脑类器官的制造方法与流程

本发明涉及一种脑类器官(brainorganoids)的制造方法。更详细而言，本发明涉及一种脑类器官的制造方法、脑类器官、被验物质的药效评价用试剂盒、被验物质的药效评价方法、由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗药及由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗用医药组合物。本申请基于2018年11月15日在日本提出申请的日本专利特愿2018-214930号而主张优先权，将其内容引用至本申请中。

背景技术：

哺乳类的大脑皮质具有多层结构(i-vi层)，其是从胎儿的大脑皮质形成期起慢慢形成。大脑皮质由背侧端脑(大脑皮层)的神经上皮生出，在慢慢外展的同时在两侧形成半球状的脑胞。大脑皮质的背尾侧与皮质缘邻接，另一方面，腹吻侧介隔原皮质而与外侧神经节隆起(lge(lateralganglioniceminence)、纹状体原基)或隔膜邻接。在成体的大脑皮质的多层结构中存在最表层的i层(胎生时期的原基被称为边缘区)，所述最表层的i层的大部分来源于皮质缘或隔膜等相邻接的组织且主要由颤蛋白(reelin)阳性的卡扎尔-雷丘斯(cajal-retzius)细胞形成(在人的大脑皮质的情况下，颤蛋白阳性细胞的一部分也可直接由大脑皮质神经上皮生出)。其余的皮质板的层具有时间及空间上有规律地生出神经细胞并加以配置的特征性模式。其被称为由内向外(inside-out)模式，更深的层的神经细胞更早地由神经前体细胞生出。

与可获得大量信息的小鼠的大脑皮质的产生不同，由于人胎儿的脑组织的利用有限，因此无法详细理解人的大脑皮质的产生。迄今为止，建立使用小鼠及人的胚胎干细胞(es细胞：embryonicstemcell)的三维培养法(无血清悬浮培养快速再聚集拟胚体样细胞聚集体(serum-freefloatingcultureofembryoidbody-likeaggregateswithquickreaggregation，sfebq)法)，示出所述聚集体再现大脑皮质的产生的初始过程。报告有所述方法也可适应人诱导多能干细胞(ips细胞：inducedpluripotentstemcell)(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/076388号

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供一种端脑标记阳性的脑类器官的制造方法。

解决问题的技术手段

本发明包含以下的实施方式。

[1]一种脑类器官的制造方法，包括：将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在包含浓度超过10体积％的细胞外基质的培养基中培养的工序。

[2]根据[1]所述的脑类器官的制造方法，其中，所述培养基中的所述细胞外基质的浓度为20体积％～50体积％。

[3]根据[1]或[2]所述的脑类器官的制造方法，其中，所述培养基还包含wnt信号增强物质。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，所述培养基还包含转化生长因子β家族信号转导途径抑制物质。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，所述工序是将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体以不插入至细胞外基质中而分散于包含浓度超过10体积％的细胞外基质的培养基中的状态培养的工序。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，在所述工序之后还包括在实质上不含细胞外基质的培养基中培养的工序。

[7]根据[6]所述的脑类器官的制造方法，其中，通过悬浮培养来进行在实质上不含细胞外基质的培养基中培养的所述工序。

[8]根据[6]或[7]所述的脑类器官的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行在实质上不含细胞外基质的培养基中培养的所述工序。

[9]根据[6]至[8]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，一边搅拌一边进行在实质上不含细胞外基质的培养基中培养的所述工序。

[10]根据[1]至[9]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，所述神经外胚层标记阳性的细胞聚集体来源于人。

[11]一种脑类器官，其是通过根据[1]至[10]中任一项所述的制造方法而制造。

[12]根据[11]所述的脑类器官，其中，所述脑类器官至少包含端脑标记阳性的细胞。

[13]根据[12]所述的脑类器官，其中，所述脑类器官还包含端脑部分样组织标记阳性的细胞。

[14]根据[13]所述的脑类器官，其中，所述端脑部分样组织标记阳性的细胞为选自由大脑皮质、基底神经节、海马及脉络丛所组成的群组中的至少一种。

[15]一种被验物质的药效评价用试剂盒，包含根据[11]至[14]中任一项所述的脑类器官。

[16]一种被验物质的药效评价方法，包括：使被验物质与根据[11]至[14]中任一项所述的脑类器官接触的工序；以及检测所述被验物质给所述脑类器官造成的影响的工序。

[17]一种由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗药，包含根据[11]至[14]中任一项所述的脑类器官。

[18]一种由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗用医药组合物，含有根据[11]至[14]中任一项所述的脑类器官作为有效成分。

本发明也可包含以下的实施方式。

[p1]一种脑类器官的制造方法，包括将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在包含超过10体积％的细胞外基质成分的第一培养基中培养，其结果，可形成脑类器官。

[p2]根据[p1]所述的脑类器官的制造方法，其中，所述第一培养基中的所述细胞外基质成分的浓度为30体积％～50体积％。

[p3]根据[p1]或[p2]所述的脑类器官的制造方法，其中，所述第一培养基还包含wnt信号增强物质。

[p4]根据[p1]至[p3]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，所述第一培养基还包含转化生长因子(transforminggrowthfactor，tgf)-β家族信号转导途径抑制物质。

[p5]根据[p1]至[p4]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其还包括将所述脑类器官在第二培养基中悬浮培养。

[p6]根据[p5]所述的脑类器官的制造方法，其中，所述第二培养基实质上不含细胞外基质成分。

[p7]根据[p5]或[p6]所述的脑类器官的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行所述悬浮培养。

[p8]根据[p5]至[p7]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，通过搅拌培养来进行所述悬浮培养。

[p9]根据[p1]至[p8]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，所述神经外胚层标记阳性的细胞聚集体来源于人。

[p10]根据[p1]至[p9]中任一项所述的脑类器官的制造方法，其中，所述脑类器官包含前脑、端脑或端脑部分样组织。

[p11]根据[p10]所述的脑类器官的制造方法，其中，所述端脑部分样组织为大脑皮质、基底神经节、海马或脉络丛。

[p12]一种脑类器官，其是通过根据[p1]至[p11]中任一项所述的制造方法而制造。

[p13]一种被验物质的毒性-药效评价用试剂盒，包含根据[p12]所述的脑类器官。

[p14]一种被验物质的毒性-药效评价方法，包括：使被验物质与根据[p12]所述的脑类器官接触；以及检验所述被验物质给所述脑类器官造成的影响。

[p15]一种由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗药，包含根据[p12]所述的脑类器官。

[p16]一种由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗用医药组合物，含有根据[p12]所述的脑类器官作为有效成分。

发明的效果

根据本发明，可提供一种端脑标记阳性的脑类器官的制造方法。

附图说明

图1是表示实验例1的结果的显微镜照片。

图2是表示实验例1的结果的显微镜照片。

图3是表示在实验例3中对培养第14天的细胞聚集体进行明视场观察的结果的显微镜照片。

图4是表示实验例3中的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。

图5是表示实验例3中的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。

图6是表示在实验例3及实验例4中对基础培养基不同的细胞聚集体进行明视场观察的结果的代表性显微镜照片。

图7是将图6的结果数值化后的图表。

图8是表示在实验例5中对培养第40天的细胞聚集体进行明视场观察的结果的显微镜照片。

图9是表示在实验例5中培养第40天的脑类器官的免疫染色的结果的荧光显微镜照片(基质胶(matrigel)浓度50体积％)。

图10是表示在实验例5中培养第40天的脑类器官的免疫染色的结果的荧光显微镜照片(基质胶浓度30体积％)。

图11是表示在实验例5中培养第40天的脑类器官的免疫染色的结果的荧光显微镜照片(基质胶浓度10体积％)。

图12是表示在实验例5中培养第40天的脑类器官的免疫染色的结果的荧光显微镜照片(基质胶浓度2体积％)。

图13是表示在实验例5中培养第70天的脑类器官的免疫染色的结果的荧光显微镜照片(基质胶浓度50体积％)。

图14是表示在实验例5中培养第70天的脑类器官的免疫染色的结果的荧光显微镜照片(基质胶浓度30体积％)。

图15是表示在实验例5中培养第70天的脑类器官的免疫染色的结果的荧光显微镜照片(基质胶浓度10体积％)。

具体实施方式

以下，示出实施方式对本发明进行更详细说明，但本发明并不受以下的实施方式任何限定。

[基因名及蛋白质名的表述]

