荧光发生核酸分子以及荧光标记靶RNA的方法与流程
本发明涉及一种用于荧光标记rna的荧光发生核酸分子(发荧光的核酸分子)、以及使用该荧光发生核酸分子的荧光标记靶rna的方法。
本申请基于2018年12月3日在日本申请的日本特愿2018-226743号主张优先权，将其内容引用至本文中。
背景技术：
为了更好地理解如何在mrna水平控制基因表达，强烈要求建立一种使活细胞的mrna的时空动态视觉化的方法。在标靶mrna上添加ms2或pp713等rna茎环的标签，并招募与荧光分子融合后的蛋白质的方法是常用于使活细胞内的mrna可视化的方法。该技术被用于追踪细胞质内的mrna的活动(例如，参见非专利文献1)或用于使细胞核内新生的mrna可视化(例如，参见非专利文献2)。但是，针对添加标签后的mrna，在使细胞内的mrna分布的动态可视化或测定表达水平时，未结合的荧光蛋白质较高的背景经常导致难以解释结果。
作为使活细胞内的mrna视觉化的方法，可列举使用碱基序列依赖性地与特定的靶分子结合的rna适体的方法作为候选。某种rna适体能够通过与荧光性的低分子化合物结合来增强其荧光(例如，参见非专利文献3及4)。这样的rna适体也被称为荧光发生rna(fluorogenicrna)。作为荧光发生rna，具有例如：与gfp(greenfluorescentprotein)的荧光团的类似物dfhbi(3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮)家族的低分子的荧光分子结合的spinach或broccoli以及它们的衍生物(例如，参见非专利文献5、专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第9,664,676号说明书
非专利文献
非专利文献1：wuetal.,science2016,vol.352,p.1430-1435.
非专利文献2：tyagi,naturemethods,2009,vol.6,p.331-338.
非专利文献3：paigeetal.,science,2011,vol.333,p.642-646.
非专利文献4：filonovetal.,journaloftheamericanchemicalsociety,2014,vol.136,p.16299-16308.
非专利文献5：filonovetal.,currentprotocolsinchemicalbiology,2017,vol.8(1),p.1-28.
非专利文献6：kettereretal.,nucleicacidsresearch,2015,vol.43,p.9564-9572.
非专利文献7：autouretal.,nucleicacidsresearch,2016,vol.44,p.2491-2500.
非专利文献8：zouetal.,journalofmolecularevolution,2015,vol.81,p.172-178.
非专利文献9：ageelyetal.,acschemicalbiology,2016,vol.11,p.2398-2406.
非专利文献10：filonovetal.,chemistry&biology,2015,vol.22,p.649-660.
非专利文献11：filonovetal.,naturebiotechnology,2011,vol.29,p.757-761.
非专利文献12：takai,etal.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2015,vol.112,p.4352-4356.
非专利文献13：zuker,nucleicacidsresearch,2003,vol.31,no.13,p.3406-3415.
非专利文献14：teraietal.,cellstructureandfunction,2019,vol.44,p.153-169.
非专利文献15：algaretal.,naturemethods,2019,vol.16,p.815-829.
非专利文献16：jepsenetal.,naturecommunications,2018,vol.9,articlenumber18.
非专利文献17：hanetal.,journaloftheamericanchemicalsociety,2013,vol.135,p.19033-19038.
非专利文献18：trachmanetal.,trendsinpharmacologicalsciences,2017,vol.38(10),p.928-939.
非专利文献19：guoandbartel,science,vol.353(6306),p.1382.
技术实现要素：
发明想要解决的课题
理论上，通过向靶mrna添加荧光发生rna的标签，能够使活细胞内的靶mrna可视化并将其定量。然而，现有的荧光发生rna均荧光强度小，未能成功使细胞内的mrna动态视觉化。
本发明的主要目的在于提供一种可以在细胞内、特别是哺乳类的活细胞内使mrna可视化的荧光发生rna以及利用该荧光发生rna的荧光标记靶rna的方法。
用于解决课题的手段
本发明人等经过潜心研究，结果发现通过制得将嵌入支架rna的状态的荧光发生rna经由接头序列多个串联连接而成的核酸分子能够显著增强与荧光分子结合时所产生的荧光的强度、通过利用该核酸分子标记靶rna可以使活细胞内的靶rna可视化，从而完成了本发明。
即，本发明的荧光发生核酸分子、荧光标记靶rna的方法、载体、接头序列的设计方法、荧光信号的检测方法以及抑制物质的筛选方法是下列项[1]至项[23]所述的技术方案。
项1.一种荧光发生核酸分子，其特征在于，包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列，
所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。
项2.根据所述项1的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列的长度为20个碱基以上。
项3.根据所述项1或项2的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列未形成特定的立体结构。
项4.根据所述项3的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区在所述支架序列中插入有2个以上的所述荧光分子结合适体序列。
项5.根据所述项4的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区通过形成含有2个以上的环结构的茎环结构的单链核酸分子中的至少2个所述环结构被取代为所述荧光分子结合适体序列的结构来构成。
项6.根据所述项1至项5中任一项的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合适体序列含有：形成以g-quadruplex结构所夹持的茎环结构的单链核酸分子的碱基序列；
所述茎环结构通过4～6个碱基的茎结构和4个碱基的环结构来构成。
项7.根据所述项1至项5中任一项的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合适体序列是broccoli、broccoli3或dbroccoli。
项8.根据所述项1至项5中任一项的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区通过序列号16或17所示的碱基序列来构成。
项9.根据所述项1至项8中任一项的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列通过序列号18～20中任一项所示的碱基序列来构成。
项10.根据所述项1至项9中任一项的荧光发生核酸分子，其中，荧光发生核酸分子含有4个以上的所述荧光分子结合适体序列。
项11.根据所述项1至项10中任一项的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子是dfhbi家族的荧光分子。
项12.一种荧光标记靶rna的方法，其是对靶rna进行荧光标记的方法；其中，使靶rna直接或间接地连接所述项1至项11中任一项的荧光发生核酸分子之后，使其与所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子接触。
项13.根据所述项12的荧光标记靶rna的方法，其中，所述靶rna是靶基因的转录产物，
向在所述靶基因的3’非翻译区内整合有编码所述荧光发生核酸分子的碱基序列的细胞的细胞内，导入所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子，并使所述靶基因的转录产物与所述荧光分子结合。
项14.一种荧光标记靶rna的方法，其是对靶rna进行荧光标记的方法；其中，向含有靶rna的试样中混合：
使与所述靶rna的一部分杂交的探针直接或间接地连接于所述项1至项11中任一项的荧光发生核酸分子而成的核酸分子，以及
所述核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子。
项15.一种载体，其具有：
控制外源基因的表达的启动子；
位于所述启动子的下游并且用于插入所述外源基因的编码区的限制性酶切位点；以及
位于所述限制性酶切位点的下游的3’非翻译区，
所述3’非翻译区包含编码所述项1至项11中任一项的荧光发生核酸分子的碱基序列。
项16.一种接头序列的设计方法，其用以设计荧光发生核酸分子中的接头序列，所述荧光发生核酸分子包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列，所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列；其中，
将在1个所述荧光分子结合区的上游及下游连接有候选接头序列而成的rna序列作为评价用rna序列，
通过以下述方式来设计所述接头序列：所述评价用rna序列中的所述荧光分子结合区的立体结构的预测结果与仅由所述荧光分子结合区构成的rna序列的立体结构的预测结果相同。并且预测所述候选接头序列部分不取得立体结构。
项17.根据所述项16的接头序列的设计方法，其中，所述候选接头序列是限制性酶切位点上添加有随机rna序列而成的序列。
