用于将DNA靶向插入基因中的方法与流程

文档序号：26003686发布日期：2021-07-23 21:21阅读：13263来源：国知局

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月16日提交的早先提交且共同未决的申请ussn62/746,497、于2019年4月8日提交的ussn62/830,654和于2019年6月20日提交的ussn62/864,432的权益，所述文献的内容通过全文引用的方式并入本文。

序列表

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本文件属于基因组编辑领域。更具体地，本文件涉及使用稀有切割核酸内切酶或转座酶对内源基因的靶向修饰。

背景技术：

单基因病症是由单个基因中的一个或多个突变引起的，其示例包含镰状细胞疾病(血红蛋白-β基因)、囊性纤维化(囊性纤维化跨膜传导调节基因)和泰-萨二氏病(tay-sachsdisease)(β-己糖胺酶a基因)。单基因病症一直是基因疗法所关注的对象，因为用功能性拷贝替代有缺陷的基因可以为治疗提供益处。然而，用于产生有效疗法的一个瓶颈包含基因的功能性拷贝的大小。许多递送方法(包含那些使用病毒的递送方法)具有大小限制，其阻碍了大型转基因的递送。进一步地，许多基因具有选择性剪接模式，从而导致单个基因编码多种蛋白质。用于纠正有缺陷的基因的部分区域的方法可以提供用于治疗单基因病症的替代性手段。

技术实现要素：

基因编辑有望纠正遗传病症中发现的突变，然而，为个体病症创建有效的疗法仍然存在许多挑战，包含由功能获得性突变引起的病症或需要精确修复的病症。这些挑战是在如脊髓小脑共济失调3和脊髓小脑共济失调6等病症的情况下看到的，其中所述病症是由基因的3'末端处的功能获得性突变(扩展的三核苷酸重复序列)引起的。

本文所述的方法提供了用于纠正基因的3'末端处发现的突变的新颖方法。本文的公开内容至少部分地基于与通过多个修复途径的整合相容的双模块转基因的设计。本文所述的转基因可以通过同源重组途径、非同源末端连接途径或同源重组途径和非同源末端连接途径两者或通过转座整合到基因中。进一步地，任何情况(hr、nhej正向、nhej反向、转座正向或转座反向)下的整合结果都可以引起靶基因的蛋白产物的精确纠正/改变。本文所述的转基因可以用于在所关注基因的3'区域中固定或引入突变。所述方法在需要精确编辑基因或靶向的突变内源基因由于其超过标准载体或病毒载体的大小容量而无法被合成拷贝“替代”的情况下特别有用。本文描述的方法可以用于应用研究(例如，基因疗法)或基础研究(例如，创建动物模型或理解基因功能)。

本文描述的方法与当前体内递送媒剂(例如，腺相关病毒载体和脂质纳米颗粒)相容，并且其解决了实现基因产物的精确改变的若干挑战。

在一个实施例中，本文件的特征在于一种用于将转基因整合到内源基因中的方法。所述方法可以包含递送转基因，其中所述转基因携带第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一部分编码序列和第二部分编码序列以及第一终止子和第二终止子。在一些实施例中，所述第一终止子和所述第二终止子可以被单个双向终止子替代。所述方法还包含施用靶向所述内源基因内的位点的一种或多种稀有切割核酸内切酶，其中然后将所述转基因整合到所述内源基因中。所述转基因可以靶向内含子内或内含子-外显子连接部处的位点。所述第一部分编码序列和所述第二部分编码序列可以以尾接尾朝向来定向，使得通过nhej在任一方向(即正向或反向)上整合转基因可以引起基因的蛋白产物的精确改变。在其它实施例中，所述转基因可以包含左同源臂和右同源臂以使得能够通过hr整合。这些转基因可以被携带在腺相关病毒载体(aav)内，其中所述转基因可以通过hr(通过同源臂)或通过nhej正向方向或nhej反向方向整合(通过将所述aav载体直接整合到靶双链断裂中)。在一个实施例中，具有第一编码序列和第二编码序列以及左同源臂和右同源臂的载体还可以包含用于由一种或多种稀有切割核酸内切酶切割的第一位点和第二位点。所述一种或多种稀有切割核酸内切酶的切割可以引起具有同源臂的线性转基因的释放，所述线性转基因能够通过hr或nhej整合到基因组中。在另一个实施例中，具有第一编码序列和第二编码序列的载体可以侧接有用于由一种或多种稀有切割核酸内切酶切割的第一位点和第二位点。所述一种或多种稀有切割核酸内切酶的切割可以引起线性转基因的释放，所述线性转基因能够通过nhej整合到基因组中。在另一个实施例中，具有第一编码序列和第二编码序列的载体可以侧接有左和右转座子末端。crispr相关转座酶(例如，cas6/7/8以及tniq、tnsa、tnsb和tnsc)的递送可以通过转座整合转基因。

所述方法可以用于改变由内源基因产生的蛋白质的c端。在一些实施例中，内源基因可以包含atxn3基因或cacna1a基因。atxn3是编码酶脊髓小脑共济失调蛋白(ataxin)-3的基因。脊髓小脑共济失调蛋白-3是有助于破坏过量或受损的蛋白质的泛素-蛋白酶体系统的成员。3型脊髓小脑共济失调是由atxn3基因的3'末端内的三核苷酸重复序列扩展引起的遗传病症。cacna1a是编码参与钙通道形成的蛋白质的基因。6型脊髓小脑共济失调是由cacna1a基因的突变引起的遗传病症。导致sca6的突变包含在cacna1a基因的3'末端中的三核苷酸重复序列扩展。在一些实施例中，本文提供的方法可以用于改变内源atxn3基因或cacna1a基因的3'末端。在具体实施例中，用于本文所述的转基因的整合的靶标可以是atxn3基因的内含子9或cacna1a基因的内含子46。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所描述的那些方法和材料的方法和材料可以用于本发明的实践中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在有矛盾的情况下，以本说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法和示例仅是说明性的并不旨在是限制性的。

在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。根据所述描述和权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将变得显而易见。

附图说明

图1是用于靶向插入到内源基因中的转基因的图示。ts1，靶位点1；sa1，剪接受体位点1；cds1，编码序列1；t1，终止子1；ts2，靶位点2；sa2，剪接受体位点2；cds2，编码序列2；t2，终止子2；ha1，同源臂1；ha2，同源臂2；bt1，双向终止子1；as1，另外的序列1；as2，另外的序列2。

图2是示出了转基因整合到示例性基因中的图示。转基因包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的两个靶位点、两个剪接受体序列、两个编码序列(3.1和3.2)和两个终止子(t)。整合通过非同源末端连接(nhej)进行。

图3是示出了转基因整合到示例性基因中的图示。转基因包括两个同源臂、用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的两个靶位点、两个剪接受体序列、两个编码序列(3.1和3.2)和两个终止子。整合通过同源重组(hr)或非同源末端连接(nhej)进行。

图4是cacna1a基因的外显子46、内含子46和内含子47的图示。还示出了整合到cacna1a基因中的pb1011-d1转基因。

图5是pb1011-d1转基因位于cacna1a基因内的整合结果的图示。

图6是atxn3基因的外显子9、内含子9、外显子10、内含子10和外显子11的图示。还示出了整合到atxn3基因中的pb1012-d1转基因。

图7是pb1012-d1转基因位于atxn3基因内的整合结果的图示。

图8是检测转基因整合到atxn3基因中的凝胶的图像。1，100bp阶梯，其中最高带运行在1,517bp处；2，pba11355’连接部；3，pba11365'连接部；4，pba11375'连接部；5，pba11353'连接部；6，pba11363'连接部；7，pba11373'连接部；8，1kb阶梯，其中较暗带运行在500bp、1,000bp和3,000bp处；9，1kb阶梯，其中较暗带运行在500bp、1,000bp和3,000bp处；10，pba1135反向5'连接部；11，1kb阶梯，其中较暗带运行在500bp、1,000bp和3,000bp处；12，pba1136反向5'连接部；13，1kb阶梯，其中较暗带运行在500bp、1,000bp和3,000bp处；14；引物对onjb156+onjb113；15，引物对114+162；16，引物对onjb116+onjb113；17，引物对onjb114+onjb170；18，引物对onjb167+onjb170；19，100bp阶梯，其中暗带运行在500bp处；20，用pba1135和核酸酶转染的基因组dna；21，用pba1136和核酸酶转染的基因组dna；22，用pba1137和核酸酶转染的基因组dna；23，用水转染的基因组dna；24，无dna对照。

具体实施方式

本文公开了用于修饰内源基因的编码序列的方法和组合物。在一些实施例中，所述方法包含将转基因插入到内源基因中，其中所述转基因提供了部分编码序列，所述部分编码序列替代了内源基因的编码序列。

在一个实施例中，本文件的特征在于一种将转基因整合到内源基因中的方法，所述方法包含：施用转基因，其中所述转基因包括第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一部分编码序列和第二部分编码序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子；以及施用靶向所述内源基因内的位点的一种或多种稀有切割核酸内切酶，其中所述转基因整合在所述内源基因内。所述方法可以包含将转基因设计为具有可操作地连接到第一部分编码序列的第一剪接受体和可操作地连接到第二部分编码序列的第二剪接受体。所述布置还可以包含使第一部分编码序列可操作地连接到第一终止子，并且使第二部分编码序列可操作地连接到第二终止子。在一个实施例中，两个终止子可以被单个双向终止子替代。在一个实施例中，可以将具有第一剪接受体和第二剪接受体、第一部分编码序列和第二部分编码序列以及第一终止子和第二终止子的转基因以尾接尾朝向定向。具有尾接尾朝向的序列的转基因还可以包括一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端。在另一个实施例中，转基因可以包括在第一剪接受体和第二剪接受体侧端的左同源臂和右同源臂。在此实施例中，转基因可以被携带在腺相关病毒载体内。在另一个实施例中，转基因还可以包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端。第一靶位点和第二靶位点可以在第一同源臂和第二同源臂的侧端。在实施例中，本文所述的转基因可以整合在内源基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。转基因可以整合在atxn3基因或cacna1a基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。转基因可以包括编码由非致病性atxn3基因的外显子10产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列，并且可以靶向致病性atxn3基因的内含子9或内含子9外显子10连接部。转基因可以包括编码由非致病性cacna1a基因的外显子47产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列，并且可以靶向致病性cacna1a基因的内含子46或内含子46外显子47连接部。在某些实施例中，稀有切割核酸内切酶可以是crispr/cas12a核酸酶或crispr/cas9核酸酶。第一部分编码序列和第二部分编码序列编码相同的氨基酸。在一个实施例中，第一编码序列和第二编码序列可以在核酸序列上不同，但编码相同的氨基酸。转基因可以被携带在载体上，其中载体形式选自双链线性dna、双链环状dna或病毒载体。病毒载体可以包含腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。此处描述的方法可以与等于或小于4.7kb的转基因一起使用。转基因可以包括编码来自由靶内源基因产生的功能蛋白的部分肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列。靶内源基因可以是异常的。