在本说明书中，人基因及人蛋白质设为由大写字母表示。另外，小鼠基因设为由大写字母表示开头字符并由小写字母表示开头字符以后的字符。另外，小鼠蛋白质设为由大写字母表示。然而，视情况而有时不严格区分地表述人基因、小鼠基因、其他种类的基因、人蛋白质、小鼠蛋白质、其他种类的蛋白质。

在本说明书中，表示“a～b”等数值范围的表述与“a以上、b以下”为相同含义，设为将a及b包含于所述数值范围内。

只要无特别说明，则本说明书中所例示的各物质、例如培养基中所含的物质或各工序中所使用的物质可分别使用一种，或者可并用两种以上来使用。

在本说明书中，所谓“包含物质x的培养基”、“在物质x的存在下”，是指添加有外源性(exogenous)的物质x的培养基、包含外源性的物质x的培养基或在外源性的物质x的存在下。即，在所述培养基中所存在的细胞或组织内源性(endogenous)地表达、分泌或产生所述物质x的情况下，内源性的物质x与外源性的物质x有所区别，不含外源性的物质x的培养基即使包含内源性的物质x，也不符合“包含物质x的培养基”的范畴。

在本说明书中，所谓“细胞聚集体”，是指细胞彼此粘附的团块。细胞团块、胚样体(embryoidbody)、球体(sphere)及球状体(spheroid)以及脑类器官也包含于细胞聚集体中。细胞聚集体的细胞彼此进行面粘附。所谓面粘附，是指某一细胞的表面积中与另一细胞的表面粘附的比例例如为1％以上、优选为3％以上、更优选为5％以上。细胞的表面可通过由对膜染色的试剂(例如dii)所致的染色或细胞粘附因子(例如，e-钙粘蛋白(cadherin)或n-钙粘蛋白(cadherin))的免疫染色来观察。另外，也可对在膜中所占的粘附区域进行定量。细胞聚集体存在如下情况：在细胞聚集体的一部分或全部中，细胞彼此形成细胞-细胞间接合(cell-celljunction)或粘附接合(adherencejunction)等细胞粘附(celladhesion)。

[脑类器官的制造方法]

关于脑类器官的制造，广为人知的是将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体插入至凝胶状的基质胶粒子中进行悬浮培养的方法。但是，凝胶状的基质胶粒子在插入时容易破碎，因此为了不破碎，而需要熟练的技术，有不适合利用自动化装置进行大量生产的问题。此外，在无法插入至凝胶状的基质胶粒子的中心部的情况下，在悬浮培养中，所述细胞聚集体从凝胶状的基质胶粒子脱离，无法形成脑类器官。另外，由于固体状的基质胶粒子的形成或所述细胞聚集体的插入花费时间，因此谋求一种可更简便地制造脑类器官的方法。因此，本实施方式提供一种脑类器官的制造方法，其包括将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在包含浓度超过10体积％的细胞外基质的培养基(也称为“第一培养基”)中培养的工序，优选为包括将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体以不插入至细胞外基质中而分散于包含浓度超过10体积％的细胞外基质的第一培养基中的状态培养的工序，其结果，可形成脑类器官。如之后在实施例中叙述那样，根据本实施方式的制造方法，可简便地制造脑类器官。

在本实施方式中，脑类器官是指至少含有端脑标记阳性的细胞的细胞聚集体。作为端脑标记，可列举foxg1(也称为bf1)、six3等，但并不限定于这些。再者，foxg1及six3也是前脑标记。本实施方式的脑类器官含有表达至少一种端脑标记的细胞。在优选形态中，脑类器官为含有foxg1阳性的细胞的细胞聚集体。也可制作脑类器官的切片，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)与抗foxg1抗体进行免疫染色，来算出foxg1阳性的细胞在脑类器官中所占的比例。脑类器官优选为以脑类器官中所含的细胞的个数计为50％以上、优选为70％以上、更优选为90％以上是端脑标记阳性。

通过本实施方式的制造方法而制造的脑类器官优选为除端脑标记阳性的细胞以外，还包含选自前脑标记阳性的细胞及端脑部分样组织标记阳性的细胞中的至少一种。作为端脑部分样组织标记阳性的细胞，可列举大脑皮质、基底神经节、海马及脉络丛等端脑部分样组织标记阳性的细胞。脑类器官除端脑标记阳性的细胞以外，还可形态性判断是否包含前脑标记阳性的细胞及端脑部分样组织标记阳性的细胞。或者，也可对各细胞测定特征性标记基因或标记蛋白质的表达来判断。

作为前脑标记，例如可列举foxg1、six3等。另外，作为大脑皮质标记，例如可列举：神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6、大脑皮质的第v层标记即ctip2、大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2等。另外，作为基底神经节标记，例如可列举nkx2.1、gsh2等。另外，作为海马标记，例如可列举ka1、zbtb2等。另外，作为脉络丛标记，例如可列举ttr、lmx1a等。

神经外胚层标记阳性的细胞聚集体优选为由干细胞诱导，作为干细胞，优选为多能干细胞或由多能干细胞诱导的干细胞。

《多能干细胞》

多能干细胞是指可在体外培养，且具有可分化为属于三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)和/或胚体外组织的细胞谱系全部的能力(分化多能性(pluripotency))的干细胞。

多能干细胞可为未经基因改变的多能干细胞，也可为经基因改变的多能干细胞。由经基因改变的多能干细胞获得的脑类器官可作为具有神经变性症等脑疾病的脑的模型来使用，因此可优选地用作例如本实施方式的被验物质的毒性或药效评价方法中所使用的脑类器官。

多能干细胞可由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织内干细胞及体细胞等诱导。作为多能干细胞，可列举：胚胎干细胞(es细胞：embryonicstemcell)、胚胎生殖干细胞(eg细胞：embryonicgermcell)、人工多能干细胞(ips细胞：inducedpluripotentstemcell)等。

再者，在多能干细胞中也包含由间充质干细胞(mesenchymalstemcell；msc)获得的muse细胞(多系分化持续应激细胞(multi-lineagedifferentiatingstressenduringcell))、或由原始生殖细胞建立的胚胎生殖干细胞(eg细胞：embryonicgermcell)。

es细胞最先在1981年建立，并且从1989年起也已应用于基因敲除小鼠制作。在1998年建立人es细胞，也正用于再生医疗。es细胞可通过将内细胞团在饲养细胞上或在包含白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，lif)的培养基中培养来制造。es细胞的制造方法记载于例如wo96/22362、wo02/101057、us5,843,780、us6,200,806、us6,280,718等中。es细胞可从规定的机构获取，另外，也可购买市售品。例如，作为人es细胞的khes-1、khes-2及khes-3可从京都大学再生医科学研究所获取。作为人es细胞rx：：gfp株(来源于khes-1)可从国立研究开发法人理化学研究所获取。另外，作为小鼠es细胞的eb5细胞可从国立研究开发法人理化学研究所获取。另外，作为小鼠es细胞的d3株可从美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)获取。

作为es细胞之一的核移植es细胞(ntes细胞)可从将体细胞的细胞核移植到去除了细胞核的卵细胞中而制作的克隆胚胎建立。

eg细胞可通过将原始生殖细胞在包含m干细胞因子(mstemcellfactor，mscf)、lif及b成纤维细胞生长因子(bfibroblastgrowthfactor，bfgf)的培养基中培养来制造(例如，参照y.松井等人(matsuiy.,etal.),从培养小鼠原始生殖细胞中分离多能胚胎干细胞(derivationofpluripotentialembryonicstemcellsfrommurineprimordialgermcellsinculture),细胞(cell),70(5),841-847,1992)。

在本实施方式中，所谓“ips细胞”，是指通过利用现有的方法等对体细胞进行初始化(reprogramming)而诱导了多能性的细胞。具体而言，可列举通过选自包含oct3/4、sox2、klf4、myc(c-myc、n-myc、l-myc)、glis1、nanog、sall4、lin28、esrrb等的初始化基因群组中的多个基因的组合的任一者的表达而将成纤维细胞或外周血单核细胞或者淋巴细胞等分化所得的体细胞初始化，从而诱导了多分化能的细胞。

