核酸序列检测用装置的制作方法

本发明涉及一种利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测用装置。

背景技术：

作为利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测方法，报告了使用荧光探针和消光探针并简化了核酸检测步骤的核酸序列检测方法(专利文献1)。在专利文献1的方法中，当不存在靶标时，通过保持荧光探针与消光探针经由存在于荧光探针和消光探针中的结合部的结合，使得接近于荧光分子的消光分子的荧光被消光。另一者面，当存在靶标时，靶标与存在于荧光探针或消光探针中的检测部结合，经由所述结合部的结合被解除，消光分子远离荧光分子因而使荧光分子呈现荧光。通过测定该荧光，可以检测包含在样本中的靶标。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5928906号公报

技术实现要素：

本发明要解决的课题

然而，在专利文献1的方法中，通过存在于荧光探针和消光探针上的一部分的具有彼此互补的核酸序列的结合部，使得附加有荧光分子的荧光探针与附加有消光分子的消光探针结合。因此，荧光探针与消光探针的结合力较弱，消光分子对荧光的抑制不能说是充分的，因而不存在靶标时的荧光，即偏移光倾向于变高。当偏移光变高时，在靶标为低浓度的情况下，难以辨别荧光的变化，检测灵敏度降低。

另外，在专利文献1的方法中，需要适当地确定存在于荧光探针和消光探针上的一部分的具有彼此互补的核酸序列的所述结合部的核酸序列的长度。因此，当所述结合部的核酸序列过短时，荧光探针与消光探针无法经由所述结合部结合，从而荧光探针无法被消光探针消光。反之，当所述结合部的核酸序列过长时，荧光探针与消光探针经由所述结合部的结合过强，即使供给了靶标，荧光探针与消光探针也会保持结合而不会分离，从而无法检测样本中的靶标。

因此，本发明的目的在于提供一种通过降低不存在靶标时的偏移光来使检测灵敏度优异，并且可以在不依赖于荧光探针与消光探针之间的结合部的长度的情况下检测靶标的核酸序列检测用装置。

用于解决课题的手段

为了实现上述目的，本发明采用了以下构成。

[1]一种核酸序列检测用装置，其利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标核酸序列检测用装置，具备：

在预定位置处附带有荧光分子的荧光探针、

在预定位置处附带有消光分子的消光探针、以及

基板，其具有固定所述荧光探针和所述消光探针的各自基端的固相面，

特征在于：

所述荧光探针或所述消光探针中的一者具有包含与所述靶标的核酸序列互补的核酸序列的检测序列，

所述荧光探针或所述消光探针中的另一者具有与所述检测序列的一部分核酸序列互补的核酸序列(以下也称为互补序列)，从所述互补序列的固相面一侧的基端到另一基端的核酸序列与所述检测序列的一部分互补，

具有所述检测序列的所述荧光探针或消光探针比具有所述互补序列的荧光探针或消光探针的核酸序列长，

将所述荧光探针的基端和所述消光探针的基端固定在所述固相面上，使得位置关系成为通过接近于所述荧光分子的所述消光分子而使所述荧光分子呈现的荧光被消光。

[2]根据[1]所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：在所述靶标与所述检测序列没有发生杂交的情况下，通过保持所述荧光探针与消光探针的结合，使得通过接近于所述荧光分子的所述消光分子而使所述荧光分子呈现的荧光被消光；在所述靶标与所述检测序列发生杂交的情况下，通过解除所述荧光探针与消光探针的结合，使得远离所述消光分子的所述荧光分子呈现荧光。

[3]根据[1]或[2]所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：所述消光探针具有所述检测序列。

[4]根据[1]～[3]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：所述基板为平板，所述固相面为所述平板的一个平面。

[5]根据[1]～[3]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其中，所述基板为微珠，所述固相面为所述微珠的表面。

[6]根据[1]～[5]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：所述消光探针的数量多于所述荧光探针的数量。

[7]根据[1]～[5]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：所述荧光探针的数量多于所述消光探针的数量。

