调控的基因编辑系统

优先权声明本申请根据35u.s.c.§119(e)要求于2018年10月9日提交的美国临时申请第62/743,317号和于2019年7月3日提交的美国临时申请第62/870,427号的权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。有关序列表的电子递交的声明根据37c.f.r.§1.821提交了ascii文本格式的序列表，命名为5470-858wo_st25.txt，大小为371,885字节，于2019年10月8日生成并通过efs-web递交，代替纸质副本。特此将该序列表以引用的方式并入本文的说明书中作为其公开内容。本发明涉及用于调控基因编辑的组合物及其使用方法。发明背景基因组测序技术和分析方法的最新进展已经显著加速了对与多种生物学功能和疾病有关的遗传因子进行分类和映射作图的能力。精确靶向基因组的能力将通过允许个别遗传元件的选择性改变来允许因果遗传变异的反向工程化，并促进合成生物学、生物技术和医学应用。尽管已经在基因组编辑技术方面取得了进展，但是已经发现，在基因编辑期间可能发生大量脱靶(例如，意外的突变)，这限制了该方法作为治疗方案。因此，需要一种针对其靶标具有更高的特异性和可靠性的更精确的基因组编辑系统。内源基因表达在几个转录后水平上被进一步调控，这些水平可能是探索外源基因表达的更精确控制的领域。例如，rna的产生受转录速率控制，但功能性rna需要正确剪接，然后才能产生正确的基因产物。通过调控转基因rna的剪接，可以控制基因产物的产生。本发明提供了用于在细胞中精确控制基因组编辑系统的表达的组合物和方法，从而降低了脱靶效应并增加其特异性。技术实现要素：本发明提供了一种具有降低的脱靶效应的用于编辑基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统，包括向具有你想要改变的基因序列(例如，靶基因序列)的细胞中导入：a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体(例如，病毒或非病毒载体、raav等)，其中编码核酸酶的核酸在其编码序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中当第一内含子和第二内含子从前体mrna信息中被剪接时，产生编码无功能核酸酶的mrna，该无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和b)结合所述调控序列的寡核苷酸，其中在细胞内，所述寡核苷酸阻止第二组剪接元件从mrna被剪接，从而产生缺少所述外显子并编码对靶基因的基因编辑起作用的核酸酶的mrna。在一个实施方案中，该系统还包含能够结合靶基因序列的grna。在此方面的一个实施方案中，核酸酶是crispr相关的核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶。在此方面的一个实施方案中，核酸酶是核酸内切酶或核酸外切酶。可以使用本文所述的系统和方法调控任何基因。例如，在一个实施方案中，待调控的基因是选自由以下组成的组的疾病或病症的疾病相关基因：肌萎缩性侧索硬化症；内毒素血症；动脉粥样硬化性血管疾病，即冠状动脉疾病；支架再狭窄；颈动脉代谢性疾病；中风；急性心肌梗死；心力衰竭；外周动脉疾病；肢体缺血；静脉移植失败；av内瘘失败(avfistulafailure)；克罗恩病；溃疡性结肠炎；回肠炎和肠炎；阴道炎；银屑病和炎症性皮肤病如皮炎；湿疹；特应性皮炎；过敏性接触性皮炎；荨麻疹；血管炎；脊柱关节病(spondyloarthropathies)；硬皮病；呼吸道过敏性疾病如哮喘；过敏性鼻炎；超敏性肺病；关节炎(例如，类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)；湿疹；牛皮癣；骨关节炎；多发性硬化；系统性红斑狼疮；糖尿病；肾小球肾炎；移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病)或工程化组织的排斥；传染病；肌炎；炎性cns病症；中风；闭合性脑损伤(closed-headinjuries)；神经退行性疾病；阿尔茨海默病；脑炎；脑膜炎；骨质疏松；痛风；肝炎；肝静脉闭塞病(vod)；出血性膀胱炎；肾炎；脓毒症；结节病；结膜炎；耳炎；慢性阻塞性肺病；鼻窦炎；贝赫切特综合征；移植物抗肿瘤效应；粘膜炎；阑尾炎；阑尾破裂；腹膜炎；主动脉瓣疾病；二尖瓣疾病；雷特综合征；结节性硬化症；苯丙酮尿症；斯-李-奥(smith-lemli-opitz)综合征和脆性x综合征；帕金森病；aicardi-goutières综合征；亚历山大病；allan-hemdon-dudley综合征；polg相关病症；α-甘露糖苷贮积症(ii型和iii型)；综合征；天使人综合征；共济失调-毛细血管扩张；神经元蜡样脂褐质沉积症；β地中海贫血；双侧视神经萎缩和(婴儿)视神经萎缩1型；视网膜母细胞瘤(双侧)；卡纳万病(canavandisease)；脑-眼-面-骨骼综合征1[cofs1]；脑腱性黄瘤症；德朗热综合征(corneliadelangesyndrome)；mapt相关病症；遗传性朊病毒病；dravet综合征；早发性家族性阿尔茨海默病；弗里德赖希共济失调[frda]；弗莱斯综合征；岩藻糖苷贮积症；福山型先天性肌营养不良症；半乳糖唾液酸贮积症；高歇氏病；有机酸血症；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症；早年衰老综合症(hutchinson-gilfordprogeriasyndrome)；粘多糖症ii；婴幼儿游离唾液酸贮积病(infantilefreesialicacidstoragedisease)；pla2g6相关神经退行性病变；珍维-兰格-尼尔逊(jervell-lange-nielsen)综合征；交界性大疱性表皮松解症(junctionalepidermolysisbullosa)；亨廷顿病；克拉伯病(婴幼儿型)；线粒体dna相关的雷氏综合征(leighsyndrome)和narp；lesch-nyhan综合征；lis1相关性无脑回畸形；勒韦(lowe)综合征；枫糖尿症；mecp2重复综合征；atp7a相关的铜转运障碍；lama2相关肌营养不良；芳基硫酸酯酶a缺乏症；粘多糖病i型、ii型或iii型；过氧化物酶体生物发生障碍(peroxisomebiogenesisdisorder)；泽尔韦格综合征谱；神经退行性疾病伴脑铁沉积症；酸性鞘磷脂酶缺乏症；尼曼匹克症c型；甘氨酸脑病；arx相关病症；尿素循环障碍；col1a1/2相关的成骨不全症；线粒体dna缺失综合征；plp1相关病症；佩里综合征；phelan-mcdermid综合征；糖原贮积病ii型(庞贝病)(婴幼儿型)；mapt相关病症；mecp2相关病症；肢根斑点状软骨发育不良1型；罗伯特综合征；山德霍夫(sandhoff)病；schindler病1型；腺苷脱氨酶缺乏症；斯-李-奥综合征；脊髓性肌萎缩；婴幼儿发作性脊髓小脑性共济失调；氨基己糖苷酶a缺乏症；致死性发育不良1型；vi型胶原相关病症；usher综合征i型；先天性肌营养不良症；wolf-hirschhorn综合征；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；和着色性干皮病。在一个实施方案中，被调控的基因是与周围神经系统或中枢神经系统中的疼痛相关的基因。在一个实施方案中，被调控的基因是肌营养不良蛋白(dystrophin)基因。肌营养不良蛋白基因位于x染色体上，且该基因的突变可导致各种疾病状态，例如杜氏(duchenne)肌营养不良、becker型肌营养不良、x连锁扩张型心肌病和家族性扩张型心肌病。在一个实施方案中，肌营养不良蛋白基因在通常带有导致所述疾病的突变(例如，1、6、7、8、23、43、44、45、46、50、51、52、53或55)的外显子处被靶向。在一个实施方案中，存在grna。例如，tgcaaaaacccaaaatattt(seqidno:81)；aaaatattttagctcctact(seqidno:82)；cagagtaacagtctgagtag(seqidno:83)；taagggatatttgttcttac(seqidno:84)；ctaagggatatttgttctta(seqidno:85)；和tgttcttacaggcaacaatg(seqidno:86)。本文例如在表1中提供了其他示例性grna。在一个实施方案中，被调控的基因是疾病或疼痛基因。本文所述的基因编辑系统可用于改变或调控与疾病(例如，克罗恩病或神经性疼痛，例如与周围神经系统或中枢神经系统相关的疼痛)相关的基因。例如，可以使用本文所述的基因编辑系统抑制在疼痛患者的背根神经节中异常表达(例如，过表达、或低表达)的基因，或调控有害刺激转导、电压门控钠通道(例如，ca2+通道、k+通道、na+通道)、nmda受体、配体门控离子通道、mas相关g蛋白偶联受体(mrgprs)的功能或为上述功能所需的基因以治疗、改善、抑制或减少神经性疼痛。可使用本文所述的基因编辑系统抑制以治疗、改善、抑制或减轻神经性疼痛的示例性基因包括但不限于navl.l、nav1.2、nav1.3、nav1.4、nav1.5、nav1.6、nav1.7、nav1.8和nav1.9、血管紧张素ii的2型受体、辣椒素受体-1(vr-1)、酪氨酸受体激酶a(trka)、缓激肽受体、csf1-dap12途径成员(例如，csf1、csfr1或dap12)。在一个实施方案中，具有降低的脱靶效应的用于编辑与神经性疼痛相关的基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统包括向具有靶基因序列的细胞中导入：a)包含编码crispr相关的核酸酶的核酸序列的载体，其中编码核酸酶的核酸在其序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中第一内含子和第二内含子从mrna信息中被剪接以产生编码无功能核酸酶的mrna，该无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；b)结合神经性疼痛相关基因(例如，nav1.8)的grna；和c)结合调控序列的寡核苷酸，其中在细胞内，所述寡核苷酸阻止第二组剪接元件从mrna被剪接，从而产生缺少所述外显子并编码对结合grna和对靶序列的基因编辑起作用的核酸酶的mrna。在一个实施方案中，所描述的发明的grna针对nav1.8，以沉默nav1.8。靶向nav1.8的示例性grna包括但不限于表2中所列的grna。在一个实施方案中，所描述的发明的grna针对转录起始位点(tss)上游的前200bp以激活nav1.8。靶向nav1.8的示例性grna包括但不限于表3中所列的grna。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，调控核酸序列是β珠蛋白突变型内含子(mutantintron)。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，系统包含至少两个调控核酸序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，调控核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：seqidno:18(ivs2-654内含子c-t)、seqidno:50(具有564ct突变的ivs2-654内含子)、seqidno:51(具有657g突变的ivs2-654内含子)、seqidno:52(具有658t突变的ivs2-654内含子)、seqidno:20(具有657gt突变的ivs2-654内含子)、seqidno:53(具有200bp缺失的ivs2-654内含子)、seqidno:68(仅具有197bp的ivs2-654内含子)、seqidno:55(具有6a突变的ivs2-654内含子)、seqidno:56(具有564c突变的ivs2-654内含子)、seqidno:57(具有841a突变的ivs2-654内含子)、seqidno:59(具有564ct突变的ivs2-705内含子)、seqidno:60(具有657g突变的ivs2-705内含子)、seqidno:61(具有658t突变的ivs2-705内含子)、seqidno:62(具有657gt突变的ivs2-705内含子)、seqidno:63(具有200bp缺失的ivs2-705内含子)、seqidno:64(具有425bp缺失的ivs2-705内含子)、seqidno:65(具有6a突变的ivs2-705内含子)、seqidno:66(具有564c突变的ivs2-705内含子)、seqidno:67(具有841a突变的ivs2-705内含子)、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:143、seqidno:144、seqidno:145、seqidno:146、seqidno:147、seqidno:148；及其任何组合，包括单一序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，结合调控序列的寡核苷酸包含选自以下的序列：seqidno:37(ivs2-654ct的寡核苷酸)、seqidno:38(具有657gt突变的ivs2-654的寡核苷酸)、seqidno:39(针对ivs2-654中6a突变的寡核苷酸)、seqidno:40(针对ivs2-654中564c突变的寡核苷酸)、seqidno:41(针对ivs2-654中564ct突变的寡核苷酸)、seqidno:43(针对ivs2-654中841a突变的寡核苷酸)、seqidno:44(针对ivs2-654中657g突变的寡核苷酸)、seqidno:45(针对ivs2-654中658t突变的寡核苷酸)、seqidno:42(针对ivs2-705中705g突变的寡核苷酸)、seqidno:49(针对ivs2-705的寡核苷酸)、seqidno:76(诱导反义外显子23跳跃的寡核苷酸)以及seqidno138(针对luc-aon1的寡核苷酸)、seqidno:139(针对luc-aon2的寡核苷酸)、seqidno:140(针对luc-aon3的寡核苷酸)、seqidno:141(针对luc-aon4的寡核苷酸)、seqidno:142(针对ivs2(s0)-654,luc-654的寡核苷酸)和seqidno:149(针对野生型调控序列的寡核苷酸)。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，结合调控序列的寡核苷酸包含选自表4中列出的那些序列的序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，具有seqidno:138的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon1)结合具有seqidno:143的序列的调控序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，具有seqidno:139的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon2)结合具有seqidno:144的序列的调控序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，具有seqidno:140的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon3)结合具有seqidno:145的序列的调控序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，具有seqidno:141的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon4)结合具有seqidno:146的序列的调控序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，具有seqidno:142的序列的寡核苷酸(例如，lna-654)结合具有seqidno:147的序列的调控序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，寡核苷酸结合的调控序列选自表5中列出的那些序列。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，脱靶效应降低至少30％(降低至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％)。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，组分(a)和(b)位于相同或不同的载体上。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，将组分(b)作为裸dna导入细胞。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，使用脂质制剂将组分(b)导入细胞。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，使用纳米颗粒将组分(b)导入细胞。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，在施用(a)之后的时间点施用组分(b)。在此方面和本文所述的所有方面中的另一个实施方案中，组分(a)和(b)基本上同时施用。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，在缺少(b)或没有(b)表达的情况下，在细胞中检测不到(a)的表达。例如，(a)的表达在细胞中为“关闭(off)”，直到它与(b)在细胞中共表达。伴随(b)表达或存在(b)，(a)在细胞中被“打开(on)”。在一个实施方案中，组分(b)控制基因编辑系统的“打开(on)”和/或“关闭(off)”状态。在一个实施方案中，基因编辑系统可以选择性地“打开(on)”或“关闭(off)”。在另一个实施方案中，基因编辑系统可以在空间和/或局部控制下选择性地“打开(on)”或“关闭(off)”。在一个实施方案中，系统的组分可以被局部递送/施用至期望的位点、位置，器官、细胞类型、组织类型等，以诱导基因编辑系统局部“打开(on)”。在一个实施方案中，可以持续给定的时间段施用基因编辑系统的组分，以控制系统“打开(on)”或“关闭(off)”的时机。不需要在具有空间和/或时间控制的情况下递送/施用系统的所有组分。例如，组分(a)可以全身施用，而组分(b)可以局部施用和/或持续特定的时间段。例如，取决于受试者的疼痛程度，人们可以将系统“打开(on)”或“关闭(off)”。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，(a)的表达取决于(b)的表达。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，载体是病毒载体。示例性的病毒载体包括但不限于aav载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体和嵌合病毒载体。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，载体是非病毒载体。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，核酸酶是crispr相关的核酸酶。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，crispr相关的核酸酶为基因编辑创建双链断裂，并且其中该crispr相关的核酸酶选自由以下组成的组：cpf1、c2c1、c2c3、cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、c2c1、c2c3、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas13a、cas13b和cas13c。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是选自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(sacas9)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)(stcas9)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)(nmcas9)、新杀手弗朗西丝菌(francisellanovicida)(fncas9)和空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)(cjcas9)的cas9变体。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，crispr相关的核酸酶已经被修饰用于基因编辑，但是没有双链dna断裂(例如，crispri或crispra)，并且选自由dcas、ncas和cas13组成的组。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，基因编辑正在降低一种或多种基因产物的表达。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，基因编辑正在增加一种或多种基因产物的表达。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，crispr相关的核酸酶被密码子优化以在真核细胞中表达。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，细胞是哺乳动物或人细胞。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，细胞在体内或体外。在此方面和本文所述的所有方面的一个实施方案中，靶基因是疾病基因。本文所述的本发明的另一个方面提供了用于编辑受试者中的基因的方法，该方法包括向需要基因编辑的受试者施用本文所述的任何系统。附图简述图1a-1c显示了剪接位点优化对诱导的影响。(图1a)ivs2-654内含子及其剪接模式的示意图。灰色框：人β珠蛋白的外显子，白色框：可替代使用的外显子(aue)，虚线：内含子。(图1b)剪接位点的修饰。上图：灰色框：荧光素酶编码区，白色框：可替代使用的外显子(调控蛋白的非天然存在的外显子)，实线：内含子，虚线：选择性剪接路径。中间图：ivs2-654内含子的5'和3'剪接位点序列。下图：具有修饰的序列的可替代5'剪接位点。(图1c)荧光素酶活性的测量。我们在有或没有结合调控序列的对应寡核苷酸(aon)的情况下将各构建体转染到hek293细胞中后24小时进行荧光素酶测定。前两行中的数据指示相对光单位(rlu)/μg。第三行中的数据呈现为具有aon的表达相对于无aon的表达的增加倍数。图2a-2c显示了对内含子尺寸的优化。(图2a)原始ivs2-654和ivs2(s0)-654内含子的示意图。白色框：可替代使用的外显子。虚线：内含子。示出了ivs2的5'和3'剪接位点的核苷酸编号和ivs2(s0)缺失后的连接区。(图2b)ivs2(s0)-654(seqidno:147)的总核苷酸序列。(图2c)ivs(s0)-654对荧光素酶诱导的影响。我们在有或没有aon654的情况下将各构建体转染到hek293细胞中后24小时进行荧光素酶测定。数据呈现为含有aon654时的表达相对于不含aon654时的表达的增加倍数。图3a-3c显示了其对应的aon对含有修饰内含子的构建体的荧光素酶表达的调控。(图3a)构建体及其aon靶序列的示意图。(图3b)aon对各构建体的诱导。在有或没有所示aon的情况下将各构建体转染到hek293细胞中后24小时进行荧光素酶测定。数据呈现为含有aon时的表达相对于无aon时的表达的增加倍数。(图3c)通过对应aon诱导荧光素酶表达。图4a-4b显示了其对应的aon对多基因表达的差异化调控。(图4a)每种构建体及其aon的预期途径的示意图。(图4b)对三种个体基因表达的差异调控。上图显示了荧光显微镜下的gfp。lnadgtl特异性诱导gfp表达。中间图显示了荧光显微镜下的rfp。lnadgt2特异性诱导rfp表达。下图显示了对每个样品的荧光素酶活性的测量。lnalucs1特异性诱导荧光素酶表达。图5a和5b显示了在小鼠肝脏中aon对aav2.5-cbh-luc-dgt1荧光素酶表达的调控。(图5a)所示条件下的荧光素酶活性。(图5b)所示包括aon1+i条件下的荧光素酶活性。图6a-6b显示了在小鼠眼睛中aon对aav2.5-cbh-luc-dgt1荧光素酶表达的调控。(图6a)实验概要。短箭头表示载体注射的时间点。箭头表示aon注射的时间点。长箭头表示荧光素酶活性测量的时间点。(图6b)aon诱导载体的荧光素酶表达。该示意图显示了每次施用aon后小鼠眼睛的荧光素酶活性(rlu)。图7显示了野生型人β珠蛋白内含子剪接的示意图。灰色数字框显示外显子。图8显示了在氨基酸654处含有点突变(c-t)的人β珠蛋白ivs2-654突变体的示意图。图9显示了人β珠蛋白ivs2-654突变体中第二个内含子的错误内含子剪接的示意图。内含子2的错误剪接抑制了β珠蛋白功能。粗箭头表示优先的剪接变体。标记了5'剪接位点(5'ss)。图10显示了结合调控序列的寡核苷酸(由黑色线条显示)的示意图，该调控序列结合人β珠蛋白ivs2-654突变体的5'ss并驱动优先剪接为野生型剪接。图11显示了luc-ivs2-654(b)的示意图。该构建体包含图10所示的可被选择性剪接的调控序列(参见图10中的相应虚线)，即，定义位于外显子侧翼的第一内含子和第二内含子的第一组剪接位点和第二组剪接位点。该可被选择性剪接的调控序列被符合读框地放置到编码待调控蛋白，例如报告基因诸如所例示的荧光素酶或核酸酶诸如crispr相关的核酸酶的核苷酸序列内。在不存在阻断第二组剪接元件的寡核苷酸(oligo)或该寡核苷酸不表达的情况下，该盒的插入导致可变剪接事件(alternatesplicingevent)，其保留非天然存在于待调控蛋白中的外显子(as)(细箭头)，从而产生无功能蛋白质。当结合调控序列的寡核苷酸与该盒结合时，发生正确的剪接，并且去除该外显子(粗箭头)从而产生功能性蛋白质(cs)。该图中例示了荧光素酶。当存在结合阻止第二组剪接元件剪接的调控序列的寡核苷酸时，观察到荧光素酶诱导水平增加了11倍。图12a-12c显示了含有gfp的ivs2-654(b)盒的修改的剪接。(图12a)gfp654int的示意图，其包含图10中在外显子侧翼使用的的盒(参见相应的虚线)。结合调控序列的寡核苷酸由灰色线条表示。该盒的插入导致保留该外显子(空心箭头)的可变剪接(as)。当结合调控序列的寡核苷酸结合该盒时，发生正确剪接(cs)，并且去除该外显子(空心箭头)。(图12b)不含反义寡核苷酸(aso)、含有错配寡核苷酸(lna654m)或结合调控序列的寡核苷酸(lna654)的所示细胞系中的gfp654int表达。