来源于棒状杆菌属的细菌的纳米囊泡及其用途的制作方法

本发明涉及来源于棒状杆菌属的细菌的纳米囊泡及其用途，并且更具体地涉及施用来源于棒状杆菌属的细菌的纳米囊泡诊断肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的方法，以及包含该囊泡的用于预防、减轻或治疗疾病的组合物，等等。

本申请要求在韩国知识产权局分别于2018年12月10日和2019年10月23提交的韩国专利申请10-2018-0158622和10-2019-0132137的优先权和权益，这些申请的说明书和附图中公开的全部内容均并入本申请中。

背景技术：

自21世纪开始，在过去被认为是流行性疾病的急性传染性疾病已变得不太重要，然而伴随由人和微生物组之间的不调和导致的免疫功能障碍的炎性疾病作为主要疾病改变了疾病模式。具体地讲，由于西化饮食习惯导致的肥胖、糖尿病、心血管疾病、神经精神疾病、癌症等慢性炎症性疾病，房屋结构变化导致的室内空气污染，室内居住时间增加，皮肤和呼吸道炎症疾病已成为人们面临的主要健康问题。

炎性疾病的发展伴随着针对外部致病因素的免疫功能的异常。分泌白细胞介素(以下称为il)-17细胞因子的th17免疫反应对于针对来源于细菌的致病因子的免疫反应很重要，并且在暴露于细菌致病因子时会发生由th17免疫反应引起的中性粒细胞炎症。此外，在炎症发展过程中由细菌致病因子分泌的炎症介质诸如肿瘤坏死因子-α(以下简称tnf-α)，在炎症和癌症发展中起重要作用。据最近报道，在炎症介质中，由细菌致病因子分泌的il-6在分化为th17细胞中起重要作用，并且由th17免疫反应引起的慢性炎症与慢性炎症疾病以及癌症的发展密切相关。

已知人体内共存的微生物数量已达100万亿，是人体细胞数量的10倍，微生物基因数量是人类基因数量的多于100倍。微生物群或微生物群是指存在于特定栖息地的包括细菌、古细菌和真核生物在内的微生物群落，众所周知，肠道微生物群或微生物群在人类生理现象中起着重要作用，并通过与人体细胞相互作用对人类健康和疾病具有很大影响。

在我们体内共存的细菌和古细菌分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。粘模形成物理防御膜，200纳米(nm)或更大的粒子无法通过，因此共存于粘模中的细菌无法通过粘膜，但来自细菌的囊泡具有100纳米或更小的尺寸并在相对自由地通过上皮细胞后经由粘膜吸收到身体中。最近发现，体内吸收的病原菌来源的囊泡在糖尿病和肥胖等代谢疾病的发病机制中起着重要作用。

棒状杆菌属细菌是需氧革兰氏阳性菌，并且被称为在自然界中广泛传播并与真核生物共生的细菌。具体地讲，谷氨酸棒状杆菌是工业上广泛用于生产氨基酸、核酸等的细菌。然而，还没有关于使用棒状杆菌属细菌的细胞外囊泡的治疗技术的报道。

因此，在本发明中，首次证实了通过从棒状杆菌属细菌中分离囊泡并确认其特性，该囊泡可用作诊断各种炎性疾病和预防、减轻或治疗炎性疾病的组合物。

技术实现要素：

[技术问题]

作为进行认真研究以解决上述常规问题的结果，发明人确认，通过宏基因组分析，来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡含量在来源于患有肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的患者的样品中相比于正常个体显著减少。此外，本发明人确认了来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡有效抑制了由病原性囊泡导致的炎性反应，从而基于此完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种诊断选自下列的一种或多种疾病的方法，所述疾病选自：肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉，或一种提供用于诊断上述疾病的信息的方法。

此外，本发明的另一目的是提供一种用于预防、减轻或治疗炎性疾病的组合物，所述组合物包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡作为活性成分。

然而，待由本发明实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员可由以下说明清楚地理解未提及的其他问题。

[技术方案]