作为优选的初始化基因群组的组合，例如可列举：(1)oct3/4、sox2、klf4及myc(c-myc或l-myc)的组合、或(2)oct3/4、sox2、klf4、lin28及l-myc(参照k.冲田等人(okitak.,etal.),一种从脐带血与外周血细胞产生无整合人诱导多能干细胞的高效非病毒方法(anefficientnonviralmethodtogenerateintegration-freehuman-inducedpluripotentstemcellsfromcordbloodandperipheralbloodcells),干细胞(stemcells),31(3),458-466,2013)的组合。

ips细胞是由山中等人在2006年利用小鼠细胞而建立(k.高桥及s.山中(takahashik.andyamanakas.),通过限定因子从小鼠胚胎与成人成纤维细胞培养物诱导多能干细胞(inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors),细胞(cell),126(4),663-676,2006)。在2007年还利用人成纤维细胞建立了ips细胞，与es细胞同样地具有多能性与自我复制能力(例如，参照k.高桥等人(takahashik.,etal.),通过限定因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞(inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors),细胞(cell),131(5),861-872,2007；j.余等人(yuj.,etal.),从人体细胞分离的诱导多能干细胞系(inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells),科学(science),318(5858),1917-1920,2007；m.中川等人(nakagawam.,etal.),从小鼠与人成纤维细胞产生无myc的诱导多能干细胞(generationofinducedpluripotentstemcellswithoutmycfrommouseandhumanfibroblasts),自然生物技术(naturebiotechnology，natbiotechnol),26(1),101-106,2008等)。

除通过利用基因表达进行的初始化而由体细胞制造ips细胞的方法以外，还可通过化合物的添加等而由体细胞诱导ips细胞(p.候等人(houp.,etal.),通过小分子化合物从小鼠体细胞诱导多能干细胞(pluripotentstemcellsinducedfrommousesomaticcellsbysmall-moleculecompounds),科学(science),341(6146),651-654,2013)。

在本实施方式中，也可使用经株化的ips细胞。例如，由京都大学建立的201b7细胞、201b7-ff细胞、253g1细胞、253g4细胞、1201c1细胞、1205d1细胞、1210b2细胞、1231a3细胞等人ips细胞株可从京都大学及日本ips学院(ipsacademiajapan)股份有限公司获取。进而，作为经株化的ips细胞，例如可列举由利普劳塞鲁(reprocell)股份有限公司销售的pcphips771。此外，作为经株化的ips细胞，可列举由卡洛斯三世健康研究所(instituteofhealthcarlosiii)建立的xfips-f44-3f-2。

作为制造ips细胞时所使用的体细胞，可列举来源于组织的成纤维细胞、血细胞系细胞(例如，外周血单核细胞或t细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞及平滑肌细胞等。

在制造ips细胞时通过几种基因的表达来进行初始化的情况下，用以表达基因的方式并无特别限定。作为所述方式，可列举：使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒(sendaivirus)载体、腺病毒载体及腺伴随病毒载体)的感染法、使用质粒载体(例如，质粒载体及附加型载体)的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、重组人纤维蛋白片段(retronectin)法及电穿孔法)、使用核糖核酸(ribonucleicacid，rna)载体的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法及电穿孔法)、以及蛋白质或mrna的直接注入法等。

本实施方式的制造方法中所使用的多能干细胞优选为es细胞或ips细胞，更优选为ips细胞。

经基因改变的多能干细胞可通过将锌指核酸酶(zincfingernucleases，zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，talen)及规律成簇的间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，crispr)等人工核酸酶转染到多能干细胞中来简单地制作。人工核酸酶向靶基因导入双链脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)断裂(dsb：doublestrandbreak)，通过作为双链断裂(doublestrandbreak，dsb)修复机制之一的非同源末端接合(nhej：non-homologousendjoining)而导入插入缺失变异，由此可制作靶基因被破坏且经基因改变的细胞株，即基因敲除细胞株。与先前的基因改变技术相比，可短时间、低费用且有效率地制作基因敲除细胞株，因此作为基因改变细胞的制作技术而广泛利用(例如，参照hsupd等人(hsupdetal.),crispr-cas9在基因组工程中的开发与应用(developmentandapplicationsofcrispr-cas9forgenomeengineering),细胞(cell),157(6),1262-1278,2014等)。

也进行了利用人工核酸酶将绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)等基因导入至目标基因组区域(或基因)中的基因敲入的尝试。利用在gfp等的基因敲入序列的两端具有目标基因组区域的相同序列约500bp-1kbp的供体质粒。通过将供体质粒与人工核酸酶一起导入至多能干细胞中，人工核酸酶将dsb导入至靶序列中，利用供体质粒的同源序列，并通过另一作为dsb修复机制的同源重组(hr：homologousrecombination)而将gfp等基因敲入至靶序列中。

另外，作为不使用供体质粒的方法，通过使用单链dna(ssodn：single-strandedoligodeoxynucleotides)，可实现靶基因的单个碱基替代或导入his标签或loxp等数十bp以下的短dna序列。通过夹持要导入的碱基序列，人工合成两端包含40bp-60bp的同源序列的单链寡脱氧核苷酸(single-strandedoligodeoxynucleotides，ssodn)，与人工核酸酶一起导入至受精卵中，利用高效率的作为dsb修复机制的单链退火(single-strandannealing，ssa)，从而可简单且有效率地制作基因敲入细胞株。

在利用供体质粒进行基因敲入时，需要对包含要基因敲入的基因的质粒附加目标基因组区域的同源序列。利用聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)等来增幅同源序列，进行连接并利用大肠杆菌进行克隆来制作供体质粒。另外，作为基因敲入细胞株的筛选方法，可使用阳性选择、启动子选择、阴性选择、聚腺苷酸(polya)选择等方法。作为从所筛选的细胞株中选择目标同源重组体的方法，可列举对于基因组dna的南部杂交法(southernhybridizationmethod)或pcr法等。

作为多能干细胞，优选为来源于哺乳动物的多能干细胞，作为哺乳动物，优选为啮齿类及灵长类，更优选为灵长类，作为灵长类，优选为人。

在“哺乳动物”中包含啮齿类、有蹄类、食肉目、灵长类等。在啮齿类中包含小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。在有蹄类中包含猪、牛、山羊、马、绵羊等。在食肉目中包含狗、猫等。所谓“灵长类”，是指属于灵长目的哺乳类动物，作为灵长类，可列举：狐猴、懒猴、树鼩等原猴亚目；猴、类人猿、人等类人猿亚目。

《多能干细胞的增殖》

在本实施方式的脑类器官的制造方法中，可使多能干细胞增殖来使用。在增殖多能干细胞时，可在饲养细胞存在下或饲养细胞不存在下(无饲养层(feeder-free))进行增殖。

当在饲养细胞存在下增殖ips细胞时，可利用现有的方法在未分化维持因子存在下增殖ips细胞。作为在饲养细胞不存在下增殖ips细胞时所使用的增殖用培养基，例如可使用现有的es细胞和/或ips细胞的维持培养基、或用以在无饲养层中建立ips细胞的培养基。作为用以在无饲养层中建立ips细胞的无饲养用培养基，可列举：essential8培养基或tesr培养基、mtesr培养基及mtesr-e8培养基(均为干细胞技术(stemcelltechnologies)公司制造)以及stemfit培养基(味之素公司制造)等。

增殖多能干细胞时所使用的培养器若为可进行“粘附培养”的培养器，则可适宜选择与培养的规模、培养条件及培养期间相应的培养器。作为此种培养器，例如可列举：烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿(平皿)、组织培养用平皿、多层平皿、微量板、微孔板、多层板、多孔板、腔室载玻片、碗、管、托盘、培养袋、微载体、珠子、叠板、旋转瓶或滚瓶。

为了可进行粘附培养，这些培养器优选为呈细胞粘附性。作为细胞粘附性的培养器，可列举对培养器的表面进行了出于提高与细胞的粘附性的目的的人工处理的培养器，具体而言，可列举经表面加工的培养器或内部经涂布剂被覆的培养器。作为涂布剂，例如可列举：层粘连蛋白(包含层粘连蛋白α5β1γ1(以下，有时称为“层粘连蛋白511”)、层粘连蛋白α1β1γ1(以下，有时称为“层粘连蛋白111”)、层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511e8等)等)、巢蛋白(entactin)、胶原、明胶、玻连蛋白(vitronectin)、信塞马库斯(synthemax)(康宁(corning)公司)、基质胶等细胞外基质等；聚赖氨酸、聚鸟氨酸等高分子等。作为经表面加工的培养器，可列举经正电荷处理等表面加工的培养容器。