只有当结合调控序列的寡核苷酸被结合时，gfp的表达才是可见的。使用gfpwtint作为对照。(图12c)显示不含反义寡核苷酸(aso)、含有错配寡核苷酸(lna654m)或结合调控序列的寡核苷酸(lna654)的所示细胞系中的as或cs的射线照片。图13显示了在不含反义寡核苷酸(aso)、含有错配寡核苷酸(lna654m)或结合调控序列的寡核苷酸(lna654)的眼睛中gfp654int的体内表达。使用gfpwtint作为对照。图14是改变内含子长度和数目的各种pgl3-654突变体的示意图。b是含有两组剪接元件(即，四个剪接位点，一个选择性剪接位点)的原始850bpivs2-654内含子。b(s0)被改变为减小内含子的尺寸，同时保持剪接元件组，例如缺失200bp片段。ab(s0)具有两个最小调控序列，其中每一个与寡核苷酸结合。图15a-15c显示了增加剪接受体或供体强度的各种pgl3-654突变体。(图15a)与图10中使用的盒相邻的侧翼序列的示意图。显示了野生型序列(上行)的突变(下行)。(图15b)所示构建体的增加倍数。(图15c)各种pgl3-654突变体与内含子的长度和数目的示意图。图15a中示出了斜线之间的区域。图16显示了所示荧光素酶构建体的侧翼序列。图17a-17e显示了与所示突变体中的调控序列结合的给定寡核苷酸的特异性。b(s0-gt)(fig.17a)、lucs1(e)(fig.17b)、dgt1(f)(fig.17c)、dgt2(e)(fig.17d)和dgt3(h)(fig.17e)。结合调控序列的寡核苷酸仅在结合至其对应突变体时增加诱导倍数。图18a和18b显示了含有图10发现的盒的aat的体内表达。在施用寡核苷酸前1年，经由aav在小鼠中表达含有该盒的aat。(图18a)显示在未施用反义寡聚核苷酸(aso)、施用错配寡聚核苷酸(lna654m)或结合调控序列的寡聚核苷酸(lna654)之后aat的as或cs的射线照片。正确剪接(cs)，下方条带。选择性剪接(as)上方条带。(图18b)在诱导(例如，施用所示的寡核苷酸)后所示天数的aat表达。具体实施方式如本文所用，“一个(a、an)”或“该(the)”可以是单数或复数，这取决于这种使用的上下文。例如，“一个细胞(acell)”可以意指单个细胞或其可以意指多个细胞。也如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任一个和所有可能的组合，以及当以备选方式(“或”)解释时不组合。此外，当涉及可测量值，例如本发明的组合物的量、剂量、时间、温度等时，本文所用的术语“约”意指包括指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本发明提供了一种具有降低的脱靶效应的用于编辑基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统，包括向具有靶基因序列的细胞中导入：(a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体(例如，病毒或非病毒载体、raav等)，其中编码核酸酶的核酸在其序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中当第一内含子和第二内含子从mrna信息被剪接时，产生编码无功能核酸酶的mrna，该无功能性核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和(b)结合调控序列的寡核苷酸，其中在细胞内，寡核苷酸阻止第二组剪接元件从mrna被剪接，从而产生缺少该外显子并编码对结合grna和对靶序列的基因编辑起作用的核酸酶的mrna。在一个实施方案中，组分(a)和(b)位于同一载体上。在另一个实施方案中，组分(a)和(b)位于两个不同的载体上。在一个实施方案中，系统还包括将结合靶基因序列的grna导入细胞中，如果该系统中包含的核酸酶是crispr相关的核酸酶的话。在一个实施方案中，组分(a)和(b)以及grna位于同一载体上。在另一个实施方案中，组分(a)和(b)以及grna位于三个不同的载体上。在另一个实施方案中，(a)和(b)位于同一载体上，而grna位于不同的载体上；或者(a)和grna位于同一载体上，而(b)位于不同的载体上；或者(b)和grna位于同一载体上，而(a)位于不同的载体上。当本文所述的至少两个组分位于同一载体上时，该组分在载体上的顺序可互换。载体可以是但不限于非病毒载体、病毒载体和合成的生物纳米颗粒。本发明的病毒载体的非限制性实例包括aav载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体和嵌合病毒载体。在一个实施方案中，组分(a)和(b)基本上同时施用给受试者。在一个实施方案中，组分(a)和(b)在不同的时间点施用给受试者。例如，组分(a)的施用时间点晚于(b)。或者，组分(a)的施用时间点早于(b)。在一个实施方案中，组分(b)在(a)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小时或更多小时施用；或在(a)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天施用；或在(a)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月或更多个月施用；或在(a)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年施用。在一个实施方案中，grna与(a)基本上同时施用。在另一个实施方案中，grna在与(a)不同的时间点施用。例如，可以在施用(a)之前的时间点施用grna。或者，可以在施用(a)之后的时间点施用grna。在一个实施方案中，grna可以基本上与(b)同时、在(b)之前或之后施用。在一个实施方案中，组分(b)被施用给受试者一次。在可选实施方案中，组分(b)在给定的时间段内(例如，数小时、数天、数月、数年或更长)被施用给受试者至少两次，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一个实施方案中，(a)的表达取决于(b)的表达。换句话说，(a)不会在细胞中表达，除非(b)随后存在于同一细胞内或在同一细胞中表达。因此，在本文所述的某些实施方案中，本文所述的系统在关闭(off)位置(例如，未表达)被导入(例如，受试者)并与本发明的结合调控序列的寡核苷酸和/或小分子接触将系统切换至打开(on)位置(例如，表达)。本文还提供了将处于打开(on)位置被导入(例如，导入受试者中)的系统转换到关闭(off)位置的方法，例如抑制赋予生物学功能的异源蛋白和/或rna产生的方法，包括：a)在允许剪接的条件下使结合调控序列的寡核苷酸和/或小分子与本发明的核酸接触，其中小分子阻断第一组剪接元件的成员，导致去除了第二内含子，从而抑制第一rna的产生。本发明还提供了一种具有降低的脱靶效应的用于编辑基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统，包括向具有靶基因序列的细胞中导入：a)包含编码crispr相关的核酸酶的核酸序列的载体(例如，病毒或非病毒载体、raav等)，其中编码核酸酶的核酸在其序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中当第一内含子和第二内含子从mrna信息被剪接时，产生编码无功能核酸酶的mrna，该无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；b)结合靶基因序列的grna；和c)结合调控序列的寡核苷酸，其中在细胞内，寡核苷酸阻止第二组剪接元件从mrna被剪接，从而产生缺少该外显子并编码对结合grna和基因编辑靶序列起作用的核酸酶的mrna。在一个实施方案中，组分(a)、(b)和(c)位于同一载体上。在另一个实施方案中，组分(a)、(b)和(c)位于三个不同的载体上。在另一个实施方案中，(a)和(b)位于同一载体上，而(c)位于不同的载体上；或者(a)和(c)位于同一载体上，而(b)位于不同载体上；或者(b)和(c)位于同一载体上，而(a)位于不同的载体上。当至少两个组分位于同一载体上时，该组分载体上的顺序可互换。载体可以是但不限于非病毒载体、病毒载体和合成的生物纳米颗粒。本发明的病毒载体的非限制性实例包括aav载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体和嵌合病毒载体。在一个实施方案中，组分(a)、(b)和(c)基本上同时施用给受试者。在一个实施方案中，组分(a)、(b)和(c)在不同的时间点施用给受试者。在可选实施方案中，组分(c)在(a)和(b)之后的时间点施用，例如组分(a)和(b)基本上同时施用，而(c)在该施用后至少一周施用。在一个实施方案中，组分(c)在(a)和/或(b)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小时或更多小时施用；或在(a)和/或(b)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天施用；或在(a)和/或(b)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月或更多个月施用；或在(a)和/或(b)之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年施用。在一个实施方案中，组分(c)被施用给受试者一次。在可选实施方案中，组分(c)在给定的时间段内(例如，数小时、数天、数月、数年或更长)被施用给受试者至少两次，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一个实施方案中，(a)和(b)的表达依赖于(c)的表达。换句话说，(a)和(b)不会在细胞中表达，除非(c)随后存在于同一细胞内或在同一细胞中表达。因此，在本文所述的某些实施方案中，本文所述的系统在关闭(off)位置(例如，未表达)被导入(例如，受试者)并且与结合本发明的调控序列的寡核苷酸和/或小分子的接触将系统切换至打开(on)位置(例如，表达)。本文还提供了将处于打开(on)位置被导入(例如，导入受试者中)的系统转到关闭(off)位置的方法，例如抑制赋予生物学功能的异源蛋白和/或rna产生的方法，包括：a)在允许剪接的条件下使结合调控序列的寡核苷酸和/或小分子与本发明的核酸接触，其中小分子阻断第一组剪接元件的成员，导致去除了第二内含子，从而抑制第一rna的产生。在一个实施方式中，grna的表达依赖(b)的表达。在一个实施方案中，核酸酶是crispr相关的核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、核酸内切酶或核酸外切酶。如本文所用，术语“核酸酶(nuclease)”是指具有dna裂解活性的分子。用于在本文公开的方法中使用的核酸酶试剂的具体实例包括rna引导的crispr-cas9系统、锌指蛋白、大范围核酸酶、tal结构域、talen、酵母装配重组酶(yeastassemblyrecombinase)、亮氨酸拉链、crispr/cas核酸内切酶以及本领域技术人员已知的其他核酸酶。可以选择或设计核酸酶以获得在给定的靶位点裂解的特异性。例如，可对核酸酶进行选择以在靶位点切割，从而在切割的多核苷酸和不同的多核苷酸之间产生重叠末端。具有蛋白质和rna元件的核酸酶，例如crispr-cas9，可被提供为已经与剂复合的核酸酶，或者可被提供为分开的蛋白质和rna元件，在这种情况下，它们在本文所述的反应混合物中复合形成核酸酶。在一个实施方案中，使用cas9以外的核酸酶。如本文所用，术语“核酸酶的识别位点”是指由核酸酶在此处诱导切口或双链断裂的dna序列。核酸酶的识别位点可以是对细胞内源性的(或天然的)或者核酸酶的识别位点对细胞可以是外源性的。在具体的实施方案中，识别位点是对细胞外源性的，且因此不是该细胞的基因组中天然存在的。仍在另外的实施方案中，识别位点对于细胞和人们想要定位在靶基因座处的目的多核苷酸而言是外源性的。在另外的实施方案中，外源性或内源性识别位点在宿主细胞的基因组中仅呈现一次。在具体的实施方案中，鉴定了在基因组内仅出现一次的内源性或天然位点。这样的位点随后可以用于设计将在该内源性识别位点处产生切口或双链断裂的核酸酶试剂。识别位点的长度可以变化，并且包括例如约30-36bp(对于锌指核酸酶(zfn)对(即每个zfn的识别位点为约15-18bp))、约36bp(对于转录激活因子样效应物核酸酶(talen))或者约20bp(对于crispr/cas9向导rna)的识别位点。在一些实施方案中，识别位点位于编码选择性标志物(selectionmarker)的多核苷酸内。这样的位置可以位于选择性标志物的编码区内或影响选择性标志物的表达的调控区内。因此，核酸酶试剂的识别位点可以位于选择性标志物的内含子、编码选择性标志物的多核苷酸的启动子、增强子、调控区或任何非蛋白编码区中。在一些实施方案中，识别位点处的切口或双链断裂破坏选择性标志物的活性。测定功能选择性标志物的存在或不存在的方法是本领域技术人员已知的。在所需的识别位点中诱导切口或双链断裂的任何核酸酶都可用于本文公开的方法和组合物中。可以使用天然存在的或天然的核酸酶，只要该核酸酶试剂在所需的识别位点中诱导切口或双链断裂即可。或者，可以使用修饰的或工程化的核酸酶试剂。“工程化的核酸酶”包括从其天然形式被工程化(修饰或衍生)为特异性识别期望的识别位点并在期望的识别位点诱导切口或双链断裂的核酸酶。因此，工程化的核酸酶试剂可以从天然的、天然存在的核酸酶试剂获得，或者其可以是人工创建或合成的。核酸酶试剂的修饰在蛋白质裂解试剂中可少至一个氨基酸，或在核酸裂解试剂中可少至一个核苷酸。在一些实施方案中，工程化的核酸酶在识别位点诱导切口或双链断裂，其中该识别位点不是天然(非工程化或非修饰的)核酸酶试剂所识别的序列。在识别位点或其他dna中产生切口或双链断裂在本文中可称为“切割(cutting)”或“裂解(cleaving)”识别位点或其他dna。随后细胞以两种方式中的一种可修复这些断裂：非同源末端连接和同源介导的修复(同源重组)。在非同源末端连接(nhej)中，双链断裂通过将断裂末端彼此直接连接而被修复。如此，尽管某些核酸材料可能丢失，从而导致缺失，但是没有新的核酸材料插入该位点。在同源介导的修复(homology-directedrepair)中，与裂解的靶dna序列具有同源性的供体多核苷酸可用作修复裂解的靶dna序列的模板，导致遗传信息从供体多核苷酸转移至靶dna。因此，新的核酸材料可被插入/复制到该位点中。nhej和/或同源介导的修复引起的对靶dna的修饰可用于基因校正、基因置换、基因加标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、基因突变等。在一个实施方案中，核酸酶是crispr相关的核酸酶。天然原核crispr相关的核酸酶系统包括具有恒定长度的间插可变序列的短重复序列的阵列(即，成簇的规律间隔的短回文重复序列)，以及crispr相关(“cas”)的核酸酶蛋白。转录的crispr阵列的rna被一部分cas蛋白加工成小向导rna，其通常具有如下所讨论的两个组分。存在至少三种不同的系统：i型、ii型和iii型。在这3种系统中，参与将rna加工成成熟crrna的酶是不同的。在天然原核系统中，向导rna(“grna”)包括两个短的、非编码的rna种类，称为crisprrna(“crrna”)和反式作用rna(“tracrrna”)。在示例性系统中，grna与核酸酶(例如cas核酸酶)形成复合物。grna:核酸酶复合物结合具有前间隔序列邻近基序(protospaceradjacentmotif，“pam”)和前间隔序列的靶多核苷酸序列，前间隔序列是与grna的一部分互补的序列。grna:核酸酶复合物对靶多核苷酸的识别和结合诱导靶多核苷酸的裂解。天然crispr相关的核酸酶系统在原核生物中起到免疫系统的作用，其中grna:核酸酶复合物以类似于真核生物体中rnai的方式识别外源遗传因子并使之沉默，从而赋予对诸如质粒和噬菌体等外源遗传原件的抗性。已经证明，单一向导rna(“sgrna”)可以代替天然存在的crrna和tracrrna之间形成的复合物。任何crispr相关的核酸酶可用于本发明的系统和方法中。crispr核酸酶系统是本领域技术人员已知的，例如，参见专利/申请8,993,233、us2015/0291965、us2016/0175462、us2015/0020223、us2014/0179770、8,697,359；8,771,945；8,795,965；wo2015/191693；us8,889,418；wo2015/089351；wo2015/089486；wo2016/028682；wo2016/049258；wo2016/094867；wo2016/094872；wo2016/094874；wo2016/112242；us2016/0153004；us2015/0056705；us2016/0090607；us2016/0029604；8,865,406；8,871,445；其每一个均通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，核酸酶是大范围核酸酶。已基于保守序列基序，将大范围核酸酶分为4个家族，这些家族是laglidadg(seqidno:153)、giy-yig、h-n-h和his-cys盒子家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。hease以其长识别位点和耐受其dna底物中的某些序列多态性而著称。大范围核酸酶的结构域、结构和功能是已知的，参见例如guhan和muniyappa(2003)critrevbiochemmolbiol38:199-248；lucas等人，(2001)nucleicacidsres29:960-9；jurica和stoddard,(1999)cellmollifesci55:1304-26；stoddard,(2006)qrevbiophys38:49-95；和moure等人，(2002)natstructbiol9:764。在一些实例中，使用了天然存在的变体和/或工程化的衍生性大范围核酸酶。用于修饰动力学、辅因子相互作用、表达、最佳条件和/或识别位点特异性以及筛选活性的方法是已知的，参见例如epinat等人，(2003)nucleicacidsres31:2952-62；chevalier等人，(2002)molcell10:895-905；gimble等人，(2003)molbiol334:993-1008；seligman等人，(2002)nucleicacidsres30:3870-9；sussman等人，(2004)jmolbiol342:31-41；rosen等人，(2006)nucleicacidsres34:4791-800；chames等人，(2005)nucleicacidsres33:el78；smith等人，(2006)nucleicacidsres34:el49；gruen等人，(2002)nucleicacidsres30:e29；chen和zhao，(2005)nucleicacidsres33:el54；w02005105989；w02003078619；w02006097854；w02006097853；w02006097784；和w02004031346，其通过引用以其整体并入本文。本文可使用任何大范围核酸酶，包括但不限于i-scel、i-sceii、1-sceiii、i-sceiv、i-scev、i-scevi、i-scevii、i-ceul、i-ceuaiip、i-crel、1-crepsbip、i-crepsbiip、1-crepsbiiip、1-crepsbivp、i-tlil、i-ppol、pi-pspi、f-scel、f-scell、f-suvl、f-tevi、f-tevii、i-amal、i-anil、i-chul、i-cmoel、i-cpal、i-cpaii、i-csmi、i-cvul、i-cvuaip、i-ddii、i-ddiii、i-dirl、i-dmol、i-hmui、i-hmuii、i-hsnip、i-llal、i-msol、i-naal、i-nani、i-nciip、i-ngrip、i-nitl、i-njal、i-nsp236ip、i-paki、i-pboip、i-pcuip、i-pcuai、i-pcuvi、i-pgrlp、i-pobip、i-porl、i-poriip、i-pbpip、i-spbetaip、i-scal、i-sexip、i-sneip、i-spoml、i-spomcp、i-spomip、i-spomiip、i-squip、i-ssp68o3i、i-sthphijp、i-sthphist3p、i-sthphiste3bp、i-tdeip、i-tevi、i-tevii、i-teviii、i-uarap、i-uarhgpaip、i-uarhgpa13p、i-vinip、i-zbiip、pi-mtui、pi-mtuhippi-mtuhiip、pi-pfui、pi-pfuii、pi-pkoi、pi-pkoii、pi-rma43812ip、pi-spbetaip、pi-scei、pi-tful、pi-tfuii、pi-thyl、pi-tlil、ρι-tliii或其任何活性变体或片段。在一个实施方案中，大范围核酸酶识别12至40个碱基对的双链dna序列。在一个实施方案中，大范围核酸酶识别基因组中一个完全匹配的靶序列。在一个实施方案中，大范围核酸酶是归巢核酸酶(homingnuclease)。在一个实施方案中，归巢核酸酶是归巢核酸酶的laglidadg(seqidno:153)家族。在一个实施方案中，归巢核酸酶的laglidadg(seqidno:153)家族选自i-scel、i-crel和i-dmol。在一个实施方案中，核酸酶是锌指核酸酶(zfn)。在一个实施方案中，zfn的每个单体包含3个或更多个基于锌指的dna结合结构域，其中每个基于锌指的dna结合结构域结合3bp亚位点。在其他实施方案中，zfn是嵌合蛋白，其包含与独立的核酸酶可操作地连接的基于锌指的dna结合结构域。在一个实施方案中，该独立的核酸内切酶是foki核酸内切酶。在一个实施方案中，核酸酶试剂包含第一zfn和第二zfn，其中第一zfn和第二zfn各自与foki核酸酶亚基可操作地连接，其中第一zfn和第二zfn识别靶dna序列的每条链中被约5-7bp间隔子隔开的两个连续的靶dna序列，并且其中该foki核酸酶亚基二聚化以创建产生双链断裂的活性核酸酶。参见，例如，us20060246567；us20080182332；us20020081614；us20030021776；wo2002/057308a2；us20130123484；us20100291048；wo2011/017293a2；和gaj等人，(2013)trendsinbiotechnology,31(7):397-405，其每一个通过引用以其整体并入本文。在一个实施方式中，核酸酶是转录激活因子样效应因子核酸酶(talen)。tal效应talen核酸酶是一类序列特异性核酸酶，其可用于在原核或真核生物体的基因组中的特异性靶序列处产生双链断裂。tal效应物核酸酶通过将天然的或工程化的转录激活因子样(tal)效应因子或其功能部分融合到核酸内切酶(诸如例如foki)的催化结构域而产生。独特的模块化tal效应物dna结合结构域允许设计具有潜在的任何给定dna识别特异性的蛋白质。因此，tal效应物核酸酶的dna结合结构域可以被工程化以识别特异性dna靶位点，并因此用于在期望的靶序列处产生双链断裂。参见，wo2010/079430；morbitzer等人，(2010)pnas10.1073/pnas.1013133107；scholze&boch(2010)virulence1:428-43；christian等人，genetics(2010)186:757-761；li等人，(2010)nuc.acidsres.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704；和miller等人，(2011)naturebiotechnology29:143-148；其全部内容通过引用以其整体并入本文。合适的tal核酸酶的实例和用于制备合适的tal核酸酶的方法公开于例如美国专利申请第2011/0239315、2011/0269234、2011/0145940、2003/0232410、2005/0208489、2005/0026157、2005/0064474、2006/0188987和2006/0063231号(其每一个通过引用以其整体并入本文)。在多种实施方案中，tal效应因子核酸酶被工程化，其在例如目的基因组基因座中的靶核酸序列中或其附近切割，其中靶核酸序列位于待被靶向载体修饰的序列处或其附近。适合用于与本文提供的各种方法和组合物的tal核酸酶包括那些经特殊设计以在待被本文所述的靶向载体修饰的靶核酸序列处或其附近结合的核酸酶。在一个实施方案中，talen的每个单体包括33-35个tal重复，其这些tal重复通过两个高变残基识别单个碱基对。在一个实施方案中，核酸酶试剂是包含与独立的核酸酶可操作地连接的基于tal重复的dna结合结构域的嵌合蛋白。在一个实施方案中，该独立的核酸酶是foki核酸内切酶。在一个实施方案中，核酸酶试剂包含第一基于tal重复的dna结合结构域和第二基于tal重复的dna结合结构域，其中第一基于tal重复的dna结合结构域和第二基于tal重复的dna结合结构域各自与foki核酸酶亚基可操作地连接，其中第一基于tal重复的dna结合结构域和第二基于tal重复的dna结合结构域识别靶dna序列的每条链中被不同长度(12-20bp)的间隔子序列隔开的两个连续的靶dna序列，并且其中foki核酸酶亚基二聚化以创建在靶序列处产生双链断裂的活性核酸酶。在一个实施方案中，核酸酶是例如催化rna降解的核糖核酸酶。为了rna编辑目的，核糖核酸酶可以与crispr-cas激发的rna靶向系统(cirt)的其他组分(例如，rna发夹结合蛋白、与发夹结合蛋白和互补靶rna相互作用的grna以及结合并稳定grna的带电荷蛋白)协同使用。示例性核糖核酸酶包括：外切核糖核酸酶(例如，多核苷酸磷酸化酶(pnpase)、rnaseph、rnaser、rnased、rnaset、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶i和核糖核酸外切酶ii)、核糖核酸内切酶(例如，rnasea、rnaseh、rnaseiii、rnasel、rnasep、rnasephym、rnaset1、rnaset2、rnaseu2和rnasev)、pin结构域核酸酶、无活性pin结构域核酸酶、ythdf1、ythdf2、hadar2、突变体hadar2(例如，e488w)。可用于用cirt进行rna编辑的核糖核酸酶进一步描述于，例如，rauch,s.等人，cell；178(122-134页),2019；mali,p.cell(leadingedgepreviews),2019；和lerner,louise.