项18.根据所述项16或项17的接头序列的设计方法，其中，所述候选接头序列的长度为20个碱基以上且80个碱基以下。
项19.一种与荧光发生核酸分子结合的荧光分子所发出的荧光信号的检测方法，使所述项11的荧光发生核酸分子结合dfhbi家族的荧光分子之后，连续照射所述dfhbi家族的荧光分子的激发光一定时间，检测从照射开始时间点的荧光信号的亮度值中减去照射结束时间点的荧光信号的亮度值而得到的亮度值，并将其作为与所述荧光发生核酸分子结合的所述dfhbi家族的荧光分子所发出的荧光信号。
项20.一种与所述项19的荧光发生核酸分子结合的荧光分子所发出的荧光信号的检测方法，按照向与所述dfhbi家族的荧光分子结合的所述荧光发生核酸分子连续照射所述激发光一定时间之后中断照射一定时间的照射循环来反复照射多次，
检测每个所述照射循环中连续照射时的照射开始时间点的荧光信号和照射结束时间点的荧光信号，
将全部照射循环中检测到的连续照射时的照射开始时间点的荧光信号的亮度值平均化，
将全部照射循环中检测到的连续照射时的照射结束时间点的荧光信号的亮度值平均化，
检测从平均化后的照射开始时间点的荧光信号的亮度值中减去平均化后的照射结束时间点的荧光信号的亮度值而得到的值，并将其作为与所述荧光发生核酸分子结合的所述dfhbi家族的荧光分子的荧光信号。
项21.一种筛选方法，其是针对所述项1至项11中任一项的荧光发生核酸分子与和所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列结合的荧光分子之间的结合进行抑制的物质的筛选方法，
在存在所述荧光发生核酸分子和所述荧光分子的反应体系中，使抑制物质的候选物质共存，并测定所述荧光分子所发出的荧光信号，当得到的亮度值小于在所述候选物质不存在的情况下与所述荧光发生核酸分子结合的所述荧光分子所发出的荧光信号的亮度值时，选出所述候选物质作为所述抑制物质。
项22.根据所述项21的筛选方法，其中，所述荧光发生核酸分子中的荧光分子结合适体序列是形成以g-quadruplex结构所夹持的茎环结构的单链核酸分子的碱基序列；
所述荧光分子是dfhbi家族的荧光分子，
所述抑制物质具有开解g-quadruplex结构的活性。
项23.根据所述项22的筛选方法，其中，向共表达所述荧光发生核酸分子和所述候选蛋白质的细胞中导入所述荧光分子并测定荧光信号，当得到的亮度值小于向仅表达所述荧光发生核酸分子的细胞中导入所述荧光分子而得到的荧光信号时，选出所述候选蛋白质作为具有开解g-quadruplex结构的活性的物质。
发明效果
本发明的荧光发生核酸分子串联连接有支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列的荧光分子结合区，能够所连接的荧光分子结合区的数量依赖性地增强与配对的荧光分子结合时所产生的荧光的强度。因此，在本发明的荧光发生核酸分子中，充足数量的荧光分子结合区连接而成的荧光发生核酸分子可以用作活细胞中的mrna的可视化工具。
附图说明
图1是与dfhbi家族的荧光分子配对的荧光分子结合适体序列的示意图。
图2是示出实施例1中表达候选rna(rna#1～#17)的细胞的、dfhbi-1t荧光强度除以nls-irfp荧光强度得到的归一化荧光强度再除以表达rna#1(spinach)的细胞的平均归一化荧光强度得到的相对荧光强度的图。
图3是示出实施例1中表达候选rna(rna#14、#18、#19)的细胞的、dfhbi-1t荧光强度除以nls-irfp荧光强度得到的归一化荧光强度再除以表达rna#1(spinach)的细胞的平均归一化荧光强度得到的相对荧光强度的图。
图4是示出实施例2中dox处理后的romanesco及nls-irfp的荧光的定量结果与添加有romanesco的nls-irfp的mrna的表达量的定量结果的图。
图5是示出实施例2中actd处理后的romanesco及nls-irfp的荧光的定量结果与添加有romanesco的nls-irfp的mrna的表达量的定量结果的图。
图6是示出实施例2中mrna拷贝数与romanesco信号之间的线性单细胞分析结果的图。
图7是示出实施例2中各细胞通过落射荧光显微镜法得到的荧光信号与通过时间门flim得到的荧光信号的结果的图。
图8是实施例3中在dox及dfhbi-1t存在下所培养的romanesco表达细胞的发光状态的荧光图像(a)以及从发光状态的荧光图像中减去非发光状态的荧光图像而得到的dfhbi-1t荧光图像(b)。
图9是示出实施例4中分别过表达候选蛋白质a～c的romanesco表达细胞的绿色荧光强度的测定结果的图。
图10a是示出实施例5中的cd83标记细胞的cd83基因座(基因位点)的示意图。
图10b是实施例5中经时获取的经cd83的表面抗原刺激的cd83标记细胞的荧光图像。
具体实施方式
在本发明及本申请说明书中，“荧光分子结合适体”表示通过与特定的荧光分子结合显著增强由该荧光分子所发出的荧光的rna适体。“荧光分子结合适体序列”表示该rna适体的碱基序列。另外，“与荧光分子结合适体序列配对的荧光分子”表示通过与该rna适体结合显著增强所产生荧光的荧光分子。
<荧光发生核酸分子>
本发明的荧光发生核酸分子串联连接有2个以上的荧光分子结合区并且该荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。在本发明中，每个荧光分子结合区所含的荧光分子结合适体序列的数量可以是1个，也可以是2个。本发明的荧光发生核酸分子具有至少2个的荧光分子结合区，与每分子所结合的配对的荧光分子较多。因此，与每分子仅具备1个荧光分子结合区的荧光发生核酸分子相比，本发明的荧光发生核酸分子在荧光分子存在下所发出的荧光的强度较高。
本发明的荧光发生核酸分子所含的荧光分子结合区只要是2个以上即可，不受特别限定。每分子所含的荧光分子结合区的数量越多，每分子存在的荧光分子结合适体序列越多，因此，结合于该核酸分子的配对的荧光分子也变多。即，所连接的荧光分子结合区的数量依赖性地增强与配对的荧光分子结合时所产生的荧光的强度。当将本发明的荧光发生核酸分子用于标记活细胞内的rna等分子时，通过接头序列将适当数量的荧光分子结合区串联连接，以使每个荧光发生核酸分子所含的荧光分子结合适体序列的数量为4个以上，优选为8个以上，更优选为10个以上，进一步优选为12个以上。本发明的荧光发生核酸分子所含的荧光分子结合区的数量的上限值不受特别限定，但考虑到在活细胞内的稳定性等，每个荧光发生核酸分子所含的荧光分子结合区的数量优选为10个以下，更优选为8个以下。例如，经由接头序列串联连接6个荧光分子结合区(且其中各荧光分子结合适体序列含有2个荧光分子结合适体序列的荧光分子结合区)的荧光发生核酸分子在与配对的荧光分子结合时会产生充分强度的荧光，因此其适合活细胞内的分子、特别是mrna等rna的荧光标记。
本发明的荧光发生核酸分子所具有的荧光分子结合适体序列不受特别限定，能够根据所使用的荧光分子的种类适当选择。作为本发明的荧光发生核酸分子所含的荧光分子结合适体序列，优选为与dfhbi家族的低分子的荧光分子配对的荧光分子结合适体序列。作为“dfhbi家族的荧光分子”(以下，有时称为“dfhbi家族分子”)，除dfhbi之外，还可列举：dfhbi-1t((z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-2-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1h-咪唑-5(4h)-酮)、dfho(4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1-甲基-5-氧代-4,5-二氢-1h-咪唑-2-甲醛肟)等。
作为“与dfhbi家族分子配对的荧光分子结合适体序列”(以下，有时称为“dfhbi结合适体序列”)，例如，作为共有序列，可列举具有下述碱基序列的序列：通过4～6个碱基的茎结构和4个碱基的环结构来构成的茎环结构被g-quadruplex结构所夹持而成的结构的碱基序列。在该共有序列中，g-quadruplex结构部分以及末端茎的碱基序列不受特别限定。例如，能够将茎环结构的5’末端侧以及3’末端侧设为图1所示的碱基序列(茎环结构的5’末端侧：序列号1(5’-grwgarvggrhcgggucc-3’)、茎环结构的3’末端侧：序列号2(5’-gurygaguagagugugrrgcuc-3’))。图1中，“rw”表示a(腺嘌呤)或u(尿嘧啶)，“rv”表示a、c(胞嘧啶)或g(鸟嘌呤)，“rh”表示a、u或c，“ry”表示u或c，“rr”表示a或g。
所述共有序列中的茎环(stem-loop)结构部分的碱基序列不受特别限定，例如，作为由5个碱基的茎结构所构成的序列，可列举序列号3～5中任一项所表示的碱基序列，作为由6个碱基的茎结构所构成的序列，可列举序列号6或7所表示的碱基序列。作为本发明的荧光发生核酸分子中的荧光分子结合适体序列，优选茎环结构部分的碱基序列为序列号3或6所表示的碱基序列。
[表1]
作为具有所述共有序列的荧光分子结合适体序列，具体而言，可列举：spinach(babyspinach)(序列号8，非专利文献3)、optimizedspinach(序列号9，非专利文献6)、ispinach(序列号10，非专利文献7)、zt-324(序列号11，非专利文献8)、broccoli(序列号12，非专利文献4)、broccoli3(序列号13，非专利文献9)、dbroccoli(序列号14，非专利文献4)等。将各序列的示意图示于图1。
本发明中，荧光分子结合区通过支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列的单链核酸结构来构成。作为该支架序列，只要是插入有荧光分子结合适体序列时不会损害由该序列构成的单链rna的荧光发生功能并且能够用作支架(scaffolding)的单链rna的碱基序列，就不受特别限定。该支架序列可以是例如形成茎环结构的单链核酸分子的碱基序列。作为该支架序列，可列举例如：来自各种生物的trna、three-wayjunctionmotif或它们的改造体等。其中，优选作为来自phi29病毒的three-wayjunctionmotif的改造体的f30支架(f30scaffold)序列(序列号15，非专利文献10)。由f30支架序列构成的rna不会被细胞核酸酶识别，因此包含在f30支架序列的环结构部分插入有荧光分子结合适体序列的荧光分子结合区的荧光发生核酸分子在细胞内的稳定性非常高且优异。