在另一个实施例中，本文件提供了具有第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一部分编码序列和第二部分编码序列、一个双向终止子或第一终止子和第二终止子、任选的第一同源臂和第二同源臂以及任选的第一稀有切割核酸内切酶靶位点和第二稀有切割核酸内切酶靶位点的dna多核苷酸。所述dna多核苷酸可以包含具有可操作地连接到第一部分编码序列的第一剪接受体和可操作地连接到第二编码序列的第二剪接受体的设计。所述布置还可以包含使第一部分编码序列可操作地连接到第一终止子，并且使第二部分编码序列可操作地连接到第二终止子。在一个实施例中，两个终止子可以被单个双向终止子替代。在一个实施例中，可以将具有第一剪接受体和第二剪接受体、第一编码序列和第二编码序列以及第一终止子和第二终止子的dna多核苷酸以尾接尾朝向定向。具有尾接尾朝向的序列的dna多核苷酸还可以包括一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端。在另一个实施例中，dna多核苷酸可以包括在第一剪接受体和第二剪接受体侧端的左同源臂和右同源臂。在此实施例中，dna多核苷酸可以被携带在腺相关病毒载体内。在另一个实施例中，dna多核苷酸还可以包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端。第一靶位点和第二靶位点可以在第一同源臂和第二同源臂的侧端。在实施例中，本文所述的dna多核苷酸可以整合在内源基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。dna多核苷酸可以整合在atxn3基因或cacna1a基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。dna多核苷酸可以包括编码由非致病性atxn3基因的外显子10产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列。dna多核苷酸可以包括编码由非致病性cacna1a基因的外显子47产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列。第一部分编码序列和第二部分编码序列编码相同的氨基酸。在一个实施例中，第一编码序列和第二编码序列可以在核酸序列上不同，但编码相同的氨基酸。dna多核苷酸可以被携带在载体上，其中载体形式选自双链线性dna、双链环状dna或病毒载体。病毒载体可以选自腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。此处描述的dna多核苷酸可以等于或小于4.7kb。

在一个实施例中，本文件的特征在于一种将转基因整合到内源基因中的方法，所述方法包含：施用转基因，其中所述转基因包括左和右转座子末端、第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一部分编码序列和第二部分编码序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子；以及施用靶向所述内源基因的转座酶，其中所述转基因整合在所述内源基因中。所述方法可以包含将转基因设计为具有可操作地连接到第一部分编码序列的第一剪接受体和可操作地连接到第二编码序列的第二剪接受体。所述布置还可以包含使第一部分编码序列可操作地连接到第一终止子，并且使第二部分编码序列可操作地连接到第二终止子。在一个实施例中，两个终止子可以被单个双向终止子替代。在一个实施例中，可以将具有第一剪接受体和第二剪接受体、第一编码序列和第二编码序列以及第一终止子和第二终止子的转基因以尾接尾朝向定向。具有尾接尾朝向的序列的转基因还可以包括在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端的左和右转座子末端。在实施例中，本文所述的转基因可以整合在内源基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。转基因可以整合在atxn3基因或cacna1a基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。转基因可以包括编码由非致病性atxn3基因的外显子10产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列，并且可以靶向致病性atxn3基因的内含子9或内含子9外显子10连接部。转基因可以包括编码由非致病性cacna1a基因的外显子47产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列，并且可以靶向致病性cacna1a基因的内含子46或内含子46外显子47连接部。转座酶可以是crispr转座酶，其中crispr转座酶包括cas12k或cas6蛋白。第一部分编码序列和第二部分编码序列编码相同的氨基酸。在一个实施例中，第一编码序列和第二编码序列可以在核酸序列上不同，但编码相同的氨基酸。转基因可以被携带在载体上，其中载体形式选自双链线性dna、双链环状dna或病毒载体。病毒载体可以包含腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。此处描述的方法可以与等于或小于4.7kb的转基因一起使用。左末端可以包括seqidno:41所示的序列，并且右末端可以包括seqidno:13所示的序列。

在另一个实施例中，本文件提供了具有第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一部分编码序列和第二部分编码序列、一个双向终止子或第一终止子和第二终止子以及左右转座子末端的dna多核苷酸。所述dna多核苷酸可以包含具有可操作地连接到第一部分编码序列的第一剪接受体和可操作地连接到第二编码序列的第二剪接受体的设计。所述布置还可以包含使第一部分编码序列可操作地连接到第一终止子，并且使第二部分编码序列可操作地连接到第二终止子。在一个实施例中，两个终止子可以被单个双向终止子替代。在一个实施例中，可以将具有第一剪接受体和第二剪接受体、第一编码序列和第二编码序列以及第一终止子和第二终止子的dna多核苷酸以尾接尾朝向定向。具有尾接尾朝向的序列的dna多核苷酸还可以包括在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端的左和右转座子末端。在实施例中，本文所述的dna多核苷酸可以整合在内源基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。dna多核苷酸可以整合在atxn3基因或cacna1a基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。dna多核苷酸可以包括编码由非致病性atxn3基因的外显子10产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列。dna多核苷酸可以包括编码由非致病性cacna1a基因的外显子47产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列。第一部分编码序列和第二部分编码序列编码相同的氨基酸。在一个实施例中，第一编码序列和第二编码序列可以在核酸序列上不同，但编码相同的氨基酸。dna多核苷酸可以被携带在载体上，其中载体形式选自双链线性dna、双链环状dna或病毒载体。病毒载体可以选自腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。此处描述的dna多核苷酸可以等于或小于4.7kb。左末端可以包括seqidno:41所示的序列，并且右末端可以包括seqidno:13所示的序列。

在一个实施例中，本文件的特征在于一种将转基因整合到内源基因中的方法，所述方法包含施用转基因，其中所述转基因包括第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一编码序列和第二编码序列、一个双向终止子或第一终止子和第二终止子以及第一同源臂和第二同源臂，其中所述转基因整合在所述内源基因内。所述方法可以包含将转基因设计为具有可操作地连接到第一部分编码序列的第一剪接受体和可操作地连接到第二编码序列的第二剪接受体。所述布置还可以包含使第一部分编码序列可操作地连接到第一终止子，并且使第二部分编码序列可操作地连接到第二终止子。在一个实施例中，两个终止子可以被单个双向终止子替代。同源臂可以在第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一编码序列和第二编码序列、一个双向终止子或第一终止子和第二终止子的侧端。编码序列可以编码完整编码序列或部分编码序列。在一个实施例中，可以将具有第一剪接受体和第二剪接受体、第一编码序列和第二编码序列以及第一终止子和第二终止子的转基因以尾接尾朝向定向。具有尾接尾朝向的序列的转基因还可以包括一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端。在另一个实施例中，转基因可以包括在第一剪接受体和第二剪接受体侧端的左同源臂和右同源臂。在此实施例中，转基因可以被携带在腺相关病毒载体内。在另一个实施例中，转基因还可以包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在第一剪接受体和第二剪接受体的侧端。第一靶位点和第二靶位点可以在第一同源臂和第二同源臂的侧端。在实施例中，本文所述的转基因可以整合在内源基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。

除非另有指示，否则本文所公开的方法的实践以及组合物的制备和使用均采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组dna及本领域技术范围内相关领域中的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如，sambrook等人《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》,第二版,冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress),1989和第三版,2001；ausubel等人,《分子生物学实验室指南(currentprotocolsinmolecularbiology)》,约翰·威利父子出版社(johnwiley&sons),纽约(newyork),1987和定期更新；《酶学方法(methodsinenzymology)》系列,学术出版社(academicpress),圣地亚哥(sandiego)；wolffe,《染色质结构和功能(chromatinstructureandfunction)》,第三版,学术出版社,圣地亚哥,1998；《酶学方法》,第304卷,“染色质(chromatin)”(p.m.wassarman和a.p.wolffe编辑),学术出版社,圣地亚哥,1999；和《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》,第119卷,“染色质方案(chromatinprotocols)”(p.b.becker编辑)胡玛纳出版社(humanapress),托托瓦(totowa),1999。

如本文所使用的，术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用。核酸和多核苷酸可以指呈线性或环状构型并且呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。这些术语不应解释为对聚合物长度的限制。所述术语可以涵盖天然核苷酸以及在碱基、糖和/或磷酸盐部分中被修饰的核苷酸的已知类似物。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换地用于指共价连接在一起的氨基酸残基。所述术语还适用于其中一个或多个氨基酸是对应天然存在的氨基酸的化学类似物或经修饰的衍生物的蛋白质。

术语“操作性地连接”或“可操作地连接”可以互换使用，并且是指两个或更多个组件(如序列元件)的并置，其中组件被布置成使得两个组件均正常发挥功能，并使得组件中的至少一个组件能够介导施加在至少一个其它组件上的功能。举例来说，如果如启动子等转录调控序列响应于一个或多个转录调控因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则转录调控序列操作性地连接到编码序列。转录调控序列通常与编码序列以顺式的方式操作性地连接，但是不必直接与其相邻。例如，增强子是操作性地连接到编码序列的转录调控序列，即使它们不是连续的。进一步地，举例来说，如果剪接受体能够界定内含子的3'边界，并且如果所得的成熟mrna的翻译导致由部分编码序列编码的肽序列并入到最终的蛋白质产物中，则剪接受体可以可操作地连接到部分编码序列。