[8]根据[1]～[7]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：所述消光分子的数量多于所述荧光分子的数量。

[9]根据[8]所述的核酸序列检测用装置，其中，所述荧光分子的数量与所述消光分子的数量之比为2:3。

[10]根据[1]～[9]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：附带有所述荧光分子的所述预定位置为所述荧光探针的中间。

[11]根据[1]～[9]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：附带有所述消光分子的所述预定位置为所述消光探针的中间。

[12]根据[1]～[11]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：具有多个附带有所述荧光分子的所述预定位置。

[13]根据[1]～[11]中任意1项所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：具有多个附带有所述消光分子的所述预定位置。

[14]根据[12]所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：在多个所述预定位置处附带有种类不同的多个所述荧光分子。

[15]根据[13]所述的核酸序列检测用装置，其特征在于：在多个所述预定位置处附带有种类不同的多个所述消光分子。

本发明的其他特征和实施方式可以通过参照附图并从以下所述的实施方式的详细说明中清楚地得知。

本发明的效果

根据本发明的核酸序列检测用装置，与通过存在于荧光探针和消光探针上的一部分的、彼此互补的结合部，来使附带有荧光分子的探针与附带有消光分子的消光探针结合的现有核酸序列检测用装置相比，由于通过从所述互补序列的固相面一侧的基端到另一基端的核酸序列部分来使荧光探针与消光探针结合，因此消光效果优异，可以减少偏移光。由此，可以减小可检测的最小光量，并且能够提高检测灵敏度。

另外，由于具有所述检测序列的所述荧光探针或消光探针比具有所述互补序列的所述荧光探针或消光探针的核酸序列长，因此与通过所述互补序列结合的荧光探针与消光探针之间的结合力相比，具有所述检测序列的荧光探针或消光探针与靶标之间的结合力更强。由此，具有检测序列的荧光探针或消光探针可与具有所述互补序列的荧光探针或消光探针解离并与靶标结合。

另外，根据本发明的核酸序列检测用装置，与能否检测靶标是依赖于所述荧光探针与消光探针之间的结合部的核酸序列长度的现有核酸序列检测用装置相比，由于通过从所述互补序列的固相面一侧的基端到另一基端的核酸序列部分来使荧光探针与消光探针结合，因此可以容易地设计出能够检测靶标的荧光探针与消光探针。

另外，根据该核酸序列检测用装置，由于将作为相互独立的分子的荧光探针和消光探针的各自基端固定在基板上，因此可以适当地发挥消光效果，检测灵敏度变得良好，并且不需要标记步骤，也可以省略清洗步骤。由于不需要标记步骤、并且省略清洗步骤，可以进一步缩短杂交实验所需要的时间和精力，作业时间和成本都会降低。此外，可以避免因清洗步骤不完备而导致的性能劣化、光量降低、偏移光上升、或者发生偏差等。由此，可以在点阵面上得到更均匀的结果，提高检测的再现性。

此外，根据本发明的核酸序列检测用装置，可以实现杂交的实时观察。即，可以在dna阵列等核酸序列检测用装置中添加有包含检测对象分子(靶标)的溶液的状态(湿状态)下直接进行观察。因此，可以确认排除了清洗影响的状态下的光量和实现杂交的实时观察。由此，在样本浓度较高、杂交进行得较快的情况等状况下，能够在较短时间内结束杂交。