能够通过例如将该茎环结构中的环结构部分取代为荧光分子结合适体序列来向形成茎环结构的支架序列插入荧光分子结合适体序列。当每个荧光分子结合区包含2个以上的荧光分子结合适体序列时，该荧光分子结合区例如通过如下结构来构成：该结构中，形成含有2个以上的环结构的茎环结构的单链核酸分子中的至少2个该环结构被取代为荧光分子结合适体序列。
作为本发明的荧光发生核酸分子所具有的荧光分子结合区，优选在f30支架序列中的环结构上的一处或两处插入有dfhbi结合适体序列的结合区，更优选在f30支架序列中的环结构上的一处或两处插入具备图1所示的共有序列的荧光分子结合适体序列的结合区。其中，从对于活细胞内的rna的检测灵敏度更加优异方面考虑，优选在f30支架序列中的环结构上的一处或两处插入有babyspinach、optimizedspinach、ispinach、zt-324、broccoli、broccoli3或dbroccoli的碱基序列的结合区，更优选在f30支架序列中的环结构上的一处插入有broccoli3的碱基序列的结合区(序列号16)或者在f30支架序列中的环结构上的两处插入有broccoli3的碱基序列的结合区(序列号17)，特别优选在f30支架序列中的两处的环结构上插入有broccoli3的碱基序列的结合区。表中，在所插入的broccoli3的碱基序列下画有下划线。需要说明的是，“在f30支架序列上插入了1个荧光分子结合适体序列的荧光分子结合适体序列”能够通过将序列号16的划线部分取代为荧光分子结合适体序列来制作。“在f30支架序列上插入了2个荧光分子结合适体序列的荧光分子结合适体序列”能够通过将序列号17的下划线部分取代为荧光分子结合适体序列来制作。
[表2]
本发明的荧光发生核酸分子包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列。作为接头序列，只要其不会损害荧光发生核酸分子中所含的荧光分子结合适体序列的荧光发生功能，就不受特别限定。例如，为了方便构建荧光发生核酸分子及对靶rna进行标记等，还可以包含限制酶序列等功能性序列。例如能够利用rna立体结构预测软件设计该接头序列以不会抑制荧光分子结合区内的荧光分子结合适体序列的立体结构的形成。作为rna立体结构预测软件，可列举例如：预测“mfold”(非专利文献13)等自由能最小的立体结构的软件。
将同种荧光分子彼此之间也会产生fret(
另外，若接头序列的长度过长，则荧光发生核酸分子中的多个荧光分子结合适体序列上所结合的荧光分子彼此的长度以及荧光发生核酸分子自身的长度会变得过长。因此，接头序列的长度优选100个碱基以下，更优选90个碱基以下，进一步优选80个碱基以下。
作为长度为20个碱基以上且由不易取得特定立体结构的碱基序列构成的接头序列，优选将在1个荧光分子结合区的上游(5’末端侧)及下游(3’末端侧)上连接有接头序列的rna序列作为评价用rna序列，以该评价用rna序列中的所述荧光分子结合区的立体结构的预测结果与仅由所述荧光分子结合区构成的rna序列的立体结构的预测结果相同并且预测所述接头序列部分不易取得立体结构的方式来设计所述接头序列。更详细而言，能够通过例如以下的方法来进行设计。首先，设计20个碱基长度、优选20～80个碱基长度的随机rna序列作为候选接头序列。接着，将所设计的候选接头序列连接于1个荧光分子结合区的上游及下游而成的rna序列作为评价用rna序列来进行设计，并预测该评价用rna序列的立体结构。单链rna的立体结构预测能够利用用于预测诸如“mfold”那样的自由能最小的立体结构的rna立体结构预测软件来进行。当通过预测评价用rna序列的立体结构，发现荧光分子结合区的立体结构的预测结果与仅由荧光分子结合区构成的rna序列的立体结构的预测结果相同并且预测该候选接头序列部分不会取得立体结构时，评价优选将该候选接头序列作为本发明的荧光发生核酸分子中的接头序列。与通过预测评价用rna序列的立体结构发现荧光分子结合区的立体结构的预测结果与仅由荧光分子结合区构成的rna序列的立体结构的预测结果不同的接头序列以及预测该候选接头序列部分会取得立体结构的接头序列相比，在荧光分子结合区的立体结构的预测结果与仅由荧光分子结合区构成的rna序列的立体结构的预测结果相同并且预测该候选接头序列部分不会取得立体结构的接头序列中，更不易产生因fret导致的荧光亮度的降低等。当得到多个评价为优选作为本发明的荧光发生核酸分子中的接头序列的候选接头序列时，能够将评价用rna序列的自由能更小者评价为更优选作为本发明的荧光发生核酸分子中的接头序列。更优选将评价用rna序列中的荧光分子结合区的立体结构的预测结果与仅由该荧光分子结合区构成的rna序列的立体结构的预测结果相同并且预测候选接头序列部分不会取得立体结构的候选接头序列作为接头序列来设计荧光发生核酸分子。
候选接头序列能够使用例如augc的四种rna并通过制作randbetween函数等随机字符串时所使用的常用方法来进行设计。另外，为了方便合成荧光发生核酸分子，也可以将在随机碱基序列中整合有限制性酶切位点等功能序列的序列作为候选接头序列。
当本发明的荧光发生核酸分子中的荧光分子结合区是在f30支架序列中的环结构上的一处或两处插入有babyspinach、optimizedspinach、ispinach、zt-324、broccoli、broccoli3或dbroccoli的碱基序列的结合区时，作为用于连接该荧光分子结合区彼此的接头序列，优选为25～75个碱基长度的碱基序列，更优选为30～70个碱基长度的碱基序列，更进一步优选为在30～70个碱基长度的中央附近包含限制酶识别序列的随机序列。其中，当荧光分子结合区为在f30支架序列中的环结构上的一处或两处插入有broccoli3的碱基序列的结合区时，作为用于连接该荧光分子结合区彼此的接头序列，优选序列号18、29～31(均为30个碱基长度)、序列号19、32～34(均为44个碱基长度)、或序列号20、35～37(均为66个碱基长度)所表示的碱基序列，更优选序列号18(30个碱基长度)，序列号19(44个碱基长度)或者序列号20(66个碱基长度)所表示的碱基序列，特别优选序列号16所表示的碱基序列。
[表3]
本发明的荧光发生核酸分子是单链结构的rna分子。作为构成本发明的荧光发生核酸分子的rna，既可以是构成分子的全部rna为天然核苷酸也可以是构成分子的一部分或全部rna为与天然核苷酸一样可以形成核苷酸链或碱基对的核酸类似物。作为核酸类似物，可列举例如：bridgednucleicacid(bna)、天然核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸或hexitolnucleicacid(hna)、肽核酸(pna)等。另外，构成本发明的荧光发生核酸分子的rna中的一部分也可以是dna。
除荧光分子结合区彼此通过接头序列连接而成的区域以外，只要不会损害该区域的荧光发生功能，则本发明的荧光发生核酸分子也可以具有其它区域。作为该其它区域，可列举例如：与除了配对的荧光分子以外的物质进行相互作用的区域等。另外，本发明的荧光发生核酸分子也可以直接或经由适当的接头与通过配对的荧光分子进行荧光标记的物质连接。
本发明的荧光发生核酸分子通过与配对的荧光分子结合而产生较强的荧光。因此，本发明的荧光发生核酸分子能够用于以生物分子为主的各种物质的荧光标记。具体而言，在待荧光标记的分子(靶分子)上直接或间接地结合本发明的荧光发生核酸分子之后，使其与配对的荧光分子结合。
<靶rna的荧光标记方法>
通过使本发明的荧光发生核酸分子直接或间接地结合于靶rna(待荧光标记的rna)，能够对该靶rna进行荧光标记。具体而言，使本发明的荧光发生核酸分子直接或间接地连接于靶rna之后，使其与该荧光发生核酸分子中的荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子接触。该荧光标记方法可以将细胞内的rna作为靶rna，也可以将细胞外的rna作为靶rna。
当将靶基因的转录产物作为靶rna时，优选使本发明的荧光发生核酸分子结合于靶基因的转录产物。例如，在靶基因的3’非翻译区内整合本发明的荧光发生核酸分子。由此，靶基因在其3’末端侧添加有本发明的荧光发生核酸分子的状态下被转录，因此，得到的转录产物能够通过配对的荧光分子来进行荧光标记。具体而言，向靶基因的3’非翻译区内整合有编码本发明的荧光发生核酸分子的碱基序列的细胞的细胞内，导入该荧光发生核酸分子中的荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子，并使靶基因的转录产物与该荧光分子结合。也可以通过在靶基因的3’非翻译区内直接整合本发明的荧光发生核酸分子，在细胞内进行基因表达时，从转录开始至翻译、然后分解期间，通过荧光使靶基因的mrna可视化，并实时检测，从而定量细胞内的靶基因的表达量。特别是，由于本发明的荧光发生核酸分子的荧光发生能力高，会产生很强的荧光信号，因此，也可以通过显微镜图像分析来实时分析经荧光发生核酸分子标记的mrna在细胞内的定位。
当靶基因为内源基因时，向染色体中的靶基因区域上的3’非翻译区插入编码本发明的荧光发生核酸分子的dna片段。该dna片段的插入能够使用基因组编辑法等该技术领域中公知的各种基因改造技术并通过常规方法来进行。
当使外源基因导入细胞并进行表达时，通常，将整合有用于表达外源基因的表达盒(表达组件)的载体导入细胞内。表达盒是指外源基因表达所需的dna片段，至少包含该基因的编码区以及控制该基因的表达的启动子，此外，还优选包含5’非翻译区、3’非翻译区以及终止子。
当靶基因为外源基因时，预先向靶基因的表达盒中的3’非翻译区插入编码本发明的荧光发生核酸分子的dna片段。通过将在3’非翻译区插入有本发明的荧光发生核酸分子的表达盒导入细胞中，靶基因在3’末端侧添加有本发明的荧光发生核酸分子的状态下被转录。靶基因的表达盒可以导入细胞的细胞核外，也可以整合在细胞核内的染色体中。靶基因的表达盒能够通过在该技术领域中公知的表达盒中整合靶基因的编码区来制作。靶基因的表达盒能够通过脂质体转染法、电穿孔法、同源重组法等该技术领域中公知的各种基因重组技术并通过常规方法来向细胞导入。
另外，通常，整合有外源基因的表达盒的载体由代替外源基因的编码区而包含限制性酶切位点的克隆载体来制作。具体而言，该克隆载体具有：控制外源基因的表达的启动子，位于该启动子的下游且用于插入外源基因的编码区的限制性酶切位点，以及位于该限制性酶切位点的下游的3’非翻译区。通过在该克隆载体中的限制性酶切位点上整合由外源基因的编码区构成的dna片段，得到外源基因的表达用载体。