如上所述，为实现本发明的目的，本发明提供了一种提供用于诊断一种或多种疾病的信息的方法，所述疾病选自：肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉，所述方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体和受试者的样品的囊泡中提取dna；

(b)使用基于在16srdna中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述dna进行聚合酶链式反应(pcr)以获得每种pcr产物；以及

(c)通过对所述pcr产物的定量分析将其中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的含量低于所述正常个体的样品的情况确定为选自下列的一种或多种疾病：肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉。

此外，本发明提供了一种诊断选自肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的一种或多种疾病的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体和受试者的样品的囊泡中提取dna；

(b)使用基于在16srdna中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述dna进行聚合酶链式反应(pcr)以获得每种pcr产物；以及

(c)通过对所述pcr产物的定量分析将其中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为选自下列的一种或多种疾病：肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉。

作为本发明的一个示例性实施方案，步骤(a)的样品可以为血液、尿液、粪便、唾液或鼻粘膜。

作为本发明的另一个示例性实施方案，步骤(b)的成对引物可为包含由seqidno.1和2表示的碱基序列的引物对。

此外，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗炎性疾病的组合物，其包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡作为活性成分。

所述组合物可包含药物组合物、食品组合物、化妆品组合物和可吸入组合物。

此外，本发明提供了一种预防或治疗炎性疾病的方法，所述方法包括将包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡作为活性成分的组合物施用于受试者的步骤。

此外，本发明提供了一种来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡用于预防或治疗炎性疾病的用途。

此外，本发明提供了一种包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡作为活性成分的组合物用于预防或治疗炎性疾病的用途。

此外，本发明提供了来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡用于制备用于炎性疾病的药物的用途。

作为本发明的一个示例性实施方案，囊泡可由谷氨酸棒状杆菌(cornynebacteriumglutamicum)分泌。

作为本发明的另一个示例性实施方案，囊泡可具有10nm至200nm的平均直径。

作为本发明的另一个示例性实施方案，囊泡可由棒状杆菌属的细菌天然地或人工地分泌。

作为本发明的又一个示例性实施方案，人工分泌的囊泡可通过对细菌执行诸如热处理和加压处理之类的方法来分泌。

作为本发明的又一个示例性实施方案，炎性疾病可以为选自下列的一种或多种疾病：肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉。

[有益效果]

本发明人发现细菌在体内不被吸收，但是来源于细菌的囊泡穿过粘膜的保护膜，并被粘膜上皮细胞吸收，全身分布，通过肾脏、肝脏和肺排出体外。此外，通过对患者血液中存在的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析，确定了与正常人相比，存在于患有肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、患者抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的患者的血液或鼻粘膜中的来源于棒状杆菌属细菌的囊泡显著减少。此外，发现当离体培养作为棒状杆菌属的菌种的谷氨酸棒状杆菌并将囊泡分离并施用于炎性细胞时，显著抑制了由病原性囊泡分泌炎症介质如tnf-α，因此预期根据本发明的来源于棒状杆菌属细菌的囊泡将有利地用于预防或治疗炎性疾病的组合物。

附图说明

图1a是在对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡(ev)之后按时间捕获细菌和来源于细菌的囊泡的分布模式的一系列照片，并且图1b是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。

图2是在对大鼠施用细菌和来源于细菌的囊泡之后评估细菌和来源于细菌的囊泡(ev)是否渗透到粘膜上皮细胞中的视图(lu：内腔；lp：固有层)。

图3是对在对肝硬化患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图4是对在对中风患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图5是在对糖尿病患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图6是在对哮喘患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图7是在对特应性皮炎患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图8是在对抑郁症患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图9是在对乳腺癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图10是在对痴呆患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图11是在对鼻息肉患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图12是用来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡处理微噬细胞(raw264.7细胞)评估细胞凋亡以便评估来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡(ev，细胞外囊泡；cgt101，谷氨酸棒状杆菌ev)的细胞凋亡作用的结果。

图13a和13b通过用来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡(cgt101)处理巨噬细胞(raw264.7细胞)比较炎性介质与作为病原性囊泡的大肠杆菌ev的分泌水平的结果，以便评估来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡的炎症诱导作用，图13a比较了il-6的分泌水平，且图13b比较了tnf-α的分泌水平(ev：细胞外囊泡)。

