配置为与所述第二茎环形成序列结合的第二多核苷酸结合结构域;和,(c)与所述反义结构域的至少一部分互补的靶标核酸。

86.根据权利要求85所述的核酸,其中所述第一茎环或所述第二茎环是ms2茎环。

87.根据权利要求85所述的核酸,其中所述第一茎环或所述第二茎环是boxb茎环。

88.根据权利要求85所述的核酸,其中所述第一茎环或所述第二茎环是u1a茎环。

89.根据权利要求85至88中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体的第一部分或所述rna编辑实体的第二部分包括adar脱氨酶结构域编码序列的n-末端片段。

90.根据权利要求85至88中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体的第一部分或所述rna编辑实体的第二部分包括adar脱氨酶结构域编码序列的c-末端片段。

91.根据权利要求85至90中任一项所述的核酸,其中所述第一多核苷酸结合结构域或所述第二多核苷酸结合结构域包括ms2外壳蛋白。

92.根据权利要求85至90中任一项所述的核酸,其中所述第一多核苷酸结合结构域或所述第二多核苷酸结合结构域包括λn肽。

93.根据权利要求85至90中任一项所述的核酸,其中所述第一多核苷酸结合结构域或所述第二多核苷酸结合结构域包括人核酸结合蛋白。

94.根据权利要求93所述的核酸,其中所述人核酸结合蛋白是u1a蛋白、tbp6.7蛋白、人组蛋白茎环结合蛋白或糖皮质激素受体的dna结合结构域。

95.根据权利要求85至94中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体能够在所述靶标核酸上进行腺苷到肌苷的突变。

96.根据权利要求85至94中任一项所述的核酸,其中所述rna编辑实体能够在所述靶标核酸上进行胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。

97.一种试剂盒,包括在容器中的权利要求1至54中任一项所述的载体,在容器中的权利要求55至60中任一项所述的非天然存在的rna,或在容器中的权利要求61至96中任一项所述的核酸。

98.根据权利要求97所述的试剂盒,进一步包括注射器。

99.根据权利要求98所述的试剂盒,其中所述容器是所述注射器。

100.一种分离的细胞,包括权利要求1至54中任一项所述的载体,权利要求55至60中任一项所述的非天然存在的rna,或权利要求61至96中任一项所述的核酸。

101.一种药物组合物,包括单位剂型中的权利要求1至54中任一项所述的载体,单位剂型中的权利要求55至60中任一项所述的非天然存在的rna,或单位剂型中的权利要求61至96中任一项所述的核酸。

102.根据权利要求101所述的药物组合物,进一步包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。

103.根据权利要求101所述的药物组合物,其中所述药物组合物包括第二活性成分。

104.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法,包括向所述受试者施用权利要求1至54中任一项所述的载体,权利要求55至60中任一项所述的非天然存在的rna,或权利要求61至96中任一项所述的核酸。

105.根据权利要求104所述的方法,其中所述施用通过静脉注射、肌内注射、鞘内注射、眶内注射、皮下注射或其任意组合来进行。

106.根据权利要求104所述的方法,进一步包括向所述受试者施用第二疗法。

107.根据权利要求104所述的方法,其中所述疾病或病症选自由神经退行性障碍、肌肉障碍、代谢障碍、眼部障碍及其任意组合组成的组。

108.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是阿尔茨海默病。

109.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是肌肉萎缩症。

110.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是色素性视网膜炎。

111.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是帕金森病。

112.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是疼痛。

113.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是斯塔加特黄斑营养不良。

114.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是腓骨肌萎缩症。

115.根据权利要求107所述的方法,其中所述疾病或病症是瑞特综合征。

116.根据权利要求104至115中任一项所述的方法,其中,与所述施用之前相比,所述施用足以减少基因的表达。

117.根据权利要求104至115中任一项所述的方法,其中所述施用足以编辑所述受试者中的至少一个点突变。

118.根据权利要求104至115中任一项所述的方法,其中所述施用足以编辑所述受试者中的至少一个终止密码子,从而产生所述终止密码子的通读。

119.根据权利要求104至115中任一项所述的方法,其中所述施用足以在所述受试者中产生外显子跳跃。

120.一种治疗受试者中的肌肉萎缩症的方法,包括向所述受试者施用包括腺相关病毒(aav)载体的药物组合物,所述腺相关病毒(aav)载体包括编码第二核酸的第一核酸,其中所述第二核酸包括(a)与肌肉萎缩症有关的rna序列至少部分互补的反义区域,和(b)至少一种rna编辑实体募集结构域,其中所述至少一种rna编辑实体募集结构域不包括茎环,或其中所述至少一种rna编辑实体募集结构域包括与以下项中的至少一种的至少约80%的序列同一性:alu结构域、载脂蛋白bmrna编辑催化多肽样(apobec)募集结构域及其任意组合。

121.根据权利要求120所述的方法,其中所述药物组合物在单位剂型中。

122.根据权利要求120或121所述的方法,其中所述施用为一周至少一次。

123.根据权利要求120或121所述的方法,其中所述施用为一个月至少一次。

124.根据权利要求120至123中任一项所述的方法,其中所述施用是通过注射进行。

125.根据权利要求124所述的方法,其中所述注射为皮下、静脉内、输注、肌内、鞘内或腹腔注射。

126.根据权利要求120至123中任一项所述的方法,其中所述施用为经皮、经粘膜、经口或经肺部施用。

127.根据权利要求120至126中任一项所述的方法,进一步包括向所述受试者施用第二疗法。

128.一种制造载体的方法,包括:将至少一个拷贝的核酸克隆到所述载体中,其中所述核酸编码至少一种rna编辑实体募集结构域,且其中编码所述至少一种rna编辑实体募集结构域的序列不形成包括茎环的二级结构,或其中编码所述至少一种rna编辑实体募集结构域的核酸包括与选自以下项中的序列的至少约80%的序列同一性:alu结构域编码序列、载脂蛋白bmrna编辑催化多肽样(apobec)募集结构域编码序列及其任意组合。

129.根据权利要求128所述的方法,其中所述载体为病毒载体。

130.根据权利要求129所述的方法,其中所述病毒载体为aav载体。

131.根据权利要求129或130所述的方法,其中所述病毒载体包括经修饰的vp1蛋白。

132.根据权利要求128所述的方法,其中所述载体为脂质体。

133.根据权利要求128所述的方法,其中所述载体为纳米颗粒。

134.根据权利要求128至133中任一项所述的方法,进一步包括将所述载体转染或转导入分离的人细胞中。


技术总结
本文公开了经由使用经改造的RNA支架、经改造的DNA支架或DNA‑RNA杂交支架,来募集ADAR以催化点突变进行治疗性编辑的系统。该系统包括经改造的ADAR2向导RNA(adRNA),其携带与靶标RNA的20~100bp的互补性,和在5'端和3'端的任一端或两端的来自GluR2 mRNA的ADAR2募集结构域。

技术研发人员:普拉尚特·马利;德拉瓦·卡特埃卡;D·梅鲁兹;陈赓灏;K·M·福特
受保护的技术使用者:加利福尼亚大学董事会
技术研发日:2019.09.06
技术公布日:2021.06.18
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