附图说明

[图1]是表示根据本发明的核酸序列检测用装置的构成的图。

[图2]是表示探针的构成例的图。

[图3]是示意性地表示检测靶标的原理的图。

[图4]是表示检测靶标的操作步骤的图。

[图5]是表示变形例的图，其是表示多个位置处附带有消光分子的例子的图。

[图6]是表示变形例的图，其是在荧光探针中赋予检测序列的例子的图。

[图7]是表示变形例的图，其是表示多个位置处附带有荧光分子和消光分子的例子的图。

[图8]是示意性地表示实施例1～3的核酸序列检测用装置和比较例1～3的核酸序列检测用装置的结构的图。

[图9]是对实施例1～3的核酸序列检测用装置的偏移光与比较例1～3的核酸序列检测用装置的偏移光进行比较的图。

具体实施方式

本发明的核酸序列检测用装置是一种利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测用装置，具备：

在预定位置处附带有荧光分子的荧光探针、

在预定位置处附带有消光分子的消光探针、以及

基板，其具有固定所述荧光探针和所述消光探针的各自基端的固相面，

特征在于：

所述荧光探针或所述消光探针中的一者具有包含与所述靶标的核酸序列互补的核酸序列的检测序列，

所述荧光探针或所述消光探针中的另一者具有与所述检测序列的一部分核酸序列互补的核酸序列(以下也称为互补序列)，从所述互补序列的固相面一侧的基端到另一基端的核酸序列与所述检测序列的一部分互补，

具有所述检测序列的所述荧光探针或消光探针比具有所述互补序列的荧光探针或消光探针的核酸序列长，

将所述荧光探针和所述消光探针的各自基端固定在固相面上，以使得位置关系成为通过接近于所述荧光分子的所述消光分子而使所述荧光分子呈现的荧光被消光。

以下，对本发明的核酸序列检测用装置的实施方式进行说明。

图1是表示本发明的核酸序列检测用装置的构成的图，图2是表示探针的构成例的图。

如图1和图2所示，在本实施方式的核酸序列检测用装置中，将消光探针20和荧光探针10分别固定在基板等的固相面100上，使得位置关系成为通过接近于所述荧光分子11的所述消光分子21而使所述荧光分子11呈现的荧光被消光，其中消光探针20是在作为检测对象的核酸即靶标30的互补序列即检测序列23上附带消光分子21而得的，荧光探针10是在作为与检测序列23的一部分互补的序列即互补序列12上附带荧光物质11而得的。检测序列23的核酸序列比互补序列12的核酸序列长。

在本发明中，利用由荧光共振能量转移而引起消光的原理。作为荧光分子11，没有特别地限定，例如可以为edans、coumarin、fam、fitc、cy2、tf2、tf3、hex、joe、tet、cy3、cy5、alexafluor(注册商标)532、alexafluor(注册商标)610、alexafluor(注册商标)647、atto532、atto633、qdot(注册商标)565、qdot(注册商标)585、qdot(注册商标)605、qdot(注册商标)705、ifluor^tm532、ifluor^tm647等公知的物质。作为消光分子21，没有特别地限定，例如可以为dabcyl、tq1、tq2、tq3、eclipse(注册商标)、bhq1、bhq2、bhq3、cy5q、cy7q、iowablack(注册商标)fq、iowablack(注册商标)rq、irdyeqc-1、qsy7、qsy21、qxl570、qxl570、qxl570等公知的物质。对荧光分子11与消光分子21的组合也没有特别地限定，例如可以为edans、coumarin或tf2与dabcyl或tq1的组合；fam、fitc、tet、alexafluor(注册商标)532、cy2、cy3、tf2或tf3与tq2的组合；alexafluor(注册商标)532、cy3、hex、joe、tf2、tf3、tf4或tet与tq3的组合；alexafluor(注册商标)532、tf2、cy3、fam或hex与eclipse(注册商标)的组合；alexafluor(注册商标)532、tf2、tf3、cy3、fam、hex、tet或cy3与bhq1的组合；tf3、tf4、cy3、cy5或hex与bhq2的组合；cy5、alexafluor(注册商标)647、tf5与iowablack(注册商标)rq、irdyeqc-1、qsy21、tq4、tq5、bhq2或bhq3的组合；cy3、tf3、tf4与cy5q、iowablack(注册商标)fq、iowablack(注册商标)rq、irdyeqc-1、qsy7或qxl570的组合；alexafluor(注册商标)532与cy5q、tq2、tq3、iowablack(注册商标)fq、iowablack(注册商标)rq、irdyeqc-1、qsy7或qxl570的组合；tf3与bhq1、bhq2或cy5q的组合等。