“usinghumangenome,scientistsbuildcrisprforrnatoopenpathwaysformedicine.”2019年6月20日uchicagonews.web.访问日期2019年7月3日；其内容通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，核酸酶是限制性核酸内切酶(即限制性酶)，包括i型、ii型、iii型和iv型核酸内切酶。i型和iii型限制性核酸内切酶识别特异性识别位点，但通常在距核酸酶结合位点的可变位置处裂解，该可变位置可能距离裂解位点(识别位点)数百个碱基对。在ii型系统中，限制性活性不依赖于任何甲基化酶活性，并且裂解通常发生在结合位点内或其附近的特定位点。大多数ii型酶切割回文序列，然而ila型酶识别非回文识别位点并在识别位点外裂解，lib型酶切割序列两次，其中两个位点都位于识别位点外，且ils型酶识别不对称识别位点并在一侧且在距离识别位点约1-20个核苷酸的特定距离处裂解。iv型限制性酶靶向甲基化dna。限制性内切酶进一步描述并分类于例如rebase数据库中(网页为rebase.neb.com)；roberts等人，(2003)nucleicacidsres31:418-20),roberts等人，(2003)nucleicacidsres31:1805-12和belfort等人，(2002)mobilednaii第761-783页,craigie等人编辑(asmpress,washington,dc)。在一个实施方案中，核酸酶是核酸外切酶。核酸外切酶是通过破坏多核苷酸链的5'或3'末端的磷酸二酯键的水解反应裂解多核苷酸链末端的核苷酸而起作用的酶。核酸外切酶可以是细胞内源性的或外源性的。天然核酸外切酶的非限制性实例包括核酸外切酶i，核酸外切酶ii、核酸外切酶iii、核酸外切酶iv、核酸外切酶v和核酸外切酶viii。在另一个实施方案中，核酸酶是格氏嗜盐碱杆菌(natronobacteriumgregoryi)argonaute蛋白(ngago)。ngago是利用一对5'磷酸化的反向互补向导dna或rna(例如，sirna)靶向并切割靶核酸(例如，基因组dna)的核酸内切酶。重要的是，argonaute蛋白不需要靶核酸序列中的基序(例如，pam)。用于ngago的序列是本领域已知的。例如，ngago可以具有seqidno:154的序列。seqidno:154是编码ngago的氨基酸序列(ncbi登录号：anc90309.1)。ngago的表达和正确折叠对盐浓度等条件敏感。ngago可以在具有高浓度盐的细胞中表达。ngago可以在具有低或中等盐浓度的细胞中表达，并且所得到的表达的ngago蛋白可以分成可溶和不可溶的级分。在可溶部分中可以发现功能性ngago。靶核酸的向导dna序列可以是靶核酸中的任一具有20-30个碱基对(bp)例如，22bp、24bp、26bp、28bp或30bp的序列。如实施例1所述的产生包含调控序列(β珠蛋白内含子区)的ngago。利用限制性消化将调控序列的内含子区(例如，seqidno:53(具有200bp缺失的ivs2-654内含子)亚克隆到携带ngago的aav载体质粒中。在一个实施方案中，核酸酶是人工限制性dna切割子(cutter)(arcut)。使用本文所述的材料和方法，可以使用称为人工限制性dna切割子(arcut)的非限制性酶方法学来编辑细胞的染色体dna。该方法使用假互补(pseudo-complementary)肽核酸(pcpna)来指定染色体或端粒区域内的裂解位点。一旦pcpna指定了位点，此处的切割就由执行剪接功能的铈(ce)和edta(化学混合物)进行。此外，该技术使用dna连接酶，该dna连接酶稍后可在剪接位点内连接任何所需的dna(参见例如，komiyamam，chemicalmodificationsofartificialrestrictiondnacutter(arcut)topromoteitsinvivoandinvitroapplications，artif.dnapnaxna.2014；5:e1112457.)。在一个实施方案中，待调控的基因是选自由以下组成的组的疾病的相关基因：肌萎缩性侧索硬化症；内毒素血症；动脉粥样硬化性血管疾病即冠状动脉疾病；支架再狭窄；颈动脉代谢性疾病；中风；急性心肌梗死；心力衰竭；外周动脉疾病；肢体缺血；静脉移植失败；av内瘘失败；克罗恩病；溃疡性结肠炎；回肠炎和肠炎；阴道炎；银屑病和炎症性皮肤病如皮炎；湿疹；特应性皮炎；过敏性接触性皮炎；荨麻疹；血管炎；脊椎关节病；硬皮病；呼吸道过敏性疾病如哮喘；过敏性鼻炎；超敏性肺病；关节炎(例如，类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)；湿疹；牛皮癣；骨关节炎；多发性硬化；系统性红斑狼疮；糖尿病；肾小球肾炎；移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病)或工程化组织的排斥；传染病；肌炎；炎性cns病症；中风；闭合性脑损伤；神经退行性疾病；阿尔茨海默病；脑炎；脑膜炎；骨质疏松；痛风；肝炎；肝静脉闭塞病(vod)；出血性膀胱炎；肾炎；脓毒症；结节病；结膜炎；耳炎；慢性阻塞性肺病；鼻窦炎；贝赫切特综合征；移植物抗肿瘤效应；粘膜炎；阑尾炎；阑尾破裂；腹膜炎；主动脉瓣疾病；二尖瓣疾病；雷特综合征；结节性硬化症；苯丙酮尿症；斯-李-奥综合征和脆性x综合征；帕金森病；aicardi-goutières综合征；亚历山大病；allan-hemdon-dudley综合征；polg相关病症；α-甘露糖苷贮积症(ii型和iii型)；综合征；天使人综合征；共济失调-毛细血管扩张；神经元蜡样脂褐质沉积症；β-地中海贫血；双侧视神经萎缩和(婴儿)视神经萎缩1型；视网膜母细胞瘤(双侧)；卡纳万病(canavandisease)；脑-眼-面-骨骼综合征1[cofs1]；脑腱性黄瘤症；德朗热综合征(corneliadelangesyndrome)；mapt相关病症；遗传性朊病毒病；dravet综合征；早发性家族性阿尔茨海默病；弗里德赖希共济失调[frda]；弗莱斯综合征；岩藻糖苷贮积症；福山型先天性肌营养不良症；半乳糖唾液酸贮积症；高歇氏病；有机酸血症；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症；早年衰老综合症；粘多糖症ii；婴幼儿游离唾液酸贮积病；pla2g6相关神经退行性病变；珍维-兰格-尼尔逊综合征；交界性大疱性表皮松解症；亨廷顿病；克拉伯病(婴幼儿型)；线粒体dna相关的雷氏综合征和narp；lesch-nyhan综合征；lis1相关性无脑回畸形；勒韦综合征；枫糖尿症；mecp2重复综合征；atp7a相关的铜转运障碍；lama2相关肌营养不良；芳基硫酸酯酶a缺乏症；粘多糖病i型、ii型或iii型；过氧化物酶体生物发生障碍；泽尔韦格综合征谱；神经退行性疾病伴脑铁沉积症；酸性鞘磷脂酶缺乏症；尼曼匹克症c型；甘氨酸脑病；arx相关病症；尿素循环障碍；col1a1/2相关的成骨不全症；线粒体dna缺失综合征；plp1相关病症；佩里综合征；phelan-mcdermid综合征；糖原贮积病ii型(庞贝病)(婴幼儿型)；mapt相关病症；mecp2相关病症；肢根斑点状状软骨发育不良1型；罗伯特综合征；山德霍夫病；schindler病1型；腺苷脱氨酶缺乏症；斯-李-奥综合征；脊髓性肌萎缩；婴幼儿发作性脊髓小脑性共济失调；氨基己糖苷酶a缺乏症；致死性发育不良1型；vi型胶原相关病症；usher综合征i型；先天性肌营养不良症；wolf-hirschhorn综合征；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；和着色性干皮病。在一个实施方案中，被调控的基因是肌营养不良蛋白基因。肌营养不良蛋白基因位于x染色体上，且该基因的突变可导致各种疾病状态，例如杜氏肌营养不良、becker型肌营养不良、x连锁扩张型心肌病和家族性扩张型心肌病。在一个实施方案中，肌营养不良蛋白基因在通常带有导致所述疾病的突变(例如，1、6、7、8、23、43、44、45、46、50、51、52、53或55)的外显子处被靶向。dmd的示例性向导rna(grna)包括但不限于表1中所列的grna。靶向dmd基因以使其沉默的方法进一步描述于，例如国际专利申请wo2016/025469和wo2016/161380，其通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，被调控的基因是ube3a。ube3a在某些组织中是双等位基因表达的(biallelicallyexpressed)，例如，神经元仅表达ube3a的母系遗传拷贝。神经元中位于染色体15q11-q13中的母系ube3a基因的失活或有害突变导致天使人综合征。在一个实施方案中，神经元的ube3a被调控。在一个实施方案中，在神经元细胞中被印记即被沉默的父系ube3a被调控。在例如以下文献中进一步描述了用于治疗angelman综合征的ube3a调节：huang，hs.等人，nature；第481卷，2012；judson，mc等人，neuron；第90卷，2016；和judson，mc等人，trendsinneurosciences；34(6)，2011；其内容通过引用以其整体并入本文。在另一个实施方案中，被调控的基因是选自以下的疾病基因：1p36；18p；6p21.3；14q32；aaas；fgd1；ednrb；cp(3p26.3)；lmbr1；col2a1(12q13.11)；4p16.3；hmbs；adsl；abcd1；jag1；notch2；tp63；trex1；rnaseh2a；rnaseh2b；rnaseh2c；samhd1；adar；ifih1；gfap；hgd；10q26.13；atp1a3；alms1；alad；fgfr2；vps33b；atm；pitx2；foxo1a；foxc1；pax6；10q26；fgfr2；igf-2；cdkn1c；h19；kcnq1ot1；btd；bcs1l；15q26.1；17flcn；atp2a1；maoa；notch3；htra1；x17q24.3-q25.1；aspa；rab23；snap29；ftr(7q31.2)；pmp22；mfn2；chd7；lyst；runx2；ercc6；ercc8；xrps6ka3；coh1；col11a1；col11a2；col2a1；ntrk1；pten；cpox；14q13-q21；5p；16q12；fgfr2；fgfr3；fgfr3；atp2a2；xp11.22clcn5；ocrl；wt1；18q；22q11.2；hspb8；hspb1；hspb3；gars；reep1；ighmbp2；slc5a7；dctn1；trpv4；sigmar1；col1a1；col1a2；col3a1；col5a1；col5a2；tnxb；adamts2；plod1；b4galt7；dse；emd；lmna；syne1；syne2；fhl1；tmem43；fech；fanca；fancb；fancc；fancd1；fancd2；fance；fancf；fancg；fanci；fancj；fancl；fancm；fancn；fancp；fancs；rad51c；xpf；gla(xq22.1)；apc；ikbkap；mycn；med12；fxn；galt；galk1；gale；gba(1)；pax6；gcdh；etfa；etfb；etfdh；bcs1l；myo5a；rab27a；mlph；atp2c1(3)；abca12；hfe；hamp；hfe2b；tfr2；tf；cp；fviii；urod；3q12；eng；acvrl1；madh4；gne；myhc2a；vcp；hnrpa2b1；hnrnpa1；ext1；ext2；ext3；hps1；hps3；hps4；hps5；hps6；hps7；ap3b1；pmp22；nodal；nkx2-5；zic3；ccdc11；cfc1；sesn1；cbs(gene)；hd；ids；idua；aass；agxt；grhpr；dhdpsl；abca1；col2a1；fgfr3(4p16.3)；20q11.2；ikbkg(xq28)；tbx4；15q11-14；fgfr2；innpp5e；tmem216；ahi1；nphp1；cep290；tmem67；rpgrip1l；arl13b；cc2d2a；ofd1；tmem138；tctn3；znf423；amrc9；als2；col2a1；pdgfrb；gal；atp13a2；lcat；hprt(x)；tp53；msh2；mlh1；msh6；pms2；pms1；tgfbr2；mlh3；ryr1(19q13.2)；bckdha；bckdhb；dbt；dld；arsb；20q13.2-13.3；xk(x)；ap1s1；mefv；atp7a(xq21.1)；mmaa；mmab；mmachc；mmadhc；lmbrd1；mut；rab3gap(2q21.3)；aspm(1q31)；galns；glb1；zeb2(2)；fgfr3；men1；ret；mstn；dmpk；cnbp；hyal1；17q11.2；smpd1；npa；npb；npc1；npc2；gldc；amt；gcsh；ptpn11；kras；sos1raf1；nras；hras；braf；shoc2；map2k1；map2k2；cbl；reln；rag1；rag2；col1a1；col1a2；ifitm5；pank2(20p13-p12.3)；urod；pds；stk11；fgfr1；fgfr2；pah；aasdhppt；tcf4(18)；pkd1(16)orpkd2(4)；dnai1；dnah5；txndc3；dnah11；dnai2；ktu；rsph4a；rsph9；lrrc50；proc；pros1；abcc6；rp1；rp2；rpgr；prph2；impdh1；prpf31；crb1；prpf8；tulp1；ca4；hprpf3；abca4；eys；cerkl；fscn2；topors；snrnp200；prcd；nr2e3；mertk；ush2a；prom1；klhl7；cngb1；ttc8；arl6；dhdds；best1；lrat；spara7；crx；mecp2；esco2；crebbp；hexb；sgsh；naglu；hgsnat；gns；hspg2；col2a1；fbn1；11p15；xp11.22；phf8；abcb7；slc25a38；glrx5；gusb；dhcr7；17p11.2；atxn1；atxn2；atxn3；plekhg4；sptbn2；cacna1a；atxn7；atxn8os；atxn10；ttbk2；ppp2r2b；kcnc3；prkcg；itpr1；tbp；kcnd3；fgf14；fgfr3；abca4；cngb3；elovl4；prom1；col11a1；col11a2；col2a1；col9a1；col2a1；hexa(15)；gch1；pcbd1；pts；qdpr；mthfr；dhfr；fgfr3；5q32-q33.1(tcof1；polr1c；orpolr1d)；tsc1；tsc2；myo7a；ush1c；cdh23；pcdh15；ush1g；ush2a；gpr98；dfnb31；clrn1；ppox；vhl；pax3；mitf；ws2b；ws2c；snai2；ednrb；edn3；sox10；col11a2；atp7b；c2orf37(2q22.3-q35)；4p16.3；15ercc4；cenpvl1；cenpvl2；gspt2；maged1；alas2(x)；pex1；pex2；pex3；pex5；pex6；pex10；pex12；pex13；pex14；pex16；pex19；和pex26。在一个实施方案中，被调控的基因是与神经性疼痛相关的基因。神经性疼痛的特征是自发的超敏疼痛反应，并且通常可以在原始神经损伤治愈后持续很长时间。这种异常升高的疼痛反应可被观察为痛觉过敏(对有害疼痛刺激的敏感性增加)或异常性疼痛(对非有害刺激如冷、热或触觉的异常疼痛反应)。神经性疼痛可以是急性的或慢性的。神经性疼痛的示例性类型包括疱疹后神经痛、hiv远端感觉性多发性神经病变、糖尿病神经性疼痛、与创伤性神经损伤相关的神经性疼痛、与中风相关的神经性疼痛、与多发性硬化相关的神经性疼痛、与脊髓空洞症相关的神经性疼痛、与癫痫相关的神经性疼痛、与脊髓损伤相关的神经性疼痛和与癌症相关的神经性疼痛。本文所述的基因编辑系统可用于改变或调控与神经性疼痛(例如，与周围神经系统或中枢神经系统相关的疼痛)相关的基因。例如，可以使用本文所述的基因编辑系统抑制在疼痛患者的背根神经节中异常表达(例如，过表达、或低表达)的基因，或调控有害刺激转导、电压门控钠通道(例如，ca2+通道、k+通道、na+通道)、nmda受体、配体门控离子通道、mas相关g蛋白偶联受体(mrgprs)的功能或为上述功能所需的基因以治疗、改善、抑制或减少神经性疼痛。可使用本文所述的基因编辑系统被抑制以治疗、改善、抑制或减轻神经性疼痛的示例性基因包括但不限于navl.l、nav1.2、nav1.3、nav1.4、nav1.5、nav1.6、nav1.7、nav1.8和nav1.9、血管紧张素ii2型受体、辣椒素受体-1(vr-1)、酪氨酸受体激酶a(trka)、缓激肽受体、csf1-dap12途径成员(例如，csf1、csfr1或dap12)。在一个实施方案中，具有降低的脱靶效应的用于编辑与神经性疼痛相关的基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统包括向具有靶基因序列的细胞中导入：a)包含编码crispr相关的核酸酶的核酸序列的载体，其中编码核酸酶的核酸在其序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中第一内含子和第二内含子从mrna信息被剪接以产生编码无功能核酸酶的mrna，该无功能性核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；(b)结合神经性疼痛相关基因(例如，nav1.8)的grna；和(c)结合调控序列的寡核苷酸，其中在细胞内，所述寡核苷酸阻止第二组剪接元件从mrna内剪接，从而产生缺少外显子并编码对结合grna和对靶序列的基因编辑起作用的核酸酶的mrna。在一个实施方案中，grna针对nav1.8。用于靶向待抑制的nav1.8的示例性grna包括但不限于表2中列出的grna。在某些实施方案中，例如，用于调控疼痛基因的crispr相关的核酸酶被连接至一个功能结构域，该功能结构域促进基因(例如，一种过表达的疾病基因)的阻遏，从而导致该基因的转录被阻遏。用来与dna结合结构域(例如，失活cas9)融合以用于阻遏基因(例如，nav1.8)表达的示例性功能域是来自人kox-1蛋白的kox阻遏结构域或krab阻遏结构域(参见，例如，thiesen等人，newbiologist2,363-374(1990)；margolin等人，proc.natl.acad.sci.usa91,4509-4513(1994)；pengue等人，nucl.acidsres.22:2908-2914(1994)；witzgall等人，proc.natl.acad.sci.usa91,4514-4518(1994)。另一种合适的阻遏结构域是甲基结合结构域蛋白2b(mbd-2b)(还参见hendrich等人，(1999)mammgenome10:906-912对mbd蛋白的描述。另一个示例性阻遏结构域是与v-erba蛋白相关的阻遏结构域。参见，例如，damm等人(1989)nature339:593-597；evans(1989)int.j.cancer增刊4:26-28；pain等人(1990)newbiol.2:284-294；sap等人，(1989)nature340:242-244；zenke等人(1988)cell52:107-119；和zenke等人(1990)cell61:1035-1049。另外的示例性阻遏结构域包括但不限于krab(也称为“kox”)、sid、mbd2、mbd3、dnmt家族的成员(例如dnmt1、dnmt3a、dnmt3b)、rb和mecp2)。参见，例如bird等人(1999)cell99:451-454；tyler等人，(1999)cell99:443-446；knoepfler等人(1999)cell99:447-450；和robertson等人(2000)naturegenet.25:338-342。另外的示例性阻遏结构域包括但不限于rom2和athd2a。参见，例如，chem等人(1996)plantcell8:305-321；和wu等人(2000)plantj.22:19-27。在一个实施方案中，所描述的发明的crispr相关的核酸酶(例如失活cas9)被连接至kox阻遏结构域。在某些实施方案中，例如用于调节疾病相关基因或疼痛基因的crispr相关的核酸酶被连接至一个功能域，该功能域促进基因(例如，低表达疾病基因)的转录激活，从而导致该基因的转录被激活。用于实现这种激活的合适的结构域包括hsvvp16活化结构域(参见，例如，hagmann等人，j.virol.71,5952-5962(1997))、核激素受体(nuclearhormonereceptor)(参见，例如，torchia等人，curr.opin.cell.biol.10:373-383(1998))；核因子κb的p65亚基(bitko&barik,j.virol.72:5610-5618(1998)和doyle&hunt,neuroreport8:2937-2942(1997))；liu等人，cancergenether.5:3-28(1998))，或人工嵌合功能结构域如vp64(seifpal等人，emboj.11,4961-4968(1992))。另外的示例性激活结构域包括但不限于vp16、vp64、p300、cbp、pcaf、src1pvalf、athd2a和erf-2。参见，例如，robyr等人(2000)mol.endocrinol.14:329-347；collingwood等人(1999)j.mol.endocrinol.23:255-275；leo等人(2000)gene245:1-11；manteuffel-cymborowska(1999)actabiochim.pol.46:77-89；mckenna等人(1999)j.steroidbiochem.mol.biol.69:3-12；malik等人(2000)trendsbiochem.sci.25:277-283；和lemon等人(1999)curr.opin.genet.dev.9:499-504；osgai、half-1、cl、ap1、arf-5、arf-6、arf-7和arf-8、cprf1、cprf4、myc-rp/gp和trabi。参见，例如，ogawa等人(2000)gene245:21-29；okanami等人(1996)genescells1:87-99；goff等人(1991)genesdev.5:298-309；cho等人(1999)plantmol.biol.40:419-429；ulmason等人(1999)proc.natl.acad.sci.usa96:5844-5849；sprenger-haus-sels等人(2000)plantj.22:1-8；gong等人，(1999)plantmol.biol.41:33-44；和hobo等人(1999)proc.natl.acad.sci.usa96:15,348-15,353。在一个实施方案中，本文所述的基因编辑系统用于激活被阻遏的基因(repressedgene)的转录。例如，本文所述的系统可以用于激活本文所述的基因(例如，疾病基因或与疼痛相关的基因(例如，被阻遏的nav1.8)的转录。在一个实施方案中，grna被引导至nav1.8的转录起始位点(tss)上游的前200bp，并导致稳健的转录激活。用于靶向待转录激活的nav1.8的示例性grna包括但不限于表3中所列的grna。本发明实施方案中的调控序列可以是限定包含一个或多个突变的内含子的核苷酸序列，该突变的存在产生了第一组剪接元件和第二组剪接元件。在一些实施方案中，调控序列可以是定义内含子-外显子-内含子区的序列，其中内含子和/或外显子区中的突变导致了第一组剪接元件和第二组剪接元件的存在。在该后一实施方案中，当第二组剪接元件有活性时，结果是产生内含子-外显子-内含子区中的外显子的rna。本文还提供了筛选方法，例如鉴定阻断本文所述的基因编辑系统的调控核酸的第二组剪接元件的成员的寡核苷酸或其他化合物或复合物的方法，包括：(a)在允许剪接的条件下，使编码包含调控核酸序列的核酸酶的核酸(或者可替代地包含调控核酸的报告基因)与寡核苷酸/化合物在细胞内接触；和b)检测在调控核酸序列内缺乏非天然存在的外显子序列的mrna的产生，通过产生这类mrna鉴定了阻断第二组剪接元件的成员的寡核苷酸或化合物/复合物。可选地，检测到功能性蛋白质(例如报告蛋白)或核酸酶是抑制/阻断第二组剪接元件的寡核苷酸/化合物的标志(indicator)。内含子是真核dna或rna的一部分，其介于该dna或rna的编码部分或“外显子”之间。内含子和外显子被从dna转录成rna，该rna被称为“初级转录物，rna前体”(或“前体mrna(pre-mrna)”)。内含子必须从前体mrna中去除，从而可以产生由外显子编码的蛋白质。去除前体mrna中的内含子并随后连接外显子是在剪接过程中进行的。剪接过程是在转录后(即转录后地)但在翻译之前对rna进行的并由剪接因子介导的一系列反应。因此，“前体mrna”是既包含外显子又包含一个或多个内含子的rna，并且“信使rna(mrna或rna)”是已经从其中去除任何内含子并且其中外显子被顺序地连接在一起的rna，从而可以通过用核糖体翻译成功能性蛋白质或者通过翻译成功能性rna而由此产生基因产物。内含子的特征是作为剪接机制的一部分并且是剪接所必需的一组“剪接元件”。内含子是相对短的、保守的核酸片段，其结合进行剪接反应的各种剪接因子。因此，每个内含子由5'剪接位点、3'剪接位点和位于其间的分支点限定。剪接元件还包含位于外显子中的外显子剪接增强子和沉默子，以及位于内含子中的与剪接位点和分支点相距一定距离的内含子剪接增强子和沉默子。除了剪接位点和分支点之外，这些元件还控制可变的、异常的和组成型剪接。可以在本文所述的基因编辑系统中使用指导包含调控序列的核酸酶表达的各种启动子。实例包括但不限于组成型启动子、阻遏型启动子和/或诱导型启动子，它们的一些非限制性实例包括病毒启动子(例如，cmv、sv40)、组织特异性启动子(例如，肌肉(例如，mck)、心脏(例如，nse)、眼(例如，msk)和合成型启动子(sp1元件)以及鸡β肌动蛋白启动子(cb或cba)。启动子可以存在任何位置，在该位置其与核酸酶序列可操作地缔合。此外，可以相同或不同的一个或多个启动子可以一起存在于同一核酸分子中，或者位于核酸分子上相对于彼此和/或相对于核酸内存在的核酸酶序列和/或调控序列的不同位置。此外，内部核糖体进入信号(ires)和/或其他核糖体-通读元件可存在于该核酸分子上。可以相同或不同的一种或多种这样的ires和/或核糖体通读元件可以一起存在于同一核酸分子中和/或在核酸分子上的不同位置存在于该同一核酸分子中。当多个核酸酶序列存在于核酸分子上时，这类ires和核糖体通读元件可用于经由帽-非依赖性机制翻译信使rna序列。发现调控序列在核酸酶的编码区内，并且被放置成使得当调节序列的外显子被表达时，其具有符合读框的终止密码子。如下文所例示的，调控序列可以被被包括在核酸酶例如cpf1或cas9或其他核酸酶的编码区域内的任何地方。