多能干细胞的增殖优选为向培养基中添加rho相关卷曲螺旋激酶(rock：rho-associatedcoiled-coilformingkinase/rho接合激酶)抑制剂进行培养。通过添加rock抑制剂而可在多能干细胞、特别是人ips/es细胞的细胞分散时抑制细胞死亡。在剥离细胞的情况下，优选为在剥离后适宜添加rock抑制剂来培养。在添加rock抑制剂的情况下，只要在添加后培养至少1天即可，优选为在培养后去除。另外，多能干细胞的增殖也可自使多能干细胞从培养基剥离的1天以上之前、优选为1天之前起在含有rock抑制剂的培养基中培养。

作为rock抑制剂，若为可抑制rho激酶(rock)的功能的抑制剂，则并无特别限定，例如可列举：y-27632(例如，参照t.石崎等人(ishizakit.,etal.),y-27632的药理性质(pharmacologicalpropertiesofy-27632),一种rho相关激酶的特异性抑制剂(aspecificinhibitorofrho-associatedkinases),分子药理学(molecularpharmacology，molpharmacol),57(5),976-983,2000；s.成宫等人(narumiyas.,etal.),rock特异性抑制剂y-27632的用途及性质(useandpropertiesofrock-specificinhibitory-27632),酶学方法(methodsinenzymology，methodsenzymol)325,273-284,2000等)、法舒地尔(fasudil)/ha1077(例如，参照m.上畑等人(uehatam.,etal.),rho相关蛋白激酶介导的高血压患者平滑肌钙增敏(calciumsensitizationofsmoothmusclemediatedbyarho-associatedproteinkinaseinhypertension),自然(nature),389(6654),990-994,1997)、h-1152(例如，参照y.佐佐木等人(sasakiy.,etal.),新型特异性rho激酶抑制剂(s)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉)磺酰基]-高哌嗪作为rho激酶相关途径的探针分子(thenovelandspecificrho-kinaseinhibitor(s)-(+)-2-methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinoline)sulfonyl]-homopiperazineasaprobingmoleculeforrho-kinase-involvedpathway),药理学与治疗学(pharmacology&therapeutics，pharmacolther.),93(2-3),225-232,2002)、wf-536(例如，参照m.中岛等人(nakajimam.,etal.),wf-536的效果(effectofwf-536),一种新型rock抑制剂(anovelrockinhibitor),对抗b16黑色素瘤的转移(againstmetastasisofb16melanoma),癌症化疗与药理学(cancerchemotherapyandpharmacology),52(4),319-324,2003)及这些的诱导物、以及对于rock的反义核酸、rna干扰诱导性核酸(例如，sirna)、显性阴性突变体及这些的表达载体。

《神经外胚层标记阳性的细胞聚集体》

继而，培养所增殖的多官能干细胞来制造神经外胚层标记阳性的细胞聚集体。

对用于培养神经外胚层标记阳性的细胞聚集体的培养基(以下，有时称为“聚集用培养基”)进行说明。

作为聚集用培养基的基础培养基，可使用通常用于培养动物细胞的培养基。作为基础培养基，例如可列举：bme培养基、bgjb培养基、cmrl1066培养基、glasgowmem(gmem)培养基、改良型(improved)memzincoption培养基、imdm培养基、medium199培养基、eaglemem培养基、αmem培养基、dmem培养基、f-12培养基、dmem/f12培养基、imdm/f12培养基、汉姆培养基(ham'smedium)、rpmi1640培养基、费舍尔培养基(fischer'smedium)或这些的混合培养基等可用于培养动物细胞的培养基。

在神经外胚层标记阳性的细胞聚集体的培养中，也可使用无血清培养基。所谓“无血清培养基”，是指不含未调整或未纯化的血清的培养基。只要不含未调整或未纯化的血清，则混入有经纯化的血液源成分或动物组织源成分(例如，生长因子)的培养基也包含于无血清培养基中。无血清培养基也可含有血清替代品。作为血清替代品，例如可列举适宜含有白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇或硫甘油、这些的等同物等的血清替代品。

血清替代品例如可通过wo98/30679中记载的方法来制备。作为血清替代品，也可利用市售品。作为市售的血清替代品，例如可列举：基因敲除(tm)血清替代品(knockout(tm)serumreplacement)(赛默飞世尔科技(thermofisherscientific)公司制造：以下有时称为“ksr”)、化学成分确定的脂质浓缩物(chemically-definedlipidconcentrated)(赛默飞世尔科技公司制造)、谷氨酰胺(glutamax)(tm)(赛默飞世尔科技公司制造)、b27(赛默飞世尔科技公司制造)、n2补充剂(赛默飞世尔科技公司制造)、1×非必需氨基酸(non-essentialaminoacids)(赛默飞世尔科技公司制造)等。

聚集用培养基优选为包含骨形成蛋白质(bonemorphogeneticprotein/bmp)信号转导途径抑制物质或转化因子β(transforminggrowthfactor-β、/tgf-β)家族信号转导途径抑制物质。

作为bmp信号转导途径抑制物质，若为抑制由bmp引起的信号转导途径的物质，则并无特别限定，可为核酸、蛋白质及低分子有机化合物的任一种。此处，作为bmp，可列举：bmp2、bmp4、bmp7及生长分化因子(growthdifferentiationfactor，gdf)7等。

作为bmp信号转导途径抑制物质，例如可列举：直接作用于bmp的物质(头蛋白(noggin)蛋白质、抗体及适体等)、抑制编码bmp的基因的表达的物质(反义寡核苷酸、sirna等)、抑制bmp受体(bonemorphogeneticproteinreceptor，bmpr)与bmp的接合的物质、以及抑制由基于bmp受体的信号转导引起的生理活性的物质。作为bmpr，可列举alk2及alk3等。

作为bmp信号转导途径抑制物质，可列举：ldn193189及多索吗啡(dorsomorphin)等。ldn193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)为bmpr(alk2/3)抑制剂(以下为bmpr抑制剂)，通常以盐酸盐的形态销售。另外，也可使用作为bmp信号转导途径抑制物质而已知的蛋白质(脊索蛋白(chordin)或头蛋白(noggin)等)。

作为bmp信号转导途径抑制物质，优选为多索吗啡(dorsomorphin)。

聚集用培养基中所含的bmp信号转导途径抑制物质的最终浓度优选为0.5μm～10μm，更优选为0.75μm～5μm，进而优选为1μm～3μm。当为所述数值的范围内时，形成层结构的神经细胞在脑类器官内空间性有规律地配置，因此优选。

tgf-β家族信号转导途径抑制物质表示抑制tgf-β家族信号转导途径即由smad家族转导的信号转导途径的物质，具体而言，可列举tgf-β信号转导途径抑制物质、nodal/激活素(activin)信号转导途径抑制物质。

作为tgf-β信号转导途径抑制物质，若为抑制由tgf-β引起的信号转导途径的物质，则并无特别限定，可为核酸、蛋白质、低分子有机化合物的任一种。

作为tgf-β信号转导途径抑制物质，例如可列举：直接作用于tgf-β的物质(例如，蛋白质、抗体、适体等)、抑制编码tgf-β的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、sirna等)、抑制tgf-β受体与tgf-β的接合的物质、抑制由基于tgf-β受体的信号转导引起的生理活性的物质(例如，tgf-β受体的抑制剂、smad的抑制剂等)。

关于作为tgf-β信号转导途径抑制物质而已知的蛋白质，可列举lefty等。作为tgf-β信号转导途径抑制物质，可使用对于本领域技术人员而言现有的化合物，具体而言，可列举：sb431542、ly-364947、sb-505124及a-83-01等。此处，sb431542(4-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1h-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)及a-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺)是作为tgf-β受体(alk5)及激活素(activin)受体(alk4/7)的抑制剂(即tgf-βr抑制剂)而现有的化合物。tgf-β信号转导途径抑制物质优选为sb431542或a-83-01，就容易推进向初始的端脑的分化的方面而言，优选为a-83-01。

聚集用培养基中所含的tgf-β信号转导途径抑制物质的最终浓度优选为0.5μm～10μm，更优选为0.75μm～5μm，进而优选为1μm～3μm。

关于聚集用培养基，在bmp信号转导途径抑制物质为多索吗啡(dorsomorphin)且tgf-β信号转导途径抑制物质为a-83-01的情况下，从多能干细胞向神经外胚层标记阳性的细胞聚集体的诱导期间优选为3天～14天，更优选为4天～12天，进而优选为5天～10天。当为所述数值的范围内时，包含神经上皮细胞的脑胞的诱导效率提高，因此优选。