如图2所示，荧光探针10具备互补序列12和接头14。互补序列12从荧光探针10的3’末端开始设置。从荧光探针10的3’末端到5’末端的核酸序列是从消光探针20的检测序列23的固相面100一侧的3’末端到对应于荧光探针10的3’末端的部分的核酸序列的互补序列。接头14与互补序列12的5’末端连接，并延续到固相面100。将荧光分子11添加到荧光探针10的3’末端。

消光探针20具备检测序列23和接头24。检测序列23从消光探针20的5’末端开始设置。接头24与检测序列23的3’末端连接，并延续到固相面100。消光分子21被固定在与添加至荧光探针10的荧光分子11接近的位置处。消光探针20所具有的检测序列23的核酸序列的长度比互补序列12的核酸序列长。

荧光探针10和消光探针20分别经由接头14和接头24而固定在固相面100上。另外，使下述两段核酸序列彼此互补：连接于荧光探针10的接头14、并且从固相面100一侧的基端(5’末端)到另一基端(3’末端)的核酸序列；以及消光探针20所具有的检测序列23的、连接于接头24、并且从固相面100一侧的末端(3’末端)到对应于荧光探针10的3’末端的核酸序列。

需要说明的是，本发明中互补是指一个核酸序列具有可以与另一个核酸序列形成两条链状态的核酸序列，不一定需要完全地互补，也可以含有几个不匹配的碱基对。

另外，在荧光探针10与消光探针20可相互结合的位置处，将荧光探针10和消光探针20固定在固相面100上。另外，配置荧光探针10和消光探针20，使得当荧光探针10与消光探针20结合时，消光分子21接近荧光分子11，从而使荧光分子11呈现消光状态。

接着，对使用核酸序列检测用装置来检测靶标30的原理和操作步骤进行说明。图3是示意性地表示检测靶标的原理的图，图4是表示检测靶标的操作步骤的图。

如图3所示，当不存在靶标30时，附带有荧光分子11的荧光探针10与附带有消光分子21的消光探针20结合。由此，荧光分子11与消光分子21处于接近的状态。在这种状态下，即使照射了激发光，由于消光分子21的影响，荧光分子11也不会呈现荧光。

如图4所示，对样本50进行基因(靶标30)的扩增(步骤1)。接着，将含有扩增后的靶标30的溶液供给到dna芯片的固相面100上，以进行杂交(步骤2)。

如图3所示，消光探针20所具有的作为与靶标30的核酸序列互补的核酸序列的检测序列23的核酸序列比荧光探针10所具有的互补序列12长。因此，与通过该互补序列12的一部分而结合的荧光探针10与消光探针20之间的结合力相比，具有检测序列23的消光探针20与靶标30之间的结合力更强。由此，当存在靶标30时，具有检测序列23的消光探针20与荧光探针10解离并与靶标30结合。当靶标30与荧光探针10结合时，由于荧光探针10与消光探针20的结合脱离，消光分子21与荧光分子11之间的距离变远，从而消光状态被解除，通过照射激发光，使得荧光分子11呈现荧光。由此，如图4所示，通过在荧光读取装置60中的固相面100的观察，可以根据荧光探针10是否呈现荧光来确认样本中是否存在对象核酸(靶标30)(步骤3)。另外，此时包含在溶液中的未被捕获的靶标30不会呈现荧光，因此无需清洗。由此，在靶标溶液存在下，可以经由溶液而观察固相面100。因此，可以测定排除了清洗影响的状态下的光量，同时可以进行杂交中的实时测定。