在一些实施方案中，调控序列位于核酸酶序列的5'核苷酸的三分之一内的任何位置、核酸酶序列的中间核苷酸的三分之一内的任何位置和/或核酸酶序列的3'核苷酸的三分之一内的任何位置。在一些实施方案中，调控序列位于核酸酶序列中的开放阅读框和多聚a位点之间的任何位置。优选地，调控序列位于核酸酶编码序列的5'端或其附近，例如距离5'末端5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸以内。调控核酸位于编码核酸酶的核酸序列内的任何位置，使得蛋白质中非天然存在的外显子被表达(具有符合读框的终止密码子)。在其中本发明的基因编辑系统中存在两个或更多个调控序列的某些实施方案中，可以将两个或更多个调控序列定位为隔开至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸，包括本文中没有具体叙述的5至1000之间的任何数量的核苷酸。本发明的核酸分子的调控序列可以包含定义位于非天然存在的外显子侧翼的第一内含子序列和第二内含子序列的第一组剪接元件和第二组剪接元件、基本上由其组成和/或由其组成。本文所用的“非天然存在的外显子”是在正常情况下在待调控的野生型蛋白中不存在的外显子，并且其在编码序列中的存在导致缺乏野生型功能的蛋白质被表达。当第一内含子序列和第二内含子序列被逐个(individually)剪接时，产生编码无功能核酸酶的rna分子，例如由于其包含具有终止密码子的非天然存在的外显子。可选地，在第二组剪接元件没有活性的情况下，外显子、第一和第二内含子全部被剪接以产生编码有功能的核酸酶的mrna，该核酸酶对于基因编辑例如碱基编辑或核酸内切酶活性是有功能的，以便于基因置换/修复。在一些实施方案中，本发明的调控序列可以包含一个或多个突变，所述突变可以是取代、添加、缺失等。基因编辑系统的组分可以存在于载体中，且这样的载体可以存在于细胞中。任何合适的载体都包括在本发明的实施方案中，包括但不限于非病毒载体(例如，核酸、微环(minicircle)、线性dna、质粒、泊洛沙姆(poloxymer)、外来体和脂质体)、病毒载体和合成的生物纳米颗粒(bnp)(例如，由不同的腺相关病毒以及其他细小病毒合成设计)。对于本领域技术人员显而易见的是，任何合适的载体都可以用于递送本发明的基因编辑系统。递送载体的选择可以根据本领域已知的多种因素进行，包括靶宿主的年龄和种类、体外与体内递送、期望的表达水平和持久性、预期目的(例如，用于治疗或多肽生产)、靶细胞或器官、递送途径、分离的核酸的尺寸、安全性考虑等。合适的载体还包括病毒载体(例如，逆转录病毒、甲病毒；牛痘病毒；腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)、脂质载体、聚赖氨酸载体、与核酸分子一起使用的合成聚氨基聚合物载体，诸如质粒等。本领域已知的任何病毒载体都可用于本发明。这类病毒载体的实例包括但不限于衍生自以下的载体：腺病毒科(adenoviridae)；双rna病毒科(birnaviridae)；布尼亚病毒科(bunyaviridae)；杯状病毒科(caliciviridae)，毛发病毒组(capillovirusgroup)；香石竹潜病毒组(carlavirusgroup)；香石竹斑驳病毒组(carmovirusvirusgroup)；花椰菜花叶病毒组(groupcaulimovirus)；黄花丝状病毒组(closterovirusgroup)；鸭跖草黄斑驳病毒组(commelinayellowmottlevirusgroup)；豇豆花叶病毒组(comovirusvirusgroup)；冠状病毒科(coronaviridae)；pm2噬菌体组；环病毒科(corcicoviridae)；潜隐病毒组(groupcrypticvirus)；隐病毒组(groupcryptovirus)；黄瓜花叶病毒组家族([phgr]6噬菌体组；囊状噬菌体科(cysioviridae)；香石竹环斑病组(groupcarnationringspot)；香石竹病毒组(dianthovirusvirusgroup)；蚕豆枯萎病组(groupbroadbeanwilt)；豆科病毒组(fabavirusvirusgroup)；丝状病毒科(filoviridae)；黄病毒科(flaviviridae)；真菌传杆状病毒组；双生病毒组(groupgeminivirus)；贾第鞭毛虫病毒组(groupgiardiavirus)；肝dna病毒科(hepadnaviridae)；疱疹病毒科(herpesviridae)；大麦病毒组(hordeivirusvirusgroup)；illar病毒组(illarvirusvirusgroup)；丝状噬菌体科(inoviridae)；虹彩病毒科(iridoviridae)；光滑病毒科(leviviridae)；脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)；黄矮病毒组(luteovirusgroup)；玉米雷亚朵非纳病毒组(marafivirusvirusgroup)；玉米褪绿矮缩病毒组(maizechloroticdwarfvirusgroup)；微小噬菌体科；肌病毒科(myoviridae)；坏死病毒组(necrovirusgroup)；线虫传多角体病毒组(nepovirusvirusgroup)；野田村病毒科(nodaviridae)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)；乳多空病毒科(papovaviridae)；副粘病毒科(paramyxoviridae)；欧防风黄点病毒组(parsnipyellowfleckvirusgroup)；分体病毒科(partitiviridae)；细小病毒科(parvoviridae)；豌豆耳突花叶病毒组(peaenationmosaicvirusgroup)；藻类dna病毒科(phycodnaviridae)；微小rna病毒科(picornaviridae)；芽生噬菌体科(plasmaviridae)；短尾噬菌体科(podoviridae)；多dna病毒科(polydnaviridae)；马铃薯x病毒组(potexvirusgroup)；马铃薯y病毒属(potyvirus)；痘病毒科(poxviridae)；呼肠孤病毒科(reoviridae)；逆转录病毒科(retroviridae)；弹状病毒科(rhabdoviridae)；根前毛菌病毒组(grouprhizidiovirus)；长尾噬菌体科(siphoviridae)；南方菜豆花叶病毒组(sobemovirusgroup)；ssv1型噬菌体；复层病毒科(tectiviridae)；纤细病毒属(tenuivirus)；四病毒科(tetraviridae)；烟草花叶病毒组(grouptobamovirus)；烟草脆裂病毒组(grouptobravirus)；披膜病毒科(togaviridae)；番茄丛矮病毒组(grouptombusvirus)；隆病毒组(grouptorovirus)；全病毒科(totiviridae)；芜菁黄花叶病毒组(grouptymovirus)；和植物卫星病毒(plantvirussatellites)。产生重组病毒载体和使用病毒载体进行核酸递送的方案可参见，例如，currentprotocolsinmolecularbiology，ausubel,f.m.等人(编辑)greenepublishingassociates,(1989)和其他标准实验室手册(例如，vectorsforgenetherapy.in:currentprotocolsinhumangenetics.johnwileyandsons,inc.:1997)。本发明的方法中采用的载体的非限制性实例包括用于将核酸递送到细胞中的任何核苷酸构建体，例如质粒、非病毒载体或病毒载体，例如可以包装重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体(参见例如，pastan等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:4486(1988)；miller等人，mol.cell.biol.6:2895(1986))。例如，重组逆转录病毒然后可用于感染并由此将本发明的核酸递送至受感染的细胞。当然，将改变的核酸导入哺乳动物细胞的确切方法不限于使用逆转录病毒载体。其他技术可广泛用于该程序，包括使用腺病毒载体(mitani等人，hum.genether.5:941-948,1994)、腺相关病毒(aav)载体(goodman等人，blood84:1492-1500,1994)、慢病毒载体(naldini等人，science272:263-267,1996)、假型逆转录病毒载体(agrawal等人，exper.hematol.24:738-747,1996)，和现在已知或以后鉴定的任何其他载体系统。还包括嵌合病毒颗粒，其是本领域熟知的并且可以包含两种或多种不同病毒的病毒蛋白和/或核酸的任意组合以产生功能性病毒载体。本发明的嵌合病毒颗粒还可以包含非病毒来源的氨基酸和/或核苷酸序列(例如，以促进载体靶向特定细胞或组织和/或诱导特异性免疫应答)。本发明还提供了“靶向”病毒颗粒(例如，包含细小病毒衣壳和重组aav基因组的细小病毒载体，其中外源靶向序列已插入或替换到细小病毒衣壳中)。也可以使用物理转导技术，例如脂质体递送和受体介导的胞吞机制以及其他胞吞机制(参见，例如，schwartzenberger等人，blood87:472-478,1996)。本发明可结合这些和/或其他通常使用的核酸转移方法的任一种使用。包括病毒载体、化学转染子或物理-机械方法如电穿孔和dna的直接扩散(directdiffusion)的合适转染方法由例如wolff等人，science247:1465-1468(1990)；和wolff，nature352:815-818,(1991)描述。因此，本发明的基因编辑系统的施用可以通过众多熟知方法中的任何一种来实现，例如但不限于在质粒或病毒载体中直接转移核酸，或通过在细胞中的转移，或与诸如阳离子脂质体等载体组合。这些方法是本领域熟知的并且容易适用于本文所述的方法。此外，这些方法可用于通过使用载体的靶向特性靶向某些疾病和组织、器官和/或细胞类型和/或细胞群体，这将是本领域技术人员所熟知的。还应充分理解，细胞和组织特异性启动子可用于本发明的基因编辑系统以靶向特定组织和细胞和/或以治疗特定疾病和病症。如本领域所熟知的，包含本发明的基因编辑系统的细胞可以是任何细胞，包括但不限于来自肌肉细胞(例如，平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞)、肝脏细胞(例如，肝细胞)、心脏细胞、脑细胞(例如，神经元细胞)、眼细胞(例如，视网膜细胞；角膜细胞)、胰腺细胞、肾细胞、内皮细胞、上皮细胞、干细胞(例如，骨髓细胞；脐带血细胞)、组织培养细胞(例如，hela细胞等)。在一个实施方案中，与不具有所要求保护的发明的组分的给定工程化基因编辑系统(例如，crispr/cas、talen、锌指)的脱靶效应相比，本文所述的基因编辑系统可将(例如由诸如cas3或cas9等crispr/cas基因编辑或talen基因编辑引起的)脱靶效应降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。如本文所用，“脱靶效应(offtargeteffect)”是指，通过使用工程化核酸酶活性(例如基因编辑系统的核酸内切酶)而产生的非特异性或非想要的基因突变。未与其靶dna结合的核酸酶可裂解脱靶双链断裂并在该位置产生基因突变。“脱靶效应”可以是非想要的点突变、缺失、插入、倒位、易位等。本领域技术人员可以通过例如在激活本文所述的基因编辑系统之前和之后的基因组测序来确定是否已经发生脱靶效应，以确定例如在基因编辑后是否在除靶序列以外的位置存在基因突变。评估基因编辑后脱靶效应的方法进一步综述于，例如，专利申请号wo2015/113063；slaymaker等人，science,2016；351(6268):84-88；morgens等人，naturecommunications.2017；8(15178)；koo等人，molcells.205:38(6):475-481；和hhaeussler等人，genomebiology.2016；17:148；其每一个通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，当与其他基因编辑系统相比时，本发明的核酸具有降低的“渗漏(leakiness)”水平。“渗漏”是指当系统处于“关闭(off)”位置时产生的基因产物或功能性rna的量。例如，在本文所述的一些实施方案中，当本发明的基因编辑系统与结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或本发明的其他化合物不接触时，本发明的系统处于“关闭(off)”位置，且因此，第一内含子不被剪接。渗漏可能是这种调控系统中固有的问题，但是在本系统的一些实施方案中，渗漏水平可能低于本领域已知的系统中的渗漏水平。因此，本发明还提供了与其他基因表达调控系统相比具有降低的渗漏的基因表达调控系统，其中该系统包含本发明的基因编辑系统和/或本发明的载体。与其他系统相比，本系统中的渗漏降低的程度可以比在本领域已知的系统中观察到的渗漏量低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。作为一个实例，系统的渗漏量可以通过在系统中使用报告基因并检测当系统处于“关闭(off)”位置时产生的报告基因产物的量来确定。可以采用多种测定来检测报告基因产物，包括但不限于蛋白质检测测定如elisa和蛋白印迹以及核酸检测测定如聚合酶链反应、dna印迹和rna印迹。用于检测基因产物的其他测定可以包括功能测定，例如，测量归因于基因产物的生物活性的量。本发明的核酸和方法可用于比较分析以证明渗漏水平与其他已知的基因调控表达系统和其中使用的核酸相比降低。本文还提供了使用本发明的基因编辑系统的各种方法。在一个实施方案中，提供了用于编辑基因的方法。该方法包括向细胞施用基因编辑系统的以下三种组分：i)包含编码核酸酶的核酸序列的载体，其中编码核酸酶的核酸在其序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中第一内含子和第二内含子被从mrna信息剪接以产生编码无功能核酸酶的mrna，该无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和ii)结合调控序列的寡核苷酸，其中在细胞内，寡核苷酸阻止第二组剪接元件从mrna被剪接，从而产生缺少该外显子并编码对结合grna和对靶序列的基因编辑起作用的核酸酶的mrna。在一个实施方案中，该方法还包括将grna施用给细胞，如果该系统中使用的核酸酶是crispr相关的核酸酶的话。在一个实施方案中，核酸酶是crispr相关的核酸酶，例如cas蛋白。示例性的cas蛋白包括但不限于cpf1、c2c1、c2c3、cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、c2c1、c2c3、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas13a、cas13b和cas13c。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是例如分离自细菌酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9或cas9变体(spcas9)。该crispr相关的核酸酶为实现其裂解作用与向导rna(grna)相关，该向导rna将核酸酶引导至期望的靶序列，该靶序列例如具有前间隔序列邻近基序(pam)序列(在靶序列的下游)。一旦cas9识别出pam序列(在spcas9的情况下为5'-ngg-3，其中n为任何核苷酸)，它就会在靶位置处产生双链断裂(dsb)。cas9活性是蛋白质的两个部分的共同作用：感测grna互补序列的识别部分(recognitionlobe)和裂解dna的核酸酶部分(nucleaselobe)。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是一种增强的特异性spcas9(espcas9)变体，其进一步描述于slaymaker等人，science.2016；351(6268):84-88，其通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是cas的天然变体。在crispr实验中，cas9变体包括，例如，仅举几例，金黄色葡萄球菌(sacas9)、嗜热链球菌(stcas9)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、新杀手弗朗西丝菌(fncas9)和空肠弯曲菌(cjcas9)。核酸酶可以基于优选的pam序列或尺寸来确定。例如，在一个实施方案中，核酸酶是sacas9核酸酶，其尺寸比spcas9小约1kb，因此其可更容易地被包装到病毒载体中，并且例如，它们是两种最紧凑的天然crispr变体。sacas9进一步以例如，casx和casy被描述(burstein，david等人，newcrispr–cassystemsfromuncultivatedmicrobes.nature542.7640(2017):237；ran,f.a.等人，invivogenomeeditingusingstaphylococcusaureuscas9.nature520(186)；2015；和friedland,aecharacterizationofstaphylococcusaureuscas9:asmallercas9forall-in-oneadeno-associatedvirusdeliveryandpairednickaseapplication.genomebiol.16:257；2015.；其内容通过引用以其整体并入本文。各物种的cas9序列是本领域已知的。例如，金黄色葡萄球菌(sacas9)具有seqidno:150的序列。seqidno:150是编码金黄色葡萄球菌cas9的氨基酸序列。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是衍生自空肠弯曲菌(c.jejuni)的cas9。这种空肠弯曲菌cas9(cjcas9)进一步描述于例如，国际专利申请wo2016/021973a1中，其通过引用以其整体并入本文。seqidno:152是编码cjcas9的氨基酸序列。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是cas12a(也称为cpf1)。由于cas9需要ngg的富含鸟嘌呤的pam序列，因此它不太适合靶向富含at的序列。zetsche等人表征了一种核酸酶(参见例如，美国专利申请us2016/0208243的序列和变体，通过引用以其整体并入本文)，其来自普氏菌属(prevotella)和弗朗西斯菌属(francisella)1的crispr(cfp1；现在被分类为cas12a)，可在靶向富含at的dna序列时使用。cfp1在靶dna中产生交错的双链切口，而不是spcas9产生的平端切口，并且对于实验是有用的(凭借hdr修复结果)。此外，cfp1比spcas9小并且不需要示踪剂rna。因此cfp1所需的向导rna长度更短，使其生产更为经济。多个物种的cfp1序列是本领域已知的。例如，氨基酸球菌属的种(acidaminococcussp.)cfp1具有seqidno:151的序列。seqidno:151是编码氨基酸球菌属的种的cfp1的氨基酸序列。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是用于crispri或crispra系统的工程化的cas9变体，例如，cas9切口酶或失活cas9。例如，在单链dna链上产生切口而不是产生双链断裂的变体。(参见例如，cong,le等人，“multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems”science(2013):1231143；mali,prashant等人，“cas9transcriptionalactivatorsfortargetspecificityscreeningandpairednickasesforcooperativegenomeengineering.naturebiotechnology31.9(2013):833；ran,f.ann等人doublenickingbyrna-guidedcrisprcas9forenhancedgenomeeditingspecificity.cell154.6(2013):1380-1389；cho,seungwoo等人analysisofoff-targeteffectsofcrispr/cas-derivedrna-guidedendonucleasesandnickasesgenomeresearch24.1(2014):132-141，其每一个通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，两种向导rna与ncas9一起使用。可选地，可以使用利用单一grna的espcas9。虽然切口酶显示了高特异性，但它们依赖两个向导rna到达靶位点，从而减少了基因组中潜在靶位点的数量。cas9的工程化版本创建了一个替代方案，该改进方案使用单一向导rna提高了保真度；(参见例如，qi,leis.等人，“repurposingcrisprasanrna-guidedplatformforsequence-specificcontrolofgeneexpression.cell152.5(2013):1173-1183，其通过引用以其整体并入本文)。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是spcas9-hf1或hypacas9kleinstiver(参见例如，benjaminp.等人high-fidelitycrispr–cas9nucleaseswithnodetectablegenome-wideoff-targeteffectsnature529.7587(2016):490；chen,janices.等人，enhancedproofreadinggovernscrispr–cas9targetingaccuracynature550.7676(2017):407，其每一个通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是识别广泛的pam序列的xcas9核酸酶，从而将基因组中的靶位点增加到四分之一(参见例如，hu,johnnyh.等人，evolvedcas9variantswithbroadpamcompatibilityandhighdnaspecificitynature(2018)，通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是分割型cas9(splitcas9)。可进行与荧光蛋白如gfp的融合。这将允许对基因组位点进行成像(参见“dynamicimagingofgenomiclociinlivinghumancellsbyanoptimizedcrispr/cassystem”chenb等人，cell2013)，但是以可诱导的方式。如此，在一些实施方案中，一个或多个cas9部分可以与荧光蛋白(例如gfp)缔合(并且特别是与之融合)。通常，使用分割型case9方法可以对case9进行任意使用，无论是寻求野生型、切口酶还是失活cas9(具有或不具有相关的功能域)。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是二聚体crisprrna引导的fokl核酸酶(参见，例如，tsaisg等人，natbiotechnol.2014.32(6):569-576，其通过引用以其整体并入本文)。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是脑膜炎奈瑟球菌(nmcas9)。nmcas9不同于其他已知的cas9核酸酶，例如，不同于sacas9和stcas9，因为它识别5'-nnnngatt-3'pam序列；参见，例如，esvelt,km.等人，naturemethods(2013)；和hou,z.等人，pnas(2013)，其内容通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是截短的。如本文所用，“截短的(truncated)”是指一种核酸酶已被修饰以从野生型序列去除某些氨基酸。截短的核酸酶可以保留其功能，例如，dna切割，或者它可以缺乏其功能(例如，无活性的核酸酶)。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是截短的cas9。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是截短的nmcas9。截短的cas9核酸酶例如，nmcas9的序列进一步描述于美国专利申请号2019/0040371，其通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，crispr相关的核酸酶是无活性cas9、失活cas9(也称为dcas9)。失活cas9(dcas9)crispr变体是通过简单地使核酸酶催化结构域失活同时保持识别结构域而制成的，识别结构域允许向导rna介导的对特定dna序列的靶向(komor,alexisc.等人programmableeditingofatargetbaseingenomicdnawithoutdouble-strandeddnacleavage)”nature533.7603(2016):420，通过引用以其整体并入本文)。已知dcas9通过物理阻断转录使基因表达沉默。dcas9也已经与其他蛋白质融合并用于各种应用。例如，基因激活剂或抑制剂可以与dcas9融合以激活或阻遏基因表达(crispra和crispri)。此外，将荧光染料标记至dcas9能够使基因组中的特定dna片段可视化(gaudelli,nicolem.等人，programmablebaseeditingofa·ttog·cingenomicdnawithoutdnacleavagenature551.7681(2017):464，其通过引用以其整体并入本文)。在一个实施方案中，使用了foki融合的dcas9(abudayyeh,omaro.等人，c2c2isasingle-componentprogrammablerna-guidedrna-targetingcrispreffector.science353.6299(2016):aaf557314，通过引用以其整体并入本文)。在一个实施方案中，失活的crispr相关的核酸酶因用作碱基编辑器而成为功能性基因编辑核酸酶。碱基编辑器酶由与将gc转化为at的催化酶，胞苷氨酶融合的失活cas9结构域组成或者由例如与cas9融合的将at转化为gc的trna腺苷脱氨酶组成，因此允许基因组中全范围的核苷酸交换：参见例如，komor,alexisc.