如本文所使用的，术语“切割”是指核酸分子的共价主链的断裂。切割可以通过多种方法引发，包含但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。切割可以是指单链切口和双链断裂。双链断裂可能是由于两个不同的单链切口引起的。核酸切割可以导致平末端或交错末端的产生。在某些实施例中，稀有切割核酸内切酶用于靶向的双链或单链dna切割。

“外源”分子可以是指在细胞外产生或存在或通常不存在于细胞中的小分子(例如，糖、脂质、氨基酸、脂肪酸、酚类化合物、生物碱)或大分子(例如，蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖)或上述分子的任何经修饰的衍生物或包括上述分子中的一个或多个分子的任何复合物。可以将外源分子引入到细胞中。用于将外源分子引入或“施用”到细胞中的方法可以包含脂质介导的转移、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、deae-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。如本文所定义的，“施用”可以是指将外源分子递送、提供或引入到细胞中。如果将转基因或稀有切割核酸内切酶施用于细胞，则将转基因或稀有切割核酸内切酶被递送、提供或引入到细胞中。稀有切割核酸内切酶可以以纯化的蛋白质、核酸或纯化的蛋白质和核酸的混合物的形式施用。核酸(即，rna或dna)可以编码稀有切割核酸内切酶或稀有切割核酸内切酶的一部分(例如，grna)。可以通过如脂质介导的转移、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、deae-葡聚糖介导的转移、病毒载体介导的转移等方法或任何适合于将纯化的蛋白质或核酸或纯化的蛋白质和核酸的混合物递送到细胞的手段来实现施用。

“内源”分子是在特定环境条件下在特定发育阶段存在于特定细胞中的分子。内源分子可以是核酸、染色体、线粒体的基因组、叶绿体或其它细胞器或天然存在的附加型核酸。另外的内源分子可以包含蛋白质，例如转录因子和酶。

如本文所使用的，“基因”是指编码基因产物的dna区域，包含调控基因产物产生的所有dna区域。因此，基因包含但不一定限于：启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点以及基因座控制区域。如本文所使用的，“野生型基因”是指在特定群体中以最高频率存在的基因形式。

“内源基因”是指通常存在于编码基因产物的特定细胞中的dna区域以及调控基因产物产生的所有dna区域。

“基因表达”是指将基因中含有的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物。例如，基因产物可以是但不限于mrna、trna、rrna、反义rna、核酶、结构rna或通过翻译mrna产生的蛋白质。基因产物还包含通过如封端、多腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的rna，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、adp-核糖基化、十四烷基化和糖基化修饰的蛋白质。

“编码”是指将核酸中含有的信息转化为产物，其中产物可以由核酸序列的直接转录产物产生。例如，产物可以是但不限于mrna、trna、rrna、反义rna、核酶、结构rna或通过翻译mrna产生的蛋白质。基因产物还包含通过如封端、多腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的rna，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、adp-核糖基化、十四烷基化和糖基化修饰的蛋白质。

“靶位点”或“靶序列”定义了稀有切割核酸内切酶或crispr相关转座酶将结合到的核酸的一部分，条件是存在充分的结合条件。

如本文所使用的，术语“重组”是指两个多核苷酸之间的遗传信息交换的过程。术语“同源重组(hr)”是指可以在例如双链断裂的修复期间发生的特殊重组形式。同源重组需要在“供体”分子上存在核苷酸序列同源性。供体分子可以被细胞用作用于修复双链断裂的模板。供体分子内的与双链断裂处或附近的基因组序列不同的信息可以稳定地并入到细胞的基因组dna中。

如本文所使用的，术语“整合”是指将dna添加到dna的靶区域的过程。如本文所描述的，可以通过若干种不同的手段来促进整合，包含非同源末端连接、同源重组或靶向转座。举例来说，可以通过非同源末端连接来促进将用户提供的dna分子整合到靶基因中。在此，在靶基因内进行靶向双链断裂，并且施用用户提供的dna分子。用户提供的dna分子可以包括暴露的dna末端，以利于通过非同源末端连接在靶基因修复期间进行捕获。暴露的末端可以在施用(即，线性dna分子的施用)后存在于dna分子上，或者在施用到细胞后产生(即，稀有切割核酸内切酶在细胞内切割用户提供的dna分子以暴露出末端)。另外，用户提供的dna分子可以被携带在病毒载体(包含腺相关病毒载体)上。在另一个示例中，通过同源重组发生整合。在此，用户提供的dna可以携带左同源臂和右同源臂。在另一个示例中，整合通过转座发生。在此，用户提供的dna携带转座子左和右末端。

如本文所使用的，术语“转基因”是指可以转移到生物体或细胞的核酸序列。转基因可以包括靶生物体或细胞中通常不存在的基因或核酸序列。另外，转基因可以包括靶生物体或细胞中通常存在的基因或核酸序列的拷贝。转基因可以是引入到靶细胞的细胞质或细胞核中的外源dna序列。在一个实施例中，本文所述的转基因含有部分编码序列，其中部分编码序列编码由宿主细胞中的基因产生的蛋白质的一部分。

如本文所使用的，术语“致病性”是指可以引起疾病的任何事物。致病性突变可以是指引起疾病的基因中的修饰。致病性基因是指包括引起疾病的修饰的基因。举例来说，患有脊髓小脑共济失调3的患者的致病性atxn3基因是指具有扩展的cag三核苷酸重复序列的atxn3基因，其中扩展的cag三核苷酸重复序列引起所述疾病。

如本文所使用的，术语“尾接尾”是指两个单元在相对和相反方向上的朝向。所述两个单元可以是单个核酸分子上的两个序列，其中每个序列的3'末端彼此相邻放置。例如，在5'至3'方向上具有元件[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]的第一核酸和具有元件[剪接受体2]-[部分编码序列2]-[终止子2]的第二核酸可以以尾接尾朝向放置，从而产生[剪接接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]，其中rc是指反向补体。

术语“内含子-外显子连接部”是指基因内的特定位置。特定位置介于内含子中的最后一个核苷酸和随后的外显子的第一个核苷酸之间。当整合本文所述的转基因时，转基因可以整合在“内含子-外显子连接部”内。如果转基因包括运载物，则运载物将被整合在紧接在内含子中的最后一个核苷酸之后的位置处。在一些情况下，将转基因整合在内含子-外显子连接部内可以引起外显子内序列的去除(例如，通过hr整合并且用转基因内的运载物替代外显子内的序列)。

如本文所使用的，术语“同源”是指与核酸或氨基酸的第二序列具有相似性的核酸或氨基酸序列。在一些实施例中，同源序列可以彼此具有至少80％的序列同一性(例如，81％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)。

如本文所使用的，术语“部分编码序列”是指编码部分蛋白质的核酸序列。与野生型蛋白质或功能性蛋白质相比，部分编码序列可以编码包括一个或更少氨基酸的蛋白质。部分编码序列可以编码与野生型蛋白质或功能性蛋白质具有同源性的部分蛋白质。当提及atxn3时，术语“部分编码序列”是指编码部分atxn3蛋白的核酸序列。与野生型atxn3蛋白相比，部分atxn3蛋白具有一个或更少的氨基酸。如果修饰基因的3’末端，则一个或更少的氨基酸可以来自蛋白质的n端。如果atxn3基因具有11个外显子，则部分编码序列可以包括编码由外显子2-11、或3-11、或4-11、或5-11、或6-11、或7-11、或8-11、或9-11、或10-11、或11产生的肽的序列。

本文件中描述的方法和组合物可以使用具有运载物序列的转基因。术语“运载物”可以是指如基因的完整或部分编码序列、相对于wt或改变的靶标携带单核苷酸多态性的基因的部分序列、剪接受体、终止子、转录调控元件、纯化标签(例如，谷胱甘肽-s-转移酶、聚(his)、麦芽糖结合蛋白、strep-标签、myc-标签、avitag、ha-标签或几丁质结合蛋白)或报告基因(例如，gfp、rfp、lacz、cat、萤光素酶、puro、新霉素)等元件。如本文所定义的，“运载物”可以是指转基因内整合在靶位点处的序列。例如，“运载物”可以是指两个同源臂、两个稀有切割核酸内切酶靶位点或左和右转座子末端之间的转基因上的序列。

术语“同源序列”是指与第二核酸具有同源性的核酸序列。例如，同源序列可以作为“具有同源性的臂”或“同源臂”存在于供体分子上。同源臂可以是供体分子内的促进与第二核酸同源重组的核酸序列。如本文所定义的，同源臂也可以称为“臂”。在具有两个同源臂的供体分子中，同源臂可以称为“臂1”和“臂2”。在一个方面，运载物序列可以侧接有第一同源臂和第二同源臂。

术语“双向终止子”是指可以在有义或反义方向上终止rna聚合酶转录的终止子。相比于尾接尾朝向上的两个单向终止子，双向终止子可以包括dna的非嵌合序列。双向终止子的示例包含aro4、trp1、trp4、adh1、cyc1、gal1、gal7和gal10终止子。

核酸分子的5'或3'末端引用了核酸的方向性和化学朝向。如本文所定义的，“基因的5'末端”可以包括具有起始密码子的外显子，但不包括具有终止密码子的外显子。如本文所定义的，“基因的3'末端”可以包括具有终止密码子的外显子，但不包括具有起始密码子的外显子。

术语“atxn3”基因是指编码酶脊髓小脑共济失调蛋白-3的基因。atxn3基因的代表性序列可以见于ncbi参考序列：ng_008198.2和对应的seqidno:42。外显子和内含子边界可以用seqidno:42中提供的序列定义。具体地，外显子1包含从1到54的序列。外显子2包含从9745到9909的序列。外显子3包含从10446到10490的序列。外显子4包含从12752到12837的序列。外显子5包含从13265到13331的序列。外显子6包含从17766到17853的序列。外显子7包含从23325到23457的序列。外显子8包含从24117到24283的序列。外显子9包含从25522到25618的序列。外显子10包含从35530到35648的序列。外显子11包含从42169到48031的序列。内含子1包含从55到9744的序列。内含子2包含从9910到10445的序列。内含子3包含从10491到12751的序列。内含子4包含从12838到13264的序列。内含子5包含从13332到17765的序列。内含子6包含从17854到23324的序列。内含子7包含从23458到24116的序列。内含子8包含从24284到25521的序列。内含子9包含从25619到35529的序列。内含子10包含从35649到42168的序列。