在进行基因扩增的阶段(步骤1)中，也可以进行确认基因是否扩增的试验，从而只在基因扩增的情况下进行杂交(步骤2)。

需要说明的是，检查是否存在基因的时机不限于扩增结束后，也可以在扩增反应中。作为检查的方法，可以适当地利用电泳、抗原抗体反应、质量分析、或实时pcr法等。

另外，核酸(靶标30)也可以与蛋白质或糖链等结合。在这种情况下，可以确认蛋白质或糖链等对核酸(靶标30)的相互作用。

本发明的核酸序列检测用装置不限于上述实施方式，也可以进行以下各种变形。

通过改变修饰了荧光体后的荧光探针与修饰了消光分子后的消光探针的存在比并将它们分别固定，可以控制消光状态下的消光效率。例如，当消光探针多于荧光探针时，被偶联的荧光分子的概率提高，消光效率上升。因此，可以将偏移光抑制得较低。另外，当荧光探针多于消光探针时，受到消光作用的荧光探针的概率降低，对象物质检测后呈现的荧光(杂交光量)增强。

所述检测序列比所述互补序列的核酸序列长。所述检测序列的长度只要比所述互补序列的长度长即可，没有特别地限定，例如，可以比所述互补序列的长度长1个碱基以上、5个碱基以上、10个碱基以上。

荧光分子或消光分子也可以不位于探针的前端，如图5～图7所示，荧光分子或消光分子也可以附加在探针的中间的位置处。在图5的例子中，消光分子21附加在消光探针20a的中间。在图6的例子中，荧光分子11附加在荧光探针10b的中间。在图7的例子中，荧光分子11和消光分子21分别附加在荧光探针10c和消光探针20c的探针的中间。但是，为了产生消光作用，在荧光探针10a～10c与消光探针20a～20c分别结合的状态下，期望其位置被设计成消光分子21接近于荧光分子11且相互面对。在将荧光分子或消光分子附加到探针的前端以外的位置的情况下，具有可以在探针的前端进一步进行其他修饰的优点。

可以分别多种类、多位置地附加荧光分子和消光分子。图5和图6是表示在多个位置处附带有消光分子的例子的图。在图5的例子中，荧光探针10a附带有荧光分子11，消光探针20a附带有消光分子21、21。在图6的例子中，荧光探针10b附带有荧光分子11，消光探针20b附带有消光分子21、21。在将多个消光分子附加到1个探针的情况下，消光分子的种类也可以不同。在1个探针上附带有多个消光分子的情况下，可以提高消光分子对荧光分子的消光效果，因此可以进一步降低偏移光。因此，可以减小可检测的最小光量，从而能够提高检测灵敏度。

图7是表示在多个位置处附带有荧光分子和消光分子的例子的图。在图7的例子中，荧光探针10c附带有2个荧光分子11、11，消光探针20c附带有3个消光分子21、21、21。在将多个荧光分子和消光分子分别附加到1个探针的情况下，每个荧光分子或消光分子的种类也可以不同。在1个探针上分别附带有多个荧光分子和消光分子的情况下，靶标结合时的荧光量增加，可以进行更高灵敏度的检测。另外，通过使消光分子的数量多于荧光分子的数量，可以降低不存在靶标时的偏移光。

所述检测序列可以设置在消光探针中，也可以设置在荧光探针中。在消光探针具有检测序列的情况下，如上所述，靶标30与消光探针所具有的检测序列结合。另一方面，在荧光探针具有检测序列的情况下，靶标30与荧光探针所具有的检测序列结合。

图6是示意性地表示在荧光探针中赋予检测序列、并在消光探针中附带有多个消光分子21、21的情况的状态的图。如图6所示，通过在消光探针中附加多个消光分子，可以降低不存在靶标时的偏移光。另外，与荧光探针与消光探针之间的结合力相比，靶标与荧光探针之间的结合力更强，因此当存在靶标时，荧光探针可以与消光探针解离并与靶标结合，从而使得荧光分子呈现荧光。

另外，固定荧光探针和消光探针的基板可以为平板，也可以为微珠。在所述基板为平板的情况下，固定荧光探针和消光探针的固相面可以为所述平板的一个平面。在所述基板为微珠的情况下，荧光探针和消光探针的固相面可以为所述微珠的表面。通过将荧光探针和消光探针固定在微珠的表面，荧光探针和消光探针以微珠为中心成为放射状扩散的形状。在这种情况下，固定探针的固相面的表面积变大，可以增加每单位面积的探针量。另外，通过利用其大小或磁性等回收捕获了检测对象分子的微珠，可以实现检测对象分子的选择性回收。所回收的分子可以用于后续步骤中的其他试验等。