等人，programmableeditingofatargetbaseingenomicdnawithoutdouble-strandeddnacleavage.nature533.7603(2016):420；gaudelli,nicolem.等人，programmablebaseeditingofa·ttog·cingenomicdnawithoutdnacleavage.nature551.7681(2017):464；通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，靶序列是rna并且crispr相关的核酸酶是rna编辑器例如cas1391和cas1392(参见例如，abudayyeh,omar0.等人，rnatargetingwithcrispr—cas13.nature550.7675(2017):280；smargon,aarona.等人，cas13bisatypevi-bcrispr-associatedrna-guidedrnasedifferentiallyregulatedbyaccessoryproteinscsx27andcsx28.”molecularcell65.4(2017):618-630；其每一个通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，核酸酶是cas13d。通过扫描原核生物序列获得类似于先前已知的cas13酶的核酸酶，鉴定了cas13d核糖核酸酶家族。这些rna引导的rna酶比cas13a—cas13c核酸酶小约20％，但显示出与先前已知的变体相当的靶向效率。这些酶的较小尺寸赋予它们若干优点，例如更便于包装和递送到细胞中(参见例如，konermann,silvana等人，“transcriptomeengineeringwithrna-targetingtypevi-dcrispreffectors.cell(2018)；yan,winstonx.等人cas13disacompactrna-targetingtypevicrispreffectorpositivelymodulatedbyawyl-domain-containingaccessoryprotein.molecularcell(2018)，其每一个通过引用以其整体并入本文)。靶多核苷酸(例如，靶序列)包括本文所述的共定位复合物可用于调控或切割的任何多核苷酸序列。靶多核苷酸包括基因。出于本公开的目的，dna(例如双链dna)可包括靶多核苷酸，并且共定位复合物可在靶多核苷酸处或挨着靶多核苷酸或在靶多核苷酸附近与dna结合或以其他方式与dna共定位并且以共定位复合物可对靶多核苷酸发挥所需作用的方式。这样的靶多核苷酸可以包括内源性(或天然存在的)多核苷酸和外源性(或外来的)多核苷酸。基于本公开，本领域技术人员将能够容易地鉴定或设计共定位至包括靶核酸的dna的向导rna和cas9蛋白。技术人员还能够鉴定同样共定位至包括靶核酸的dna的转录调控蛋白或结构域。dna包括基因组dna、线粒体dna、病毒dna或外源dna。在一个实施方案中，靶多核苷酸是疾病基因。如本文所用，“疾病基因”是指具有导致给定疾病或引起给定疾病发作的遗传改变(例如，遗传突变)的基因。遗传改变可以是但不限于错义突变、无义突变、取代、插入、缺失、重复、移码突变、易位、倒位、重复扩增或编码的隐蔽(cryptic)起始位点或终止位点。遗传改变可导致例如基因或基因产物的活性增加、基因或基因产物的活性降低、基因的可变剪接、截短的基因或基因产物或延长的基因或基因产物。换句话说，疾病基因的遗传改变导致基因或基因产物的活性、功能和/或水平与野生型基因(例如，不具有基因突变的基因)相比被改变。下文进一步描述可以用本文所述的系统治疗的示例性疾病及其相应的疾病基因。给定疾病的疾病基因是本领域已知的。本领域技术人员可以使用标准技术确定受试者中给定基因的遗传改变的类型。例如，可对患有给定疾病的受试者进行基因组测序，并比较未患有该疾病的受试者的基因组序列。使用该技术，本领域技术人员可以评估受试者基因组中任何基因的序列，或者可以专门集中于推定的或已知的疾病基因。如本文所用，术语“向导rna”通常是指这样的rna分子(或总的一组rna分子)，其可以结合crispr相关的核酸酶(例如，核酸内切酶，例如cas蛋白)并且帮助将核酸内切酶靶向至靶多核苷酸(例如，dna)内的特定位置。向导rna可以包含crrna片段和tracrrna片段。如本文所用，术语“crrna”或“crrna片段”是指rna分子或其部分，其包括多核苷酸靶向引导序列、茎序列和任选的5'突出端序列(5'-overhangsequence)。如本文所用，术语“tracrrna”或“tracrrna片段”是指包括蛋白结合片段的rna分子或其部分(例如，蛋白结合片段能够与crispr相关蛋白如cas9相互作用。术语“向导rna”涵盖单一向导rna(sgrna)，其中crrna片段和tracrrna片段位于同一rna分子中。术语“向导rna”还共同涵盖两种或更多种rna分子的组，其中crrna片段和tracrrna片段位于不同的rna分子中。具有“grna功能”的合成向导rna是这样一种向导rna，其具有天然存在的向导rna的一种或多种功能(例如与核酸内切酶缔合)或向导rna与核酸内切酶联合所执行的功能。在某些实施方案中，功能性包括结合靶多核苷酸。在某些实施方案中，功能性包括将核酸内切酶或grna:核酸内切酶复合物靶向到靶多核苷酸。在某些实施方案中，功能性包括使靶多核苷酸产生切口。在某些实施方案中，功能性包括裂解靶多核苷酸。在某些实施方案中，功能性包括与核酸内切酶缔合或结合。在某些实施方案中，功能性是向导rna在具有核酸内切酶的crispr相关的核酸酶系统(包括具有工程化核酸内切酶，例如，工程化cas蛋白的人工crispr相关的核酸酶系统)中的任何其他已知功能。在某些实施方案中，功能性是天然向导rna的任何其他功能。合成的向导rna可以具有比天然存在的向导rna更高或更低程度的grna功能。在某些实施方案中，与类似的天然存在的向导rna相比，合成的向导rna可能在一种性质方面具有较大的功能性，而在另一种性质方面具有较小的功能性。例如，与本文所述系统一起使用的向导rna是本领域已知的，并且进一步描述于美国专利第9,834,791号；和专利申请号us2013/0254304。例如，与zfn系统一起使用的向导rna是本领域已知的，并且进一步描述于国际专利申请号w02014/186,585。本文引用的专利通过引用以其整体并入本文。可以使用例如以下的预测软件为给定的靶序列轻松生成向导rna序列：crisprdirect(可在万维网上的crisper.dbels.jp/获得)，参见natio等人bioinformatics(2015)4月1日；31(7):1120-1123；atumgrna设计工具(可在万维网上的atum.bio:ecommerce/cas9/input获得)；crispr-era(可在万维网上的crispr-era.stanford.eduu/indexjsp获得)，参见liu等人bioinformatics，(2015)11月15日；31(22):3676-3678。本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。公开可用的grna设计软件的非限制性实例包括：sgrnascorer1.0、quilt通用向导rna设计器、cas-offinder&cas-designer、crispr-era、crispr/cas9靶标在线预测器、设计grna的off-spotter、crisprmultitargeter、zifittargeter、crisprdirect、来自crispr.mit.edu/的crispr设计、e-crisp等。本文所述的向导rna可以被修饰，例如，通过化学修饰。向导rna的示例性化学修饰描述于例如专利申请w02016/089,433中，其通过引用以其整体并入本文。在本文所述的任何方法中，可以将结合调控序列和/或小分子和/或其他化合物的寡核苷酸导入包含本文所述的基因编辑系统的组分的细胞中，并且这样的细胞可以位于动物中，所述动物可以是人、非人哺乳动物(狗、猫、马、牛等)或其他动物。当编码一种或多种单一向导rna的核酸和编码本文所述的crispr相关的核酸酶(rna引导的核酸酶)的核酸各自需要在体内施用时，特别考虑使用腺病毒相关载体(aav)。用于同时将核酸递送至基因组编辑/片段化系统的所有组分(例如，sgrna、rna-引导的核酸内切酶)的其他载体包括慢病毒载体，例如eb(epsteinbarr)病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)和乙型肝炎病毒(hbv)。rna引导的基因组编辑系统的每个组分(例如，sgrna和核酸内切酶)可以在单独的载体(病毒或非病毒)中递送，如本领域已知的或如本文所述的。此外，与调控序列结合并阻止导致功能性核酸酶表达的剪接的基因编辑系统的寡核苷酸组分可以通过裸dna、非病毒载体或通过使用病毒载体递送。高剂量的核酸酶(例如cas9)可以加剧显示与导引链极少错配的脱靶序列的插入缺失(indel)频率。如果错配是不连续的和/或在向导物的种子区之外，则这样的序列是特别敏感的。在本文中，我们描述了一种通过核酸酶活性的特异性调控(对crispr相关的核酸酶活性的时间控制和局部控制)来减轻脱靶效应的方法。本文所述的基因编辑系统可以用于在长期表达实验中降低剂量并且因此导致与组成型活性的crispr相关的核酸酶(例如，cas9)相比降低的脱靶插入缺失。在一些实施方案中，使用了使毒性和脱靶效应的水平最小化的其他方法，并且包括例如使用cas切口酶mrna(例如，具有d10a突变的酿脓链球菌cas9)和一对靶向目标位点的向导rna，还参见wo2014/093622(pct/us2013/074667)，其通过引用以其整体并入本文。结合本发明的调控序列的寡核苷酸是阻止在特定剪接位点的剪接活性的寡核苷酸(例如，rna或dna或两者的组合)。结合调控序列的寡核苷酸结合的核苷酸序列是指导剪接事件的剪接元件组例如第二组剪接元件的成员，从而抑制剪接。因此，结合调控序列的寡核苷酸可以与剪接点、5'剪接元件、3'剪接元件、隐蔽剪接元件、分支点、隐蔽分支点、天然剪接元件、突变剪接元件等互补。本发明的结合调控序列的寡核苷酸的一些非限制性实例包括对珠蛋白内含子654t突变特异的gctattaccttaacccag(seqidno:37)；对珠蛋白内含子657gt突变特异的gcacttaccttaacccag(seqidno:38)。其他实例包括包含以下的核苷酸序列、主要由以下的核苷酸序列组成或由以下的核苷酸序列组成的寡核苷酸：seqidno:37、38、42、49、46、47、48、39、40、41、43、44、45、72、73、76、79和80。在这些寡核苷酸序列的上下文中，“主要由…组成”意指该寡核苷酸可以在寡核苷酸序列的3'端或5'端包括另外的核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的核苷酸)，这些另外的核苷酸实质上不影响寡核苷酸的功能或活性(例如，这些另外的核苷酸不与互补于原始寡核苷酸序列的序列杂交)。在一个实施方案中，结合调控结构域的寡核苷酸具有选自表4的序列。在一个实施方案中，具有seqidno:138的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon1)结合具有seqidno:143序列的调控序列。在一个实施方案中，具有seqidno:139的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon2)结合具有seqidno:144的序列的调控序列。在一个实施方案中，具有seqidno:140的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon3)结合具有seqidno:145的序列的调控序列。在一个实施方案中，具有seqidno:141的序列的寡核苷酸(例如，lna-aon4)结合具有seqidno:146的序列的调控序列。在一个实施方案中，具有seqidno:142的序列的寡核苷酸(例如，lna-654)结合具有seqidno:147的序列的调控序列。在一个实施方案中，寡核苷酸结合的调控序列选自表5。在一个实施方案中，调控序列野生型247aa:gggttaag/gcaatagc具有seqidno:148的核苷酸序列。在一个实施方案中，结合野生型247aa调控序列的寡核苷酸(oligo)是寡核苷酸在一个实施方案中，调控序列ivs2(s0)-654:gggttaag/gtaatagc具有seqidno:147的核苷酸序列。在一个实施方案中，结合ivs2(s0)-654调控序列的寡核苷酸是寡核苷酸oligo5'-gctattaccttaaccc-3'(seqidno:142)。在一个实施方案中，调控序列luc-aon1:gagggcag/gtgagtac具有seqidno:143的核苷酸序列。在一个实施方案中，结合luc-aon1调控序列的寡核苷酸是寡核苷酸在一个实施方案中，调控序列luc-aon2:gtgccgag/gtaagttc具有seqidno:144的核苷酸序列。在一个实施方案中，结合luc-aon2调控序列的寡核苷酸是寡核苷酸在一个实施方案中，调控序列luc-aon3:ctgactag/gtgagtcc具有seqidno:seqidno:145的核苷酸序列。在一个实施方案中，结合luc-aon3调控序列的寡核苷酸是寡核苷酸在一个实施方案中，调控序列luc-aon4:gccaatag/gtaagtgc具有seqidno:146的核苷酸序列。在一个实施方案中，结合luc-aon4调控序列的寡核苷酸是寡核苷酸在一些实施方案中，结合调控序列的寡核苷酸可以是不激活rna酶h的寡核苷酸。不激活rna酶h的寡核苷酸可以根据已知技术制备。参见，例如，pederson等人的美国专利第5,149,797号。这种寡核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，包含在空间上阻碍或阻止rna酶h与包含该寡核苷酸作为其一个成员的双链体分子的结合的任何结构修饰，该结构修饰基本上不阻碍或破坏双链体的形成。因为参与双链体形成的寡核苷酸部分与参与rna酶h结合的寡核苷酸部分有很大的不同，所以许多不激活rna酶h的寡核苷酸是可用的。本发明的寡核苷酸也可以是这样的寡核苷酸，其中至少一个或全部核苷酸间桥连的磷酸酯残基是修饰的磷酸酯，例如甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、磷酰吗啉酯(phosphoromorpholidate)、磷酰哌嗪酯(phosphoropiperazidate)和氨基磷酸酯(phosphoramidate)。作为另外的实例，核苷酸间桥连磷酸酯残基中的每隔一个可以如描述的那样进行修饰。在另一个非限制性实例中，这种寡核苷酸是其中至少一个或全部核苷酸含有2'低级烷基部分(例如，c1-c4、直链或支链的、饱和或不饱和的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)的寡核苷酸。例如，核苷酸中每隔一个可以如描述的那样进行修饰。(还参见furdon等人nucleicacidsres.17:9193-9204(1989)；agrawal等人，proc.natl.acad.sci.usa87:1401-1405(1990)；baker等人nucleicacidsres.18,3537-3543(1990)；sproat等人nucleicacidsres.17:3373-3386(1989)；walder和walder,proc.natl.acad.sci.usa85:5011-5015(1988))因此，在一些实施方案中，本发明的阻断核苷酸可以包含修饰的核苷酸间桥连磷酸酯残基，其可以是但不限于甲基硫代磷酸酯、磷酰吗啉酯、磷酰哌嗪酯和/或氨基磷酸酯的任意组合。在某些实施方案中，阻断可以包括在其2'位具有低级烷基取代基的核苷酸。本文所述的调控序列的寡核苷酸可被例如小分子修饰以增加其在细胞中向rna的募集。以这种方式修饰的寡核苷酸当在细胞中与小分子共表达时将具有增加的结合和裂解rna的效率。对这种修饰的其他综述可见于，例如，costales,mg等人，j.am.chem.soc.2081,140；6741,-6744；美国专利申请号us2008/0227213a1；和国际专利号wo2015/021415a1；其每一个通过引用以其整体并入本文。可以修饰本文的结合调控序列的寡核苷酸，例如为了增加寡核苷酸的渗透性、亲和力、稳定性(例如，防止其降解)和药效学性质。这种修饰的实例包括但不限于肽核酸(pna)和锁核酸(lna)。这些修饰的进一步综述可见于，例如，havens,ma等人nucleicacidsresearch2016:44(14)；6549-6563，其通过引用以其整体并入本文。在pna中，主链由通过肽键连接的重复的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。不同的碱基(嘌呤和嘧啶)通过亚甲基羰基键(methylcarbonyllinkage)与主链连接。不同于dna或其他dna类似物，pna不含有任何戊糖部分或磷酸基团。pna被描述得类似n末端在第一(左)位置且c末端在右的肽。pna主链不带电荷，并且这为该聚合物提供的pna/dna链之间的结合比在pna链和在dna链之间强得多。这是由于pna和dna链之间缺乏电荷排斥。与在低于10℃的温度下变性的dnadt/dnada6聚体双链体相比，使用同型嘧啶链的早期实验显示6聚体pnat/dnada的tm被确定为31℃。其肽主链带有嘌呤和嘧啶碱基的pna并不是容易被核酸酶或蛋白酶识别的分子种类。因此它们抗酶降解。pna在宽ph范围内也是稳定的。因为它们不易被酶降解，这些聚合物的寿命在体外和体内都被延长。此外，它们不带电荷的事实有助于它们穿过细胞膜，并且它们更强的结合特性应减少调控基因表达所需的寡核苷酸的量。lna是一类含有核苷的核酸，其主要的区别特征是在核糖环的2'-o和4'-c原子之间存在亚甲基桥。该桥限制了核苷酸类似物的呋喃核糖环的柔性并将其锁定为刚性双环n-型构象。此外，lna诱导相邻的dna碱基采取这种构象，导致形成热力学上更稳定形式的a双链lna核苷，其含有在dna(a、t、g、c)中出现的四个常见核酸碱基，它们可以根据标准沃森-克里克法则与其互补核苷碱基配对。使用标准亚磷酰胺dna合成化学可以将lna与dna或rna以及其他核酸类似物混合。因此，lna寡核苷酸可以容易地用例如氨基-接头、生物素、荧光团等加标签。因此，在引物和探针的设计中存在非常高的自由度。它们的锁定构象增加了对互补序列的结合亲和力，并提供了新的化学方法来优化和微调用于灵敏和特异地检测核酸的引物和探针。该差异在实验上可观察为lna-na异源双链体的增加的热稳定性，并且取决于序列中存在的lna核苷的数目以及所使用的碱基的化学性质。这种实验差异可用于调控寡核苷酸探针的特异性，该探针被设计为通过标准杂交技术检测特定核酸靶标。如本文所用，“第二组剪接元件的成员”包括参与激活来自前体mrna的第二内含子剪接的任何元件。例如，第二组剪接元件的元件可以是天然dna和/或前体mrna中的突变的结果，该突变可以是产生新剪接元件的置换突变和/或添加突变和/或缺失突变。新剪接元件因此是限定第二内含子的第二组剪接元件的一个成员。第二组剪接元件的其余成员也可以是限定第一内含子的剪接元件组的成员。例如，如果突变产生了既在第一3'剪接位点上游(即在其5'端)又在第一分支点下游(即在其3'端)的新的第二3'剪接位点，那么第一5'剪接位点和第一分支点可作为第一组剪接元件和第二组剪接元件二者的成员。在一些情况下，导入第二组剪接元件可导致正常休眠的或作为剪接元件不起作用的rna的天然区域被激活并用作剪接元件。这些元件被称为“隐蔽(cryptic)”元件。例如，如果导入新的3'剪接位点，其位于第一3'剪接位点和第一分支点之间，则其可以激活新的3'剪接位点和第一分支点之间的隐蔽分支点。在其他情况下，导入位于第一分支点和第一5'剪接位点之间的新的5'剪接位点可以进一步在该新的5'剪接位点的上游顺序地激活隐蔽3'剪接位点和隐蔽分支点。在这种情况下，第一内含子被分为两个异常内含子，其间有一个新的外显子。此外，在第一剪接元件(特别是分支点)也是第二组剪接元件的成员的一些情况下，有可能会阻断第一元件并激活隐蔽元件(即，隐蔽分支点)，该隐蔽元件将募集第一组剪接元件的其余成员相对于不正确的剪接强制正确的剪接。还要注意，当激活隐蔽剪接元件时，它可以位于内含子和/或相邻外显子中的一个外显子中。因此如上所述，根据构成“第二组剪接元件”的剪接元件组，本发明的结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物可以阻断各种不同的剪接元件以实施本发明。例如，它可以阻断突变元件、隐蔽元件、天然元件、5'剪接位点、3'剪接位点和/或分支点。通常，如上所述，它不会阻断也定义第一内含子的剪接元件，当然考虑了阻断第一内含子的剪接元件激活隐蔽元件的情况，该隐蔽元件随后充当第一组剪接元件的替代成员并参与正确剪接。结合调节序列的寡核苷酸的长度(即其中的核苷酸数目)不是关键的，只要其选择性地结合期望的位置即可，并且可以根据常规程序确定。因此，在一些实施方案中，本发明的结合调控序列的寡核苷酸的长度可以为约5至约100个核苷酸。特别地，本发明的阻断核苷酸长度可以是约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的结合调控序列的寡核苷酸长度为8至50个核苷酸。又在本发明的其他实施方案中，结合调控序列的寡核苷酸的长度为15-25个核苷酸，并且长度也可以是18-20个核苷酸。结合调控序列的寡核苷酸可以作为相同寡核苷酸的群体和/或以任何组合和/或相对于彼此的任何比例存在的不同寡核苷酸的群体用在本文所述的方法中。本发明的小分子是与其他小分子相比结构和/或功能不同并且具有低分子量(例如，小于5,000道尔顿)的活性化合物。小分子可以是天然或合成物质。它们可以通过有机化学方案合成和/或从天然来源如植物、真菌和微生物分离。小分子可以是“药物样的”(例如，阿斯匹林、青霉素、化疗药物)有毒的和/或天然的。小分子药物可以是一种或多种活性化合物，通常配制为可口服的丸剂，其与特定的生物靶标(例如受体、酶或离子通道)相互作用以提供治疗效果。本发明的小分子的具体但非限制性的实例包括抗生素、核苷类似物(例如，丰加霉素)和适体(例如，rna适体；dna适体)。本发明的小分子可以是存在于任何数量的小分子文库中的小分子，其中一些可商购获得。可以含有本发明的小分子的文库的非限制性实例包括从各种商业实体例如specs和biospecb.v.(rijswijk荷兰)、chembridgecorporation(sandiego,ca)、comgenexusainc.,(princeton,nj)、maybridgechemicalltd.(cornwall,uk)以及asinex(moscow,russia)获得的小分子文库。一个典型实例称为diversettm，可从chembridgecorporation,16981viatazon,suiteg,sandiego,calif.92127获得。diversettm含有10,000至50,000个药物样、手工合成的小分子。预先选择化合物以形成“通用”库，该“通用”库涵盖具有最小数量的化合物的最大药效团多样性且适于高通量或低通量筛选。关于其他文库的描述，参见，例如tan等人，“stereoselectivesynthesisofovertwomillioncompoundshavingstructuralfeaturesbothreminiscentofnaturalproductsandcompatiblewithminiaturizedcell-basedassays120,8565-8566,1998；floyd等人，progmedchem36:91-168,1999。许多文库可从例如analyticonusainc.,p.o.box5926,kingwood,tex.77325；3d制药公司(3-dimensionalpharmaceuticals,inc.)，665stocktondrive,suite104,exton,pa.19341,-1151；triposinc.,1699hanleyrd.,st.louis,mo.,63144-2913等商购获得。本发明的小分子和其他化合物可以通过多种机制起作用以改变本发明核酸中的剪接事件。例如，本发明的小分子和其他化合物可以干扰剪接复合物、剪接体及其组分例如hnrnp、snrnp、sr-蛋白和其他剪接因子或元件的形成和/或功能和/或其他性质，导致前体mrna分子中的剪接事件被阻止和/或诱导。作为另一个实例，本发明的小分子和其他化合物可以防止和/或修饰基因产物的转录，该基因产物可以包括例如但不限于hnrnp、snrnp、sr蛋白和其他剪接因子，其随后参与特定剪接体的形成和/或功能。本发明的小分子和其他化合物还可以防止和/或改变基因产物的磷酸化、糖基化和/或其他修饰，该基因产物包括但不限于hnrnp、snrnp、sr蛋白和其他剪接因子，其随后参与特定剪接体的形成和/或功能。另外，本发明的小分子和其他化合物可以结合和/或以其他方式影响特异性前体mrna，从而通过不涉及以序列特异性方式与rna碱基配对的机制来阻止或诱导特定剪接事件。本发明还提供了在受试者中进行基因编辑的方法，包括：a)将本发明的基因编辑系统导入受试者；和b)将本发明的结合调控序列的寡核苷酸和/或小分子和/或阻断第二组剪接元件的成员的其他化合物导入受试者，从而产生在受试者中赋予生物学功能的蛋白质和/或rna。可以根据领域已知的方法随时间监测受试者中发生的基因编辑的程度，并且当量降至期望的和/或治疗水平以下时，可以将结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物导入受试者中以增加蛋白质和/或rna的产量，从而调控产量。在本文所述的方法中，其中在结合调控序列的寡核苷酸和/或小分子和/或其他化合物(它们的存在将导致第二组剪接元件中的成员被阻断)不存在或不存在其表达的情况下将本发明的基因编辑系统施用给受试者，该核酸、载体和/或细胞可能最初存在于受试者中。在这种状态下，第二组剪接元件是有活性的，并且受试者中不产生或极少(例如，微不足道)产生赋予生物学功能的如由核酸酶序列编码的外源蛋白、肽和/或rna。当受试者中存在本发明的结合调控序的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物时，核酸上的第二组剪接元件的成员被阻断，导致第一内含子通过剪接被去除并随后在受试者中产生由赋予生物学功能(例如，基因编辑)的核酸酶序列编码的蛋白质和/或rna。结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物可以在相对于将本发明的基因编辑系统导入受试者的任何时间导入受试者。例如，可以在将核酸、载体和/或细胞导入受试者之前、同时和/或之后，将结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物导入受试者。