作为利用聚集用培养基的培养方法，优选为悬浮培养，悬浮培养优选为一边搅拌聚集用培养基一边进行。再者，所谓悬浮培养，是指一边维持细胞聚集体悬浮于培养液中而存在的状态一边培养以及进行所述培养的方法。悬浮培养是在不使细胞或细胞聚集体粘附于培养器材等的条件下进行，在粘附于培养器材等的条件下进行的培养(粘附培养或粘附培养法)不包含于悬浮培养的范畴内。在所述情况下，所谓细胞粘附，是指在细胞或细胞聚集体与培养器材之间可形成牢固的细胞-基质间接合(cell-substratumjunction)。更详细而言，所谓悬浮培养，是指在细胞或细胞聚集体与培养器材等之间未形成牢固的细胞-基质间接合的条件下的培养，所谓粘附培养，是指在细胞或细胞聚集体与培养器材等之间形成牢固的细胞-基质间接合的条件下的培养。

在利用聚集用培养基培养多能干细胞时，可预先使多能干细胞分散。通过使多能干细胞分散，可获得均匀性优异的神经外胚层标记阳性的细胞聚集体。所谓分散，是指通过酶处理或物理处理等分散处理而将细胞或组织分离成小细胞簇(2个细胞以上、100个细胞以下，优选为50个细胞以下)或单一细胞。所谓一定数量的分散的细胞，是指一定数量的细胞簇或单一细胞的集合。作为使多能干细胞分散的方法，例如可列举：机械分散处理、细胞分散液处理及细胞保护剂添加处理。也可将这些处理组合来进行。优选为以进行细胞分散液处理，继而进行机械分散处理为宜。作为机械分散处理的方法，可列举移液处理或利用刮刀的刮取操作。

作为细胞分散液处理中所使用的细胞分散液，例如可列举：包含胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、dna酶及木瓜蛋白酶等酶类、或乙二胺四乙酸等螯合剂的任一种的溶液。也可使用市售的细胞分散液、例如trypleselect(赛默飞世尔科技公司制造)或trypleexpress(赛默飞世尔科技公司制造)。

在分散多能干细胞时，可通过利用细胞保护剂进行处理来抑制多能干细胞的细胞死亡。作为细胞保护剂处理中所使用的细胞保护剂，可列举：成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor/fgf)信号转导途径作用物质、肝素、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor/igf)信号转导途径作用物质、血清及血清替代品等。

为了抑制由分散诱导的细胞死亡(特别是人多能干细胞的细胞死亡)，可在分散时添加rock抑制物质或肌球蛋白(myosin)抑制物质。作为rock抑制物质，可列举y-27632、法舒地尔(fasudil)(ha1077)、h-1152等。作为肌球蛋白(myosin)抑制物质，可列举布雷他汀(blebbistatin)。作为优选的细胞保护剂，可列举rock抑制物质。

在神经外胚层标记阳性的细胞聚集体的培养中，优选为将所分散的多能干细胞快速采取至窄空间中进行培养。若以所述方式培养，则在由所形成的细胞聚集体分化诱导的脑类器官中可再现性良好地形成上皮样结构。作为具有窄空间的培养板，例如可列举具有窄孔的板(例如，孔的底面积以平底换算计为0.1cm²～2.0cm²左右的板)、微孔及小离心管。

作为具有窄孔的板，例如可列举：24孔板(面积以平底换算计为1.88cm²左右)、48孔板(面积以平底换算计为1.0cm²左右)、96孔板(面积以平底换算计为0.3cm²左右、内径6mm～8mm左右)、384孔板。这些中，优选为96孔板。

关于具有窄孔的板的形状，作为从上方观察孔时的底表面的形状，可列举多边形、长方形、椭圆、正圆，优选为可列举正圆。关于具有窄孔的板的形状，作为从侧面观察孔时的底表面的形状，可为平底结构，也可为外周部高且内凹部低的下凹结构。作为底表面的形状，例如可列举u型底、v型底、m型底，优选为可列举u型底或v型底，进而优选为可列举v型底。作为具有窄孔的板，也可使用在细胞培养皿(例如，60mm～150mm平皿、培养瓶)的底表面具有凹凸或凹陷的板。作为具有窄孔的板的底表面，优选为使用非细胞粘附性的底表面、优选为经非细胞粘附性涂布的底表面。

形成有细胞聚集体及细胞聚集体的均匀性可根据细胞聚集体的尺寸及细胞数、宏观形态、基于组织染色分析所得的微观形态及其均匀性等来判断。另外，在细胞聚集体中形成有上皮样结构及上皮样结构的均匀性可根据细胞聚集体的宏观形态、基于组织染色分析所得的微观形态及其均匀性、分化及未分化标记的表达及其均匀性、分化标记的表达控制及其同步性、分化效率在细胞聚集体间的再现性等来判断。

形成有神经外胚层标记阳性的细胞聚集体可根据神经外胚层标记为阳性来判断。作为神经外胚层标记，可列举巢蛋白(nestin)、βiii-微管蛋白(tubulin)等。

《神经外胚层标记阳性的细胞聚集体的培养》

本实施方式的制造方法包括将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在包含浓度超过10体积％的细胞外基质的第一培养基中培养的工序。优选为包括将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体以不插入至细胞外基质中而分散于包含浓度超过10体积％的细胞外基质的第一培养基中的状态培养的工序。通过将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在第一培养基中培养而可形成脑类器官。

所谓“细胞外基质成分”，是指通常在细胞外基质中发现的各种成分。在本实施方式中，优选为使用基膜成分。作为基膜成分，例如可列举：iv型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin)及巢蛋白(nidogen)等。作为添加于培养基中的细胞外基质成分，可利用市售品，例如可列举基质胶(康宁公司制造)、人型层粘连蛋白(西格玛(sigma)公司制造)等。基质胶为来源于engelbrethholmswarm(ehs)小鼠肉瘤的基膜制备物。基质胶的主成分为iv型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin)及巢蛋白(nidogen)，除这些以外，还包含tgf-β、fgf、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、ehs肿瘤所天然产生的生长因子。关于基质胶的生长因子减少(growthfactorreduced)制品，与通常的基质胶相比，生长因子的浓度低，且其标准浓度为上皮生长因子(epidermalgrowthfactor/egf)＜0.5ng/ml、神经生长因子(nervegrowthfactor/ngf)＜0.2ng/ml、血小板源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor/pdgf)＜5pg/ml、igf-1≦5ng/ml、tgf-β≦1.7ng/ml。作为细胞外基质成分，优选为使用基质胶的生长因子减少(growthfactorreduced)制品。

第一培养基中的细胞外基质成分的浓度有助于形成神经管样结构体。另外，在长期培养的大脑皮质样分层结构的构建中，也对上层神经细胞的制作时期或上层的厚度造成影响。

在使用基质胶作为细胞外基质成分的情况下，通过将基质胶与第一培养基在冰浴上移液来加以混合。当进行15次以上的移液时，基质胶分散于培养基中。所谓分散，是指在目视下在培养基中通过目视无法观察到细胞外基质的团块的状态。当基质胶无法分散于培养基中时，产生所获得的脑类器官间的聚集。

将第一培养基与细胞外基质合计而得的体积设为100体积％，细胞外基质的浓度的上限值优选为70体积％，更优选为60体积％，进而优选为50体积％。另一方面，细胞外基质的浓度的下限值优选为10体积％，更优选为20体积％，进而优选为30体积％。当为10体积％以下时，在进行培养第70天的脑类器官切片的免疫染色的情况下，基本观察不到大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2的表达。另外，当为30体积％～50体积％的范围内时，在培养第70天的脑类器官切片中，可明显观察到大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2的表达。另外，当为30体积％～50体积％的范围内时，直至表达satb2为止的期间短，因此优选。

第一培养基可将用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基，若为例如bme培养基、bgjb培养基、cmrl1066培养基、glasgowmem培养基、改良型(improved)memzincoption培养基、imdm培养基、medium199培养基、eaglemem培养基、αmem培养基、dmem培养基、汉姆培养基(ham'smedium)、汉姆(ham's)f-12培养基、rpmi1640培养基及费舍尔培养基(fischer'smedium)、这些的混合培养基等可用于培养动物细胞的培养基，则并无特别限定。

第一培养基可含有n2补充剂(赛默飞世尔科技公司制造品名)、化学成分确定的脂质浓缩物(chemicallydefinedlipidconcentrate)、血清、血清替代品、肝素等。关于血清替代品，与所述血清替代品相同。