接下来，对本发明的核酸序列检测方法所涉及的核酸序列检测用装置的制造方法进行说明。

(1)溶液制备

首先，制备混合了荧光探针10和消光探针20而得的探针液，并调节探针浓度。

(2)偶联

接着，将探针液加热后急速冷却，使荧光探针10与消光探针20偶联。由此，通过荧光探针10或所述消光探针20的一者所具有的互补序列的一部分使荧光探针10与消光探针20结合。这里，例如，通过将探针液加热到95℃后，保持温度5分钟，然后急速冷却到25℃，从而使荧光探针10与消光探针20偶联。

(3)固定到固相面

接着，将荧光探针10和消光探针20处于偶联状态下的探针液滴加到固相面上，使荧光探针10和消光探针20固定在固相面100上。

(4)清洗

接着，清洗固相面100以除去未固定的剩余的探针。通过以上步骤，制造了核酸序列检测用装置。

这样，在通过荧光探针10或消光探针20中的一者所具有的互补序列的一部分来使它们彼此结合的状态下，使荧光探针10和消光探针20在固相面100上结合，因此可以适当地管理荧光探针10与消光探针20的位置关系，可以适当地发挥消光效果。由此，检测灵敏度也可以变得良好。

本发明的适用范围不限于上述实施方式。本发明可以广泛地应用于利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测用装置。

实施例

以下，基于实施例和比较例对本发明进行更详细的说明，但是本发明不限于这些示例。

(实施例1)

将具有接头序列、以及核酸序列长度为33的检测序列、并且结合有荧光分子的荧光探针1；以及具有接头序列、以及与从所述荧光探针1的检测序列的固相面一侧的基端起28个碱基的部分互补的核酸序列、并且结合有消光分子的消光探针1混合，从而制备了探针液。

接着，将探针液加热到95℃后，保持温度5分钟，然后急速冷却到25℃，从而使荧光探针1与消光探针1偶联。由此，通过消光探针1所具有的互补序列的一部分使荧光探针1与消光探针1结合。需要说明的是，在消光探针1中，消光分子与消光探针1的固相面一侧的基端相反侧的基端结合，荧光分子在与消光探针1中的消光分子距离固相面的高度相同高度的位置处与荧光探针1结合。

接着，将荧光探针1和消光探针1处于偶联状态的探针液滴加到固相面上，使荧光探针1和消光探针1固定在固相面上。

然后，通过清洗固相面以除去未固定的剩余的探针，从而制造了由荧光探针1和消光探针1构成的核酸序列检测用装置(图8)。

表1中示出了核酸序列检测用装置1的荧光探针和消光探针的长度、以及荧光探针与消光探针的哪个部分结合。

接着，检测了上述所制造的核酸序列检测用装置1的偏移光。结果如图9所示。

(实施例2)

除了使用将荧光分子的结合位置设为与荧光探针的固相面一侧的基端相反侧的基端的荧光探针2来代替荧光探针1以外，与实施例1同样地，制造了由荧光探针2和消光探针1构成的核酸序列检测用装置2(图8)。

表1中示出了核酸序列检测用装置2的荧光探针和消光探针的长度、以及荧光探针与消光探针的哪个部分结合。

接着，检测了上述所制造的核酸序列检测用装置2的偏移光。结果如图9所示。

(实施例3)

使用荧光探针1的检测序列长度为34的荧光探针3来代替荧光探针1；使用具有与从所述荧光探针3的检测序列的固相面一侧的基端起24个碱基的部分互补的核酸序列、且消光分子结合在与固相面一侧的基端相反侧的基端的消光探针3来代替消光探针1，除上述以外，与实施例1同样地，制造了由荧光探针3和消光探针3构成的核酸序列检测用装置3(图8)。需要说明的是，在荧光探针3中荧光分子在与消光探针3中的消光分子距离固相面的高度相同高度的位置处与荧光探针3结合。