此外，结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物可以在任何时间间隔内一次或多次施用，并且可以延长至贯穿受试者的寿命。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，包括：a)将有效量的本发明的基因编辑系统导入受试者；和b)将有效量的本发明的结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物导入受试者，从而治疗受试者中的病症。当核酸、载体和/或细胞以及结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物在受试者中存在时，它们是在结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物能够接触核酸并阻断第二组剪接元件的成员的条件下存在的，从而导致受试者中产生赋予生物学功能的蛋白质、肽和/或rna。参见例如图11；当第二组剪接元件被结合调控序列(aso(lna544))的寡核苷酸阻断时，产生了编码正确蛋白质而没有非天然外显子的mrna(cs)。然而，当缺少寡核苷酸时，第一内含子和第二内含子逐个地被从前体mrna剪接，产生包含(例如，包含框内终止密码子的)非天然存在的外显子的mrna，并且产生无功能蛋白质(as)。在另外的实施方案中，根据本发明的方法调控基因表达可以与本文所述系统相反地进行。具体地，在一些实施方案中，在存在结合调控序列的寡核苷酸、调控剪接介导的表达的小分子和/或其他化合物时，系统处于本文所述的“关闭(off)”位置。在一个实施方案中，例如，本文所述的基因编辑系统的“打开(on)”和“关闭(off)”控制在空间控制下被选择性地控制。例如，系统的组分可以被局部递送/施用至期望的位点、位置、器官、细胞类型、组织类型等，以诱导基因编辑系统局部“打开(on)”。不需要所有组分都被局部递送/施用。在一个实施方案中，组分(a)和(b)可以全身施用，而组分(c)可以局部施用，导致基因编辑系统的局部控制(例如，“打开(on)”)。在一个实施方案中，组分(a)和(b)可以局部施用，而组分(c)可以全身施用。可以通过将组分直接递送至特定位置来实现基因编辑系统的组分的局部递送。可选地，可使用将组分驱动至特定位置的定位序列或允许所述组分在特定位置表达的特定启动子来实现局部递送。在一个实施方案中，通过直接注射(例如注射至肌肉、心脏或其他器官)来实现局部递送。在另一个实施方案中，本文所述的基因编辑系统的“打开(on)”和“关闭(off)”控制在时间控制下被选择性地控制。例如，可以在给定的持续时间内施用基因编辑系统的组分，以控制系统“打开(on)”或“关闭(off)”的时间。例如，组分(c)的脉冲施用(例如，间歇施用)可能导致基因编辑系统反复地“打开(on)”和“关闭(off)”。在一个实施方案中，本文所述的基因编辑系统的“打开(on)”和“关闭(off)”控制在时间控制和空间控制下被选择性地控制。治疗本发明的基因编辑系统、结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物的“有效量”是指无毒但足以提供期望效果(可能是有益效果和/或治疗效果)的量。如本领域所充分理解的，所需的确切量将随受试者而变化，这取决于受试者的年龄、性别、物种、一般情况、正在治疗的病况的严重程度、所施用的特定药剂等。在任何单独情况下，适当的“有效”量可以由本领域技术人员通过参考相关的教科书和文献(例如，remington’spharmaceuticalsciences(最新版本))和/或通过使用常规药理学程序来确定。本文所用的“治疗(treat或treating)”是指任何类型的治疗，其对被诊断患有、有风险患有、怀疑患有和/或可能患有能够以有利方式对本发明的蛋白质和/或rna作出响应的疾病或病症的受试者给予益处。益处可包括受试者的病况(例如，一种或多种症状)的改善、病况进展的延迟和/或逆转、疾病或病症发作的阻止或延迟等。可以通过本发明的方法治疗的疾病和/或病症的非限制性实例和可以由本发明的核酸酶序列编码并且可以赋予治疗效果的基因产物的一些实例包括代谢疾病，例如糖尿病(胰岛素)、生长/发育障碍(生长激素；调控生长因子的锌指蛋白)、血液凝固障碍(例如，血友病a(因子viii)；血友病b(因子ix)、中枢神经系统疾病(例如，癫痫发作(seizure)、帕金森病(神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)和gdnf样生长因子)、阿尔茨海默病(神经生长因子、gdnf和gdnf样生长因子)、肌萎缩性侧索硬化、脱髓鞘疾病)、骨同种异体移植(骨形态发生蛋白2)(蛋白1-9，例如，mbp2)、炎性病症(例如，关节炎、自身免疫性疾病)、肥胖、癌症、心血管疾病(例如，充血性心力衰竭(磷蛋白和与ca泵有关的基因)、黄斑变性(色素上皮衍生因子(pdef)、13-地中海贫血、a-地中海贫血、泰-萨综合征(tay-sachssyndrome)、苯丙酮尿症、囊性纤维化和/或病毒感染)。另外的实例包括编码可溶性cd4的核酸(用于治疗aids)和编码α-抗胰蛋白酶的核酸(用于治疗由α-抗胰蛋白酶缺乏引起的肺气肿)。可以通过本发明的方法和组合物治疗的其他疾病、综合征和病况包括，例如，腺苷脱氨酶缺乏症、镰状细胞缺乏症、脑病如亨廷顿氏病、溶酶体贮积病、戈谢病、赫尔勒氏综合征、克拉伯氏病、运动神经元疾病如显性脊髓小脑性共济失调(实例包括sca1、sca2和sca3)、地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症和心脏病，例如由胆固醇代谢改变和免疫系统缺陷引起的那些。可通过这些方法治疗的其他疾病包括代谢性疾病，例如肌肉骨骼疾病、心血管疾病和癌症。还可以将本发明的基因编辑系统递送至气道上皮细胞以治疗遗传疾病例如囊性纤维化、假性醛固酮减少症(pseudohypoaldosteronism)和纤毛不动综合征以及非遗传疾病(例如，支气管炎、哮喘)。还可以将本发明的基因编辑系统递送至肺泡上皮细胞以治疗遗传疾病如α-1-抗胰蛋白酶以及肺病(例如，治疗肺炎和肺气肿肺纤维化、肺水肿；将编码表面活性蛋白的核酸递送至早产婴儿或ards患者)。通常，本发明的基因编辑系统可用于递送具有生物学功能的任何核酸，以治疗或改善与基因表达相关的任何疾病相关的症状。例证性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(和其他肺部疾病)、血友病a、血友病b、地中海贫血、贫血和其他血液病、aids、癌症(例如，脑肿瘤)、糖尿病、肌肉萎缩症(例如，杜氏肌肉萎缩症、becker型肌肉萎缩症)、戈谢病、赫尔勒氏综合征、腺苷脱氨酶缺乏症、糖原贮积病和其他代谢缺陷、粘多糖病以及实体器官(例如脑、肝、肾、心脏、肺、眼睛等)的疾病。在某些实施方案中，可以施用本发明的递送载体以治疗cns疾病，包括遗传疾病、神经变性疾病、精神障碍和/或肿瘤。示例性的cns疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、雷特综合征、卡纳万病、雷氏病(leigh'sdisease)、雷夫叙姆病、妥瑞综合征、原发性侧索硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、进行性肌萎缩症、匹克氏病、肌肉萎缩症、多发性硬化症、重症肌无力、宾斯旺格病(binswanger'sdisease)、脊髓或头部受伤引起的外伤、泰萨病(taysachsdisease)、lesch-nyhan综合征、癫痫、脑梗塞、精神疾病包括情绪障碍(例如抑郁症、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性情绪障碍)、精神分裂症、药物依赖(例如，酒精中毒和其他物质依赖)、神经症(例如，焦虑、强迫性障碍、躯体形式障碍、解离性障碍、忧郁、产后抑郁症)、精神病(例如，幻觉和妄想)、痴呆、妄想症、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、饮食或体重障碍(例如，肥胖、恶病质、神经性厌食症和贪食症)以及cns的癌症和肿瘤(例如，垂体肿瘤)。可根据本发明的方法治疗的cns病症包括涉及视网膜、后束(posteriortract)和视神经的眼科病症(例如，色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病和其他视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)。大多数(如果不是全部)眼科疾病和病症与以下三种类型的适应症状中的一种或多种相关：(1)血管生成、(2)炎症和(3)退化。本发明的递送载体可用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞退化、促进细胞存留(cellsparing)或促进细胞生长的因子以及前述的组合。例如，糖尿病性视网膜病的特征为血管生成。可通过眼内(例如，在玻璃体中)或眼周(例如，在眼球筋膜下区域中)递送一种或多种抗血管生成因子来治疗糖尿病性视网膜病。一种或多种神经营养因子也可通过眼内(例如，在玻璃体内)或眼周被共递送。葡萄膜炎涉及炎症。一种或多种抗炎因子可以通过眼内(例如，玻璃体或前房)施用本发明的核酸来施用。相比之下，色素性视网膜炎的特征为视网膜变性。在代表性的实施方案中，色素性视网膜炎可以通过眼内(例如，玻璃体)施用编码一种或多种神经营养因子的递送载体来治疗。年龄相关性黄斑变性涉及血管生成和视网膜变性。这种疾病可通过眼内(例如，玻璃体)施用编码一种或多种神经营养因子的本发明的基因编辑系统和/或眼内或眼周(例如，在筋膜下区域(sub-tenon’sregion)中)施用编码一种或多种抗血管生成因子的本发明的基因编辑系统来治疗。青光眼的特征为眼压升高和视网膜神经节细胞损失。青光眼的治疗包括使用本发明的递送载体施用一种或多种保护细胞免受兴奋毒性损伤的神经保护试剂。这类试剂包括经眼内递送，优选经玻璃体内递送的n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)拮抗剂、细胞因子和神经营养因子。在其他实施方案中，本发明可用于治疗癫痫，以降低癫痫的发作、发病率和/或严重性。癫痫的治疗方法的疗效可以通过行为(例如，眼睛或嘴巴的抖动、声响(tick))和/或电记录方式(electrographicmeans)(大多数癫痫发作具有电记录异常的征象)来评估。因此，本发明还可以用于治疗癫痫，癫痫的标志是随着时间的推移多次发作。作为另一实例，可以使用本发明的递送载体将生长抑素(或其活性片段)施用给脑，以治疗垂体肿瘤。根据该实施方案，编码生长抑素(或其活性片段)的递送载体可以通过微量注射施用给垂体。同样，这种治疗可用于治疗肢端肥大症(即，垂体生长激素分泌异常)。生长抑素的核酸(例如，genbank登录号j00306)和氨基酸(例如，genbank登录号p01166含有加工的活性肽，生长抑素-28和生长抑素-14)序列是本领域已知的。在其他实施方案中，通过使用本发明的基因编辑系统可以调控可变剪接事件。例如，可以将本发明的基因编辑系统与本发明的结合调控序列的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物一起导入受试者以产生第一蛋白和/或rna，该第一蛋白和/或rna由于激活剪接组的特定组而在受试者中提供了生物学功能。相同的核酸可被工程化为编码不同的蛋白、肽和/或rna，该蛋白、肽和/或rna通过激活剪接组中的不同组而在受试者中提供生物学功能。当将本发明的结合调控序列的不同寡核苷酸、小分子和/或化合物导入受试者时，产生了不同的蛋白和/或rna。例如，当存在结合调控序列的第一寡核苷酸、小分子和/或其他化合物时，第一rna可以产生第一目的蛋白；并且在添加本发明的结合调控序列的不同的第二寡核苷酸、小分子和/或化合物之后，第二rna会导致产生第二目的蛋白或目的功能性rna(例如，可以产生第一蛋白的同种型(例如，白介素(il)-4)及其剪接变体il-4a2)。(参见，例如，fletcher等人“increasedexpressionofmrnaencodinginterleukin(il)-4anditssplicevariantil-4a2incellsfromcontactsofmycobacteriumtuberculosis,intheabsenceofinvitrostimulation”immunology2004年8月；112(4):669-73；minn等人，“insulinomasandexpressionofaninsulinsplicevariant”lancet2004年1月31日；363(9406):363-7；schlueter等人“tissue-specificexpressionpatternsoftheragereceptoranditssolubleforms--aresultofregulatedalternativesplicing？”biochimbiophysacta2003年10月20日；1630(1):1-6；vegran等人“implicationofalternativesplicetranscriptsofcaspase-3andsurvivininchemoresistance”bullcancer2005年3月；92(3):219-26；ren等人，“alternativesplicingofvitamind-24-hydroxylase:anovelmechanismfortheregulationofextra-renal1,25-dihydroxyvitamindsynthesis”jbiolchem.2005年3月23日；“mutanthuntingtonprotein:asubstratefortransglutaminase1,2,and3”jneuropatholexpneurol2005年1月；64(1):58-65；ding和keller，“splicevariantsofthereceptorforadvancedglycosylationendproducts(rage)inhumanbrain”neuroscilett.2005年1月3日；373(1):67-72；“transcriptscanningrevealsnovelandextensivesplicevariationsinhuman1-typevoltage-gatedcalciumchannel,cav1.2alsubunit”jbiolchem2004年10月22日；279(43):44335-43,epub200年8月6日。所有这些参考文献通过引用以其整体并入本文。本发明还以组合物提供了本发明的基因编辑系统。因此，在另外的实施方案中，本发明提供了在药学上可接受的载体中包含本发明的基因编辑系统、本发明的载体和/或本发明的细胞的组合物。“药学上可接受的载体”是指与药物组合物中的其他成分相容并且对受试者无害或无毒的载体。特别地，期望药学上可接受的载体是一种无菌载体，其被配制用于施用至或递送至本发明的受试者。还提供了包含本发明的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本文所述的组合物可被配制以便根据已知技术在药物载体中施用。参见，例如remington,thescienceandpracticeofpharmacy(最新版本)。载体可以是固体或液体、或两者，并且优选与本发明的组合物一起配制为单位剂量制剂，例如片剂，其可以占组合物重量的约0.01％或0.5％至约95％或99％。药物组合物通过任何熟知的制药技术制备，包括但不限于混合任选地包含一种或多种辅助成分的组分。本发明的药物组合物包括适合于口服、直肠、局部、吸入(例如，通过气雾剂)、含服(例如，舌下)、阴道、肠胃外(例如，皮下、肌内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤和粘膜表面，包括气道表面)以及经皮施用的那些；但是如本领域众所周知的，在任何给定情况下最合适的途径都取决于此类因素如受试者的物种、年龄、性别和总体状况，所治疗病况的性质和严重程度和/或正在施用的特定组合物的性质(即，剂量、配方)。适于口服施用的药物组合物可以以离散单位存在，例如胶囊剂、扁囊剂、锭剂或片剂，其各自含有预定量的本发明的组合物；粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油或油包水乳液。可以通过将本发明的组合物复合到能够耐受动物肠道中的消化酶降解的载体上来进行口服递送。这类载体的实例包括本领域已知的塑料胶囊或片剂。这类制剂通过任何合适的制药方法制备，该方法包括使组合物与合适的载体(其可含有一种或多种如上所述的辅助成分)联合的步骤。通常，通过将组合物与液体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地混合，并且随后如果需要，使所得混合物成形来制备根据本发明的实施方案的药物组合物。例如，可通过压缩或模制含有组合物的粉末或颗粒，任选地与一种或多种辅助成分一起来制备片剂。通过在合适的机器中压缩自由流动形式的组合物，例如任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合的粉末或颗粒来制备压缩片剂。通过在合适的机器中对用惰性液体粘合剂润湿的粉末状化合物进行摸制来制备模制片剂。适于含服(舌下)施用的药物组合物包括：锭剂，其在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含本发明的组合物；以及软锭剂，其在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含所述组合物。适于肠胃外施用的本发明的药物组合物可以包含本发明组合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制剂优选地与预期接受者的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使得组合物与预期接受者的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液、溶液和乳液可包括悬浮剂和增稠剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏溶液或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如盐水或注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，可以提供在密封容器中的单位剂型的本发明的可注射的、稳定的、无菌的组合物。该组合物可以以冻干剂的形式提供，该冻干剂可以用合适的药学上可接受的载体重构以形成适于注射到受试者体内的液体组合物。该单位剂型可以是约1μg至约10g的本发明的组合物。当组合物基本上不溶于水时，可以包括足够量的生理学上可接受的乳化剂，以在水性载体中乳化该组合物。一种这样的有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。适于直肠施用的药物组合物优选作为单位剂量的栓剂存在。这些可以通过将组合物与一种或多种常规固体载体诸如例如可可脂混合，然后使所得混合物成形来制备。适于局部施用给皮肤的本发明的药物组合物优选采取软膏剂、乳膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油的形式。可使用的载体包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增强剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，可以通过将本发明的药物组合物与能够进入皮肤的亲脂性试剂(例如，dmso)混合来进行局部递送。适于经皮施用的药物组合物可以是适于与受试者的表皮保持长时间紧密接触的离散贴剂的形式。适用于经皮施用的组合物也可通过离子电渗法递送(参见，例如，pharmaceuticalresearch3:318(1986))，并且通常采取本发明组合物的任选缓冲水溶液的形式。合适的制剂可以包含柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(ph6)或乙醇/水，并且可以含有0.1至0.1m的活性成分。本发明的组合物的有效量将随组合物和受试者的不同而变化，并且将取决于多种因素，例如年龄、物种、性别、体重、受试者的总体状况和待治疗的具体疾病或病症。有效量可以根据本领域技术人员已知的常规药理学程序来确定。在一些实施方案中，从约0.1μg/kg至约1gm/kg的剂量将具有治疗功效。在使用病毒载体递送本发明的基因编辑系统的实施方案中，可以测量病毒剂量以包括特定数量的病毒颗粒或噬斑形成单位(pfu)或感染性颗粒，这取决于所使用的病毒。例如，在一些实施方案中，特定的单位剂量可以包括约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017或1018pfu或感染性颗粒。本发明组合物的施用频率可以是赋予所需治疗效果必需的频率。例如，组合物可以每天施用一次、两次、三次、四次或更多次；每周施用一次、两次、三次、四次或更多次；每月施用一次、两次、三次、四次或更多次；每年施用一次、两次、三次或四次和/或根据控制特定病症和/或实现特定效果和/或益处的需要来施用。在一些实施方案中，在受试者的一生中，一剂、二剂、三剂或四剂可能足以实现所需的治疗效果。本发明组合物的施用量和施用频率将根据所治疗或待预防的具体病况和所需的治疗效果而变化。在一个实施方案中，在给定的时间段(例如，受试者的终生或疾病的持续时间)内将结合调控序列的寡核苷酸重复施用给受试者。例如，结合调控序列的寡核苷酸可以每天施用一次、两次、三次、四次或更多次；每周施用一次、两次、三次、四次或更多次；每月施用一次、两次、三次、四次或更多次；每年施用一次、两次、三次或四次，和/或根据控制特定病况和/或实现特定效果和/或益处的需要来施用。组合物的组分(例如，(a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体；(b)结合调控序列的寡核苷酸)可以基本上同时施用给受试者。可选地，这些组分可以在不同的时间施用，例如，(a)可以在施用(b)之后或之前至少一小时、至少一天、至少一周、至少一个月、至少一年施用。组合物的组分(例如，(a)包含编码crispr相关的核酸酶的核酸序列的载体；(b)结合靶基因序列的grna；和(c)结合调控序列的寡核苷酸)可以基本上同时施用给受试者。可选地，这些组分可以在不同的时间施用，例如，(a)和(b)可以基本上同时施用，并且(c)可以在(a)和(b)的施用之后至少一小时、至少一天、至少一周、至少一个月、至少一年施用。本文所述的基因编辑系统的组分不需要以相同的频率、间隔和/或水平施用。本文特别考虑的是，各组分以产生所需治疗效果的频率、间隔和/或水平施用。本发明的组合物可以在体内或体外施用给受试者的细胞。为了体内施用给受试者的细胞，以及为了施用给受试者，本发明的组合物可以例如如上所述通过口服、肠胃外(例如静脉内)、通过肌内注射、皮内(例如，通过基因枪)、腹膜内注射、皮下注射、透皮、体外、局部等进行施用。此外，可以根据本领域熟知的方法将本发明的组合物脉冲到从受试者的细胞分离或培养的树突细胞上，或者可以脉冲到大量pbmc或从受试者中消除的多种细胞上。如果采用离体方法，则可根据本领域熟知的标准方案将细胞或组织移出并维持在体外，同时将本发明的组合物导入到细胞或组织中。例如，本发明的基因编辑系统可以通过任何基因转移机制(例如病毒介导的基因递送、磷酸钙介导的基因递送、电穿孔、显微注射或蛋白脂质体)导入细胞。然后根据针对细胞或组织类型的标准方法，将转导的和/或转染的细胞输注(例如，在药学上可接受的载体中)或移植回受试者。用于将各种细胞移植或输注到受试者中的标准方法是已知的。本发明的制剂可以包含活性化合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制剂优选与预期接受者的血液等渗并且基本上无热原。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使得制剂与预期接受者的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如盐水或注射用水。本文所述的组分(例如，(a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体；(b)结合调控序列的寡核苷酸)可以配制到同一组合物(例如，一种组合物具有所有组分)中。可选地，这些组分可以配制到两种不同的组合物中。本文所述的组分(例如，(a)包含编码crispr相关的核酸酶的核酸序列的载体；(b)结合靶基因序列的grna；和(c)结合调控序列的寡核苷酸)可以配制到同一组合物(例如，一种组合物具有所有组分)。可选地，这些组分可配制到不同的组合物中，例如，(a)和(b)配制到一种组合物中，并且(c)配制到不同的组合物中；或者(a)、(b)、(c)全部配制到不同的组合物中。在一种制剂中，本发明的基因编辑系统的组分可以作为裸dna递送或导入受试者。在一种制剂中，本发明的基因编辑系统的组分可以包含在可能适合于肠胃外施用的脂质颗粒或囊泡中(例如脂质体或微晶)。只要化合物包含在其中，颗粒可以是任何合适的结构例如单层或多层。带正电荷的脂质如n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基-甲基硫酸铵或“dotap”对于这类颗粒和囊泡是特别优选的。这类脂质颗粒的制备是熟知的。参见，例如，janoff等人的美国专利第4,880,635号；kurono等人的美国专利第4,906,477号；wallach的美国专利第4,911,928号；wallach的美国专利no.4,917,951；allen等人的美国专利第4,920,016号；wheatley等人的美国专利第4,921,757号等等。在一种制剂中，本发明的基因编辑系统可以包含在纳米颗粒内。在另一种制剂中，本发明的基因编辑系统可以包含在重组aav衣壳内。在一个实施方案中，经由裸dna或在脂质颗粒、纳米颗粒或重组aav衣壳内将组分(c)递送到受试者或导入受试者。本发明的药物组合物可用于例如生产用于治疗本文所述的疾病和/或病症的药物。本发明包括以下序列：seqidno:1.质粒trcba-int-lucmut。核苷酸163-2036:cba启动子；核苷酸2739-4573:突变型内含子(654c-t)；核苷酸4592-4813:polya信号。seqidno:2.质粒trcba-int-luc(wt)。核苷酸163-2036:cba启动子；核苷酸2739-3588:野生型内含子(654c)；核苷酸2071-4573:荧光素酶中的内含子；核苷酸4592-4813:多聚a信号。seqidno:3.质粒trcba-int-luc(657gt)。核苷酸163-2036:cba启动子；核苷酸2739-3588:突变型内含子(654c-t)；657ta-gt)；核苷酸2071-4573:荧光素酶中的内含子；核苷酸4592-4813:多聚a信号。seqidno:4.