术语“cacna1a”基因是指编码钙电压门控通道亚基α1a蛋白的基因。cacna1a基因的代表性序列可以见于ncbi参考序列：ng_011569.1和对应的seqidno:43。外显子和内含子边界可以用seqidno:43中提供的序列定义。具体地，外显子1包含从1到529的序列。外显子2包含从51249到51354的序列。外显子3包含从53446到53585的序列。外显子4包含从134682到134773的序列。外显子5包含从140992到141144的序列。外显子6包含从146662到146855的序列。外显子7包含从170552到170655的序列。外显子8包含从171968到172083的序列。外显子9包含从173536到173592的序列。外显子10包含从176125到176217的序列。外显子11包含从189140到189349的序列。外显子12包含从193680到193792的序列。外显子13包含从197933到198045的序列。外显子14包含从198210到198341的序列。外显子15包含从198607到198679的序列。外显子16包含从202577到202694的序列。外显子17包含从202848到202915的序列。外显子18包含从205805到205911的序列。外显子19包含从207108到207917的序列。外显子20包含从219495到219958的序列。外显子21包含从221255到221393的序列。外显子22包含从223065到223194的序列。外显子23包含从229333到229392的序列。外显子24包含从230505到230611的序列。外显子25包含从243628到243727的序列。外显子26包含从244851到245011的序列。外显子27包含从246760到246897的序列。外显子28包含从248910到249111的序列。外显子29包含从251202到251366的序列。外显子30包含从253360到253470的序列。外显子31包含从261196到261279的序列。外显子32包含从270731到270847的序列。外显子33包含从271187到271252的序列。外显子34包含从271425到271540的序列。外显子35包含从274601到274751的序列。外显子36包含从276252到276379的序列。外显子37包含从277666到277762的序列。外显子38包含从281689到281794的序列。外显子39包含从291853到291960的序列。外显子40包含从292128到292228的序列。外显子41包含从293721到293830的序列。外显子42包含从293939到294077的序列。外显子43包含从294245到294358的序列。外显子44包含从295809到295844的序列。外显子45包含从296963到297149的序列。外显子46包含从297452到297705的序列。外显子47包含从298413到300019的序列。内含子1包含从530到51248的序列。内含子2包含从51355到53445的序列。内含子3包含从53586到134681的序列。内含子4包含从134774到140991的序列。内含子5包含从141145到146661的序列。内含子6包含从146856到170551的序列。内含子7包含从170656到171967的序列。内含子8包含从172084到173535的序列。内含子9包含从173593到176124的序列。内含子10包含从176218到189139的序列。内含子11包含从189350到193679的序列。内含子12包含从193793到197932的序列。内含子13包含从198046到198209的序列。内含子14包含从198342到198606的序列。内含子15包含从198680到202576的序列。内含子16包含从202695到202847的序列。内含子17包含从202916到205804的序列。内含子18包含从205912到207107的序列。内含子19包含从207918到219494的序列。内含子20包含从219959到221254的序列。内含子21包含从221394到223064的序列。内含子22包含从223195到229332的序列。内含子23包含从229393到230504的序列。内含子24包含从230612到243627的序列。内含子25包含从243728到244850的序列。内含子26包含从245012到246759的序列。内含子27包含从246898到248909的序列。内含子28包含从249112到251201的序列。内含子29包含从251367到253359的序列。内含子30包含从253471到261195的序列。内含子31包含从261280到270730的序列。内含子32包含从270848到271186的序列。内含子33包含从271253到271424的序列。内含子34包含从271541到274600的序列。内含子35包含从274752到276251的序列。内含子36包含从276380到277665的序列。内含子37包含从277763到281688的序列。内含子38包含从281795到291852的序列。内含子39包含从291961到292127的序列。内含子40包含从292229到293720的序列。内含子41包含从293831到293938的序列。内含子42包含从294078到294244的序列。内含子43包含从294359到295808的序列。内含子44包含从295845到296962的序列。内含子45包含从297150到297451的序列。内含子46包含从297706到298412的序列。

如下确定特定核酸或氨基酸序列与由特定序列标识号引用的序列之间的序列同一性百分比。首先，使用来自含有blastn版本2.0.14和blastp版本2.0.14的blastz的独立版本的blast2序列(bl2seq)程序，将核酸或氨基酸序列与特定序列标识号中列出的序列进行比较。可以从fr.com/blastoratncbi.nlm.nih.gov上在线获得blastz的此独立版本。在blastz随附的自述文件中可以找到有关如何使用bl2seq程序的说明。bl2seq使用blastn或blastp算法在两个序列之间执行比较。blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。为了比较两个核酸序列，选项设置如下：将-i设置为含有待比较的第一核酸序列的文件(例如，c:\seq1.txt)；将-j设置为含有待比较的第二核酸序列的文件(例如，c:\seq2.txt)；将-p设置为blastn；将-o设置为任何期望的文件名(例如，c:\output.txt)；将-q设置为-1；将-r设置为2；并且使所有其它选项保持处于默认设置。例如，可以使用以下命令来生成含有两个序列之间的比较的输出文件：c:\bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastn-oc:\output.txt-q-1-r2。为了比较两个氨基酸序列，将bl2seq的选项设置如下：将-i设置为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(例如，c:\seq1.txt)；将-j设置为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(例如，c:\seq2.txt)；将-p设置为blastp；将-o设置为任何期望的文件名(例如，c:\output.txt)；并且使所有其它选项保持处于默认设置。例如，可以使用以下命令来生成含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：c:\bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastp-oc:\output.txt。如果所述两个经过比较的序列共享同源性，则指定的输出文件将把那些同源区域呈现为经过比对的序列。如果所述两个经过比较的序列不共享同源性，则指定的输出文件将不呈现经过比对的序列。

一旦经过比对，就通过对在两个序列中呈现相同的核苷酸或氨基酸残基的位置的数目进行计数来确定匹配数。序列同一性百分比是通过将匹配数除以经鉴定序列中列出的序列的长度或被铰接的长度(例如，来自经鉴定序列中列出的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将所得值乘以100来确定的。序列同一性百分比值被四舍五入至最近的十分位。

在一个实施例中，本文件的特征在于用于修饰内源基因的3'末端的方法，其中内源基因在两个编码外显子之间具有至少一个内含子。所述内含子可以是通过常规信使rna加工机器从前体信使rna中去除的任何内含子。所述内含子可以介于20bp与>500kb之间，并且包括包含剪接供体位点、分支序列和受体位点的元件。本文公开的用于修饰内源基因的3'末端的转基因可以包括多个功能元件，包含用于稀有切割核酸内切酶的靶位点、同源臂、剪接受体序列、编码序列和转录终止子(图1)。

在一个实施例中，转基因包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的两个靶位点。所述靶位点可以是适合于由稀有切割核酸内切酶切割的序列和长度。所述靶位点可以由crispr系统、tal效应子核酸酶、锌指核酸酶或大范围核酸酶或crispr系统、tale核酸酶、锌指核酸酶或大范围核酸酶的组合或任何其它位点特异性核酸酶切割。可以定位靶位点，使得通过稀有切割核酸内切酶的切割引起转基因从载体释放。载体可以包含病毒载体(例如，腺相关载体)或非病毒载体(例如，质粒、小环载体)。如果转基因包括两个靶位点，则靶位点可以是相同序列(即，被相同的稀有切割核酸内切酶靶向)或它们可以是不同序列(即，被两个或更多个不同的稀有切割核酸内切酶靶向)。

在一个实施例中，转基因包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点以及第一同源臂和第二同源臂。第一同源臂和第二同源臂可以包含与在期望的整合位点处或附近的基因组序列同源的序列。同源臂的长度可以适合于参与与在期望的整合位点处或附近的序列的同源重组。每个同源臂的长度可以介于20nt与10,000nt之间(例如，20nt、30nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1,000nt、2,000nt、3,000nt、4,000nt、5,000nt、6,000nt、7,000nt、8,000nt、9,000nt、10,000nt)。在一个实施例中，同源臂可以包括功能元件，包含用于稀有切割核酸内切酶的靶位点和/或剪接受体序列。在一个实施例中，第一同源臂(例如，左同源臂)可以包括与被靶向的内含子同源的序列，其包含被靶向的内含子的剪接受体位点。在另一个实施例中，第二同源臂可以包括与被靶向的内含子下游的基因组序列同源的序列(例如，外显子序列，3’utr序列)。然而，第二同源臂在反向补体方向上必定不具有剪接受体功能。为了确定序列是否包括剪接受体功能，可以采取若干个步骤，包含计算机模拟分析和实验测试。为了确定是否存在剪接受体功能的潜力，可以搜索第二同源臂所期望的序列以寻找共有分支序列(例如，ytrac)和剪接受体位点(例如，富含y的ncagg)。如果存在分支或剪接受体序列，则可以引入单核苷酸多态性以破坏功能，或者可以选择不包括此类序列的不同但相邻的序列。优选地，可以用于第二同源臂的序列窗口在靶向整合的内含子下游从1bp延伸到10kb。为了实验确定第二同源性是否具有剪接受体功能，可以构建在报告基因内的内含子内包括第二同源臂的合成构建体。然后可以将构建体施用于适当的细胞类型，并监测其剪接功能。

在一个实施例中，转基因包括在本文中称为第一剪接受体序列和第二剪接受体序列的两个剪接受体序列。第一剪接受体序列和第二剪接受体序列在相反的方向上(即，以尾接尾朝向)定位在转基因内并且在内部序列(即，编码序列和终止子)的侧端。当转基因在正向或反向方向上整合到内含子中时，剪接受体序列可以在mrna加工期间促进相邻/上游内含子序列的去除。第一剪接受体序列和第二剪接受体序列可以是相同序列或不同序列。一个或两个剪接受体序列可以是转基因将被整合到的内含子的剪接受体序列。一个或两个剪接受体序列可以是合成剪接受体序列或来自不同基因的内含子的剪接受体序列。