本实施方式的制造方法只要包括将神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在第一培养基中培养的工序即可，也可包括不使用第一培养基的其他工序。例如，可在进行使用第一培养基以外的培养基(包含n2补充剂及化学成分确定的脂质浓缩物(chemicallydefinedlipidconcentrate)且不含血清、肝素、细胞外基质成分的培养基)来培养神经外胚层标记阳性的细胞聚集体的工序后，从中途(例如，在foxg1阳性细胞聚集体中形成具有脑室样的空洞的半球状的神经管样结构的阶段以后)切换为第一培养基而进行在第一培养基中培养的工序。

第一培养基也可还包含wnt信号增强剂。作为wnt信号增强剂，可列举：wnt蛋白质、糖原合成酶激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β，gsk-3β)抑制剂及r-spondin等wnt激动剂(agonist)、以及dkk(wnt抑制蛋白质的抑制剂)等。这些中，作为wnt信号增强剂，优选为wnt蛋白质及gsk-3β抑制剂。

作为gsk-3β抑制剂，可列举：chir99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1h-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile))、肯帕罗酮(kenpaullone)及6-溴靛玉红-3'-肟(6-bromoindirubin-3'-oxime，bio)等。这些中，作为gsk-3β抑制剂，优选为chir99021。

作为wnt蛋白质，可使用来源于各种生物的wnt蛋白质。来源于生物的wnt蛋白质中，优选为来源于哺乳类动物的wnt蛋白质。作为哺乳类动物的wnt蛋白质，可列举：wnt1、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11及wnt16等。其中，优选为wnt3a，wnt3a更优选为与α白蛋白的复合体。

在使用chir99021作为wnt信号增强剂的情况下，培养基中所含的chir99021的最终浓度优选为0.1μm～30μm，更优选为0.5μm～10μm，进而优选为1μm～5μm。当为所述数值的范围内时，包含神经上皮细胞的脑胞的诱导效率提高，因此优选。

在使用wnt3a作为wnt信号增强剂的情况下，培养基中所含的wnt3a的最终浓度优选为0.1ng/ml～20ng/ml，更优选为0.5ng/ml～15ng/ml，进而优选为1ng/ml～10ng/ml。当为所述数值的范围内时，包含神经上皮细胞的脑胞的诱导效率提高，因此优选。

第一培养基可还包含tgf-β家族信号转导途径抑制物质。关于tgf-β家族信号转导途径抑制物质的详细情况，与所述tgf-β家族信号转导途径抑制物质相同。在使用sb431542作为tgf-β家族信号转导途径抑制物质的情况下，以培养基中的最终浓度计，优选为0.5μm～10μm，更优选为0.75μm～5μm，进而优选为1μm～3μm。

神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在第一培养基中的培养是在获得端脑标记阳性的脑类器官所需的期间实施。关于端脑标记，与所述端脑标记相同。

例如，在第一培养基包含wnt信号增强剂及tgf-β家族信号转导途径抑制物质，wnt信号增强剂为wnt3a及chir99021，tgf-β家族信号转导途径抑制物质为sb431542的情况下，神经外胚层标记阳性的细胞聚集体在第一培养基中的培养期间优选为3天～14天，更优选为4天～12天，进而优选为5天～10天，特别优选为6天～8天。

《在实质上不含细胞外基质成分的培养基中培养的工序》

本实施方式的制造方法可包括在实质上不含细胞外基质成分的培养基(以下，也称为“第二培养基”)中培养的工序。具体而言，优选为还包括如下工序：将在第一培养基中培养神经外胚层标记阳性的细胞聚集体而获得的细胞聚集体在实质上不含细胞外基质成分的培养基中培养。通过包括所述工序，可获得包含端脑标记阳性的细胞以及前脑标记阳性的细胞及端脑部分样组织标记阳性的细胞的细胞聚集体(脑类器官)。所述培养优选为通过悬浮培养来进行。

在悬浮培养中的细胞聚集体中，细胞与细胞面粘附。在悬浮培养中的细胞聚集体中，在与培养器材等之间基本未形成细胞-基质间接合，或者即使形成，其贡献也小。在一部分的形态中，在悬浮培养中的细胞聚集体中，内源的细胞-基质间接合存在于聚集体的内部，但在与培养器材等之间基本未形成细胞-基质间接合，或者即使形成，其贡献也小。

进行悬浮培养时所使用的培养器若为可进行“悬浮培养”的培养器，则并无特别限定，若为本领域技术人员，则可适宜决定。作为此种培养器，例如可列举：烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿(平皿)、皮氏培养皿、组织培养用平皿、多层平皿、微量板、微孔板、微孔、多层板、多孔板、腔室载玻片、碗、管、托盘、培养袋、旋转烧瓶、三角烧瓶、滚瓶等。

为了可进行悬浮培养，这些培养器优选为呈非细胞粘附性。作为非细胞粘附性的培养器，可使用未对培养器的表面进行出于提高与细胞的粘附性的目的的人工处理(例如，利用基膜制剂、层粘连蛋白、巢蛋白(entactin)、胶原、明胶等细胞外基质等或聚赖氨酸、聚鸟氨酸等高分子等进行的涂布处理或正电荷处理等表面加工)的培养器等。作为非细胞粘附性的培养器，可使用对培养器的表面进行了出于降低与细胞的粘附性的目的的人工处理(例如，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine，mpc)聚合物等超亲水性处理、蛋白低吸附处理等)的培养器等。可使用旋转烧瓶、滚瓶、带搅拌叶片的小型生物反应器等进行搅拌。培养器的培养面可为平底，亦可具有凹凸。

悬浮培养优选为在高氧分压条件下进行。通过在高氧分压条件下进行悬浮培养，可达成脑类器官中所含的脑室区的长期的维持培养，可形成不仅具有端脑标记阳性的细胞而且至少具有选自前脑标记阳性的细胞及端脑部分样组织标记阳性的细胞中的一种以上的细胞的细胞聚集体。

所谓高氧分压条件，是指高于空气中的氧分压(20％)的氧分压条件。作为高氧分压条件，也可在30％～60％下培养。

第二培养基可将用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基，若为例如bme培养基、bgjb培养基、cmrl1066培养基、glasgowmem培养基、改良型(improved)memzincoption培养基、imdm培养基、medium199培养基、eaglemem培养基、αmem培养基、dmem培养基、汉姆培养基(ham'smedium)、汉姆(ham's)f-12培养基、rpmi1640培养基、费舍尔培养基(fischer'smedium)、这些的混合培养基等可用于培养动物细胞的培养基，则并无特别限定。

第二培养基也可还含有n2补充剂、化学成分确定的脂质浓缩物(chemicallydefinedlipidconcentrate)、血清、血清替代品、肝素等。关于血清替代品，与所述血清替代品相同。

第二培养基实质上不含细胞外基质成分。此处，所谓“实质上不含细胞外基质成分”，是指未有意向第二培养中添加细胞外基质成分，允许添加于第一培养基中的细胞外基质成分的一部分或全部混入至第二培养基中；及在第二培养基中包含脑类器官自身所产生的细胞外基质成分等。在一形态中，将第二培养基与基质胶合计而得的体积设为100体积％，第二培养基中的细胞外基质成分的浓度优选为1体积％以下，更优选为0.5体积％以下，进而优选为0.1体积％以下。

通过第二培养基实质上不含细胞外基质成分，可制造不仅具有端脑标记阳性的细胞而且至少具有前脑标记阳性的细胞及端脑部分样组织标记阳性的细胞的任一种以上的细胞的细胞聚集体。

第二培养基中的培养期间优选为7天～154天，更优选为14天～147天，进而优选为21天～140天。当在第二培养基中培养77天以上时，有容易获得大脑皮质的分层结构(由内向外模式)明确的脑类器官的倾向。

[脑类器官]

在一实施方式中，本发明提供一种通过本实施方式的脑类器官的制造方法而制造的脑类器官。本实施方式的脑类器官与通过和本实施方式的脑类器官的制造方法不同的制造方法而制造的脑类器官有可能在基因表达模式等方面存在差异。然而，是否存在此种差异并不确定，另外，为了特定此种差异并通过基因表达模式等来特定本实施方式的脑类器官，需要反复非常多的尝试错误，且实质上无法实现。因此，可以说实际的是本实施方式的脑类器官通过利用所述制造方法来制造的情况进行特定。

如之后在实施例中叙述那样，本实施方式的脑类器官在对神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6、大脑皮质的第v层标记即ctip2、大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2进行免疫染色的情况下，确认到由内向外模式。另外，通过进行长期培养，并通过免疫染色而可确认本实施方式的脑类器官具有星形胶质细胞标记即s100β或胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，gfap)阳性细胞。