质粒gl3-int-luc(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1797:突变型内含子(654c-t)；核苷酸2814-3035:多聚a信号；核苷酸280-2782:具有突变型内含子的荧光素酶。wo2006/119137pct/us2006/016514seqidno:5.质粒gl3-int-luc(wt)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1797:wt内含子(654c)；核苷酸280-2782:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2814-3035:多聚a信号。seqidno:6.质粒gl3-int-luc(657gt)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1797:内含子(654c-t；657ta-gt)；核苷酸280-2782:具有突变型内含子的荧光素酶；核苷酸2814-3035:多聚a信号。seqidno:7.质粒gl3-2int-fron-sph(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸251-1100；1771-2620:突变型内含子(654c-t)；核苷酸1103-3635:具有突变型内含子的荧光素酶；核苷酸3637-3858:多聚a信号。seqidno:8.质粒gl3-3int-2fron-sph(mut).核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸251-1100；1106-1965；2635-3484:突变型内含子(654c-t)；核苷酸1967-4469:具有突变型内含子的荧光素酶；核苷酸4514-4735:多聚a信号。seqidno:9.质粒gl3-int-luca(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸673-1522:内含子(654c-t)；核苷酸280-2782:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2814-3035:多聚a信号。seqidno:10.质粒gl3-int-lucb(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸1440-2289:内含子(654c-t)；核苷酸280-2782:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2814-3035:多聚a信号。seqidno:11.质粒gl3-int-lucc(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸1691-2540:内含子(654c-t)；核苷酸280-2782:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2814-3035:多聚a信号。seqidno:12.质粒gl3-int-fron(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸251-1100:内含子(654c-t)；核苷酸1103-2755:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2787-3008:多聚a信号。seqidno:13.质粒gl3-2int-sph(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1797；1798-2647:内含子(654c-t)；核苷酸280-3632:具有内含子的荧光素酶；核苷酸3664-3885:多聚a信号。seqidno:14.质粒gl3-2int-sphc(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1797；2541-3390:内含子(654c-t)；核苷酸280-3632:具有内含子的荧光素酶；核苷酸3664-3885:多聚a信号。seqidno:15.质粒gl3-sint200-sph(mut)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1597:内含子(654c-t)；核苷酸280-2582:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2794-2835:多聚a信号。seqidno:16.质粒gl3-sint200-sph(657gt)。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1597:内含子(654c-t；657ta-gt)；核苷酸280-2582:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2794-2835:多聚a信号。seqidno:17.质粒gl3-sint425-sph。核苷酸48-250:sv40启动子；核苷酸948-1373:内含子(654c-t)；核苷酸280-2358:具有内含子的荧光素酶；核苷酸2569-2615:多聚a信号。seqidno:18.突变型内含子(654c-t).seqidno:19.野生型内含子(654c).seqidno:20.具有两个突变(654c-t；657ta-gt)的内含子。seqidno:21.核苷酸669-1518处具有突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:22.核苷酸669-1518处具有野生型内含子的荧光素酶cdna。seqidno:23.核苷酸669-1518处具有双突变型内含子(c654c-t；657ta-gt)的荧光素酶cdna。seqidno:24.核苷酸1-850处具有突变型内含子(654c-t)和核苷酸1521-2370处具有突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:25.核苷酸1-850处具有突变型内含子(654c-t)以及核苷酸861-1710和核苷酸2385-3234处具有两个突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:26.可选位置a(核苷酸394-1243)处具有突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:27.可选位置b(核苷酸1161-2010)处具有突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:28.可选位置c(核苷酸1412-2261)处具有突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:29.在翻译起始位点上游(核苷酸1-850)具有突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:30.核苷酸669-1518和核苷酸1519-2368处具有两个突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:31.核苷酸669-1518和核苷酸2262-3111处具有两个突变型内含子(654c-t)的荧光素酶cdna。seqidno:32.核苷酸669-1318处有突变型内含子(654c-t)和200个碱基对缺失的荧光素酶cdna。seqidno:33.核苷酸669-1318处有双突变型内含子(654c-t；657ta-gt)和200个碱基对缺失的荧光素酶cdna。seqidno:34.核苷酸669-1094处有突变型内含子(654c-t)和425个碱基对缺失的荧光素酶cdna。seqidno:35.核苷酸2866-3715处具有α抗胰蛋白酶cdna和突变型内含子(654c-t)的质粒trcba。seqidno:36.核苷酸772-1621处具有突变型内含子(654c-t)的α抗胰蛋白酶cdna。seqidno:37.结合ivs2-654的调控序列的寡核苷酸gctattaccttaacccag。seqidno:38.结合ivs2-654(具有657gt突变)的调控序列的寡核苷酸gcacttaccttaacccag。seqidno:50(具有564ct突变的ivs2-654内含子)。seqidno:51(具有657g突变的ivs2-654内含子)。seqidno:52(具有658t突变的ivs2-654内含子)。seqidno:20(具有657gt突变的ivs2-654内含子)。seqidno:53(具有200bp缺失的ivs2-654内含子)。seqidno:54(具有425bp缺失的ivs2-654内含子)。seqidno:68(仅具有197bp的ivs2-654内含子)。seqidno:69(仅具有247bp的ivs2-654内含子)。seqidno:55(具有6a突变的ivs2-654内含子)。seqidno:56(具有564c突变的ivs2-654内含子)。seqidno:57(具有841a突变的ivs2-654内含子)。seqidno:58(ivs2-705内含子)。seqidno:59(具有564ct突变的ivs2-705内含子)。seqidno:60(具有657g突变的ivs2-705内含子)。seqidno:61(具有658t突变的ivs2-705内含子)。seqidno:62(具有657gt突变的ivs2-705内含子)。seqidno:63(具有200bp缺失的ivs2-705内含子)。seqidno:64(具有425bp缺失的ivs2-705内含子)。seqidno:65(具有6a突变的ivs2-705内含子)。seqidno:66(具有564c突变的ivs2-705内含子)。seqidno:67(具有841a突变的ivs2-705内含子)。seqidno:70(cftr外显子19野生型序列)。seqidno:71(cftr外显子193849+10kbc-t突变)。seqidno:72(cftr外显子19野生型寡核苷酸)。seqidno:70(cftr外显子193849+10kbc-t突变寡核苷酸)。seqidno:74(小鼠肌营养不良蛋白内含子22、外显子23和内含子23野生型序列)。seqidno:75(mdx小鼠肌营养不良蛋白内含子22、外显子23和内含子23无义突变)。seqidno:76(诱导反义外显子23跳跃的寡核苷酸)。seqidno:39(针对ivs2-654中6a突变的寡核苷酸)。seqidno:40(针对ivs2-654中564c突变的寡核苷酸)。seqidno:41(针对ivs2-654中564ct突变的寡核苷酸)。seqidno:43(针对ivs2-654中841a突变的寡核苷酸)。seqidno:44(针对ivs2-654中657g突变的寡核苷酸)。seqidno:45(针对ivs2-654中658t突变的寡核苷酸)。seqidno:42(针对ivs2-705中705g突变的寡核苷酸)。seqidno:49(针对ivs2-705的寡核苷酸)。seqidno:46(针对ivs2-654的寡核苷酸)。seqidno:47(针对ivs2-654的寡核苷酸)。seqidno:48(针对ivs2-654的寡核苷酸)。本文引用的所有出版物、专利申请、专利、专利出版物和其他参考文献通过引用以其整体并入本文，以获得与出现所述参考文献的句子和/或段落有关的教导。给出以下实例以例示本发明，而不应解释为对本发明的限制。本发明可进一步描述于以下编号的段落中：1.一种具有降低的脱靶效应的用于编辑基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统，包括向具有靶基因序列的细胞中导入：a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体，其中编码所述核酸酶的所述核酸在其序列内包含调控核酸序列，所述调控核酸序列具有限定第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中所述第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中所述第一内含子和第二内含子从前体mrna信息中被剪接以产生编码无功能核酸酶的mrna，所述无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和b)结合所述调控核酸序列的寡核苷酸，其中在所述细胞内，所述寡核苷酸阻止所述第二组剪接元件从所述mrna被剪接，从而产生缺少所述外显子并编码对靶基因的基因编辑起作用的核酸酶的mrna。2.根据段落1所述的系统，其中所述核酸酶选自由以下组成的组：crispr相关的核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶。3.根据段落1所述的系统，其中所述核酸酶是核酸内切酶或核酸外切酶。4.根据前述任一段落所述的系统，其中组分(a)还包含结合所述靶基因序列的grna。5.根据前述任一段落所述的系统，其中所述调控核酸序列是β珠蛋白突变型内含子。6.根据前述任一段落所述的系统，其包含至少两个调控核酸序列。7.根据前述任一段落所述的系统，其中所述调控核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：seqidno:18(ivs2-654内含子c-t)、seqidno:50(具有564ct突变的ivs2-654内含子)、seqidno:51(具有657g突变的ivs2-654内含子)、seqidno:52(具有658t突变的ivs2-654内含子)、seqidno:20(具有657gt突变的ivs2-654内含子)、seqidno:53(具有200bp缺失的ivs2-654内含子)、seqidno:68(仅具有197bp的ivs2-654内含子)、seqidno:55(具有6a突变的ivs2-654内含子)、seqidno:56(具有564c突变的ivs2-654内含子)、seqidno:57(具有841a突变的ivs2-654内含子)、seqidno:59(具有564ct突变的ivs2-705内含子)、seqidno:60(具有657g突变的ivs2-705内含子)、seqidno:61(具有658t突变的ivs2-705内含子)、seqidno:62(具有657gt突变的ivs2-705内含子)、seqidno:63(具有200bp缺失的ivs2-705内含子)、seqidno:64(具有425bp缺失的ivs2-705内含子)、seqidno:65(具有6a突变的ivs2-705内含子)、seqidno:66(具有564c突变的ivs2-705内含子)、seqidno:67(具有841a突变的ivs2-705内含子)、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:143、seqidno:144、seqidno:145、seqidno:146、seqidno:147、seqidno:148；及其任何组合，包括单一序列。8.根据前述任一段落所述的系统，其中结合所述调控序列的所述寡核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：seqidno:37(针对ivs2-654ct的寡核苷酸)、seqidno:38(针对具有657gt突变的ivs2-654的寡核苷酸)、seqidno:39(针对ivs2-654中6a突变的寡核苷酸)、seqidno:40(针对ivs2-654中564c突变的寡核苷酸)、seqidno:41(针对ivs2-654中564ct突变的寡核苷酸)、seqidno:43(针对ivs2-654中841a突变的寡核苷酸)、seqidno:44(针对ivs2-654中657g突变的寡核苷酸)、seqidno:45(针对ivs2-654中658t突变的寡核苷酸)、seqidno:42(针对ivs2-705中705g突变的寡核苷酸)、seqidno:49(针对ivs2-705的寡核苷酸)、seqidno:76(诱导反义外显子23跳跃是的寡核苷酸)以及seqidno138(针对luc-aon1的寡核苷酸)、seqidno:139(针对luc-aon2的寡核苷酸)、seqidno:140(针对luc-aon3的寡核苷酸)、seqidno:141(针对luc-aon4的寡核苷酸)、seqidno:142(针对ivs2(s0)-654,luc-654的寡核苷酸)和seqidno:149(针对野生型调控序列的寡核苷酸)。9.根据前述任一段落所述的系统，其中所述脱靶效应降低至少30％。10.根据前述任一段落所述的系统，其中所述脱靶效应降低至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。11.根据前述任一段落所述的系统，其中组分(a)和(b)位于相同或不同的载体上。12.根据前述任一段落所述的系统，其中将组分(b)作为裸dna导入细胞。13.根据前述任一段落所述的系统，其中使用脂质制剂将组分(b)导入细胞。14.根据前述任一段落所述的系统，其中使用纳米颗粒将组分(b)导入细胞。15.根据前述任一段落所述的系统，其中在施用(a)之后的时间点施用组分(b)。16.根据前述任一段落所述的系统，其中组分(a)和(b)基本上同时施用。17.根据前述任一段落所述的系统，其中在缺少(b)或没有(b)表达的情况下，在细胞中检测不到(a)的表达。18.根据前述任一段落所述的系统，其中(a)的表达依赖于(b)的表达。19.根据前述任一段落所述的系统，其中组分(b)控制系统的“打开(on)”和/或“关闭(off)”状态。20.根据段落19述的系统，其中所述“打开(on)”和/或“关闭(off)”状态处于选择性控制下。21.根据段落20述的系统，其中所述选择性控制是空间控制和/或时间控制。22.根据前述任一段落所述的系统，其中所述载体是病毒载体。23.根据段落22述的系统，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：aav载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体和嵌合病毒载体。24.根据前述任一段落所述的系统，其中所述载体是非病毒载体。25.根据前述任一段落所述的系统，其中所述核酸酶是crispr相关的核酸酶。26.根据前述任一段落所述的系统，其中所述crispr相关的核酸酶为基因编辑创建双链断裂，并且其中所述crispr相关的核酸酶选自由以下组成的组：cpf1、c2c1、c2c3、cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、c2c1、c2c3、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas13a、cas13b和cas13c。27.根据前述任一段落所述的系统，其中所述crispr相关的核酸酶是选自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(sacas9)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)(stcas9)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)(nmcas9)、新杀手弗朗西丝菌(francisellanovicida)(fncas9)和空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)(cjcas9)的cas9变体。28.根据前述任一段落所述的系统，其中所述crispr相关的核酸酶已经被修饰用于基因编辑但不产生双链dna断裂(例如，crispri或crispra)，并且选自由dcas、ncas和cas13组成的组。29.根据前述任一段落所述的系统，其中所述crispr相关的核酸酶被密码子优化以在真核细胞中表达。30.根据前述任一段落所述的系统，其中所述基因编辑是降低一种或多种基因产物的表达。31.根据前述任一段落所述的系统，其中所述基因编辑是增加一种或多种基因产物的表达。32.根据前述任一段落所述的系统，其中所述细胞是哺乳动物细胞或人类细胞。33.根据前述任一段落所述的系统，其中所述细胞位于体内。34.根据前述任一段落所述的系统，其中所述细胞位于体外。35.根据前述任一段落所述的系统，其中所述靶基因是疾病基因。36.一种用于编辑受试者中的基因的方法，所述方法包括向需要基因编辑的受试者施用段落1-35所述的系统。实施例实施例1.通过选择性剪接差异调控aav载体中的多个转基因介绍野生型aav是非致病性的、无包膜的、小的单链dna病毒，其具有长4.7kb的基因组。重组aav已被开发并用作基因治疗载体几十年。调控转基因表达的能力对于确保许多基因治疗策略的安全性是至关重要的。已针对aav载体介导的基因转移测试了几种控制转基因表达的策略(如tet-on或雷帕霉素诱导型系统)。取决于待治疗的靶标，每种调控系统具有优点和缺点。作为开发转基因调控系统的策略，将ivs2-654内含子的剪接转换机制调整为aav介导的基因递送，所述转基因调控系统简化基因递送系统、消除针对反式激活蛋白的免疫反应并单独诱导多个转基因、且更重要的是使aav载体的包装能力最大化。已知超过90％的包含多个外显子的转录物会经历选择性剪接。在这些条件下，剪接位点的选择是决定基因表达的关键因素之一。据报道，许多遗传性疾病的病例是由改变剪接模式的突变引起的。在过去的几十年中，反义寡核苷酸(aon)的用途已得到深入研究，并在体外和体内作为可通过恢复或改变剪接来控制基因表达的治疗剂被应用。通过使用aon进行剪接转换来恢复功能性基因表达的第一靶标之一是β珠蛋白基因的地中海贫血突变。β珠蛋白转录物的第二内含子ivs2含有共有的5'和3'剪接位点，且该内含子在正常条件下在剪接过程中被组成性去除以产生功能性蛋白。地中海贫血患者中经常发现的突变之一是ivs2的654位核苷酸c变为t，这种改变在653位产生异常的5'剪接位点，并带有一个隐蔽3'剪接位点，以及在上游选择性使用的外显子(aue)(图1a)。这些隐蔽剪接位点是剪接机制优选使用的，随后将aue保留在β珠蛋白mrna中，这使开放阅读框向下游偏移并产生截短的蛋白质。通过施用aon可以恢复这种异常剪接，aon结合隐蔽5'剪接位点并阻断其使用(图1a)。在最近的出版物中，发明人使用ivs2-654突变型内含子和对应的aon表明该诱导型系统可用于在体外和体内控制aav介导的转基因。调控转基因表达的能力对于确保许多基因治疗策略的安全性是必要的。对于由于新生血管紊乱导致的眼部疾病的基因治疗尤其如此，其可能需要长期存在多种血管生成抑制蛋白(angiostaticprotein)，这些蛋白可能会抑制正常血管以及异常血管。理论上，可以联合多种电流调控系统来调控多种转基因。然而，由于这些系统的要求，这种方法会非常麻烦。因此，开发了选择性剪接作为独立控制多个转基因在相同生物体中表达的策略。在本文描述的基于选择性剪接的调控系统中，通过使用靶向5'选择性剪接位点的aon调控转基因信息的选择性剪接来控制转基因表达。在先前的研究中，本发明人成功地使用了lna654(一种与5'选择性剪接位点及其侧翼序列互补的16聚体寡核苷酸)来诱导转基因表达。在该系统中，可以通过aon的特异性来决定剪接转换。修饰的aon、lna对其靶标具有高度特异性。它们的特异性可以通过几个核苷酸差异来区分。这种能力对于多种基因调控是非常有利的。内含子中选择性使用的5'供体位点的侧翼区域中的仅仅几个改变的核苷酸就可以成为另一个可区分的靶标。因此，可应用它们因其靶区域的几个改变的核苷酸而单独控制多个基因的能力，而无需改变骨架。使用不同的靶向aon来独立控制同一生物体中多个转基因的表达将是可能的。这种想法将允许单个患者接受需要转基因表达差异调控的多基因疗法。在本文中，报道了，通过优化内含子大小和剪接位点，这种诱导型系统被显著改善以获得紧密和有效的调控。这种优化的系统证明了在体外和体内显著改善的转基因诱导。此外，通过在小鼠眼中重新施用aon可以再诱导转基因表达。本文还显示了这种系统使用一组修饰的内含子及其对应的aon可用于差异化调控多种转基因。结果优化ivs2-654内含子的选择性5'剪接位点以有效调控。为促进选择性剪接的优化以控制转基因表达，利用萤火虫的荧光素酶标记基因来插入850bp选择性剪接内含子ivs2-654。因此，在存在或不存在aon的情况下，通过测定包含aue和跳过aue两种条件下的荧光素酶表达水平，可以方便地确定转基因表达的控制。首先，通过修饰ivs2-654内含子的选择性剪接位点来优化选择性剪接以控制转基因表达。ivs2-654内含子在657和658处的核苷酸序列(即选择性5'剪接位点的第5个和第6个下游核苷酸)是t和a。与共有5'剪接位点的g和t相比，这些序列的共有性较低。核苷酸657处的t被转换为g，658处的a被转化为t，或ta被转化为gt。这些突变通过使剪接位点与共有序列更相似或相同来增加选择性5'剪接位点的强度(图1b)。使用pei转染方法将得到的质粒和对应的aon转染到293细胞中。转染后24小时，收获细胞以对荧光素酶的表达定量。构建体658t在诱导水平上产生了与构建体ivs2-654相比大约两倍的提高。因此，构建体657g和657gt导致诱导水平提高190和250倍(图1c)。诱导水平的增加显然是由于转基因表达的背景水平比转基因表达的诱导水平更急剧的降低。这些结果表明，通过调节剪接位点的强度，可以优化选择性剪接以控制转基因表达。优化ivs2-654内含子尺寸以将aav的转基因能力最大化。aav具有4.7kb的包装限制，因为其根据启动子的尺寸、多聚a和itr仅允许转基因编码区的最大尺寸为约3kb。原始ivs2-654内含子长度为850个核苷酸(nt)(图2a)，将该内含子插入待调控的转基因的开放阅读框(orf)进一步降低了转基因的克隆能力。因此，850ntivs2-654被转化为称为s0的247nt的小内含子，其含有β珠蛋白mrna的有效剪接所需的必需剪接位点和aue以及5'端上的第32个核苷酸和3'端上的最后57个核苷酸(图2b)。将s0内含子插入到荧光素酶基因中，产生构建体ivs2(s0)-654，导致信息的选择性剪接。重要的是，aon对小内含子的诱导水平与对原始ivs2-654内含子的诱导水平相似(图2c)。其对应的aon对含有修饰的内含子的构建体的荧光素酶表达的个体化调控。产生了在5'选择性剪接位点ivs(s0)-654的5'选择性剪接位点的侧翼区含有不同序列的四种构建体(图3a)。保留了对于剪接是关键的5'选择性剪接位点651-658的8个核苷酸，并且剪接位点外部的突变核苷酸彼此具有至少5个核苷酸(nt)的差异。在hek293细胞中测试每种构建体的表达以确定其转基因是否由其对应的aon诱导，并且是否受其他非对应的aon的影响。观察到对应的aon对报告基因表达的诱导，但没有被其他aon交叉调控(图3b)。尽管构建体之间的诱导效率是可变的，但与ivs(s0)-654相比，所有四种构建体都导致转基因诱导水平提高(图3c)。这些数据证实了转基因的剪接被aon以高度序列特异性的方式控制，从而允许多个转基因的差异化调控。