表1中示出了核酸序列检测用装置3的荧光探针和消光探针的长度、以及荧光探针与消光探针的哪个部分结合。

接着，检测了上述所制造的核酸序列检测用装置3的偏移光。结果如图9所示。

(比较例1)

使用具有接头序列以及核酸序列长度为28的检测序列、并且荧光分子与固相面一侧的基端相反侧的基端结合的荧光探针1’来代替荧光探针1；使用具有接头序列以及与所述荧光探针1’的检测序列的固相面一侧的基端相反侧的基端侧的核酸序列(以下也称为前端序列)的一部分互补且核酸序列长度为28的核酸序列、并且消光分子与固相面一侧的基端相反侧的基端结合的消光探针1’来代替消光探针1，除上述以外，与实施例1同样地，制作了由荧光探针1’和消光探针1’构成的核酸序列检测用装置1’(图8)。

表1中示出了核酸序列检测用装置1’的荧光探针和消光探针的长度、以及荧光探针与消光探针的哪个部分结合。

接着，检测了上述所制造的核酸序列检测用装置1’的偏移光。结果如图9所示。

(比较例2)

使用具有接头序列以及核酸序列长度为33的检测序列、并且荧光分子与固相面一侧的基端相反侧的基端结合的荧光探针2’来代替荧光探针1；使用具有接头序列以及前端序列的一部分与荧光探针2’互补且核酸序列长度为28的核酸序列、并且消光分子与固相面一侧的基端相反侧的基端结合的消光探针2’来代替消光探针2，除上述以外，与实施例1同样地，制作了由荧光探针2’和消光探针2’构成的核酸序列检测用装置2’(图8)。

表1中示出了核酸序列检测用装置2’的荧光探针和消光探针的长度、以及荧光探针与消光探针的哪个部分结合。

接着，检测了上述所制造的核酸序列检测用装置2’的偏移光。结果如图9所示。

(比较例3)

使用具有接头序列以及核酸序列长度为24的检测序列、并且荧光分子与固相面一侧的基端相反侧的基端结合的荧光探针3’来代替荧光探针1；使用具有接头序列以及与荧光探针3’的前端序列的一部分互补且核酸序列长度为24的核酸序列、并且消光分子与固相面一侧的基端相反侧的基端结合的消光探针3’来代替消光探针1，除上述以外，与实施例1同样地，制作了由荧光探针3’和消光探针3’构成的核酸序列检测用装置3’(图8)。

表1中示出了核酸序列检测用装置3’的荧光探针和消光探针的长度、以及荧光探针与消光探针的哪个部分结合。

接着，检测了上述所制造的核酸序列检测用装置3’的偏移光。结果如图9所示。

[表1]

如图9所示，与通过消光探针的前端序列的一部分使荧光探针与消光探针结合的比较例1～3的核酸序列检测用装置相比，通过除了接头序列的消光探针的整个核酸序列部分来使荧光探针与消光探针结合的实施例1～3的核酸序列检测用装置的偏移光较低。结果，可以确认实施例1～3的核酸序列检测用装置可以减小可检测的最小光量，从而能够提高检测灵敏度。

另外，在实施例1～3和比较例1～3中的任意一者中，与荧光分子和消光分子的位置远离的情况相比，荧光分子和消光分子的位置相互靠近的情况下的偏移光较低，但是荧光分子和消光分子的位置远离的实施例2的核酸序列检测用装置与荧光分子和消光分子的位置同样远离的比较例2的核酸序列检测用装置相比，可以降低偏移光。

以上，说明了本发明的优选实施例，但是本发明不限于这些实施例。在不脱离本发明主旨的范围内，可以进行构成的添加、省略、置换以及其他变化。本发明不限于上述说明，而是仅限于随附的权利要求书的范围。

符号的说明

10荧光探针

11荧光分子

12互补序列

13检测序列

14接头

20消光探针

21消光分子

22互补序列

23检测序列

24接头

60荧光读取装置

100固相面