在一个实施例中，转基因包括可操作地连接到第一剪接受体序列和第二剪接受体序列的第一编码序列和第二编码序列。第一编码序列和第二编码序列在相反的方向上(即，以尾接尾朝向)定位在转基因内。当转基因在正向或反向方向上整合到内源基因中时，内源基因的启动子将第一编码序列或第二编码序列转录到mrna中。可以设计编码序列以纠正有缺陷的编码序列、引入突变或引入新的肽序列。第一编码序列和第二编码序列可以是相同的核酸序列，并且编码相同的蛋白质。可替代地，第一编码序列和第二编码序列可以是不同的核酸序列，并且编码相同的蛋白质(即，使用密码子的简并性)。编码序列可以编码纯化标签(例如，谷胱甘肽-s-转移酶，聚(his)、麦芽糖结合蛋白、strep-标签、myc-标签、avitag、ha-标签或几丁质结合蛋白)或报道蛋白(例如，gfp、rfp、lacz、cat、萤光素酶、puro、新霉素)。在一个实施例中，转基因包括可操作地连接到第一剪接受体序列和第二剪接受体序列的第一部分编码序列和第二部分编码序列，并且转基因不包括启动子。

在一个实施例中，转基因可以包括可操作地连接到第一编码序列和第二编码序列的双向终止子或第一终止子和第二终止子。双向终止子或第一终止子和第二终止子在相反的方向上(即，以尾接尾朝向)定位在转基因内。当转基因在正向或反向方向上整合到内源基因中时，双向终止子或第一终止子和第二终止子终止从内源基因的启动子的转录。第一终止子和第二终止子可以是相同的终止子或不同的终止子。

在一个实施例中，本文件提供了一种转基因，所述转基因包括第一稀有切割核酸内切酶靶位点和第二稀有切割核酸内切酶靶位点、第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一编码序列和第二编码序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子。可以通过包含非同源末端连接和替代性非同源末端连接在内非同源性依赖性方法或者通过微同源性介导的末端连接将转基因整合在内源基因中。在一个方面，将转基因整合到内源基因内的内含子中(图2)。

在另一个实施例中，本文件提供了一种转基因，所述转基因包括第一同源臂和第二同源臂、第一稀有切割核酸内切酶靶位点和第二稀有切割核酸内切酶靶位点、第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一编码序列和第二编码序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子。可以通过同源性依赖性方法(例如，合成依赖性链退火和微同源性介导的末端连接)和非同源性依赖性方法(例如，非同源末端连接和替代性非同源末端连接)将转基因整合在内源基因中。在一个方面，将转基因整合到内源基因内的内含子中(图3)。在另一个方面，将转基因整合在内含子的末端处或下游外显子的起点处(图3)。

在另一个实施例中，本文件提供了一种转基因，所述转基因包括第一同源臂和第二同源臂、第一编码序列和第二编码序列、第一剪接受体序列和第二剪接受体序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子(图1)。在另一个实施例中，本文件提供了一种转基因，所述转基因包括第一编码序列和第二编码序列、第一剪接受体序列和第二剪接受体序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子。

在另一个实施例中，本文件提供了一种转基因，所述转基因包括第一同源臂和第二同源臂、第一编码序列和第二编码序列、第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、一个双向终止子或第一终止子和第二终止子以及第一另外的序列和第二另外的序列(图1)。在某些实施例中，另外的序列可以是转基因上的5’和3’末端处存在的任何另外的序列，然而，另外的序列不应包括任何用作剪接受体的元件。另外的序列可以是例如病毒基因组的反向端重复序列。另外的序列可以存在于具有线性形式的转基因上。线性形式允许通过nhej进行整合。例如，在腺相关病毒载体中携带的转基因(其中另外的序列是反向端重复序列)可以在由稀有切割核酸内切酶切割后，通过nhej直接整合在靶位点处(即，不需要对转基因进行加工)。在另一个示例中，另外的序列是左和右转座子末端。

在另一个实施例中，本文件提供了病毒载体(包含腺相关病毒和腺病毒)内的转基因，其中转基因包括第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一编码序列和第二编码序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子。由于病毒载体的反向端重复序列，转基因还包括第一另外的序列和第二另外的序列。

在另一个实施例中，本文件提供了病毒载体(包含腺相关病毒和腺病毒)内的转基因，其中转基因包括第一同源臂和第二同源臂、第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一编码序列和第二编码序列以及一个双向终止子或第一终止子和第二终止子。由于病毒载体的反向端重复序列，转基因还包括第一另外的序列和第二另外的序列。

在一些实施例中，本文提供的转基因可以与转座酶整合。转座酶可以包含crispr转座酶(strecker等人,《科学(science)》10.1126/science.aax9181,2019；klompe等人,《自然(nature)》,10.1038/s41586-019-1323-z,2019)。转座酶可以与包括第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一编码序列和第二编码序列、一个双向终止子或第一终止子和第二终止子(图1)以及转座子左末端和右末端的转基因组合使用。crispr转座酶可以包含typev-u5、c2c5crispr蛋白、cas12k以及蛋白tnsb、tnsc和tniq。在一些实施例中，cas12k可以来自贺氏伪枝藻(scytonemahofmanni)(seqidno:30)或柱孢鱼腥藻(anabaenacylindrica)(seqidno:31)。在一个实施例中，可以将本文所述的包括左转座子末端(seqidno:32)和右转座子末端(seqidno:33)的转基因与shcas12k、tnsb、tnsc、tniq和grna(seqidno:14)一起递送到细胞。可替代地，crispr转座酶可以包含cas6蛋白以及包含cas7、cas8和tniq的辅助蛋白。在一个实施例中，可以将本文所述的包括左转座子末端(seqidno:41)和右转座子末端(seqidno:13)的转基因与cas6(seqidno:37)、cas7(seqidno:37)、cas8(seqidno:37)、tniq(seqidno:37)、tnsa(seqidno:37)、tnsb(seqidno:37)、tnsc(seqidno:37)和grna(seqidno:12)一起递送到真核细胞。这些蛋白质可以作为纯化的蛋白质直接施用于细胞，或者可以在rna或dna上编码。如果在rna或dna上编码，则可以对所述序列进行密码子优化以在真核细胞中表达。可以将grna(seqidno:12)放置于rnapoliii启动子的下游，并且用poly(t)终止子终止。

在一些实施例中，本文所述的转基因可以具有包含剪接受体、部分编码序列、终止子、同源臂、左和右转座酶末端以及用于由稀有切割核酸内切酶切割的位点的元件的组合。在一个实施例中，所述组合可以是从5'至3'的[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]，其中rc代表反向补体。这种组合可以被携带在线性dna分子或aav分子上，并且可以通过nhej借助于靶基因的靶向断裂而整合。在另一个实施例中，所述组合可以是从5'至3'的[稀有切割核酸内切酶切割位点1]-[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]-[稀有切割核酸内切酶切割位点1]。在另一个实施例中，所述组合可以是从5'至3'的[稀有切割核酸内切酶切割位点1]-[同源臂1]-[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]-[同源臂2]-[稀有切割核酸内切酶切割位点2]。在这种组合中，一种或多种稀有切割核酸内切酶可以用于促进hr和nhej。例如，单一稀有切割核酸酶可以切割靶基因(即，期望的内含子)，并且可以将同源臂的侧端的切割位点设计为内含子内的相同靶序列。在另一个实施例中，所述组合可以是从5'至3'的[同源臂1+稀有切割核酸内切酶切割位点1]-[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]-[同源臂2]-[稀有切割核酸内切酶切割位点1]。在这种组合中，一种或多种稀有切割核酸内切酶可以促进hr和nhej。例如，单一稀有切割核酸酶可以在同源臂1内、同源臂2的下游和基因组靶位点处(即，与同源臂1中的序列具有同源性的位点处)切割。在另一个实施例中，所述组合可以是从5'至3'的[转座酶的左末端]-[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]-[转座酶的右末端]。在所有实施例中，剪接受体1和剪接受体2可以是相同或不同的序列；部分编码序列1和部分编码序列2可以是相同或不同的序列；终止子1和终止子2可以是相同或不同的序列。

在实施例中，可以通过递送一种或多种稀有切割核酸内切酶将包括结构[稀有切割核酸内切酶切割位点1]-[同源臂1]-[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]-[同源臂2]-[稀有切割核酸内切酶切割位点2]的转基因整合到dna中。如果递送一种稀有切割核酸内切酶，则稀有切割核酸内切酶可以通过在稀有切割核酸内切酶切割位点1和2处切割来释放转基因。进一步地，相同的稀有切割核酸内切酶可以在靶基因内产生断裂，从而模拟通过hr或nhej的插入。

在其它实施例中，可以通过递送一种或多种稀有切割核酸内切酶将包括结构[同源臂1+稀有切割核酸内切酶切割位点1]-[剪接受体1]-[部分编码序列1]-[终止子1]-[终止子2rc]-[部分编码序列2rc]-[剪接受体2rc]-[同源臂2]-[稀有切割核酸内切酶切割位点1]的转基因整合到dna中。如果递送一种稀有切割核酸内切酶，则稀有切割核酸内切酶可以通过在稀有切割核酸内切酶切割位点1和2处切割来释放转基因。进一步地，相同的稀有切割核酸内切酶可以在靶基因内产生断裂，从而模拟通过hr或nhej的插入。当切割在整合位点的上游(即，在同源臂内)时，可以通过hr进行整合。

在实施例中，转基因整合的位置可以是内含子或内含子-外显子连接部。当靶向内含子时，部分编码序列可以包括编码由内源基因内的之后的外显子产生的肽的序列。例如，如果转基因被设计为整合在具有11个外显子的内源基因的内含子9中，则部分编码序列可以包括编码由内源基因的外显子10和11产生的肽的序列。当靶向内含子-外显子连接部时，转基因可以被设计为包括具有与所述内含子的3'同源的序列的同源臂。

在一些实施例中，部分编码序列可以是完整编码序列。完整编码序列可以编码内源基因(例如，因子viii、因子ix或ins)或报道基因(例如，rfp、gfp、cat、lacz、荧光素酶)。完整编码序列可以可操作地连接到剪接受体和终止子，并且以尾接尾朝向放置于转基因中。