图14是通过在处理大肠杆菌ev之前对来源于棒状杆菌属细菌的囊泡进行预处理来评估对作为炎症介质的tnf-α从大肠杆菌evs分泌的影响的结果，所述大肠杆菌evs是致病性囊泡，以评估源自谷氨酸棒状杆菌的囊泡(cgt101)的抗炎作用(ev，细胞外囊泡)。

具体实施方式

本发明涉及来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡及其用途。

发明人确认，通过宏基因组分析，来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡含量在来源于患有肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的患者的样品中相比于正常个体显著减少。此外，发明人确认，由病原性致病因子导致的炎症反应通过在施用病原性致病因子之前用来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡处理炎性细胞得到有效抑制，从而基于此完成了本发明。

因此，本发明提供了一种诊断选自肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的一种或多种疾病的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体和受试者的样品的囊泡中提取dna；

(b)使用基于在16srdna中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述dna进行聚合酶链式反应(pcr)以获得每种pcr产物；以及

(c)通过对所述pcr产物的定量分析将其中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的含量低于所述正常个体的样品的情况确定为选自下列的一种或多种疾病：肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉。

如本文所用的，术语“诊断”是指广义上在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病的实体、病因、发病机理、严重程度、疾病的详细方面、是否存在并发症、预后等。本发明中的诊断是指确定肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉是否发生，疾病的程度等。

如本文所用的，术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由从各种细菌分泌的纳米尺寸的膜组成的结构。来源于革兰氏阳性细菌(诸如棒状杆菌)的囊泡除了蛋白质和核酸之外还包括作为细菌的细胞壁成分的肽聚糖和脂磷壁酸，以及囊泡中的各种低分子量化合物。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是由棒状杆菌属的细菌天然分泌的或通过对细菌进行热处理、加压处理等人工产生的，并具有10至200nm的平均直径。

如本文所用的，术语“宏基因组”还指微生物组，并且是指在诸如土壤和动物肠等独立区域中的包括所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且通常用作基因组的概念，解释通过使用序列分析仪一次鉴定大量微生物以分析未培养的微生物(uncultivatedmicroorganisms)。具体地讲，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是从形成完整物种的观点衍生的术语，它是由各种彼此相互作用的物种以及一种功能上存在的物种形成的。从技术上讲，宏基因组是技术的目标，该技术通过快速序列分析方法，通过分析所有dna和rna来识别一个环境中的所有物种，并研究相互作用和代谢，而与物种无关。

可通过使用选自离心、超高速离心、高压处理、挤出、超声处理、细胞裂解、均质化、冷冻-解冻、电穿孔、机械分解、化学处理、通过过滤器的过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳和毛细管电泳的一种或多种方法，从包含棒状杆菌属的细菌的培养液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如用于去除杂质的洗涤和浓缩所获得的囊泡之类的过程。

在本发明中，步骤(a)中的样品可以为血液、尿液、粪便、唾液或鼻粘膜，但不限于此。

在本发明中，步骤(b)中的成对引物可为包含由seqidnos.1和2表示的碱基序列的引物对，但不限于此。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗炎性疾病的组合物，其包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡作为活性成分。

所述组合物包含药物组合物、食品组合物、化妆品组合物和可吸入组合物。

作为本发明的另一方面，本发明提供了一种预防或治疗炎性疾病的方法，所述方法包括将包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡作为活性成分的组合物施用于受试者的步骤。

作为本发明的另一方面，本发明提供了一种来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡用于预防或治疗炎性疾病的用途。

作为本发明的另一方面，本发明提供了包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡作为活性成分的组合物用于预防或治疗炎性疾病的用途。

作为本发明的另一方面，本发明提供了包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡用于制备用于炎性疾病的药物的用途。

如本文所用，术语“炎性疾病”是由对皮肤或肠上皮细胞的损坏导致以及后续由于暴露于引发炎症的致病因子造成炎症的疾病，并且包括由于炎症发生的代谢性疾病、心血管疾病、神经精神疾病和癌症，但不限于此。