在该克隆载体的3’非翻译区上预先整合有编码本发明的荧光发生核酸分子的碱基序列而成的载体能够用于获得3’末端侧添加有荧光发生核酸分子的转录产物。通过在该载体的限制性酶切位点上整合靶基因的编码区的dna片段，能够制作靶基因表达用载体，该靶基因表达用载体用于获得靶基因在3’末端侧添加有本发明的荧光发生核酸分子的状态下被转录的细胞。该载体能够通过例如在用于插入靶基因的编码区的dna片段来制作靶基因表达用载体的市售表达载体的3’非翻译区内整合编码本发明的荧光发生核酸分子的碱基序列来制作。
靶rna的荧光标记也可以通过使用末端直接或间接地连接有与靶rna的一部分杂交的探针的荧光发生核酸分子来进行。该探针的设计、合成以及与荧光发生核酸分子的末端的结合能够通过常规方法来进行。在含有靶rna的试样中混合：连接有该探针的荧光发生核酸分子，以及与该荧光发生核酸分子中的荧光分子结合适体序列配对的荧光分子。由此，靶rna被该荧光分子标记。
babyspinach等dfhbi家族分子光依赖性地产生结构变化。结构变化后的荧光分子不会与由dfhbi结合适体序列构成的单链rna结合。因此，若向dfhbi家族分子与包含dfhbi结合适体序列的荧光发生核酸分子结合而成的复合体照射光，则最初会发出荧光，但dfhbi家族分子会因结构变化而从dfhbi结合适体序列上脱离，从而变得不再发出荧光；若中断光照射，则结构再次变化，dfhbi家族分子与荧光发生核酸分子重新结合，进而荧光复活(非专利文献17)。利用该光依赖性的结构变化，能够提高从与dfhbi家族分子结合的荧光发生核酸分子检测到的荧光信号的s/n比(信噪比)。
具体而言，检测从在dfhbi家族分子与配对的荧光发生核酸分子结合而发出荧光的状态(发光状态)下所获取的荧光信号的亮度值(强度值)中减去dfhbi家族分子从荧光发生核酸分子上脱离而不发出荧光的状态(非发光状态)下所获取的荧光信号的亮度值而得到的值，并将其作为从与配对的荧光发生核酸分子结合的dfhbi家族分子所发出的荧光信号。dfhbi家族分子在非发光状态下所获取的荧光信号中表现出背景荧光或内源荧光等dfhbi家族分子以外的物质所发出的信号(噪音)。因而，通过从发光状态下的亮度值中减去非发光状态下的亮度值，dfhbi家族分子所发出的荧光信号的s/n比提高。
发光状态的荧光信号和非发光状态的荧光信号能够通过例如向与配对的荧光发生核酸分子结合的dfhbi家族分子连续照射该荧光分子的激发光(可以激发该荧光分子使其产生荧光的波长的光)来获取，其中，连续照射时间为足以引发使其从发光状态变为非发光状态的结构变化的时长以上。激发光的连续照射的照射开始时间点的荧光信号相当于发光状态的荧光信号，照射结束时间点的荧光信号相当于非发光状态的荧光信号。激发光的连续照射时间能够根据dfhbi家族分子的种类适当设置，例如设为10～30毫秒。即，使dfhbi家族分子结合于包含dfhbi结合适体序列的荧光发生核酸分子之后，连续照射该dfhbi家族分子的激发光一定时间，检测从照射开始时间点的荧光信号的亮度值中减去照射结束时间点的荧光信号的亮度值而得到的亮度值，并将其作为与该荧光发生核酸分子结合的dfhbi家族分子所发出的荧光信号。
若中断光照射，则dfhbi家族分子的结构再次变化，dfhbi家族分子与荧光发生核酸分子中的dfhbi结合适体序列重新结合，进而荧光复活。因而，例如，在照射充分时间的激发光而获取了发光状态的荧光信号与非发光状态的荧光信号之后，中断光照射一定时段，由此使dfhbi家族分子的结构变化，使dfhbi家族分子与荧光发生核酸分子中的dfhbi结合适体序列重新结合。激发光的照射中断时间能够根据dfhbi家族分子的种类适当设置，例如能够设为5～20秒。
避光并中断激发光的照射之后，在使dfhbi家族分子与荧光发生核酸分子中的dfhbi结合适体序列重新结合的状态下再次照射激发光，由此，针对相同样品能够再次获得发光状态的荧光信号和非发光状态的荧光信号。通过重复激发光的连续照射及随后的非照射时间，能够多次获得相同样品的发光状态的荧光信号及非发光状态的荧光信号，通过将各个荧光信号平均化，能够进一步提高dfhbi家族分子所发出的荧光信号的检测精度。
具体而言，按照向与dfhbi家族的荧光分子结合的配对的荧光发生核酸分子连续照射所述激发光一定时间之后中断一定时间这一照射循环反复照射多次。每个照射循环均检测连续照射时的照射开始时间点的荧光信号和照射结束时间点的荧光信号。通过将全部照射循环中检测到的连续照射时的照射开始时间点的荧光信号的亮度值平均化，能够提高照射开始时间点的荧光信号(即发光状态的荧光信号)的检测精度。同样地，通过将全部照射循环中检测到的连续照射时的照射结束时间点的荧光信号的亮度值平均化，能够提高照射结束时间点的荧光信号(即非发光状态的荧光信号)的检测精度。检测从平均化后的照射开始时间点的荧光信号的亮度值中减去平均化后的照射结束时间点的荧光信号的亮度值而得到的值，并将其作为与荧光发生核酸分子结合后的dfhbi家族分子的荧光信号。
<针对荧光分子与配对的荧光发生核酸分子的结合进行抑制的物质筛选方法>
能够将通过荧光分子与配对的荧光发生核酸分子结合而产生的荧光信号作为指标来筛选抑制两者结合的抑制物质。通过使存在荧光分子和配对的荧光发生核酸分子的反应体系中共存抑制物质的候选物质来测定荧光分子所发出的荧光信号，并比较在该候选物质不存在的情况下与荧光发生核酸分子结合的荧光分子所发出的荧光信号。当候选物质共存下的荧光分子所发出的荧光信号的亮度值小于该候选物质不存在的情况下的荧光信号的亮度值时，该候选物质被选作抑制荧光分子与配对的荧光发生核酸分子的结合的抑制物质。
例如，当候选物质为蛋白质时，向表达作为单链rna的荧光发生核酸分子的细胞中导入并表达编码候选物质的基因。向表达候选物质基因的细胞和不表达该基因的细胞中掺入荧光分子，并检测荧光信号。当表达候选物质基因的细胞的荧光信号小于不表达候选物质基因的细胞的荧光信号时，该候选物质被选作抑制荧光分子与配对的荧光发生核酸分子的结合的抑制物质。各细胞的荧光信号能够由向细胞照射激发光而获取的荧光图像来求得。
例如，dfhbi结合适体序列形成以g-quadruplex结构所夹持的茎环结构，并通过利用该g-quadruplex结构夹持dfhbi家族分子来发出荧光(非专利文献18)。若开解(unfold)该g-quadruplex结构，则不能再与dfhbi家族分子结合，荧光消失。一般认为真核细胞中存在开解g-quadruplex结构的酶(g4resolvase)，但尚未鉴定(非专利文献19)。
因而，向表达包含dfhbi结合适体序列的荧光发生核酸分子的基因重组细胞中进一步导入并表达编码g4resolvase的候选蛋白质的基因。向共表达包含dfhbi结合适体序列的荧光发生核酸分子和候选蛋白质基因的细胞中导入dfhbi家族分子并测定荧光信号，当得到的亮度值小于向仅表达包含dfhbi结合适体序列的荧光发生核酸分子的细胞中导入dfhbi家族分子而得到的荧光信号时，该候选蛋白质被选作具有g4resolvase活性的物质。作为包含dfhbi家族分子和dfhbi结合适体序列的荧光发生核酸分子，可以用于g4resolvase的基因全面鉴定。
实施例
接着，通过实施例等对本发明进行更详细说明，但本发明不受这些例子限定。
<质粒>
以下的实验中使用的质粒如下制作。
向pegfp-n1(clontech公司制造)的nhei/noti位点进行融合并亚克隆3×nls(lvpkkkrkvvpkkkrkvvpkkkrkvfegpdppv：序列号21)及irfp713(下面简称“irfp”，来自松田道幸先生的亲切赠送，非专利文献11)的编码序列，从而得到pnls-irfp。为了筛选dfhbi家族分子的配对的荧光发生rna的候选(候选rna)，由pav5s-f30-2×dbroccoli(#66845，addgene公司制造)进行pcr扩增得到f30-2×dbroccoli。其它的rna通过合成寡核苷酸片段来构建。使用in-fusion(clontech公司制造)，将这些寡核苷酸片段亚克隆至pnls-irfp的noti位点。以仅回收noti位点的3'侧的方式设计用于in-fusion的引物。将单片段反复插入noti位点，由此构建rna片段的串联重复(tandemrepeat)。筛选之后，将观察到最高荧光发生效果的候选rna“romanesco”(rna#14)进行pcr扩增，并亚克隆至pbluescriptiisk(+)(stratagene公司制造)的多克隆位点。
针对强力霉素(dox)诱导性romanesco表达，将来自padenox-tet3g(clontech公司制造)的tre3g启动子、nls-irfp编码序列以及romanesco序列融合，并亚克隆至包含tol2识别序列、chs4绝缘子以及嘌呤霉素抗性基因表达盒的pt2-mcs-pgk-puro载体(非专利文献12)，从而得到pt2-tre3g-nls-irfp-romanesco。
<细胞培养及转染>
在下面的实验中，只要没有特别记载，则细胞培养及转染如下进行。
在添加有10％fbs、1mm丙酮酸钠及1％青霉素/链霉素的dmem(和光纯药株式会社制造)中，于37℃、5％co2下培养hek293t、mcf-7及u2os细胞。向细胞的转染使用转染试剂(产品名为“x-tremegenhpdna”，roche公司制造)按照生产厂家的指示进行。在制成图像之前，将细胞重新接种至经matrigel(bdbioscience公司制造)涂布的玻璃底培养皿(mattek公司制造)，以进行显微镜分析。
[参考例1]
f30-2×dbroccoli(在f30支架序列中的环结构上的两处插入dbroccoli的碱基序列而成，序列号22)被认为是broccoli突变体中荧光强度最高的。因而，首先，为了调查该f30-2×dbroccoli是否能够使人细胞内的rna聚合酶ii(polii)依赖性mrna可视化，在rna聚合酶ii依赖性的cmv启动子的下游，使用在dfhbi-1t存在下发出绿色荧光的f30-2×dbroccoli与nls-irfp(细胞核核定位的红外荧光蛋白质irfp)一同在hek293t细胞中表达。具体而言，将质粒载体(pnls-irfp-#0)转染至hek293t细胞，并向培养用培养基中添加dfhbi-1t进行培养，其中，该质粒载体(pnls-irfp-#0)是向表达nls-irfp的pnls-irfp的3’非翻译区内整合f30-2×dbroccoli而成的。
其结果，导入有pnls-irfp-#0的nls-irfp阳性细胞几乎不显示可检测的绿色荧光。即，现有的荧光分子结合适体不能使人细胞内的mrna可视化。