本文提供的方法和组合物可以用于修饰细胞内的内源基因。内源基因可以包含纤维蛋白原、凝血酶原、组织因子、因子v、因子vii、因子viii、因子ix、因子x、因子xi、因子xii(哈格曼(hageman)因子)、因子xiii(血纤维蛋白稳定因子)、冯·威兰布兰德(vonwillebrand)因子、前激肽释放酶、高分子量激肽原(菲兹杰拉尔德(fitzgerald)因子)、纤连蛋白、抗凝血酶iii、肝素辅因子ii、蛋白c、蛋白s、蛋白z、蛋白z相关蛋白酶抑制剂、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、葡糖脑苷脂酶(gba)、α-半乳糖苷酶a(gla)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(ids)、艾杜糖醛酸酶(idua)、酸性鞘磷脂酶(smpd1)、mmaa、mmab、mmachc、mmadhc(c2orf25)、mtrr、lmbrd1、mtr、丙酰辅酶a羧化酶(pcc)(pcca和/或pccb亚基)、葡糖-6-磷酸酯转运体(g6pt)蛋白或葡糖-6-磷酸酶(g6pase)、ldl受体(ldlr)、apob、ldlrap-1、pcsk9、线粒体蛋白如nags(n-乙酰谷氨酸合成酶)、cps1(氨甲酰磷酸合成酶i)和otc(鸟氨酸转氨甲酰酶)、ass(精氨基琥珀酸合成酶)、asl(精氨基琥珀酸酸裂解酶)和/或arg1(精氨酸酶)和/或溶质载体家族25(slc25a13、天冬氨酸盐/谷氨酸盐载体)蛋白、ugt1a1或udp葡萄糖醛酸基转移酶多肽a1、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fah)、丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(agxt)蛋白、乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(grhpr)蛋白、转甲状腺素蛋白基因(ttr)蛋白、atp7b蛋白、苯丙氨酸羟化酶(pah)蛋白、ush2a蛋白、atxn蛋白和脂蛋白裂解酶(lpl)蛋白。

转基因可以包含用于修饰对患有遗传疾病的受试者中缺乏的或无功能的或具有功能获得性突变的多肽进行编码的序列的序列，所述遗传疾病包含但不限于以下遗传疾病：软骨发育不全、全色盲、酸性麦芽糖酶缺乏症、腺苷脱氨酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良、艾卡尔迪综合征(aicardisyndrome)、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、α-地中海贫血、雄激素不敏感综合征、珀特综合征(pertsyndrome)、致心律失常性右心室发育不良、共济失调毛细血管扩张症、巴氏综合征(barthsyndrome)、β-地中海贫血、蓝色橡皮疱痣综合征、卡纳万病(canavandisease)、慢性肉芽肿性疾病(cgd)、猫叫综合征、囊性纤维化、德尔肯氏病(dercum'sdisease)、外胚层发育不良、范可尼贫血、渐进性骨化性纤维发育不良、脆性x综合征、半乳糖症、高歇氏病(gaucher'sdisease)、广泛性神经节苷脂沉积症(例如，gm1)、血色沉着病、β-珠蛋白的第6个密码子的血红蛋白c突变(hbc)、血友病、亨廷顿氏舞蹈病(huntington'sdisease)、胡尔勒综合征(hurlersyndrome)、低磷酸脂酶症、克兰费尔特综合征(klinefletersyndrome)、克拉贝病(krabbesdisease)、langer-giedion综合征、白细胞粘附缺乏症、脑白质营养不良、长qt综合征、马方综合征(marfansyndrome)、莫比斯综合征(moebiussyndrome)、粘多糖贮积症(mps)、指甲髌骨综合征、肾原性尿崩症、神经纤维瘤病、neimann-pick疾病、成骨不全症、卟啉症、普拉德-威利综合征(prader-willisyndrome)、早衰、普罗蒂斯综合征(proteussyndrome)、视网膜母细胞瘤、雷特综合征(rettsyndrome)、鲁宾斯坦-泰比综合征(rubinstein-taybisyndrome)、沙费利波综合征(sanfilipposyndrome)、严重的联合免疫缺陷症(scid)、舒瓦克曼综合征(shwachmansyndrome)、镰状细胞疾病(镰状细胞性贫血)、smith-magenis综合征、斯蒂克勒综合征(sticklersyndrome)、泰-萨二氏病(tay-sachsdisease)、血小板减少症桡骨缺失(thrombocytopeniaabsentradius，tar)综合征、崔契尔柯林斯综合征(treachercollinssyndrome)、三体性、结节性硬化症、特纳氏综合征(turner'ssyndrome)、尿素循环病症、vonhippel-landau病、瓦登伯革氏综合征(waardenburgsyndrome)、威廉斯综合征(williamssyndrome)、威尔逊氏病(wilson'sdisease)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(wiskott-aldrichsyndrome)、x连锁淋巴组织增生综合征、溶酶体贮积病(例如，高歇氏病、gm1、法布里病(fabrydisease)和泰-萨二氏病)、黏多糖病(例如，亨特氏病(hunter'sdisease)、赫尔勒氏病(hurler'sdisease))、血红蛋白病(例如，镰状细胞疾病、hbc、α-地中海贫血、β-地中海贫血)和血友病。

可以通过靶向整合治疗的另外的疾病包含血管性血友病、乌谢尔综合征(ushersyndrome)、多囊性肾病、3型脊髓小脑共济失调和6型脊髓小脑共济失调。

在一个实施例中，基因组修饰是将转基因插入内源cacna1a基因组序列中。转基因可以包含cacna1a蛋白的合成和部分编码序列。部分编码序列可以与野生型cacna1a基因或野生型cacna1a基因的功能变体或野生型cacna1a基因的突变体内的编码序列同源。在一个实施例中，将编码部分cacna1a蛋白的转基因插入到内含子46中或外显子47的起点中。

在另一个实施例中，基因组修饰是将转基因插入内源性atxn3基因组序列中。转基因可以包含atxn3蛋白的合成和部分编码序列。部分编码序列可以与野生型atxn3基因或野生型atxn3基因的功能变体或野生型atxn3基因的突变体内的编码序列同源。在一个实施例中，将编码部分atxn3蛋白的转基因插入到内含子9中或外显子10的起点中。

在一个实施例中，本文所述的方法和组合物可以用于修饰内源基因的3'末端，从而引起对内源基因编码的蛋白质的c端的修饰。内源基因的编码序列的3'末端的修饰可以包含最终编码外显子(即，包括终止密码子的外显子)的替代，直至介于具有起始编码的外显子与最终外显子之间的外显子。如本文所定义的，“替代”是指将dna插入基因中，其中插入的dna提供了用于产生1个或更多个外显子的mrna和蛋白质的信息。可以通过将转基因整合到内源基因中来进行替代，其中转基因包括可操作地连接到剪接受体的一个或多个编码序列。插入可能引起或可能不会引起内源基因内序列的缺失(例如，内含子和外显子的缺失)。例如，如果基因包括72个外显子并且起始密码子在外显子1内，则修饰可以包含外显子2-72、3-72、4-72、5-72、6-72、7-72、8-72、9-72、10-72、11-72、12-72、13-72、14-72、15-72、16-72、17-72、18-72、19-72、20-72、21-72、22-72、或23-72、或24-72、或25-72、或26-72、或27-72、或28-72、或29-72、或30-72、或31-72、或32-72、或33-72、或34-72、或35-72、或36-72、或37-72、或38-72、或39-72、或40-72、或41-72、或42-72、或43-72、或44-72、或45-72、或46-72、或47-72、或48-72、或49-72、或50-72、或51-72、或52-72、或53-72、或54-72、或55-72、或56-72、或57-72、或58-72、或59-72、或60-72、或61-72、或62-72、或63-72、或64-72、或65-72、或66-72、或67-72、或68-72、或69-72、或70-72、或71-72或72的替代。在一个实施例中，可以通过将转基因整合到内源基因中来替代内源基因的外显子，其中转基因包括第一部分编码序列和第二部分编码序列，其中第一部分编码序列和第二部分编码序列编码由内源基因外显子产生的肽。例如，转基因的第一编码序列和第二编码序列可以编码由内源基因的外显子2-72、3-72、4-72、5-72、6-72、7-72、8-72、9-72、10-72、11-72、12-72、13-72、14-72、15-72、16-72、17-72、18-72、19-72、20-72、21-72、22-72、或23-72、或24-72、或25-72、或26-72、或27-72、或28-72、或29-72、或30-72、或31-72、或32-72、或33-72、或34-72、或35-72、或36-72、或37-72、或38-72、或39-72、或40-72、或41-72、或42-72、或43-72、或44-72、或45-72、或46-72、或47-72、或48-72、或49-72、或50-72、或51-72、或52-72、或53-72、或54-72、或55-72、或56-72、或57-72、或58-72、或59-72、或60-72、或61-72、或62-72、或63-72、或64-72、或65-72、或66-72、或67-72、或68-72、或69-72、或70-72、或71-72或72产生的肽。转基因可以整合在内源基因内的上游内含子中或与转基因的部分编码序列内的第一外显子相对应的外显子的起点处(图2)。可以将转基因设计为4.7kb或更小并且并入到aav载体和颗粒中，并且然后体内递送到靶细胞。

在一个实施例中，转基因是携带第一部分编码序列和第二部分编码序列的dna序列，其中所述部分编码序列编码部分蛋白质，其中所述部分蛋白质与由野生型基因产生的功能性蛋白质中的对应区域同源。宿主基因或内源基因是其中蛋白质表达异常，换句话说，不表达、以低水平表达或表达但mrna或蛋白质产物或其部分无功能、功能降低或具有功能获得性从而导致宿主的病症的宿主基因或内源基因。

如本文所描述的，供体分子可以在病毒或非病毒载体中。载体可以呈环状或线性双链或单链dna的形式。供体分子可以与促进稳定性或细胞更新的试剂缀合或缔合。所述试剂可以是脂质、磷酸钙、阳离子聚合物、deae-葡聚糖、树状聚合物、聚乙二醇(peg)细胞穿透肽、气体封装的微泡或磁珠。供体分子可以并入到病毒颗粒中。所述病毒可以是逆转录病毒、腺病毒、腺相关载体(aav)、单纯性疱疹、痘病毒、杂交腺病毒载体、爱泼斯坦-巴病毒(epstein-barvirus)、慢病毒或单纯性疱疹病毒。