根据本发明的炎性疾病的示例包括肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉等，但不限于此。

如本文所用，术语“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来抑制炎性疾病或延迟其发作的所有行为、

如本文所用，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来减轻或有益地改变炎性疾病的症状的所有行为。

如本文所用，术语“减轻”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有行为。

在本发明的一个实施方案中，作为向小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡并观察细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的结果，确认虽然细菌不经由肠粘膜吸附，但来源于细菌的囊泡在施用后5分钟内被吸收并全身分布，并经由肾脏、肝脏等排泄(参见实施例1)。

在本发明的另一示例性实施方案中，评估了细菌和来源于直接施用于肠的细菌的囊泡是否穿过肠粘膜的保护膜，并且确认了细菌不能穿过肠粘膜的保护膜，然而来源于细菌的囊泡穿过肠粘膜的保护膜(参见实施例2)。

在本发明的另一示例性实施方案中，通过对患有肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的患者和正常对照的临床样本的宏基因组分析，比较了棒状杆菌属的细菌的分布，因此确认，患者的临床样本中的来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡分布相比于正常对照显著减少(参见实施例3至12)。

在本发明的另一示例性实施方案中，通过以下方法来评估由属于棒状杆菌属的细菌的谷氨酸棒状杆菌所分泌的囊泡的炎性诱导效果：培育菌株，通过用各种浓度的来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡处理巨噬细胞，然后用作为病原性囊泡的来源于大肠杆菌的囊泡处理巨噬细胞，发现与由来源于大肠杆菌的囊泡分泌il-6和tnf-α相比，来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡分泌炎性介质的能力显著降低(参见实施例14)。

在本发明的另一示例性实施方案中，评估了来源于谷氨酸棒状杆菌菌株的囊泡的抗炎效果。在用来源于大肠杆菌的囊泡(其为病原性囊泡)处理之前，用各种浓度的来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡处理巨噬细胞，然后评估炎性介质的分泌。确认来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡有效抑制了炎症诱导的来源于大肠杆菌的囊泡分泌tnf-α(参见实施例15)。

本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括生理盐水(saline)、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不受限于此，并且如果需要，还可包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用remington’sliterature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。

本发明的药物组合物可根据所期望的方法口服施用或可肠胃外施用(例如静脉内、皮下、皮内、鼻内或气管内施用)，并且施用剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物制剂以及给药途径和持续时间而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。

根据本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物的因素，以及其他医学领域众所周知的因素确定。根据本发明的组合物可作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。

具体而言，根据本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化，并且可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重或年龄等而增加或减少。

本发明的吸入剂组合物可通过将活性成分添加到吸入剂中来使用或可与其他成分一起使用，并且可通过典型的方法适当使用。活性成分的混合量可根据使用目的(用于预防或治疗)适当地确定。

本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或减轻)适当地确定。通常，当制备食品或饮料时，基于原料计，本发明的组合物的添加量为15重量％或更少，优选为10重量％或更少。但是，对于出于健康和卫生目的或出于健康控制目的而长期摄入时，所述量可能少于上述范围。

除了本发明的食品组合物包含指定比例的活性成分作为必要成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可包含各种调味剂、天然碳水化合物等作为附加成分，如同典型的饮料一样。上述天然碳水化合物的示例包括常规的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，诸如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白(thaumatin)，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙a、甘草甜素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。

除了所述添加剂之外，本发明的食品组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或以其组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。

本发明的化妆品组合物不仅包含来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡，而且还包含常用于化妆品组合物中的成分，并且可例如为佐剂，诸如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料、以及载体。