接下来，在pnls-irfp的3’非翻译区内整合f30-2×dbroccoli直接串联连接而成的序列，将由此得到的质粒载体转染至hek293t细胞，同样添加dfhbi-1t并培养。其结果，随着f30-2×dbroccoli的重复数量增多，发现观察到显著的绿色荧光的细胞增加的趋势。该结果表明，通过优化荧光分子结合适体，能够改善dfhbi家族分子的荧光强度以足以使细胞内的rna可视化。
[实施例1]
筛选与dfhbi家族分子配对的荧光发生rna即能够通过与dfhbi家族分子结合而改善所产生的荧光强度的荧光发生rna。
如图1所示，spinach及broccoli等公知的荧光分子结合适体的序列均类似，由末端茎(terminalstem)、g-quadruplex、茎环(stem-loop)、连接体(connector)构成。这些链段通过spinach的结晶结构以及与其它荧光分子结合适体之间的碱基序列比对来确定。
末端茎中显示spinach突变体中所含的双链-四链过渡区的a:g嘌呤-嘌呤错配以及c-gwatson-click碱基对较大地影响细胞环境中的适体亮度(非专利文献9)。因而，将gagac-ggcuc用于末端茎序列。
下面来观察g-quadruplex，可知除了spinach和dbroccoli包含g-quadruplex的后半的第三个位置上的u的特征性的1个碱基取代c之外，这些序列中几乎未发现变化。因而，我们采用了来自broccoli和dbroccoli的序列(ggucgggucc-gucgaguagagugug)或来自broccoli3的序列(ggucgggucc-guugaguagagugug)作为g-quadruplex。
作为茎环，简单而言，broccoli使用来自broccoli的茎环，broccoli3的g-quadruplex使用dbroccolig的quadruplex和broccoli3的茎环。此外，还使用了包含broccoli3的g-quadruplex、6bp(碱基对长度)的茎以及4nt(碱基长度)的ispinach茎环的嵌合体。
有报道称f30支架会增强荧光分子结合适体对于哺乳动物细胞中的dfhbi家族的荧光发生能力(非专利文献10)。因而，为了进行比较，构建具有f30支架序列的候选rna和不具有f30支架序列的候选rna。
通过将f30-2×dbroccoli串联连接能够改善所产生的荧光强度(参考例1)，因此，以经由接头序列将整合在支架序列(f30支架序列)中的荧光分子结合适体序列串联连接的方式构建荧光发生rna，并通过该整合在支架序列中的荧光分子结合适体序列的串联重复数量来尝试优化荧光发生rna。为了尽可能减小荧光发生rna并避免重组的情况，串联重复序列的数量设置为6以下。需要说明的是，下面所设计并合成的包含6次重复的“romanesco”(rna#14)在细菌细胞和哺乳动物细胞两者的研究中均未引起重组(未示出数据)。
在整合至支架序列的荧光分子结合适体序列彼此之间插入30、44或66个碱基长度的接头序列。使用rna立体结构预测软件“mfold”优化接头序列，以防止阻碍f30支架及荧光分子结合适体的二级结构。
接头序列具体如下设置。首先，设计以除了与限制性酶切位点对应的6个碱基之外的区域的序列作为由augc的四种rna构成的随机序列的候选接头序列。由augc的四种rna构成的随机序列使用电子制表软件“microsoftexcel”的randbetween函数进行设计。
接下来，针对所设计的各候选接头序列，设计在f30-2×dbroccoli序列的上游和下游连接有候选接头序列而成的评价用rna序列(候选接头序列-f30-2×dbroccoli序列-候选接头序列)，并预测其立体结构。访问rna立体结构预测软件“mfold”([online]http://unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/rna-folding-form)，输入得到的评价用rna序列，将“enterthemaximumdistancebetweenpairedbasesifyouwish”设置为150，其它参数保持初始值不变，点击“foldrna”，从而预测立体结构。需要说明的是，将“enterthemaximumdistancebetweenpairedbasesifyouwish”设置为150是为了防止接头序列之间的碱基配对(basepairing)。
针对通过“mfold”所预测出的立体结构确认：f30-2×dbroccoli序列的立体结构是否未被候选接头序列抑制，以及该候选接头序列是否是柔性区域。具体而言，确认f30-2×dbroccoli序列部分的立体结构是否与仅由f30-2×dbroccoli序列所预测的立体结构相同。当两者的立体结构不同时，则预测f30-2×dbroccoli序列的立体结构会被该候选接头序列抑制。另外，当未预测到候选接头序列部分的特定的立体结构时，则预测该候选接头序列为柔性区域。
在候选接头序列中，选出通过“mfold”预测出的评价用rna序列的立体结构以及f30-2×dbroccoli序列部分的立体结构与仅由f30-2×dbroccoli序列预测的立体结构相同并且未预测到候选接头序列部分有特定立体结构的序列，作为接头序列。最终选出表3中记载的序列作为接头序列。在各种碱基长度中，使用自由能(δg)最小的序列号18、19以及20的接头序列来合成后面的候选rna。需要说明的是，例如对于表4中记载的序列而言预测到候选接头序列部分取得立体结构，或者预测到f30-2×dbroccoli序列部分的立体结构受到接头序列部分的影响而产生变化，因此评价表3中记载的序列优选作为接头序列。
[表4]
首先，设计17个候选rna(rna#1～17)。rna#1是仅由broccoli(序列号12)构成的rna。rna#2是由1个在f30支架序列上插入有2个broccoli的荧光分子结合适体序列构成的rna。rna#3～rna#5分别是通过2、4或6、44个碱基长度的接头序列(序列号19)连接有在f30支架序列上插入有2个broccoli的荧光分子结合适体序列的rna。rna#6是不经由接头序列而直接串联连接有12个仅由broccoli构成的rna(序列号12)的rna。rna#7～rna#9分别是通过2、4、或6、44个碱基长度的接头序列(序列号19)连接有在f30支架序列上插入有2个dbroccoli(序列号14)的荧光分子结合适体序列的rna。rna#10是仅由broccoli3(序列号13)构成的rna。rna#11是由1个在f30支架序列上插入有2个broccoli3的荧光分子结合适体序列构成的rna。rna#12～rna#14分别是通过2、4或6、44个碱基长度的接头序列(序列号19)连接有在f30支架序列上插入有2个broccoli3的荧光分子结合适体序列的rna。rna#15是将rna#14中的broccoli3的茎环区域取代为序列号6所表示的碱基序列而成的rna。rna#16是不经由接头序列而直接串联连接有12个仅由broccoli3构成的rna(序列号13)的rna。rna#17是将rna#16中的broccoli3的茎环区域取代为序列号6所表示的碱基序列而成的rna。
将所设计的17个候选rna(rna#1～17)与pnls-irfp-#0同样地整合至pnls-irfp的3’非翻译区，从而制作pnls-irfp-#1～17。将所制作的质粒转染至hek293t细胞并使其表达，使用现有的激光扫描共聚焦显微镜在dfhbi-1t存在下测定nls-irfp阳性细胞的绿色荧光强度，由此评价其荧光发生性能。
具体而言，将转染了与参考例1同样地制作的质粒后的hek293t细胞接种在玻璃底培养皿上进行培养。使用具备油浸物镜(产品名为“planfluor40×/1.30(nikon公司制造)的共聚焦显微镜(产品名为“a1r”，nikon公司制造)对转染24小时后的细胞进行拍摄。针对细胞使用488nm激光束(mellesgriot，0.5μw)及640nm激光束(coherent，3μw)分别激发候选荧光发生rna及nls-irfp。共聚焦显微镜的扫描是在2倍的倍率下以可能的最高速度沿双向进行扫描，针孔闭合至100μm。对于各视场获取距离1μm的7张图像的堆叠物的z剖面。在成像期间，将dfhbi-1t(tocris公司制造)添加于l-15培养基(thermofisherscientific公司制造)，使其最终浓度为20μm。在室温下进行实验。
使用图像解析软件(产品名为“fiji”，nih制)分析所获取的图像。图像首先转换为32位的浮点图像。对于各视场，按如下方式计算通过488nm激光及640nm激光所诱发的细胞荧光强度。首先，针对全部的z剖面获得488nm信道及640nm信道的平均投影。接着，将主要由nls-irfp信号构成的640nm信道的平均图像通过使用otsu法的自动阈值处理转换为二值图像，应用通过fiji软件实施的功能(“fillholes”、“watershed”及“analyzeparticles”)，得到细胞核感兴趣区域(regionsofinterest：roi)。细胞roi通过将细胞核roi扩大10像素(1像素＝311nm)来定义。最后，测定细胞核roi的平均值，得到640nm信道的荧光强度，并测定细胞roi的平均值，以得到488nm信道的荧光强度。针对各信道还测定了相邻的未转染的细胞的荧光强度，并作为背景减去它们的平均值。以上处理之后，针对每个细胞得到通过候选rna由dfhbi-1t所产生的荧光的强度和nls-irfp的荧光强度的值。需要说明的是，下面，有时将“通过荧光发生rna由dfhbi家族的荧光分子所产生的荧光”称为“荧光发生rna的荧光”。
图2是示出分别表达候选rna(rna#1～17)的细胞的、候选rna的荧光强度除以nls-irfp荧光强度得到的归一化荧光强度再除以表达rna#1(spinach)的细胞的平均归一化荧光强度而得到的相对荧光强度的图。表达候选rna的细胞的dfhbi-1t荧光的检测界限通过计算未表达候选rna的细胞的荧光强度的平均值±3sd来确定。其中仅对表达nls-irfp的细胞进行。图中，误差条表示s.e.m.(均值的标准误差)。使rna#1～17表达的细胞的n数分别为55、310、255、217、360、316、299、212、271、282、216、401、343、229、217、150以及244。
如图2所示，经由接头序列串联连接有荧光分子结合适体序列的候选rna(rna#2～9、11～17)均显示出比仅有1个荧光分子结合适体序列的现有的荧光分子结合适体(rna#1及#10)更高的荧光发生性能。