在某些实施例中，本文所述的aav载体可以衍生自任何aav。在某些实施例中，aav载体衍生自有缺陷的和非致病性细小病毒腺相关的2型病毒。所有此类载体均衍生自仅保留在转基因表达盒的侧端的aav145bp反向端重复序列的质粒。由于整合到经转导细胞的基因组中，有效的基因转移和稳定的转基因递送是此载体系统的关键特征。(wagner等人,《柳叶刀(lancet)》351:91171702-3,1998；kearns等人,《基因疗法(genether.)》9:748-55,1996)。根据本发明，也可以使用其它aav血清型，包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9和aavrh.10以及任何新颖的aav血清型。在一些实施例中，使用嵌合aav，其中病毒核酸的长端重复(ltr)序列的病毒来源与衣壳序列的病毒来源异源。非限制性示例包含具有衍生自aav2的ltr和衍生自aav5、aav6、aav8或aav9的衣壳的嵌合病毒(即，分别为aav2/5、aav2/6、aav2/8和aav2/9)。

本文所述的构建体也可以并入到腺病毒载体系统中。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率并且并不需要细胞分裂。使用此类载体，可以获得高滴度和高表达水平。

本文所述的方法和组合物适用于期望通过基因组修饰来改变生物体的任何真核生物。真核生物包含植物、藻类、动物、真菌和原生生物。真核生物还可以包含植物细胞、藻类细胞、动物细胞、真菌细胞和原生生物细胞。

示例性哺乳动物细胞包含但不限于卵母细胞、k562细胞、cho(中国仓鼠卵巢)细胞、hep-g2细胞、baf-3细胞、施耐德细胞(schneidercell)、cos细胞(表达sv40t-抗原的猴肾细胞)、cv-1细胞、hutu80细胞、ntera2细胞、nb4细胞、hl-60细胞和hela细胞、293细胞(参见例如graham等人(1977)《普通病毒学杂志(j.gen.virol.)》36:59)和如sp2或ns0等骨髓瘤细胞(参见例如galfre和milstein(1981)《酶学方法(meth.enzymol.)》73(b):346)。如可以使用胚胎干细胞和成体干细胞，也可以使用外周血单核细胞(pbmc)或t细胞。例如，可以使用的干细胞包含胚胎干细胞(es)、诱导多能干细胞(ipsc)、间充质干细胞、造血干细胞、肝干细胞、皮肤干细胞和神经元干细胞。

本发明的方法和组合物可以用于产生经修饰的生物体。经修饰的生物体可以是小型哺乳动物、伴侣动物、牲畜和灵长类动物。啮齿动物的非限制性示例可以包含小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠。伴侣动物的非限制性示例可以包含猫、狗、兔子、刺猬和雪貂。牲畜的非限制性示例可以包含马、山羊、绵羊、猪、美洲驼、羊驼和牛。灵长类动物的非限制性示例可以包含卷尾猴、黑猩猩、狐猴、猕猴、狨猴、绢毛猴、蜘蛛猴、松鼠猴和黑长尾猴。本发明的方法和组合物可以用于人类。

可以使用本文描述的方法修饰的示例性植物和植物细胞包含但不限于单子叶植物(例如，小麦、玉米、水稻、小米、大麦、甘蔗)、双子叶植物(例如，大豆、马铃薯、番茄、苜蓿)、水果作物(例如，番茄、苹果、梨、草莓、橙子)、饲料作物(例如，苜蓿)、根用蔬菜作物(例如，胡萝卜、马铃薯、甜菜、山药)、叶菜作物(例如，生菜、菠菜)；供消费的营养体作物(例如，大豆和其它豆类、南瓜、辣椒、茄子、芹菜等)、开花植物(例如，矮牵牛、玫瑰、菊花)、针叶树和松树(例如，冷杉、云杉)；杨树(例如，欧洲山杨×银白杨(p.tremula×p.alba))；纤维作物(棉花、黄麻、亚麻、竹子)、用于植物修复的植物(例如，重金属积累植物)；油料作物(例如，向日葵、油菜籽)和用于实验目的的植物(例如，拟南芥)。本文公开的方法可以在芦笋属、燕麦属、芸苔属、柑橘属、西瓜属、辣椒、南瓜、胡萝卜属、飞蓬属、甘氨酸、棉属、大麦属、莴苣属、黑麦草属、番茄属、苹果属、木薯、烟草属、诸葛菜属、稻属、鳄犁属、菜豆属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、黑麦属、茄属、高粱、小麦属、葡萄属、豇豆属和玉蜀黍属中使用。术语植物细胞包含分离的植物细胞以及整个植物或整个植物的一部分，如种子、愈伤组织、叶和根。本公开还涵盖上述植物的种子，其中所述种子已经使用本文所述的组合物和/或方法进行了修饰。本公开还涵盖上述转基因植物的子代、克隆、细胞系或细胞，其中所述子代、克隆、细胞系或细胞具有转基因或基因构建体。示例性藻类物种包含微藻、硅藻、布朗葡萄藻、小球藻、盐生杜氏藻、江蓠属(gracileria)、颗石藻(pleurochrysiscarterae)、马尾藻类(sorgassum)和石莼。

本文件中描述的方法可以包含使用稀有切割核酸内切酶来刺激转基因分子同源重组或非同源整合到内源基因中。稀有切割核酸内切酶可以包含crispr、talen或锌指核酸酶(zfn)。crispr系统可以包含crispr/cas9或crispr/cas12a(cpf1)。crispr系统可以包含显示出广泛pam功能(hu等人,《自然》556,57-63,2018；nishimasu等人,《科学》doi:10.1126,2018)或更高的靶上结合或切割活性(kleinstiver等人,《自然》529:490-495,2016)的变体。基因编辑试剂可以呈以下形式：核酸酶(mali等人,《科学》339:823-826,2013；christian等人,《遗传学(genetics)》186:757-761,2010)、切口酶(cong等人,《科学》339:819-823,2013；wu等人,《生物化学与生物物理学研究通讯(biochemicalandbiophysicalresearchcommunications)》1:261-266,2014)、crispr-foki二聚体(tsai等人,《自然·生物技术(naturebiotechnology)》32:569-576,2014)或成对的crispr切口酶(ran等人,《细胞(cell)》154:1380-1389,2013)。

本文件中描述的方法和组合物可以用于期望修饰内源基因编码序列的3'末端的情况。例如，患有sca3或sca6的患者分别在外显子10(倒数第二个外显子)和外显子47(最后一个外显子)中扩展了cag重复序列。患有sca3或sca6的患者可以分别受益于外显子10-11和外显子47的替代。在其它示例中，患有由于内源基因的3’末端内功能突变丧失而引起的遗传病症的患者可以受益于所述基因的最终外显子的替代。

本发明将在以下示例中进一步描述，所述示例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。

示例

示例1：将dna靶向整合在atxn3基因中

用被设计成整合到人细胞中的atxn3基因中的转基因构建了三个质粒。将所有转基因设计成插入atxn3基因的内含子9或内含子9与外显子10的连接部内，并且将所有转基因设计成针对atxn3基因的外显子10和11插入至少一个剪接受体和至少一个功能性编码序列。命名为pba1135的第一质粒包括左同源臂和右同源臂，其序列与内含子9的3’末端和内含子10的5’末端同源(即，成功的基因靶向将引起外显子10的去除并被pba1135内的运载物序列替代)。从5'至3'，在同源臂之间是剪接受体(来自atxn3内含子9的剪接受体)、atxn3的外显子10和11的编码序列、sv40终止子、反向bgh终止子、外显子10和11的反向编码序列(经调整的密码子)以及反向剪接受体。pba1135转基因的序列示出于seqidno:17中。对应的cas9核酸酶被设计成：i)在atxn3基因的内含子9内切割；ii)在pba1135的左同源臂内切割；以及iii)在pba1135的右同源臂的3’末端处切割。预期质粒的成功切割将释放转基因，从而使所述序列能够用作hr的模板或用于通过nhej进行整合。cas9grna靶位点示出在seqidno:18中。seqidno:44-51中示出了pba1135内的各个元件。seqidno:44包括左同源臂、核酸酶靶位点和剪接受体。seqidno:45包括非致病性atxn3基因的部分编码序列(外显子10和11)。seqidno:46包括sv40p(a)终止子序列。seqidno:47包括反向补体中的bgh终止子。seqidno:48包括非致病性atxn3基因的反向补体、密码子调整的部分编码序列(外显子10和11)。seqidno:49包括剪接受体的序列。seqidno:50包括右同源臂的序列。seqidno:51包括核酸酶的靶位点序列。命名为pba1136的第二质粒包括的运载物与pba1135包括的运载物相同，然而去除了同源臂。核酸酶靶位点被保持以促进转基因从质粒中释放。预期质粒的成功切割将释放转基因，从而使所述序列能够用于通过nhej整合到atxn3基因中。pba1136的序列示出于seqidno:19中。除反向序列和核酸酶靶位点(即，反向终止子、反向编码序列和反向剪接受体)外，命名为pba1137的第三质粒包括的序列与pba1135包括的序列相同。质粒pba1137用作常规的基于hr的方法的对照。pba1137的序列示出于seqidno:20中。

使用hek293t细胞进行转染。将hek293t细胞维持在37℃和5％co2下、补充有10％胎牛血清(fbs)的高dmem中。hek293t细胞用2ug的供体、2ug的指导rna(rna形式)和2ug的cas9(rna形式)进行转染。使用电穿孔进行转染。在转染后72小时分离基因组dna并评估整合事件。表1中示出了用于检测整合或基因组dna的引物的列表。