其对应的aon对多基因表达的差异调控用其对应的aon测试了3种不同报告基因的差异表达。将修饰的内含子aon4导入荧光素酶，aon1导入绿色荧光蛋白(gfp)，且aon2导入红色荧光蛋白(rfp)。将那些报告基因分别亚克隆到cbh载体骨架中(luc-aon4、gfp-aon1和rfp-aon2)(图4a和4b)。在转染后的当天，将三种质粒的混合物转染到hek293细胞中，并且用单独的aon、lnaaon4、lnaaon1和lnaaon2处理细胞。观察到每种aon特异性地诱导其对应的靶基因(图5b)。这些数据表明使用本文所述的诱导型载体及其对应的aon可以个体化调控多种转基因的表达。aon对携带优化的ivs2突变型内含子的aav载体在小鼠肝脏中的荧光素酶表达的调控为了证明含有优化的小内含子的调控系统也可起到控制动物中的转基因表达的功能，在6周龄雌性balb/c小鼠中测试了aav2.5-cbh-luc-aon1载体。将aav载体以1x1011vg的剂量眶后(retroorbitally)注射到小鼠中。在注射后6周，给小鼠连续两天注射lnaaon1并对其成像以获得荧光素酶表达的诱导。当aav靶向到肝脏时，通过施用lnaaon1诱导了肝脏中的荧光素酶的增加表达多达5.2倍(图5a)。荧光素酶表达在第6天达到高峰并持续14天。本文所述的结果表明，优化的诱导型系统也可用于体内控制转基因表达。然而，施用aon后的诱导水平与体外数据相比不高。一个可能的原因可能是aon到靶标的递送效率低。为了检验该假设，将lnaaon1与阳离子转染试剂一起在体内施用。使用该试剂，通过施用lnaaon1诱导肝脏中荧光素酶表达多达317.4倍，并在第3天达到高峰，随后逐渐降低，但持续超过45天(图5b)。这些数据表明aon到靶标的递送是该系统的限制因素之一，并且aon到靶标的递送被显著改善。通过在小鼠眼中施用aon可重新诱导aav2.5-cbh-luc-dgt1的荧光素酶表达。我们在小鼠眼中测试了诱导型载体luc-aon1，其在启动子cbh控制下使用修饰的aav2衣壳aav2.5。在视网膜下注射病毒载体4周后，给予玻璃体内注射对应的aon、lnaaon1或错配的aon、lna654。在注射aon后3周，注射lnaaoni的眼中的平均荧光素酶活性是注射lnaa654的眼中的平均荧光素酶活性的2.5倍高(p＝0.0038，图6)。在注射lnaaon1后6周和9周，平均荧光素酶活性降低，但仍显著高于注射lna654的眼中的荧光素酶活性。aon注射后13周不再有统计学显著性差异，因此在16周给予第二次aon玻璃体内注射。3周后，注射lnaaon1的眼的平均荧光素酶活性增加，并且是注射lna654的眼的2倍高(p＝0.017)。3周后，荧光素酶活性的差异不再显著(p＝0.079)。在第23周进行aon的第三次玻璃体内注射。3周后，注射lnaaon1的眼和注射lna654的眼之间的荧光素酶活性没有统计学显著差异。这些数据提供了在眼中使用诱导型系统的概念证明，并表明至少可以进行一次重新诱导，但是诱导的幅度可能会随时间降低。讨论本文提供的研究成功地证明了通过优化的诱导型载体aav2.5-cbh-luc-aon1介导的体外荧光素酶表达的诱导改善。还成功地证明了用相同载体对小鼠肝脏和眼中荧光素酶表达的诱导。与没有aon的情况相比，在ivs2内含子657和658处将核苷酸t和a修改为g和t通过显著降低背景表达而使aon对荧光素酶的诱导增加超过100倍。这很可能是对剪接过程的紧密调控，该紧密调控通过使剪接位点更接近共有序列来增加选择性使用的5'剪接位点的强度。与长度为850nt的原始ivs2-654相比诱导强度没有变化的小的长度为247nt的ivs2-654内含子s0允许在aav系统中更大的转基因克隆能力。同时，优化的诱导型系统可用于控制aav介导的转基因表达。血管生成是一个复杂的多步骤过程，涉及通过血管内皮细胞增殖、迁移、管形成和细胞外基质重塑而使血管内皮细胞从现有血管中萌发。该过程由生长因子、细胞外基质和细胞组分之间的复杂相互作用控制，最终结果由血管生成和血管生成抑制因子的平衡决定。许多生长因子分子参与控制血管生成，并且对它们中的一个或组合的治疗性操纵提供了控制眼中新血管形成的潜在手段。到目前为止，实验模型中使用基因治疗方法靶向的细胞因子和/或已被增强的血管生成抑制蛋白包括血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、色素上皮衍生因子(pedf)、基质金属蛋白酶(mmp)、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素和整联蛋白。然而，没有一个能使新血管形成几乎完全消退。在患有视网膜新生血管性疾病的患者中有效控制血管生成可能需要在眼中长期存在血管生成抑制蛋白。对新生血管形成的不当抑制可能导致对正常眼部结构的损伤。因此，需要开发能够适当调控基因表达的策略以使局部毒性的可能性最小化。在本研究中，成功地证明了使用优化的诱导型系统可以控制小鼠眼中的转基因表达。在小鼠眼中，在用携带含有荧光素酶基因的dgt1内含子的aav2.5载体转导后，通过施用aon证明了对荧光素酶活性的特异性诱导。还证明了通过在小鼠眼中重新施用aon可再诱导该系统。此外，成功地证明了用其对应的aon，3种不同的报告基因被个体化表达。aon4、aon1和aon2在没有任何交叉的情况下分别独立地调控荧光素酶、gfp和rfp的表达。对每个靶转基因使用与选择性使用的5'剪接位点及其侧翼序列互补的16聚体aon以个体化诱导表达。该16核苷酸区由剪接位点必需的8个核苷酸和对于侧翼区的8个核苷酸组成。在侧翼序列中有8个碱基可以突变而不影响选择性剪接位点的强度。结果表明，每个aon彼此之间存在6-7个错配，且不交叉调节靶基因的选择性剪接。因此，在5'剪接位点的靶区内，可突变比所需碱基更多的碱基(8>6)以创建不会被其他aon交叉调控的不同靶序列。这种转基因调控的能力对于通常使用的调控系统如tet-on和雷帕霉素诱导型系统是不可能的。实际上，这些系统中的每一个理论上只能独立地调控一个转基因。总之，这些数据表明该新型优化调控系统可能是一种非常有用的在临床上应用以差异化调控多种转基因表达以用于临床相关疾病如眼部新血管形成的基因治疗的策略。材料和方法细胞的维持。将人胚肾(hek)293细胞维持在dulbecco改良的eagle培养基中，该培养基含有10％热灭活的胎牛血清和1xpenn/strep(dmem+，sigma)。使细胞在37℃在5％co2潮湿的培养箱中生长。aav载体质粒。所有携带荧光素酶的aav载体质粒均由ptr-cbh-luciferasegl3+noti(xiaohuai等人)产生。用sphi和xcmi限制性酶消化将内含子区亚克隆到该质粒中。使用标准pcr技术在ivs2-654的选择性使用的5'剪接位点处进行突变，并进行测序以确保它们与预期得一致。pzsgreen1-dr(#632428)和pdsred-express-dr(#632423)购自clontech。使用agei和noti从ptr-cbh-luciferasegl3+noti质粒取出荧光素酶编码区，并用zsgreen1-dr或dsred-express-dr编码区替换，分别命名为ptr-cbh-zsgreen1-dr和ptr-cbh-dsred-express-dr。然后，将突变的ivs(s0)-654内含子，aon1插入ptr-cbh-zsgreen1-dr的zsgreen1-dr编码区，并将其命名为ptr-cbh-zsgreen1-dr-aon1。同样将修饰的ivs(s0)-654内含子，aon2插入ptr-cbh-dsred-express-dr的dsred-express-dr编码区，并将其命名为ptr-cbh-reddr-aon2。反义寡核苷酸。修饰的反义寡核苷酸lna购自exiqon。lna-dgt1由unc的juliano博士慷慨提供。在表4中，大写字母表示lna碱基，且小写字母表示天然dna碱基。aav载体产生和表征。如grieger等人所述，使用在无血清悬浮条件下在摇瓶中生长的hek293细胞产生重组aav载体(手稿在准备中)。简而言之，使用聚乙烯亚胺(polysciences)和以下质粒：pxx680、pxr2.5和ptr-cbh-luc-aon1转染悬浮hek293细胞，以产生携带cbh-luc-aon1的aav。转染后48小时，将细胞培养物离心并弃去上清液。将细胞重悬并通过超声裂解。向裂解液中加入550u单位的dna酶，并在37℃孵育45分钟，接着在9400xg离心以沉淀细胞碎片，并将澄清的裂解液上样到改良的不连续碘克沙醇梯度中，接着进行柱层析。然后使用如前所述的qpcr测定确定每种aav载体制备物的物理粒子滴度(physicalparticletiter)。转基因表达的体外表征。使用三个标记基因(萤火虫荧光素酶、zsgreen1-dr和dsred-express-dr)在24孔板中使用培养的细胞系在体外研究转基因表达的调控。为了测量荧光素酶活性，如使用pei转染方法所示，用500ng对应的质粒和10pmol的aon转染每个24孔板中的细胞。在转染后24小时，用100μl的1x报告物裂解缓冲液(promega，货号e4030)裂解细胞。然后将20ul裂解液与100μl荧光素酶底物(promega，货号e4030)混合以确定荧光素酶活性。对于涉及zsgreen1-dr和dsred-express-dr标记基因的研究，使用pei转染法用含有10pmol的aon的500ng质粒转染细胞。转染后，将细胞再培养48小时并使用荧光显微镜成像。转基因表达的体内表征。使用荧光素酶研究6周龄雌性balb/c小鼠中的转基因表达调控。以1x1011vg的剂量通过眶后注射将aav载体，aav2.5-cbh-luc-wt和aav2.5-cbh-luc-aon1靶向到肝脏。在病毒注射后6周，使用以下程序对动物成像以获得荧光素酶转基因表达基础水平：通过异氟烷麻醉小鼠。然后腹腔内注射荧光素(125μl，25mg/ml)以允许体内测定荧光素酶活性。然后使用ivis成像系统(xenogen)对小鼠进行成像。为了开启荧光素酶转基因的表达，连续两天将aon或aon与25mg/kg的invivofectamine一起进行眼眶后注射。然后按照如上所述得在从aon注射的最后一天开始的指定天数对小鼠成像。为了测试眼中的诱导型aav载体，严格按照视觉和眼科研究协会关于动物在研究中使用的声明对小鼠进行人道处理。如先前所述(mori等人)，用harvard泵装置和拉伸式玻璃微量移液器(pulledglassmicropipette)对4周龄balb/c小鼠进行视网膜下注射含有109个aav2.5-cbh-luc-aon1或aav2.5-cbh-luc-wt的基因组颗粒的1μl注射液。注射载体4周后，对小鼠进行玻璃体内注射含有0.556μg的lnaaon1或lna654的1μl注射液。然后按照以上描述得在从aon注射的最后一天开始的指定天数对小鼠成像。参考文献1.morik,duhe,gehlbachp,andoa,takahashik,pearlmanj,morik,yanghs,zackdj,ettyreddyd,broughde,weill,campochiaropa:pigmentepithelium-derivedfactorinhibitsretinalandchoroidalneovascularization.j.cell.physiol.188:253-263,2001实施例2.产生包含调控核酸序列的sacas9如实施例1所述，产生包含调控序列(β珠蛋白内含子区)的sacas9。使用限制性消化将调控序列内含子区(例如，seqidno:53(具有200bp缺失的ivs2-654内含子)亚克隆到携带sacas9的aav载体质粒中。实施例3.基因编辑的脱靶效应测定消化的基因组的测序(digenome-seqover)是一种体外cas9消化的全基因组测序，它是一种稳健、灵敏、无偏和成本有效的用于分析可编程核酸酶(例如cas9)在哺乳动物(例如人细胞)中的全基因组脱靶效应的方法。使用lipofectamine2000(lifetechnologies)将表达nav1.8定向性的grna的hela、hek和cho细胞用以下进行转染：(1)无核酸酶(例如，未转染群体)；(2)组成型活性的casp9；(3)不含结合调控序列的寡核苷酸的本文所述的基因编辑系统，例如处于“关闭(off)”位置的核酸酶；以及(4)本文所述的基因编辑系统和结合调控序列的寡核苷酸，例如，处于“打开(on)”位置的核酸酶。在含有10％fbs的dmem培养基中培养hela细胞。将细胞培养48小时。体外裂解基因组dna。然后，使用dneasytissue试剂盒(qiagen)，从每个细胞群体中分离完整的基因组dna。将分离自未转染细胞群的dna独立地与且不与本文所述的组成型活性核酸酶一起孵育，以允许对分离的dna的消化。从核酸酶表达群体中分离的dna用它们所指示的核酸酶分离，以允许对分离的dna进行酶切。该反应在37℃在反应缓冲液(100mmnacl，50mmtris–hcl，10mmmgcl2和100μg/mlbsa)中进行8小时。在反应结束时，添加rna酶a(50μg/ml)以降解sgrna。用dneasytissuekit(qiagen)纯化酶切的dna。全基因组测序和digenome-seq.使用标准方法通过全基因组测序分析纯化的消化的dna。用核酸酶消化产生具有相同5’末端的dna片段，其产生在裂解位点垂直对齐的序列读段。相反，没有相同5'端的所有其他序列读段将以交错的方式排列。将序列读段映射到参照基因组，并使用整合基因组学查看器(igv)观察中靶位点(on-targetsite)(例如，nav1.8序列)和脱靶位点(off-targetsite)(例如，非nav1.8序列)上的序列排列模式。igv可在万维网(例如，softward.broadinstitute.org/software/igv/)上获得。digenome-seq进一步描述于，例如，国际专利申请号wo2016/076672l；kim等人natmethods,2015,12:237-243.；mei等人，jgenetgenomics2016；43:63-75；hu等人，natprotoc.2016；11:853-871；其各自通过引用以其整体并入本文。分析digenome-seq数据的其他程序可在万维网(例如，rgenome.net/digenome/portable)上获得。将组成型活性的cas9的脱靶效应与在用组成型活性的cas9消化的未转染细胞群体中观察到的任何脱靶效应进行比较。鉴定常见的脱靶位点且不予考虑，如在核酸酶消化的和未进行核酸酶消化的未转染细胞群之间鉴定的任何常见的脱靶位点。将在“打开(on)”核酸酶群体中鉴定的脱靶位点与“关闭(off)”核酸酶群体中的进行比较，且不予考虑。不予考虑这些位点(例如，鉴定为真正的脱靶效应)的原因是，它们不太可能是由核酸酶的脱靶编辑引起的。digenome-seq揭示了在hela细胞中，组成型活性的cas9导致脱靶效应(例如，编辑)的发生率与本文所述的“打开(on)”基因编辑系统相比增加，表明与常规crispr/cas9基因编辑相比，本文所述的基因编辑系统提供显著降低的脱靶效应率。此外，脱靶编辑和中靶编辑揭示了例如，对nav1.8序列的编辑在表达“关闭(off)”基因编辑系统的细胞中不发生，表明本文所述的基因编辑系统提供了对基因编辑的时间和空间控制。此外，这些结果是在本文测试的所有细胞类型中总结的，表明降低的脱靶效应是该基因编辑系统的特征，而不是细胞类型特异性的。序列表<110>北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校理查·j·萨谬斯基<120>调控的基因编辑系统<130>5470-858wo<150>62/870,427<151>2019-07-03<150>62/743,317<151>2018-10-09<160>154<170>patentinversion3.5<210>1<211>7713<212>dna<213>人工的(artificial)<220><223>质粒trcba-int-luc-mut(654c-t)<220><221>内含子<222>(2739)..(3588)<400>1gggggggggggggggggttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccg60ggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgag120cgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctagatcttcaatattggcc180attagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggatattggccattgca240tacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgcc300atgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttca360tagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc420gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat480agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagt540acatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcc600cgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatcta660cgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccc720catctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgc780agcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggg840gcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaa900gtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcg960ggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgcc1020gcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggccctt1080ctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgc1140gtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggt1200gcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtg1260agcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcgg1320ccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggg1380gtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtatgggcgcggcggtcgggctgtaaccccccc1440ctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacg1500gggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggc1560ggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagc1620gccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgag1680agggcgcagggacttactttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgc1740cgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggc1800ggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggc1860tgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctgg1920cgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttccta1980cagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattagct2040tggcattccggtactgttggtaaagccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggc2100ccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatg2160aagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggac2220atcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatat2280gggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatg2340ccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataat2400gaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaa2460aaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattatt2520atcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatct2580catctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaag2640acaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctg2700cctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccaggtgagtctatgggacccttgat2760gttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaaca2820gggtacagtttagaatgggaaacagacgaatgattgcatcagtgtggaagtctcaggatc2880gttttagtttcttttatttgctgttcataacaattgttttcttttgtttaattcttgctt2940tctttttttttcttctccgcaatttttactattatacttaatgccttaacattgtgtata3000acaaaaggaaatatctctgagatacattaagtaacttaaaaaaaaactttacacagtctg3060cctagtacattactatttggaatatatgtgtgcttatttgcatattcataatctccctac3120tttattttcttttatttttaattgatacataatcattatacatatttatgggttaaagtg3180taatgttttaatatgtgtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaattt3240taaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccc3300taatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattcta3360aagaataacagtgataatttctgggttaaggtaatagcaatatttctgcatataaatatt3420tctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatcc3480agctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagc3540taggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagagatcctatttt3600tggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttt3660tggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatag3720atttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgct3780ggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatc3840taatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggt3900tgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatc3960agctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttcc4020attttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaag4080aggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagc4140gaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactggga4200cgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggcta4260tcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgc4320aggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgtttt4380ggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagta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