如表达rna#1～#5的细胞的结果、表达rna#7～#9的细胞的结果以及表达rna#10～#14的细胞的结果所示，若串联连接的荧光分子结合适体序列的数量增加，则由配对的荧光分子产生的荧光更加明亮。另外，荧光分子结合适体序列为broccoli3的候选rna的荧光发生效果比荧光分子结合适体序列为broccoli或dbroccoli的候选rna更为优异。另外，如表达rna#5～#6的细胞的结果以及表达rna#14和#16的细胞的结果所示，支架序列是实现更高荧光发生性能不可或缺的。另外，比较表达rna#14和#15的细胞的结果发现，若将荧光分子结合适体序列中的茎环结构由5bp的茎结构变更为6bp的茎结构，则荧光发生性能显著降低。在表达其它候选rna的细胞中，表达rna#14的细胞显示出最明亮的荧光，亮度是表达rna#1的细胞的300倍以上。
针对rna#14，为了调查接头序列的长度对于荧光发生性能的影响，设计将rna#14中的44个碱基长度的接头序列(序列号19)改为30个碱基长度的接头序列(序列号18)而成的rna#18、将rna#14中的44个碱基长度的接头序列(序列号19)改为66个碱基长度的接头序列(序列号20)而成的rna#19，并同样地调查荧光发生性能。将结果示于图3。图中，误差条表示s.e.m.(分别地n＝94、68或57)。进行kruskal-wallis试验(p<0.001)之后，接着进行steel-dwass试验(**：p<0.01，n.s.：p>0.05)。其结果，rna#18和rna#19均与rna#14相同而显示出高于现有rna#1的荧光发生性能。在这三个候选rna中，rna#14的荧光发生性能最为良好。
将可以实现活的哺乳动物细胞的mrna的可视化rna#14命名为“romanesco”，并用于后面的实验。
[实施例2]
确认实施例1中制作的romanesco可以实现活细胞内的mrna的定量测定。
dfhbi家族分子与以romanesco为主配对的荧光分子结合适体进行结合后才会开始产生充分的荧光强度。因此，来自细胞的dfhbi家族的荧光的总强度直接反映包含romanesco在内的mrna的表达量。即，通过利用romanesco修饰靶基因的mrna，能够基于dfhbi家族的荧光强度来定量评价该靶基因的表达量。
使经romanesco修饰的靶基因的mrna在强力霉素(dox)诱导性启动子的控制下表达，并在dfhbi家族的存在下将该细胞的romanesco的荧光信号的变化与该靶基因的mrna合成一同进行监测。
<mrna合成及分解的动态的图像化>
向作为报告细胞(reportercell)的hek293t细胞中转染pt2-tre3g-nls-irfp-romanesco，并使用具有表达nls-irfp及romanesco的报告基因的细胞。
为了对转录激活期间的romanesco进行经时成像，在dox诱导性启动子的控制下将报告细胞在含有4mm的l-谷氨酰胺、10％fbs、1mm丙酮酸钠、1％青霉素/链霉素以及20μmdfhbi-1t的d-mem(无酚红，和光纯药株式会社制造)中培养。细胞的图像是通过共聚焦显微镜a1r，使用油浸物镜planfluor40×/1.30，在37℃、5％co2下拍摄的。将最终浓度为1μg/ml的dox(clontech公司制造)添加在培养基中以诱导转录，使用488nm激光束(0.5μw)及640nm激光束(3μw)分别激发romanesco及nls-irfp。扫描是在2倍的倍率下以可能的最高速度进行双向扫描，针孔被闭合至100μm。对于各视场，历时8小时每隔10分钟获得间隔1μm的13张图像的层叠体作为z剖面。
为了对转录未激活期间的romanesco进行经时成像，将报告细胞在1μg/mldox存在下孵育12小时，与上述同样地用于成像之后，加入最终浓度为5μg/mlactd从而抑制了转录。
处理所获取的图像，并与实施例1同样地测定各细胞的荧光强度。将得到的romanesco及nls-irfp的荧光强度归一化，以使dox添加后8小时之际的平均荧光强度为1，actd添加后0小时之际的平均荧光强度为1。
<通过rt-qpcr确定romanesco标记mrna表达水平>
为了对转录激活期间报告细胞中的romanesco标记mrna合成的动态进行分析，将稳定地表达dox诱导性报告基因的hek293t细胞接种在24孔板上，用最终浓度为1μg/mldox进行处理，针对添加dox后0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6以及8小时后的细胞，从各孔中回收。为了分析转录未激活期间的mrna分解动态，将稳定表达dox诱导性报告基因的hek293细胞接种于24孔板，用最终浓度1μg/mldox处理12小时，接着用最终浓度5μg/mlactd处理，针对添加actd后0、1、2、3、4、5以及6小时后的细胞，从各孔中回收。
接下来，降解细胞，使用fastgenerna高级试剂盒(nippongenetics公司制造)纯化rna。逆转录得到的rna，使用onestepsybrprimescriptplusrt-pcr试剂盒(takara公司制造)，通过利用cfx96系统(bio-rad公司制造)的实时pcr进行定量。逆转录及pcr反应在以下的条件下实施：按照42℃下5分钟、95℃下10秒、接着在95℃下10秒以及60℃下30秒的循环，进行50次循环。
通过按照生产厂家的流程进行解离曲线分析来调查扩增子的特异性。为了分析报告mrna的表达水平，使用扩增nls-irfp的编码序列的pcr引物组(正向引物：5’-ccaatccacattccaggagctatc-3’(序列号23)、反向引物：5’-ctttcgcattgtgaagccgac-3’(序列号24))。这是因为romanesco在romanesco序列内具有多个重复。另外，针对经dox处理的样品，将pgk1基因选作内标。这是因为，pgk1的表达水平不会受dox处理的影响，另外，用于pgk1扩增的引物组(正向引物：5’-tggacgttaaagggaagcggg-3’(序列号25)、反向引物：5’-ggctcataaggactaccgacttggc-3’(序列号26))的扩增效率与用于nls-irfp的引物组的扩增效率相当(图中未示出数据)。而作为经actd处理的样品，将18s核糖体rna选作内标。这是因为，18s核糖体rna的表达水平不会受actd处理的影响，另外，用于18s核糖体rna扩增的引物组(正向引物：5’-cggctaccacatccaaggaag-3’(序列号27)、反向引物：5’-tttttcgtcactacctccccg-3’(序列号28))的扩增效率与用于nls-irfp的引物组的扩增效率相当(图中为示出数据)。
实验通过三次生物学重复来进行，在各次生物学重复中，对各引物组实施三次rt-qpcr分析。使用δδcq法确定报告mrna的相对表达水平。得到的值进一步归一化，以使dox处理样品中dox添加8小时后的平均表达量为1，actd处理样品中添加actd后0小时之际的平均表达量为1。
图4中示出dox处理后的romanesco及nls-irfp的荧光(分别为绿色及品红色系统)的定量结果以及通过rt-qpcr测得的添加有romanesco的nls-irfp的mrna的表达量(黑点)的定量结果。romanesco及nls-irfp的荧光的定量的结果为n＝66细胞。rt-qpcr通过三次生物学重复来进行。图中，点区域及斜线区域表示平均值±s.e.m。比较romanesco及nls-irfp的荧光动态与mrna表达量的动态可知，romanesco荧光信号以及romanesco的荧光动态完全依据mrna合成的动态，dox添加后立刻快速增加。而nls-irfp的荧光信号则延迟。
图5中示出了actd处理后的romanesco及nls-irfp的荧光的定量结果以及通过rt-qpcr测得的添加有romanesco的nls-irfp的mrna的表达量(黑点)的定量结果。图中，点区域及斜线区域表示平均值±s.e.m。romanesco及nls-irfp的荧光的定量的结果为n＝67细胞。rt-qpcr通过三次生物学重复进行。当转录被actd处理灭活时，nls-irfp荧光信号持续，但romanesco荧光信号反映mrna分解动态并快速减少。这些结果表明，通过监测romanesco的荧光能够对活细胞内的mrna合成及分解进行定量测定。
<mrna拷贝数与romanesco信号之间的线性单细胞分析>
进一步调查romanesco信号是否能够线性反映各单细胞的mrna的拷贝数。具体而言，首先，通过现有的落射荧光显微镜法将表达romanesco的细胞图像化以确定romanesco信号，接着用于单细胞rt-qpcr实验，并针对各单细胞分析所表达的mrna分子的拷贝数。将结果示于图6。图中，虚线表示与检测界限相对应的背景信号的平均值±3sd(n＝63细胞)。实线表示对于对数变换得到的数据的线性回归。作为其结果，在103～3×105分子(r2＝0.87)的范围内，mrna拷贝数与romanesco信号之间确认到较高的线性相关。
<时间依赖型flim>
所述单细胞分析表明，具有低于5.4×103的romanesco分子的细胞不能通过现有的显微镜进行视觉化。因而，为了观察时间依赖型flim是否能够更敏感地使romanesco表达视觉化，通过现有的落射荧光显微镜法及时间门flim两者对具有低拷贝数的romanesco的细胞进行观察，以比较荧光信号。
将各细胞通过落射荧光显微镜法得到的荧光信号及通过时间门flim得到的荧光信号的结果示于图7。各荧光信号将值归一化，以使与各显微镜(虚线)的检测界限对应的荧光强度为1。如图7所示，在现有的显微镜法中显示检测界限以下的荧光的细胞大部分在时间依赖型flim中显示显著的荧光(17个细胞中的13个细胞)。即，时间依赖型flim大幅度提高了检测灵敏度，表达接近内源基因的mrna水平的1.4×103分子的细胞得以成功视觉化。这些结果表明，romanesco能够在大范围的表达水平下定量求取特定的mrna的细胞内含量，从而能够用于转录活性的动态的解析。
[实施例3]
将向实施例2中制作的hek293细胞中转染pt2-tre3g-nls-irfp-romanesco而得到的romanesco表达细胞在dox及dfhbi-1t的存在下培养，并通过落射荧光显微镜法测定该细胞所发出的荧光信号。