[被验物质的毒性-药效评价方法及试剂盒]

在一实施方式中，本发明提供一种被验物质的毒性-药效评价方法，其包括：使被验物质与本实施方式的脑类器官接触；以及检验所述被验物质给所述脑类器官造成的影响。

通过本实施方式的方法，可再现性良好地进行被验物质对于脑的药效评价。另外，通过使用来源于人的脑类器官，可正确地评价被验物质在人中的药效。

作为被验物质，可列举：天然化合物库、合成化合物库及现有药库等。

作为被验物质给脑类器官造成的影响的检验方法，可列举：被验物质的存在下及不存在下的直径的测定、形态的分析、细胞生存率的分析、基因表达模式的分析、切片的免疫染色及神经活动的测定等。

[由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗药及治疗用医药组合物]

本实施方式的脑类器官例如可用作如下治疗药：移植到阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease)、小头畸形症、自闭症等由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的患者的脑中来治疗疾病的治疗药。

另外，本实施方式的治疗药也可制备成治疗用医药组合物的形态，所述治疗用医药组合物含有本实施方式的脑类器官作为有效成分，还包含使脑类器官悬浮的缓冲液、对于由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的现有的治疗药等。此处，作为“作为有效成分而含有”，是指含有可获得由神经系统细胞或神经组织的障碍所致的疾病的治疗效果的程度的量的脑类器官，其含量并无特别限定。

实施例

其次，示出实施例对本发明进行更详细说明，但本发明并不受这些任何限定。

[实验例1]

依据“m.中川等人(nakagawam.,etal.),一种用于分离人诱导多能干细胞的新型高效无饲养层培养系统(anovelefficientfeeder-freeculturesystemforthederivationofhumaninducedpluripotentstemcells),科学报告(scientificreports),4,3594,2014”中记载的方法对人ips细胞(pchips771株、lot.a01qm28、利普劳塞鲁(reprocell)公司制造)进行无饲养层培养。作为无饲养层培养基，使用stemfitak02n(味之素公司制造)或在无饲养层支架中使用imatrix-511(日皮(nippi)公司制造)。

作为具体的扩大培养操作，首先，利用磷酸盐缓冲盐水(以下简称为“pbs(phosphatebufferedsaline)”)将成为60％～80％汇合(培养面积的6成～8成被细胞覆盖的程度)的人ips细胞(pchips771株、lot.a01qm28、利普劳塞鲁(reprocell)公司制造)清洗，然后使用trypleselect(赛默飞世尔科技公司制造)分散成单一细胞。然后，将所述分散成单一细胞的人ips细胞接种于经imatrix-511(日皮(nippi)公司制造)涂布的塑料培养平皿中，在添加有y27632(rock抑制物质、最终浓度10μm)的stemfitak02n培养基中进行无饲养层培养。作为所述塑料培养平皿，使用60mm平皿(dish)(易威奇(iwaki)公司制造、细胞培养用)，所述分散成单一细胞的人ips细胞的接种细胞数设为3×10⁴个。

在从接种细胞起1天后，更换为不含y27632的stemfitak02n培养基。以后，每1天～2天利用不含y27632的stemfitak02n培养基进行一次培养基更换。然后，在从接种细胞起6天后成为80％汇合。图1表示以明视场观察从接种细胞起7天后的ips细胞的显微镜照片。

[实验例2]

将80％汇合的人ips细胞(pchips771株、lot.a01qm28、利普劳塞鲁(reprocell)公司制造)在y27632(rock抑制物质、10μm)存在下处理2小时，获得人ips细胞。

使用细胞分散液(制品名“trypleselect”、赛默飞世尔科技公司制造)并通过移液操作而对所述2小时处理后的人ips细胞进行单一细胞处理。将制成单一细胞的人ips细胞在100μl的聚集用培养基中、在37℃下且在容器内为5体积％co2的存在下进行悬浮培养，以使非细胞粘附性的96孔培养板(制品名“primesurface96v底板”、住友电木(bakelite)公司制造)的每1孔为2×10⁴个。

作为聚集用培养基，使用向stemfitak02n(味之素公司制造)中添加非必需氨基酸(non-essentialaminoacids)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度200倍)、青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(半井(nacalaitesque)公司制造、稀释浓度100倍)、谷氨酰胺(glutamax)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度100倍)、1×2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度1000倍)、多索吗啡(dorsomorphin)(西格玛公司制造、最终浓度2μm)、a-83-01(最终浓度2μm)而得的培养基。

在悬浮培养开始时(培养第0天，以下，只要无特别说明，则培养天数由从悬浮培养开始时起的培养天数表示)，向所述聚集用培养基中添加y27632(最终浓度30μm)。另外，在悬浮培养开始后第一天，向与所述聚集用培养基为相同组成的培养基中加入150μl的包含y27632(最终浓度10μm)的培养基，不进行培养基更换而持续悬浮培养，直至悬浮培养开始后第7天。图2是表示利用倒置显微镜(奥林巴斯(olympus)公司)明视场观察悬浮培养开始后第7天的细胞聚集体的结果的显微镜照片。

将悬浮培养开始后第7天的细胞聚集体免疫染色来研究神经外胚层标记的表达。具体而言，利用4质量％多聚甲醛水溶液将细胞聚集体固定，然后利用蔗糖溶液进行置换，使用莱卡(leica)cm3050s(莱卡(leica)公司制造)来制作冷冻切片。继而，针对这些冷冻切片，将神经外胚层标记免疫染色。

作为神经外胚层标记，研究了βiii-tubulin。其结果，明确悬浮培养开始后第7天的细胞聚集体是神经外胚层标记阳性。

[实验例3]

在实验例2的悬浮培养开始后第7天从各孔中去除230μl的聚集用培养基。继而，以150μl/孔为单位添加第一培养基，以使细胞外基质与其他成分均匀地分散的方式在冰浴上混合，在37℃下且在容器内为5体积％co2的存在下不搅拌地进行悬浮培养。

作为第一培养基，准备各种向dulbecco'smodifiedeaglemedium：nutrientmixturef-12(赛默飞世尔科技公司制造)中添加1×n2补充剂(supplement)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度200倍)、肝素钠盐(heparinsodiumsalt)(西格玛公司制造、最终浓度10μg/ml)、非必需氨基酸(non-essentialaminoacids)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度200倍)、青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(半井(nacalaitesque)公司制造、稀释浓度100倍)、谷氨酰胺(glutamax)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度100倍)、wnt-3a(人(human)、重组细胞(recombinant)、r&d系统公司制造、最终浓度4ng/ml)、chir99021(阿喜隆(axon)公司制造、最终浓度1μm)及sb-431542(西格玛公司制造、最终浓度1μm)，进而添加2体积％、10体积％、30体积％或50体积％的基质胶(康宁公司制造)而得的细胞外基质的含有浓度不同的第一培养基。

图3是表示明视场观察实验例3的悬浮培养开始后第14天的各细胞聚集体的结果的显微镜照片。

继而，针对实验例3中的悬浮培养开始后第14天的各细胞聚集体，与实验例2同样地制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记。

具体而言，对前脑及端脑标记即foxg1(抗foxg1抗体、abcam公司、家兔)、幼弱的神经细胞标记即βiii-tubulin(抗βiii-tubulin抗体、西格玛(sigma)公司、小鼠)、神经干细胞及神经前体细胞标记即pax6(抗pax6抗体、mbl公司、野兔)的表达进行研究。使用共焦显微镜(蔡司(zeiss)公司制造)对免疫染色后的各试样进行荧光显微镜观察。

图4及图5是表示以基质胶浓度30体积％培养的细胞聚集体的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图4中，“dapi”表示利用dapi将细胞聚集体的冷冻切片染色的结果，“βiii-tubulin”表示利用抗βiii-tubulin抗体将细胞聚集体的冷冻切片染色的结果，“pax6”表示利用pax6抗体将细胞聚集体的冷冻切片染色的结果，“merge”表示将所述结果合成所得的结果。

图5中，“dapi”与“merge”表示和图4中的这些为相同含义，“sox2”表示利用抗sox2抗体将细胞聚集体的冷冻切片染色的结果，“foxg1”表示利用抗foxg1抗体将细胞聚集体的冷冻切片染色的结果。

其结果，明确以基质胶浓度30体积％培养的细胞聚集体(实验例3的悬浮培养开始后第14天)的foxg1、βiii-tubulin、pax6为阳性，且至少为前脑及端脑标记阳性的脑类器官。