表1：用于检测atxn3中转基因的整合的引物。

为了检测pba1135、pba1136和pba1137的整合，对基因组dna执行pcr。关于pba1137，转基因被设计成通过hr精确整合。因此，在5'和3'连接部pcr中检测到条带，这指示精确插入到外显子10中(图8的泳道4和7)。预期5'连接部的条带大小为1,520bp，并且3'连接部的条带大小为786bp。引物onjb113和onjb116用于5'连接部pcr。引物onjb167和onjb170用于3'连接部pcr。关于pba1136，由于不存在同源臂，因此预测转基因将通过nhej插入而插入。对于在正向和反向方向上整合的转基因，观察到合适大小的条带。在图8的泳道3(预期大小大约为1,520bp)和泳道6(预期大小大约为1,519bp)中可以看到在正向方向上的整合。在图8的泳道12(预期大小大约为1,520bp)中可以看到在反向方向上的整合。引物onjb113和onjb116用于5'连接部pcr。引物onjb114和onjb170用于3'连接部pcr。引物onjb116和onjb114用于反向5’连接部pcr。关于ppba1135，同源臂和核酸酶切割位点都存在于转基因上。通过检测5'和3'连接部pcr中的条带观察到通过hr进行的整合(图8的泳道2和5)。进一步地，通过在反向5'连接部pcr中检测条带观察到通过nhej进行的整合(图8的泳道10)。5'连接部pcr的预期大小为1,520bp。3'连接部pcr的预期大小为1,157bp。反向5'连接部pcr的预期大小大约为1,520bp。引物onjb113和onjb116用于5'连接部pcr。引物onjb114和onjb170用于3'连接部pcr。引物onjb116和onjb114用于反向5’连接部pcr。

结果表明，所描述的包括双向部分编码序列的转基因可以通过多种不同的修复途径整合到基因组dna中。

示例2：将dna靶向整合在cacna1a基因中

靶向cacna1a的转基因被设计成替代cacna1a编码序列的3'末端。用被设计成将wt编码序列整合到内含子46或外显子47的起点中的转基因构建质粒(图4)。转基因包括与紧接在内含子46中的剪接供体位点之后的序列同源的第一同源臂。第一同源臂还包括用于核酸酶的靶位点(seqidno:9)和剪接受体序列。在第一同源臂之后是包括cacna1a外显子47和未扩展的cag重复序列的第一编码序列(seqidno:3)。在第一编码序列之后是sv40poly(a)终止序列(seqidno:4)。在尾接尾朝向上存在第二组功能元件。第二组元件的起点包括用于核酸酶的靶位点(seqidno:9)，其后是第二同源臂。第二同源臂具有446bp，其与紧接在终止编码后的序列(seqidno:8)同源。通过计算机模拟分析确定此序列不含共有分支或剪接受体序列。在第二同源臂之后是来自鲤鱼β-肌动蛋白内含子1的第二剪接受体(seqidno:7)。在剪接受体之后是cacna1a外显子47(seqidno:6)和bghpoly(a)终止子(seqidno:5)的密码子优化版本。

对应的cas12a核酸酶被设计成在质粒转染后i)在内源cacna1a基因的内含子46内、2)在pba1011-d1转基因中的第一同源臂内以及3)在pba1011-d1转基因中的第二同源臂之后产生三个双链断裂。cas12a核酸酶的靶序列示出在seqidno:9中。

通过转染hek293细胞来实现转基因和crispr载体的功能的确认。将hek293细胞维持在37℃和5％co2下、不具有l-谷氨酰胺、丙酮酸钠介质的补充有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素(ps)溶液100x的dmem高葡萄糖中。使用lipofectamine3000用每种质粒构建体及其组合转染hek293细胞。转染后两天，提取dna并评估cacna1a基因内的突变和靶向插入。使用cel-i分析或通过对包括crispr/cas12a靶序列的扩增子进行深度测序来分析核酸酶活性。使用pcr分析转基因的成功整合(图5)。

示例3：将dna靶向整合在atxn3基因中

靶向atxn3的转基因被设计成替代atxn编码序列的3’末端(外显子10和11)。用被设计成将wt编码序列整合到内含子9或外显子10的起点中的转基因构建质粒(图5)。转基因包括与序列内含子9同源的第一同源臂(seqidno:10)。第一同源臂还包括用于cas12a核酸酶的靶位点和剪接受体序列。在第一同源臂之后是包括atxn3外显子10和11以及未扩展的cag重复序列的第一编码序列。在第一编码序列之后是sv40poly(a)终止序列。在尾接尾朝向上存在第二组功能元件。第二组元件的起点包括用于cas12a核酸酶的靶位点，其后是第二同源臂。第二同源臂具有379bp，其与紧接在外显子10的末端之后(即，内含子10的起点)的序列同源。通过计算机模拟分析确定此序列具有有限数目的潜在分支或剪接受体序列。在第二同源臂之后是来自鲤鱼β-肌动蛋白内含子1的第二剪接受体。在剪接受体之后是atxn3外显子10和11和bghpoly(a)终止子的密码子优化版本。

对应的cas12a核酸酶被设计成在质粒转染后i)在内源atxn3基因的内含子9内、2)在pba1012-d1转基因中的第一同源臂内以及3)在pba1012-d1转基因中的第二同源臂之后产生三个双链断裂。cas12a核酸酶的靶序列示出在seqidno:11中。

通过转染hek293细胞来实现转基因和crispr载体的功能的确认。将hek293细胞维持在37℃和5％co2下、不具有l-谷氨酰胺、丙酮酸钠介质的补充有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素(ps)溶液100x的dmem高葡萄糖中。使用lipofectamine3000用每种质粒构建体及其组合转染hek293细胞。转染后两天，提取dna并评估atxn3基因内的突变和靶向插入。使用cel-i分析或通过对包括crispr/cas12a靶序列的扩增子进行深度测序来分析核酸酶活性。使用pcr分析转基因的成功整合(图7)。

示例4：使用cas12k转座酶将dna靶向整合在atxn3基因中

靶向atxn3的转基因被设计成替代atxn编码序列的3’末端(外显子10和11)。用被设计成将wt编码序列整合到内含子9或外显子10的起点中的转基因构建质粒。转基因包括转座子右末端和左末端、第一剪接受体和第二剪接受体、第一编码序列和第二编码序列(编码来自外显子10和11的氨基酸)以及第一终止子和第二终止子。介于转座子左和右末端之间的序列示出在seqidno:17中。

使用真核启动子对质粒进行工程化以表达贺氏伪枝藻tnsb、tnsc、tniq和cas12k(seqidno:30)。第二质粒被工程化以表达对应的cas12k指导rna(seqidno:14)。指导rna靶向序列ccgcccgacctttcactttc(seqidno:15)。cas12k转座子质粒与携带靶向atxn3的转基因的质粒在hek293细胞中共转化。将hek293细胞维持在37℃和5％co2下、不具有l-谷氨酰胺、丙酮酸钠介质的补充有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素(ps)溶液100x的dmem高葡萄糖中。使用lipofectamine3000用每种质粒构建体及其组合转染hek293细胞。转染后两天，提取dna并评估atxn3基因内的靶向插入。使用pcr分析转基因的整合。

示例5：将dna靶向整合在cacna1a基因中

靶向cacna1a的转基因被设计成替代cacna1a编码序列的3'末端。用被设计成将wt编码序列整合到内含子46或外显子47的起点中的转基因构建质粒。转基因包括转座子右末端和左末端、第一剪接受体和第二剪接受体、第一编码序列和第二编码序列(编码来自外显子47的氨基酸)以及第一终止子和第二终止子。

使用真核启动子对质粒进行工程化以表达贺氏伪枝藻tnsb、tnsc、tniq和cas12k(seqidno:30)。第二质粒被工程化以表达对应的cas12k指导rna(seqidno:14)。指导rna被设计成靶向序列cccggatcccggctgtgacc(seqidno:16)。cas12k转座子质粒与携带靶向atxn3的转基因的质粒在hek293细胞中共转化。将hek293细胞维持在37℃和5％co2下、不具有l-谷氨酰胺、丙酮酸钠介质的补充有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素(ps)溶液100x的dmem高葡萄糖中。使用lipofectamine3000用每种质粒构建体及其组合转染hek293细胞。转染后两天，提取dna并评估atxn3基因内的靶向插入。使用pcr分析转基因的整合。

其它实施例

应理解，虽然已经结合其具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都处于以下权利要求书的范围内。

序列表

<110>蓝色等位基因有限责任公司

<120>用于将dna靶向插入基因中的方法

<130>ba2018-4prio

<150>62/746,497

<151>2018-10-16

<150>62/830,654

<151>2019-04-08

<150>62/864,432

<151>2019-06-20

<160>51

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>3527

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>构建体

<400>1

gtgcggctgcaagtgaccccaggctgggctcggccgggaggcggggaggagagaagggga60

taccccatccaacagccactctaggcaaaggtccccggatcccggctgtgaccacctccc120

atcctgcccccaagccaccggggtgcccggcggccggagcggacacggatccccaccaca180

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gctactaccggggctccgactacgacgaggccgatggcccgggcagcgggggcggcgagg1200

aggccatggccggggcctacgacgcgccaccccccgtacgacacgcgtcctcgggcgcca1260

ccgggcgctcgcccaggactccccgggcctcgggcccggcctgcgcctcgccttctcggc1320

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cgggctccaggaagggcctgcacgaaccctacagcgagagtgacgatgattggtgctaaa1440

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ataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctt1560

atcatgtctggatctccccagcatgcctgctattctcttcccaatcctcccccttgctgt1620

cctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaattt1680

cctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgg1740

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ggattcgctgtagggttcatggagacccttccgagacccaggtcctcttggccgggccaa1860

gccgtgtgcagggtaatatccattggggagcctccggccatgccgagaaggtgaagcgca1920

cgctggtcctgacgcccggggggtgcgaggagacctccctgtcgccccggaagacgcatg1980

cctaacgggaggcggagcatcataagcaccagccatcgcttcctcgccaccaccactgcc2040

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atagcgccgcggaccggaggtagcagcccgaccgggtcgtgctaccgcttgctgttgctg2340

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tttaaaagaaaaaacggggagaaaaaaatagcttctattgatgagttttatcatctcaat3060

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atcaatttaaaaaaataataataacaataaacaattttaaaaaggacaaaaaaattaatg3300

attgagaaaagaggcatttttttctgacatttggtcctgcttgaaacaacaaaagaagaa3360

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tgaaaaccgtgggcttgggactgtgaattattgcatgacattcaaaaagaaaaaaaaaat3480

aaaaaaaagttgaatcaaatttctgtcctctggacgcctgtgagtaa3527

<210>2

<211>703

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>构建体

<400>2