此外，除了来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡之外，本发明的组合物还可包含有机紫外阻断剂的混合物，该有机紫外阻断剂可在不由于与来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡反应而不利的影响皮肤保护效果的范围内使用。该有机紫外阻断剂可以为选自下列中的一种或多种：甘油paba酯、甲酚曲唑三硅氧烷、甲酚曲唑、棓酰棓酸三油酸酯、亚苯基二苯丙咪唑磺酸酯钠盐、二乙基己基丁酰胺基三嗪酮、二乙氨基羟苯甲酰基苯甲酸己酯、甲氧基肉桂酸dea盐、指甲花醌和二羟基乙酮的混合物、亚甲基双苯并三唑基四甲基丁基苯酚、4-甲基亚苄基樟脑、邻氨基苯甲酸薄荷酯、二苯甲酮-3(氧基苯腙)、二苯甲酮-4、二苯甲酮-8(二氧基苯腙)、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、双乙基己氧基苯酚甲氧基苯基三嗪、西诺沙酯、乙基二羟丙基paba、奥克立林、乙基己基二甲基paba、乙基己基甲氧基肉桂酸酯、乙基己基水杨酸酯、乙基己基三嗪酮、异戊基-对甲氧基肉桂酸酯、聚硅氧烷15(亚苄基丙二酸盐聚硅氧)、对苯二亚甲基二樟脑磺酸及其盐、tea-水杨酸盐和对氨基苯甲酸(paba)。

本发明的化妆品组合物中可添加的产物的示例包括化妆品，诸如收敛剂、皮肤柔软剂、滋养调色剂、各种霜、精华、面膜、粉底等，清洁剂、洗面奶、皂、处理剂、美容液等。本发明化妆品组合物的具体制剂包括化妆水、柔肤剂、爽肤水、收敛剂、乳液、牛奶乳液、保湿乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、保湿霜，护手霜，精华液、滋养精华液、面膜、皂、洗发水、洁面泡沫，洁面乳、洁面霜、身体乳液、沐浴露、乳液、口红、底妆、粉底、粉饼、散粉、眼影等。

下文，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅用于更容易地理解本发明，并且本发明的内容不限于以下实施例。

实施例

实施例1.细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析

为了评估细菌和来源于细菌的囊泡是否通过粘膜被全身吸收，用以下方法进行实验。将50μg剂量的带有荧光标记的细菌和来源于鼠的胃中的细菌的囊泡中的每一种施用于胃肠道，并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠的整个图像的结果，如图1a所示，细菌不被全身吸收，但是在给药后5分钟，来源于细菌的囊泡被全身吸收，并且在给药后3小时在膀胱中观察到强烈荧光，从而可以看出囊泡是排泄到泌尿道。此外，可以看出，囊泡在体内存在直至给药后12小时(参见图1a)。

为了评估其中的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，然后在给药12小时后收集血液、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉。作为观察到的在收集的组织中的荧光的结果，如图1b所示，可以看出来源于细菌的囊泡分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、肌肉和脂肪中，但是细菌没有被吸收(参见图1b)。

实施例2.细菌和来源于细菌的囊泡是否渗透粘膜的保护膜的评估

为了评估在将细菌和来源于细菌的囊泡直接施用于肠之后，穿过粘膜的保护膜的细菌和来源于细菌的囊泡是否渗透到上皮组织中，通过免疫组织学方法来评估穿过粘膜的保护膜之后向上皮组织中的渗透。为了评估粘膜组织中细菌和囊泡的存在，制备针对细菌和囊泡的抗体，附着到绿色荧光蛋白(gfp)并使用，并且在用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色之后，在显微镜下观察。

结果，确认细菌不能穿过粘膜的保护膜，然而来源于细菌的囊泡穿过粘膜的保护膜并渗透到上皮组织中(参见图2)。

实施例3.存在于临床样品中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析

在首先将临床样品(例如血液、鼻粘膜组织等)放入10ml试管中，并且通过离心(3,500×g，10分钟，4℃)使悬浮物沉降后，仅将上清液转移至新的10ml试管。使用0.22-μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到centriprep管(离心过滤器50kd)中，并在1,500×g和4℃下离心15分钟，弃去小于50kd的物质，将残余物浓缩至10ml。使用0.22-μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，通过使用90ti型转子在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的团块(pellet)溶解在生理盐水(pbs)中。

将通过上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，从脂质中提取内部dna，然后在冰上冷却5分钟。然后，为了除去残留的悬浮物，将dna在10,000×g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用nanodrop定量dna的量。此后，为了确认提取的dna中是否存在来源于细菌的dna，用下表1所示的16srdna引物进行pcr，并确认提取的基因中存在来源于细菌的基因。