[实验例4]

在实验例3的第一培养基中，使用stemfitak02n(味之素公司制造)来代替dulbecco'smodifiedeaglemedium：nutrientmixturef-12(赛默飞世尔科技公司制造)，除此以外，与实验例3同样地准备以浓度50体积％含有基质胶的培养基(实验例4的第一培养基)，并培养实验例2的悬浮培养开始后第7天的细胞聚集体。

图6是表示明视场观察悬浮培养开始后第7天、第9天、第11天及第14天的各细胞聚集体的结果的显微镜照片。图7是表示根据图6的照片测量各细胞聚集体的二维投影面积的结果的图表。

图6及图7中，“dmemf12”为使用基质胶浓度50体积％的实验例3的第一培养基的结果，“ak02n”为使用实验例4的第一培养基的结果。

针对与实验例3同样地使用实验例4的第一培养基所培养的细胞聚集体，也与实验例3同样地制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记。其结果，明确使用实验例4的第一培养基所培养的细胞聚集体的foxg1、βiii-tubulin、pax6也为阳性，且至少为前脑及端脑标记阳性的脑类器官。

[实验例5]

在实验例3中，从各孔中回收在细胞外基质的含有浓度不同的各种第一培养基中所培养的培养第14天的各细胞聚集体，移至放入有10ml的pbs的福尔肯(falcon)(注册商标)锥形管50ml(康宁公司制造)。继而，倒转混合5次，去除上清液，由此去除基质胶(细胞外基质)。

继而，从福尔肯(falcon)(注册商标)锥形管50ml中回收各细胞聚集体，移至30ml一次性生物反应器(single-usebioreactor)中。继而，加入20ml的第二培养基，一边进行搅拌一边开始悬浮培养。搅拌速度设定为50rpm，培养基更换是每3天～4天进行1次。

作为第二培养基，使用不含细胞外基质的培养基。具体而言，作为第二培养基，使用向dulbecco'smodifiedeaglemedium：nutrientmixturef-12(赛默飞世尔科技公司制造)中添加1×n2补充剂(supplement)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度200倍)、b-27补充剂(supplement)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度100倍)、1×非必需氨基酸(non-essentialaminoacids)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度200倍)、1×青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(半井(nacalaitesque)公司制造、稀释浓度100倍)、1×2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)(赛默飞世尔科技公司制造、稀释浓度1000倍)及胰岛素溶液(insulinsolution)(人(human)、重组细胞(recombinant)、和光纯药公司制造、2.5μg/ml)而得的培养基。

针对悬浮培养开始后第40天及第70天的各细胞聚集体，与实验例3同样地制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记。具体而言，对神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6(抗pax6抗体、绵羊)、大脑皮质的第v层标记即ctip2(抗ctip2抗体、abcam公司、大鼠)、大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2(抗satb2抗体、、小鼠)进行免疫染色，使用共焦显微镜(蔡司(zeiss)公司制造)进行荧光显微镜观察。

图8是表示在悬浮培养开始后第40天明视场观察基质胶浓度不同的各细胞聚集体的结果的显微镜照片。其结果，明确随着基质胶的浓度变高，细胞聚集体的尺寸变大。另外，明确当基质胶浓度为10体积％以上时，可形成具有神经管样的结构体的聚集体。

图9是表示如下结果的荧光显微镜照片：在悬浮培养开始后第40天，由使用基质胶浓度为50体积％的第一培养基所获得的细胞聚集体制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记所得的结果。其结果，明确在悬浮培养开始后第40天所获得的细胞聚集体具有神经管样结构，存在神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6阳性的细胞密度高的区域。另外，在pax6阳性的细胞密度高的区域的外侧配置有大脑皮质的第v层标记即ctip2阳性细胞，但是未观察到大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2阳性细胞。根据以上结果，明确所获得的细胞聚集体至少为神经干细胞-神经前体细胞及大脑皮质的第v层标记阳性的脑类器官。

再者，图9中，“dapi”表示利用dapi染色的结果，“satb2”表示利用抗satb2抗体染色的结果，“pax6”表示利用抗pax6抗体染色的结果，“ctip2”表示利用抗ctip2抗体染色的结果，“merge”表示将所述结果合成所得的结果。以下，对于图10～图15，也相同。

图10是表示如下结果的荧光显微镜照片：在悬浮培养开始后第40天，由使用基质胶浓度为30体积％的第一培养基所获得的细胞聚集体制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记所得的结果。其结果，明确在悬浮培养开始后第40天所获得的细胞聚集体具有神经管样结构，存在神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6阳性的细胞密度高的区域。另外，在pax6阳性的细胞密度高的区域的外侧配置有大脑皮质的第v层标记即ctip2阳性细胞，但是未观察到大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2阳性细胞。根据以上结果，明确所获得的细胞聚集体至少为神经干细胞-神经前体细胞及大脑皮质的第v层标记阳性的脑类器官。

图11是表示如下结果的荧光显微镜照片：在悬浮培养开始后第40天，由使用基质胶浓度为10体积％的第一培养基所获得的细胞聚集体制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记所得的结果。其结果，明确在悬浮培养开始后第40天所获得的细胞聚集体具有神经管样结构，存在神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6阳性的细胞密度高的区域。另外，在pax6阳性的细胞密度高的区域的外侧配置有大脑皮质的第v层标记即ctip2阳性细胞，但是未观察到大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2阳性细胞。根据以上结果，明确所获得的细胞聚集体至少为神经干细胞-神经前体细胞及大脑皮质的第v层标记阳性的脑类器官。

图12是表示如下结果的荧光显微镜照片：在悬浮培养开始后第40天，由使用基质胶浓度为2体积％的第一培养基所获得的细胞聚集体制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记所得的结果。其结果，在悬浮培养开始后第40天所获得的细胞聚集体与基质胶浓度10体积％～50体积％的细胞聚集体相比，神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6阳性的细胞少。另外，未观察到大脑皮质的第v层标记即ctip2阳性细胞、大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2阳性细胞。根据以上结果，明确所获得的细胞聚集体至少为神经干细胞-神经前体细胞及大脑皮质的第v层标记阳性的脑类器官。

图13是表示如下结果的荧光显微镜照片：在悬浮培养开始后第70天，由使用基质胶浓度为50体积％的第一培养基所获得的细胞聚集体制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记所得的结果。其结果，明确在悬浮培养开始后第70天所获得的细胞聚集体具有神经管样结构，存在神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6阳性的细胞密度高的区域。另外，示出在pax6阳性的细胞密度高的区域的外侧存在大脑皮质的第v层标记即ctip2阳性细胞层，进而在其外侧配置有大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2阳性细胞，从而形成大脑皮质样的分层结构。根据以上结果，明确所获得的细胞聚集体至少为神经干细胞-神经前体细胞及大脑皮质的第v层以及大脑皮质的第ii/iii层标记阳性的脑类器官。

图14是表示如下结果的荧光显微镜照片：在悬浮培养开始后第70天，由使用基质胶浓度为30体积％的第一培养基所获得的细胞聚集体制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记所得的结果。其结果，明确在悬浮培养开始后第70天所获得的细胞聚集体具有神经管样结构，存在神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6阳性的细胞密度高的区域。另外，示出在pax6阳性的细胞密度高的区域的外侧存在大脑皮质的第v层标记即ctip2阳性细胞层，进而在其外侧配置有大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2阳性细胞，从而形成大脑皮质样的分层结构。根据以上结果，明确所获得的细胞聚集体至少为神经干细胞-神经前体细胞及大脑皮质的第v层以及大脑皮质的第ii/iii层标记阳性的脑类器官。

图15是表示如下结果的荧光显微镜照片：在悬浮培养开始后第70天，由使用第基质胶浓度为10体积％的第一培养基所获得的细胞聚集体制作冷冻切片，进行免疫染色并评价脑标记所得的结果。其结果，明确在悬浮培养开始后第70天所获得的细胞聚集体具有神经管样结构，存在神经干细胞-神经前体细胞标记即pax6阳性的细胞密度高的区域。另外，在pax6阳性的细胞密度高的区域的外侧配置有大脑皮质的第v层标记即ctip2阳性细胞。另一方面，基本未观察到大脑皮质的第ii/iii层标记即satb2阳性细胞。根据以上结果，明确所获得的细胞聚集体至少为神经干细胞-神经前体细胞及大脑皮质的第v层标记阳性的脑类器官。

产业上的可利用性

根据本发明，可提供一种端脑标记阳性的脑类器官的制造方法。