首先，在含有4mm的l-谷氨酰胺、10％的fbs、1mm丙酮酸钠、1％的青霉素/链霉素以及20μm的dfhbi-1t的d-mem(无酚红，和光纯药株式会社制造)中培养该romanesco表达细胞。将最终浓度1μg/ml的dox(clontech公司制造)添加在培养基中以诱导转录，间断地照射488nm激光束(0.5μw)以激发romanesco，通过落射型的共聚焦荧光显微镜a1r获取romanesco表达细胞的荧光图像。通过重复进行20毫秒曝光后避光8秒这一循环8次来向细胞照射激光束。针对每一视场，在20毫秒曝光期间，每10毫秒连续拍摄一张荧光图像。
各循环中，采用最初的10毫秒所拍摄的dfhbi-1t处于发光状态(onstate)的荧光图像以及随后的10毫秒所拍摄的dfhbi-1t处于非发光状态(offstate)的荧光图像。将每一视场所得到的8张发光状态的荧光图像平均化后作为该视场的发光状态的荧光图像。同样地，将每一视场得到的8张非发光状态的荧光图像平均化后作为该视场的非发光状态的荧光图像。对于各视场，从发光状态的荧光图像的各图像的亮度值中减去非发光状态的荧光图像中的相应的图像的亮度值，将由此得到的荧光图像作为该视场的dfhbi-1t荧光图像。
将发光状态的荧光图像示于图8(a)，将dfhbi-1t荧光图像示于图8(b)。在图8(b)中，图8(a)中的来自romanesco非表达细胞的背景荧光(箭形符号)及romanesco表达细胞中的内源荧光(本征荧光)(箭头)消失，从而实现高s/n比的成像。
[实施例4]
使用romanesco表达细胞，筛选具有g4resolvase的活性的蛋白质，其中romanesco表达细胞是将向实施例2中制作的hek293细胞中转染有pt2-tre3g-nls-irfp-romanesco而成的。作为g4resolvase的候选蛋白质，使用三种蛋白质(a、b、c)。
具体而言，向romanesco表达细胞转染候选蛋白质基因的表达用质粒并使其表达，并在dfhbi-1t的存在下测定表达该候选蛋白质的nls-irfp阳性细胞的绿色荧光强度。质粒的转染、各细胞的绿色荧光强度的测量与实施例1同样地进行。针对作为对照的未过表达候选蛋白质的romanesco表达细胞，也同样地测定nls-irfp阳性细胞的绿色荧光强度。
将各nls-irfp阳性细胞的绿色荧光强度的测定结果示于图9。图中，“a”、“b”及“c”分别表示表达a蛋白质、b蛋白质及c蛋白质的nls-irfp阳性细胞的荧光强度(a.u.)的测定结果。在过表达a蛋白质和c蛋白质的细胞中，荧光强度比对照的细胞小，这些蛋白质被选作具有g4resolvase活性的蛋白质。
另一方面，在过表达b蛋白质的细胞中，荧光强度比对照的细胞大，该蛋白质被鉴定为具有提高g4romanesco的亮度的活性(即具有促进g-quadruplex结构形成的活性)的蛋白质。
需要说明的是，通过测量使能够取得g-quadruplex结构的rna溶解而得到的溶液的圆二色性，能够测定g-quadruplex结构的形成程度。a蛋白质和c蛋白质是有报道称当添加于在体外转录(invitrotranscription)下合成了能够取得g-quadruplex结构的rna而得到的反应溶液中时圆二色性发生变化且g-quadruplex结构开解的蛋白质，也就是有报道称至少在体外(invitro)具有g4resolvase活性的蛋白质。通过使用细胞来进行的本发明中的筛选方法，确认a蛋白质和c蛋白质即使在细胞内也具有g4resolvase活性。
[实施例5]
使用实施例1中制作的romanesco调查靶基因转录产物的表达动态。
具体而言，首先，制作在dt40细胞的cd83基因的3’utr上敲入romanesco而成的cd83标记细胞。将该cd83标记细胞的cd83基因座的示意图示于图10a。
向培养cd83标记细胞的含dfhbi-1t培养基中添加cd83的表面抗原进行刺激，由此诱导cd83的表达，并作为dfhbi-1t的荧光强度变化来观察其转录产物的表达动态。各细胞的荧光强度与实施例2同样地通过落射荧光显微镜法来测定。cd83的表面抗原刺激前(添加第0分钟)及刺激后360分钟内每1分钟获取各细胞的荧光图像。将针对某一细胞所获取的37张荧光图像示于图10b。图中，上侧部分(图中的“raw”)为经时检测1个细胞的荧光信号而得到的结果，下侧部分(图中的“masked”)示出了设置围绕细胞区域的roi并将roi内的荧光强度平均化而得到的结果。通过用romanesco标记靶基因，能够连续在1个细胞水平上观测到靶基因的转录动态。
序列表
<110>日本科学技术振兴机构(japanscienceandtechnologyagency)
<120>荧光发生核酸分子以及荧光标记靶rna的方法(fluorogenicnucleicacidmoleculeandmethodoffluorescentlabelingoftargetrna)
<130>pc-28922
<160>46
<210>1
<211>15
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>共有序列的茎/环的5'末端的序列(thesequenceatthe5'endofthestem/loopoftheconsensussequence)
<400>1
gwgavgghcgggucc15
<210>2
<211>20
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>共有序列的茎/环的3'末端的序列(thesequenceatthe3'endofthestem/loopoftheconsensussequence)
<400>2
guygaguagagugugrgcuc20
<210>3
<211>14
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>茎/环结构区的序列(thesequenceofthestem/loopstructureregion)
<400>3
agauauuaauaucu14
<210>4
<211>14
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>茎/环结构区的序列(thesequenceofthestem/loopstructureregion)
<400>4
agauauucguaucu14
<210>5
<211>14
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>茎/环结构区的序列(thesequenceofthestem/loopstructureregion)
<400>5
aguaguucgcuacu14
<210>6
<211>16
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>茎/环结构区域的序列(thesequenceofthestem/loopstructureregion)
<400>6
aguagcuucggcuacu16
<210>7
<211>16
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>茎/环结构区域的序列(thesequenceofthestem/loopstructureregion)
<400>7
agcugcuucggcagcu16
<210>8
<211>49
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>babyspinach
<400>8
gugaaggacggguccaguaguucgcuacuguugaguagagugugagcuc49
<210>9
<211>51
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>optimizedspinach
<400>9
gagaaggacggguccagcugcuucggcagcuguugaguagagugugagcuc51
<210>10
<211>51
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>ispinach
<400>10
gugagggucggguccaguagcuucggcuacuguugaguagagugugggcuc51
<210>11
<211>47
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>zt-324
<400>11
gugaaggccggguccagccgugaggcuguugaguagagugugagcuc47
<210>12
<211>49
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>broccoli
<400>12
gagacggucggguccagauauucguaucugucgaguagagugugggcuc49
<210>13
<211>49
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>broccoli3
<400>13
gagacggucggguccagauauuaauaucuguugaguagagugugggcuc49
<210>14
<211>92
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>dbroccoli
<400>14
gagacggucggguccaucugagacggucggguccagauauucguaucugucgaguagagu60
gugggcucagaugucgaguagagugugggcuc92
<210>15
<211>57
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>f30scaffold
<400>15
uugccauguguaugugggccacauacucugaugauccuucgggaucauucauggcaa57
<210>16
<211>105
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>f30-broccoli3
<400>16
uugccauguguaugugggagacggucggguccagauauuaauaucuguugaguagagugu60
gggcucccacauacucugaugauccuucgggaucauucauggcaa105