[表1]

使用16srdna引物对通过上述方法提取的dna进行扩增，然后进行测序(illuminamiseq测序仪)，结果以标准流程图格式(sff)文件输出，使用gsflx软件(v2.9)将sff文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件，然后确认用于阅读的可靠性估计，并且其中窗口(20bps)的平均碱基检出准确性低于99％的部分(phred分数<20)已删除。对于操作分类单元(otu)分析，通过使用uclust和usearch根据序列相似性进行聚类，属、科、目、纲和门分别基于94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性进行聚类，在每个otu的门、纲、目、科和属级上进行分类，并使用blastn和greengenes(qiime)的16srna序列数据库(108,453个序列)对在该属级上具有97％或更高的序列相似性的细菌进行分析。

实施例4.患有肝硬化的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从97名患有肝硬化的患者和171名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有肝硬化和肝癌的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图3)。

实施例5.患有中风的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从79名患有中风的患者和158名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有中风的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图4)。

实施例6.患有糖尿病的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从81名患有中风的患者和126名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有糖尿病的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图5)

实施例7.患有哮喘的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从182名患有哮喘的患者和180名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有哮喘的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图6)。

实施例8.患有特应性皮炎的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从42名患有特应性皮炎的患者和40名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有特应性皮炎的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图7)。

实施例9.患有抑郁症的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从72名患有抑郁症的患者和80名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有抑郁症的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图8)。

实施例10.患有乳腺癌的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从102名患有乳腺癌的患者和100名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有乳腺癌的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图9)。

实施例11.患有痴呆的患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

通过从73名患有痴呆的患者和70名正常个体(两组的年龄和性别匹配)的血液中存在的囊泡提取基因，使用实施例3的方法对所述血液进行宏基因组分析之后，评估来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的分布。结果，确认与来源于正常个体的血液相比，在患有痴呆的患者的血液中来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见图10)。

实施例12.通过对患有鼻息肉的患者和正常对照进行鼻粘膜宏基因组分析的来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的渗透模式

通过实施例3的方法进行宏基因组分析来评估患有鼻息肉的患者(43名非过敏性患者和45名过敏性患者)的鼻息肉和39人的正常对照中来源于细菌的囊泡的渗透模式。结果，在患有过敏性鼻息肉的患者和患有非过敏性鼻息肉的患者的鼻组织中，与正常对照相比，来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡显著减少，并且在存在或不存在过敏性息肉的情况下，在患有息肉的患者中，来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡的渗透程度没有差别(参见图11)。

实施例13.囊泡从谷氨酸棒状杆菌培养溶液中的分离

基于上述实施例，培养谷氨酸棒状杆菌菌株，然后从其中分离囊泡并分析分离的囊泡的特征。首先，在37℃下在培养器在deman-rogosaandsharpe(mrs)培养基中培养谷氨酸棒状杆菌菌株直至吸光率变成1.0至1.5，然后在luria-bertani(lb)培养基中继代培养。随后，回收包含菌株的培养上清液并在10,000xg和4℃下离心20分钟，然后移除菌株并通过0.22μm过滤器过滤。

通过使用具有100kdapellicon2cassette过滤膜(merckmillipore，us)的masterflex泵系统(cole-parmer,us)，通过微滤将经过滤的上清液浓缩至小于或等于50ml的体积，并用0.22μm过滤器再次过滤浓缩的上清液。此后，使用bca测定量化蛋白质，并且对获得的囊泡进行以下实验。

实施例14.来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡的炎症诱导作用

为检查来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡(谷氨酸棒状杆菌ev，spc101)对炎症细胞中的炎症介质(il-6和tnf-α)的分泌的影响，用各种浓度的(0.1、1或10μg/ml)来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡处理作为鼠巨噬细胞系的raw264.7细胞，之后进行细胞凋亡和elisa。