<210>17
<211>150
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>f30-2xbroccoli3
<400>17
uugccauguguaugugggagacggucggguccagauauuaauaucuguugaguagagugu60
gggcucccacauacucugaugauccgagacggucggguccagauauuaauaucuguugag120
uagagugugggcucggaucauucauggcaa150
<210>18
<211>30
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>(linker)r(30nt)
<400>18
caguggggcagcggccggucgucuggggga30
<210>19
<211>44
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(44nt)
<400>19
cagacguuguccgccuugugcggccgaucgacugaggauaugaa44
<210>20
<211>66
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(66nt)
<400>20
ggaucauucauggcaaucuagcaccuucgcggccgaacauacaacugcuugccaugugua60
uguggg66
<210>21
<211>33
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>3xnls
<400>21
leuvalprolyslyslysarglysvalvalprolyslyslysarglys
151015
valvalprolyslyslysarglysvalphegluglyproasppropro
202530
val
<210>22
<211>234
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>f30-2xdbroccoli
<400>22
uugccauguguaugugggagacggucggguccaucugagacggucggguccagauauucg60
uaucugucgaguagagugugggcucagaugucgaguagagugugggcucccacauacucu120
gaugauccagacggucggguccaucugagacggucggguccagauauucguaucugucga180
guagagugugggcucagaugucgaguagagugugggcuggaucauucauggcaa234
<210>23
<211>24
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>nls-irfp编码区的正向引物(forwordprimerofnls-irfpcodingregion)
<400>23
ccaatccacattccaggagctatc24
<210>24
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>nls-irfp编码区的反向引物(riverseprimerofnls-irfpcodingregion)
<400>24
ctttcgcattgtgaagccgac21
<210>25
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>forwordprimerofpgk1gene
<400>25
tggacgttaaagggaagcggg21
<210>26
<211>25
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>pgk1基因的反向引物(riverseprimerofpgk1gene)
<400>26
ggctcataaggactaccgacttggc25
<210>27
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>18srrna的正向引物(forwordprimerof18srrna)
<400>27
cggctaccacatccaaggaag21
<210>28
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>18srrna的反向引物(riverseprimerof18srrna)
<400>28
tttttcgtcactacctccccg21
<210>29
<211>30
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(30nt)
<400>29
aagguaucuggcggccauagcagcugcgag30
<210>30
<211>30
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(30nt)
<400>30
aggcacagaagcggcccaaagugauagcag30
<210>31
<211>30
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(30nt)
<400>31
ucaacuucccgcggcccgccgccguccuga30
<210>32
<211>44
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(44nt)
<400>32
auuggucauaccagaaauugcggccagcaacgugcgcuuucacg44
<210>33
<211>44
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(44nt)
<400>33
cccccugucuuacucaucugcggccgaauagagggaguuuaaau44
<210>34
<211>44
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(44nt)
<400>34
cgcguguucaucaaagugggcggccuagcguguucaucaaagug44
<210>35
<211>66
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(66nt)
<400>35
uggucucuuugaugucauccgguugauagcggccguccgcccuagauuguuucuaugacc60
auuaga66
<210>36
<211>66
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(66nt)
<400>36
ucaccgugggacggaguacagaaggagugcggcccuaaaggcacaagucuaacuaugaac60
caucau66
<210>37
<211>66
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(66nt)
<400>37
ggucuagaacaccuaccuuaggccgugugcggccuugugacuuacacagucauuguccac60
agcccc66
<210>38
<211>30
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(30nt)
<400>38
ggaugacgaggcggccugguuaaaagguag30
<210>39
<211>30
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(30nt)
<400>39
cgaucuaggagcggccaguuacgcggugga30
<210>40
<211>30
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(30nt)
<400>40
cucacaacaagcggccguaacugccuuugu30
<210>41
<211>44
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(44nt)
<400>41
gaucgacugaggauauguugcggccguuggaccuggagaguccu44
<210>42
<211>44
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(44nt)
<400>42
cuuauaguaguccauggucgcggccuguuuaaacggcuagucua44
<210>43
<211>44
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(44nt)
<400>43
cguaguauacgcgcguguggcggcccaucgaucuucccgugcuu44
<210>44
<211>66
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(66nt)
<400>44
uauauucggcuaaucaacaucccaacacgcggccgucgaccgugacagagaacgccugaa60
uaguaa66
<210>45
<211>66
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(66nt)
<400>45
ucaucuuagcgugcacacacugguuccagcggccgugaacgccucgugcgcauuugagug60
ugcuug66
<210>46
<211>66
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>接头(linker)(66nt)
<400>46
acucuuuugaacgcccgauaguggcguggcggcccuuccggcaauauguaccugcagaac60
uaguaa66
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！