更具体地，用各种浓度的来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡处理以5x10⁴细胞/孔等分在48孔细胞培养板中的raw264.7细胞，所述囊泡用dmem(dulbecos改性的eagles培养基)无血清培养基稀释，并且将经处理的细胞培养12小时。此后，将细胞培养液收集到1.5ml管中并在3,000g下离心5分钟，并且回收上清液并储存于-80℃，然后进行elisa分析。

对于elisa而言，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)稀释捕获抗体并且根据工作浓度将其50μl等分试样分散于96孔聚苯乙烯板中，然后使其在4℃下反应过夜。随后，用100μlpbst(含0.05％tween-20的pbs)溶液将样品洗涤三次，并且将rd(含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs)溶液分散于100μl等分试样中，之后在室温下封闭1小时，然后将根据浓度将样品和标准品分散于50μl等分试样中并使其在室温下反应2小时。然后，用100μlpbst将样品和标准品洗涤三次，并且用rd稀释检测抗体，并根据工作浓度将稀释溶液分散于50μl等分试样中并使其在室温下反应2小时。此后，用100μlpbst将样品和标准品洗涤三次并且将链霉亲和素-辣根过氧化物酶(hrp)(r&dsystems，usa)在rd中稀释至1/40，并将稀释的溶液分散于50μl等分试样中并使其在室温下反应20分钟。最后，用100μlpbst将样品和标准品洗涤三次，然后将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb)底物(surmodics，usa)分散于50μl等分试样中，并且然后在5分钟至20分钟之后显色时，将1m硫酸溶液分散于50μl等分试样中，从而停止反应，并使用spectramaxm3微板读取计(moleculardevices，usa)测量450nm下的吸光率。

结果，如图12所示，未观察到由于用来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡(cgt101)处理的细胞凋亡(参见图12)。另外，如图13a和13b所示，作为评估炎症细胞中炎症介质的分泌模式的结果，确认与用作为阳性对照的来源于大肠杆菌的囊泡(大肠杆菌ev1μg/ml)处理时相比，用来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡(cgt101)处理时，il-6(图13a)和tnf-α(图13b)的分泌显著减少。

实施例15.来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡的抗炎效果

为了基于实施例14的结果评估来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡的抗炎效果，在用各种浓度(0.1、1和10μg/ml)的来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡(cgt101)预处理鼠巨噬细胞并持续12小时之后，用作为病原性因子的1μg/ml的来源于大肠杆菌的囊泡处理细胞系，然后在12小时后通过elisa测量炎症细胞因子的分泌。

结果，发现在来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡的预处理期间，受大肠杆菌ev刺激分泌到炎症细胞中的tnf-α量受到显著抑制(参见图14)。这意指来源于谷氨酸棒状杆菌的囊泡可有效抑制由促炎性因子诸如来源于大肠杆菌的囊泡(其为病原性囊泡)诱导的炎症反应。

本发明的上述描述出于说明的目的提供，并且那些本发明所属领域的普通技术人员将理解在不改变本发明的技术精神和基本特征的情况下，可容易地将本发明修改成其他特定形式。因此，应当理解上述实施例在所有方面仅进行了说明，而不是限制性的。

工业实用性

因为确认了根据本发明的来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡穿过粘膜的保护膜，并被粘膜上皮细胞吸收，全身分布并由肾脏、肝脏和肺从身体排出，所以确认该囊泡在患有肝硬化、中风、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、抑郁症、乳腺癌、痴呆和鼻息肉的患者的血液或鼻粘膜中显著减少，并且可显著抑制炎症介质诸如tnf-α从病原性囊泡中的分泌，预期来源于棒状杆菌属的细菌的囊泡具有很大的工业实用价值，因为囊泡可以有用地用于预防或治疗炎性疾病的组合物中。

<110>md保健株式会社

<120>来源于棒状杆菌属的细菌的纳米囊泡及其用途

<130>mpo21-020cn

<150>kr10-2018-0158622

<151>2018-12-10

<150>kr10-2019-0132137

<151>2019-10-23

<160>2

<170>kopatentin3.0

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>16s_v3_f

<400>1

tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcctacgggnggcwgcag50

<210>2

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>16s_v4_r

<400>2

gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggactachvgggtatctaatcc55