DNA文库的多重确定性组装的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求2018年10月31日提交的美国临时申请序列号62/753,254的优先权的权益，该美国临时申请通过引用以其整体并入本文用于所有目的。本公开涉及用于连接单链和/或双链核酸分子的组合物和方法，其允许在单个反应中体外或体内组装具有重叠端序列的多个核酸分子。所公开的方法和组合物可用于核酸序列的片段的确定性组装，并且可以用于编辑任何dna序列，诸如例如所需的宿主细胞或生物体的基因组中的质粒、粘粒或特异性基因。关于序列表的声明与本申请相关联的序列表以文本形式提供，以代替纸质副本，并且据此通过引用被并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为zymr_029_01wo_seqlist_st25.txt。文本文件为约262kb，并且创建于2019年10月31日，并经由efs网以电子方式提交。
背景技术：
：：传统上，核酸组装体诸如质粒或线性dna以确定性的方式一次生成一个，因此可能是缓慢、昂贵和劳动密集型的。相比之下，目前用于生成复杂核酸组装体的文库的混合方法可以能够一次生成许多组装体，但通常产生代表组装体中的部件的集合之间所有可能组合的文库。此类方法是一种非确定性和组合性的组装方法，并且也可能是耗时的、劳动密集型的和昂贵的，特别是在其中序列的子集是组装反应的所需产物的情况下。因此，在本领域中需要用于生成复杂核酸组装体的新方法，其不具有用于生成核酸组装体的传统方法固有的上述缺点。技术实现要素：在一个方面中，本文提供了一种包括多核苷酸的混合物的组合物，所述混合物包括：含有成对的多核苷酸的第一池，其中第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸；和插入多核苷酸的第二池，其中第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列。在一些情况下，组合物进一步包括克隆载体，其中，对于第一池中的每对，第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端包括与克隆载体互补的序列。在一些情况下，选择来自第一池的每一多核苷酸，使得除了第一池的成对的多核苷酸与第二池的插入多核苷酸之间、或第一池的成对的多核苷酸与克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自第一池的多核苷酸与来自第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。在一些情况下，指定的阈值为5至15个连续核苷酸。在一些情况下，组合物进一步包括聚合酶。在一些情况下，聚合酶是链置换的或非链置换的。在一些情况下，聚合酶是非链置换的，并且组合物进一步包括拥挤剂。在一些情况下，拥挤剂是聚乙二醇(peg)。在一些情况下，peg以约3％至约7％(重量/体积)的浓度使用。在一些情况下，peg选自peg-200、peg-4000、peg-6000、peg-8000或peg-20,000。在一些情况下，聚合酶是链置换的，并且组合物进一步包括单链结合蛋白质。在一些情况下，单链dna结合蛋白质是极端耐热的单链dna结合蛋白质(etssb)、大肠杆菌reca、t7基因2.5产物、噬菌体λredb或rac前噬菌体rect。在一些情况下，组合物进一步包括5'-3'核酸外切酶。在一些情况下，组合物进一步包括连接酶。在一些情况下，第一池中的每对是双链dna(dsdna)或单链(ssdna)。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸是dsdna或ssdna。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中靶基因组基因座的序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于作为代谢途径的一部分的基因的编码序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于功能结构域或一或多种蛋白质的编码序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸在单个构建体中连接在一起，其中所述单个构建体包括用于第一多核苷酸与第二多核苷酸之间的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。在一些情况下，用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列包括归巢核酸内切酶识别序列。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括分别与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的1或多个核苷酸。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括分别与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的约25个核苷酸。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸包括位于第一组装重叠序列与第二组装重叠序列之间的一或多个有效负载序列。在一些情况下，一或多个有效负载序列选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、终止子、唯一标识符序列或其部分。在一些情况下，第一池中的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与第一池中的每个其他对相比对应于宿主细胞中不同靶基因组基因座的序列。在一些情况下，第一池中的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中相同靶基因组基因座的序列。在一些情况下，第二池中的插入多核苷酸中的每个有效负载序列不同于第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列。在一些情况下，第二池中的插入多核苷酸中的每个有效负载序列与第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同。在一些情况下，位点特异性核酸酶是限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen或切口酶中的一或多种。在另一个方面中，本文提供了一种用于生成多核苷酸的文库的方法，所述方法包括：a.组合多核苷酸的第一池和多核苷酸的第二池，其中第一池含有成对的多核苷酸，其中第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第二池含有插入多核苷酸，其中第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；b.将所述第一池和所述第二池组装成多核苷酸的文库，其中所述文库中的每一多核苷酸包括来自所述第二池的插入多核苷酸和来自所述第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述组装通过体外克隆方法或体内克隆方法进行。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括分别与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的1或多个核苷酸。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括分别与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的约25个核苷酸。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸在单个构建体中连接在一起，其中所述单个构建体包括用于第一多核苷酸与第二多核苷酸之间的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。在一些情况下，用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列包括归巢核酸内切酶识别序列。在一些情况下，通过经由剪接和重叠延伸pcr(soe-pcr)、限制-连接、钝端连接、基于重叠的组装方法、基于重组的方法、或连接第一多核苷酸和第二多核苷酸的任何其他酶促或化学方法，或者通过直接合成单个构建体，连接单独的第一多核苷酸和第二多核苷酸，来产生连接的单个构建体。在一些情况下，所述方法进一步包括在步骤(a)期间将克隆载体与第一池和第二池组合，其中对于第一池中的每对，克隆载体的相对端包括与第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端互补的序列。在一些情况下，所述方法进一步包括在步骤(a)之前将克隆载体与第一池组合，其中对于第一池中的每对，克隆载体的相对端包括与第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端互补的序列。在一些情况下，克隆载体和来自第一池的每对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。在一些情况下，所述方法进一步包括通过添加用于一或多个识别序列的一或多种位点特异性核酸酶，在克隆载体的相对端与来自第一池的每对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端之间生成单链互补突出物。在一些情况下，所述方法进一步包括连接克隆载体的相对端与来自第一池的每对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端之间的单链互补突出物。可以使用dna连接酶进行连接。在一些情况下，步骤(b)产生环状产物，所述环状产物包括来自第二池的插入多核苷酸、来自第一池的一对的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及克隆载体。在一些情况下，通过从更大的一组此类序列中选择成对的多核苷酸序列来生成第一池，使得除了第一池的成对的多核苷酸与第二池的插入多核苷酸，或第一池的成对的多核苷酸与克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自第一池的多核苷酸与来自第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。在一些情况下，指定的阈值为5至15个连续核苷酸。在一些情况下，组装是体外克隆方法，其中将第一池和第二池的混合物加热以使存在于第一池和第二池中的多核苷酸部分或完全变性，然后在组装之前被冷却至室温。在一些情况下，在步骤(a)之前，通过将含有来自成对的多核苷酸的每一个第一多核苷酸的混合物与含有来自成对的多核苷酸的每一个第二多核苷酸的混合物组合来生成多核苷酸的第一池。在一些情况下，第一池中的每对是双链dna(dsdna)或单链dna(ssdna)。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸是dsdna或ssdna。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中靶基因组基因座的序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于作为代谢途径的一部分的基因的编码序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于功能结构域或一或多种蛋白质的编码序列。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸包括位于第一组装重叠序列与第二组装重叠序列之间的一或多个有效负载序列。在一些情况下，一或多个有效负载序列选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、终止子、唯一标识符序列或其部分。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与第一池中的每个其他对相比对应于宿主细胞中不同靶基因组基因座的序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中相同靶基因组基因座的序列。在一些情况下，第二池中的插入多核苷酸中的每个有效负载序列不同于第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列。在一些情况下，第二池中的插入多核苷酸中的每个有效负载序列与第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸通过以下产生：(i)对包括有效负载序列、正向引物和反向引物的混合物进行聚合酶链反应(pcr)，其中所述正向引物包括5'至3'、与所述有效负载序列互补的一或多个核苷酸的短段、所述第一组装重叠序列、用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列、所述第二组装重叠序列和与所述有效负载序列互补的一或多个核苷酸的第二段，并且其中所述反向引物包括与所述有效负载序列互补的序列，其中所述pcr生成pcr产物，所述pcr产物包括5'至3'、与所述有效负载序列互补的核酸的短段、所述第一组装重叠序列、所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列、所述第二组装重叠序列和所述有效负载序列；(ii)经由选自由剪接和重叠延伸pcr(soe-pcr)、限制性连接、钝端连接、基于重叠的组装方法和基于重组的方法组成的群组的组装方法，或用于连接两个dna分子的任何其他酶促或化学方法，使pcr产物环化；以及(iii)用一或多种识别一或多个位点特异性核酸酶识别序列的位点特异性核酸酶使环化的pcr产物线性化，从而生成多核苷酸的第二池。在一些情况下，位点特异性核酸酶是限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen或切口酶中的一或多种。在又一个方面中，本文提供了一种用于生成多核苷酸的文库的方法，所述方法包括：(a)经由聚合酶链反应(pcr)扩增多核苷酸的第一池，其中第一池含有成对的多核苷酸，其中第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中一对中的每个第一多核苷酸和每个第二多核苷酸包括5'端和3'端，其中所述扩增在来自所述第一池的一对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上引入共同重叠序列，所述共同重叠序列包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列；(b)通过利用共同重叠序列将来自第一池的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸组装成单个核酸片段，其中每对的单个核酸片段包括由共同重叠序列从第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端分离的第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中每对的单个核酸片段中第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端位于单个核酸片段的相对末端上，远离一或多个位点特异性核酸酶识别序列；(c)将每对的单个核酸片段与含有插入多核苷酸的第二池组合，其中第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与单个核酸片段中存在的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与单个核酸片段中存在的第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；(d)将所述第一池和所述第二池组装成环化的产物的第三池，其中所述组装通过体外或体内重叠组装方法进行，并且其中所述第三池中的每种环化的产物包括来自所述第二池的插入序列和来自所述第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸；(e)经由一或多种位点特异性核酸酶的消化使第三池中的每种环化的产物线性化，所述位点特异性核酸酶识别位于第三池中的每种环化的产物中的第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列；以及(f)通过体外或体内克隆方法将线性化的产物组装到克隆载体中。在一些情况下，位于第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列是归巢核酸酶识别序列。在一些情况下，位于第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶是归巢核酸内切酶。在一些情况下，共同重叠序列包括至少1个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。在一些情况下，共同重叠序列包括10-25个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。在一些情况下，基于重叠的dna组装方法选自soe-pcr或体外重叠组装方法(例如hifi组装)。在一些情况下，存在于第一多核苷酸的5'端的共同重叠序列中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列与存在于每对中的第二多核苷酸的3'端上的共同重叠序列中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列互补，并且其中在步骤(b)中利用每对中的第一多核苷酸和第二多核苷酸的共同重叠序列需要进行soe-pcr。在一些情况下，在步骤(b)中利用每对中的第一多核苷酸和第二多核苷酸的共同重叠序列需要用一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上的共同重叠序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在每对中第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上生成包括互补序列的单链突出物；以及连接在每对中第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上的单链突出物上存在的互补序列。在一些情况下，使用基于重叠的dna组装方法进行步骤(d)的组装。在一些情况下，基于重叠的dna组装选自soe-pcr和体外重叠组装方法(例如hifi组装)。在一些情况下，每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端包括一组附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，并且第二池中的每个插入多核苷酸中的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。在一些情况下，步骤(d)中的组装需要用每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端上的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列以及来自第二池的每个插入多核苷酸中的第一组装序列和第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端上存在的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列和来自第二池的每个插入多核苷酸中的第一组装序列和第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在第一多核苷酸的3'端上生成单链突出物(其包括与来自第二池的插入多核苷酸的第一组装序列的5'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列)和在第二多核苷酸的5'端上生成单链突出物(其包括与来自第二池的相同插入多核苷酸的第二组装序列的3'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列)；以及连接单链突出物上存在的互补序列。在一些情况下，步骤(f)的克隆载体包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。在一些情况下，步骤(f)中的组装需要用克隆载体中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化克隆载体中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，其中消化在克隆载体的相对端生成单链突出物，其中克隆载体的相对端的一个上的单链突出物包括与步骤(e)中生成的线性化的产物的末端互补的序列，并且克隆载体的相对端的另一个上的单链突出物包括与步骤(e)中生成的线性化的产物的相对端互补的序列；以及连接克隆载体的单链突出物上存在的互补序列和来自步骤(e)的线性化的产物。在一些情况下，通过从更大的一组此类序列中选择成对的多核苷酸序列来生成第一池，使得除了第一池的成对的多核苷酸与第二池的插入多核苷酸，或第一池的成对的多核苷酸与克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自第一池的多核苷酸与来自第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。在一些情况下，指定的阈值为5至15个连续核苷酸。在一些情况下，第二池中每个插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括1或多个与单个核酸片段的相对末端互补的核苷酸。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括与单个核酸片段的相对末端互补的约25个核苷酸。在一些情况下，在步骤(a)之前，通过将含有来自成对的多核苷酸的每一个第一多核苷酸的混合物与含有来自成对的多核苷酸的每一个第二多核苷酸的混合物组合来生成多核苷酸的第一池。在一些情况下，第一池中的每对是双链dna(dsdna)或单链dna(ssdna)。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸是dsdna或ssdna。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中靶基因组基因座的序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于作为代谢途径的一部分的基因的编码序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于功能结构域或一或多种蛋白质的编码序列。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸包括位于第一组装重叠序列与第二组装重叠序列之间的一或多个有效负载序列。在一些情况下，一或多个有效负载序列选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、终止子、唯一标识符序列或其部分。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与第一池中的每个其他对相比对应于宿主细胞中不同靶基因组基因座的序列。在一些情况下，对于第一池中的每对，第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中相同靶基因组基因座的序列。在一些情况下，第二池中的插入多核苷酸中的每个有效负载序列不同于第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列。在一些情况下，第二池中的插入多核苷酸中的每个有效负载序列与第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同。在一些情况下，第二池中的每个插入多核苷酸通过以下生成：(i)对包括有效负载序列、正向引物和反向引物的混合物进行聚合酶链反应(pcr)，其中正向引物包括5'至3'、与有效负载序列互补的一或多个核苷酸的短段、第一组装重叠序列、用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列、第二组装重叠序列和与有效负载序列互补的一或多个核苷酸的第二段，并且其中所述反向引物包括与所述有效负载序列或与所述有效负载序列下游的其他序列互补的序列，其中所述pcr生成pcr产物，所述pcr产物包括5'至3'、与所述有效负载序列互补的核酸的短段、所述第一组装重叠序列、所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列、所述第二组装重叠序列和所述有效负载序列；(ii)经由选自由剪接和重叠延伸pcr(soe-pcr)、限制性连接、钝端连接、基于重叠的组装方法和基于重组的方法组成的群组的组装方法，或用于连接两个dna分子的任何其他酶促或化学方法，使pcr产物环化；以及(iii)用识别一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶使环化的pcr产物线性化，从而生成多核苷酸的第二池。在一些情况下，位点特异性核酸酶是限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen或切口酶中的一或多种。附图说明图1描绘了用于dna文库的多重确定性组装的方法，其示出了插入多核苷酸和包括载体重叠组装序列的第一多核苷酸和包括载体重叠组装序列的第二多核苷酸以及任选的克隆载体的初始组合物。插入多核苷酸可以包括有效负载序列，如果缺失，该有效负载序列的长度为零个核苷酸，或者如果插入或替换，该有效负载序列的长度为非零。图2示出了用于图1的方法中的将第一多核苷酸和第二多核苷酸预缔合的由内向外的组装方法，以允许组装比最大合成寡核苷酸长度更长的插入多核苷酸(例如启动子)。图3示出了图1的方法的修改，以允许组装比最大合成寡核苷酸长度更长的插入多核苷酸(例如，启动子)。图4示出了使用图1的方法的确定性文库的组装。在表中给出了每个文库中唯一基因座、有效负载和全部可能构建体的数量。图5示出了采用包括精确设计的dna部分的池的确定性文库的成功体外组装的结果，所述dna部分包含环状排列的有效负载(插入物)。顶部的长条表示待在池中组装的质粒的结构，并且下方的较短条表示与来自组装体的池的三个单独样品的相应参考序列对齐的sanger序列。读段内端的细垂直线表示sanger读段尾端的预期测序伪影。图6示出了混合的组装体的总成功率，对于所述混合的组装体，使用附加了源自宿主基因组的模板的组装重叠的引物经由pcr来创建含有有效负载的部分。具体实施方式定义虽然以下术语被认为是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述以下定义以便于解释当前公开的主题。如本文中所使用的，术语“一(a或an)”可以指一或多个该实体，即可以指多个指代物。因此，术语“一”、“一或多个”和“至少一个”在本文中可以互换地使用。此外，通过不定冠词“一”对“要素”的提及并不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确地要求存在一个要素并且仅存在一个要素。除非上下文另有要求，否则在整个本说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变体，诸如“包括(comprises和comprising)”应以开放的、包含的意义来解释，即“包含但不限于”。在整个说明书中对“一个实施例(oneembodiment)”或“一个实施例(anembodiment)”的提及意指结合该实施例描述的特定特征、结构或特性可以被包含在本公开的至少一个实施例中。因此，在整个本说明书的各处出现的短语“在一个实施例中(inoneembodiment)”或“在一个实施例中(inanembodiment)”可能不一定都指同一实施例。应当理解，为了清楚起见在单独实施例的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为了简洁起见在单个实施例的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。如本文中所使用的，术语“细胞生物体”、“微生物(microorganism)”或“微生物(microbe)”应被广义地理解。这些术语可互换地使用，并且包含但不限于两种原核生物域：细菌和古细菌，以及某些真核生物真菌和原生生物。在一些实施例中，本公开涉及本公开中存在的清单/表和图的“微生物”或“细胞生物体”或“微生物”。这种表征不仅可以指表和图的所鉴定的分类属，而且还可以指所鉴定的分类种，以及所述表或图中任何生物体的各种新的和最新鉴定的或设计的菌株。对于这些术语在本说明书的其他部分中(诸如在实例中)中的叙述来说，相同表征保持成立。如本文中所使用的，术语“原核生物”是本领域公认的，并且是指不含有核或其他细胞器的细胞。原核生物通常按照两种域之一归类：细菌和古细菌。古细菌域和细菌域的生物体之间的决定性差异是基于16s核糖体rna中的核苷酸碱基序列的根本差异。如本文中所使用的，术语“古细菌”是指疵壁菌门(mendosicutes)的生物体的类别，其通常在异常的环境中发现，并且通过若干标准(包含核糖体蛋白质的数量和细胞壁中胞壁酸的缺乏)与其余的原核生物区分开。根据ssrrna分析，古生菌由系统发生学截然不同的两种群组组成：泉古菌门(crenarchaeota)和广古菌门(euryarchaeota)。根据它们的生理学，古细菌可以被分为三种类型：产甲烷菌(methanogens)(产甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(extremehalophiles)(生活在非常高浓度的盐(nacl)下的原核生物)；和极端(超)嗜热菌(生活在非常高的温度下的原核生物)。除了将它们与细菌区分开的统一古细菌特征(即在细胞壁中没有胞壁质、酯连接的膜脂质等)之外，这些原核生物表现出使其适应其特定栖息地的独特的结构或生物化学属性。泉古菌门主要由极端嗜热性硫依赖性原核生物组成，并且广古菌门含有产甲烷菌和极端嗜盐菌。如本文中所使用的，“细菌”或“真细菌(eubacteria)”可以指原核生物体的域。细菌至少包含如下11个不同的群组：(1)革兰氏阳性(革兰氏+)细菌，其中存在两个主要的亚门：(1)高g+c群组(放线菌(actinomycetes)、分枝杆菌(mycobacteria)、微球菌(micrococcus)及其他)(2)低g+c群组(芽孢杆菌(bacillus)、梭菌(clostridia)、乳杆菌(lactobacillus)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、支原体(mycoplasmas))；(2)变形菌门(proteobacteria)，例如紫色光合成+非光合成革兰氏阴性菌(包含最“常见”的革兰氏阴性菌)；(3)蓝细菌(cyanobacteria)，例如含氧光养生物；(4)螺旋体(spirochetes)和相关菌种；(5)浮霉状菌属(planctomyces)；(6)拟杆菌属(bacteroides)、黄杆菌(flavobacteria)；(7)衣原体(chlamydia)；(8)绿色硫细菌(greensulfurbacteria)；(9)绿色非硫细菌(也称厌氧光养生物)；(10)耐辐射微球菌和相关菌种；(11)热袍菌属(thermotoga)和嗜热性热袍菌(thermosiphothermophiles)。如本文中所使用的，“真核生物”是其细胞含有核和封闭在膜内的其他细胞器的任何生物体。真核生物属于真核生物域(eukarya或eukaryota)分类单元。将真核细胞与原核细胞(上述细菌和古细菌)区分开来的决定性特征是，它们具有膜结合的细胞器，尤其是含有遗传物质并被核膜封闭的细胞核。如本文中所使用的，术语“遗传修饰的宿主细胞”、“重组宿主细胞”和“重组菌株”在本文中可互换地使用，并且可以指已经通过本公开的克隆和转化方法进行遗传修饰的宿主细胞。因此，该术语包含宿主细胞(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞、cho、人类细胞等)，其已经被遗传改变、修饰或工程改造，使得与其所来源于的天然存在的生物体相比，它表现出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。应当理解，在一些实施例中，该术语不仅指所讨论的特定重组宿主细胞，而且还指此类宿主细胞的后代或潜在后代。如本文中所使用的，术语“野生型微生物”或“野生型宿主细胞”可以描述在自然界中存在的细胞，即未经遗传修饰的细胞。如本文中所使用的，术语“遗传工程改造的”可以指对宿主细胞的基因组的任何操作(例如通过核酸的插入、缺失、突变或替换)。如本文中所使用的，术语“对照”或“对照宿主细胞”可以指用于确定遗传修饰或实验处理的效果的合适的比较宿主细胞。在一些实施例中，对照宿主细胞是野生型细胞。在其他实施例中，对照宿主细胞在基因上除了遗传修饰之外，与经遗传修饰的宿主细胞相同，从而有别于处理宿主细胞。在一些实施例中，本公开教导了使用亲本菌株作为对照宿主细胞(例如，使用s1菌株作为菌株改良程序的基础)。在其他实施例中，宿主细胞可以是遗传上相同的细胞，其缺乏在处理宿主细胞中所测试的特定启动子或snp。如本文中所使用的，术语“等位基因”可以指基因的一或多种替代形式中的任何一种，所有这些等位基因都与至少一种性状或特性相关。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。如本文中所使用的，术语“基因座(locus)”(复数形式的基因座(loci))可以表示期望对天然基因组序列进行编辑的任何位点。在一个实施例中，所述术语可以指染色体上的特定的一或多个位置或位点，在该位置或位点例如发现了基因或遗传标记物。如本文中所使用的，术语“遗传连接的”可以指在繁殖期间两种或更多种性状以高速率共同遗传，使得它们难以通过杂交分离。如本文中所使用的“重组”或“重组事件”可以指染色体杂交或独立的分类。如本文中所使用的，术语“表型”可以指个体细胞、细胞培养物、生物体或生物体群组的可观察特性，其由该个体的基因组成(即基因型)与环境之间的相互作用产生。如本文中所使用的，术语“嵌合的”或“重组的”当描述核酸序列或蛋白质序列时可以指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子，或使至少一种天然核酸或蛋白质序列的一或多个元件重排的核酸或蛋白质序列。例如，术语“重组”可以指两个以其他方式分离的序列的片段的人工组合，例如通过化学合成或通过经由基因工程改造技术操纵核酸的分离的片段。如本文中所使用的，“合成的核苷酸序列”或“合成的多核苷酸序列”是已知在自然界中不存在或不是天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其他天然存在的核苷酸序列相比时，此类合成核苷酸序列可以包括至少一种核苷酸差异。如本文中所使用的，术语“核酸”可以指任何长度的核苷酸的聚合物形式：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物。该术语可以指分子的初级结构，并且因此包含双链和单链dna，以及双链和单链rna。它还包含修饰的核酸，诸如甲基化的和/或封端的核酸、含有修饰的碱基、主链修饰的核酸等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换地使用。如本文中所使用的，术语“基因”可以指与生物功能相关的任何dna片段。因此，基因可以包含但不限于编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还可以包含未表达的dna片段，其例如形成用于其他蛋白质的识别序列。基因可以从各种来源获得(包含从感兴趣的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成)，并且可以包含被设计为具有所需参数的序列。如本文中所使用的，术语“同源的”或“同源物”或“直系同源物(ortholog)”或“直系同源物(orthologue)”在本领域中是已知的，并且可以指共享共同祖先或家族成员并基于序列同一性的程度确定的相关序列。术语“同源性”、“同源的”、“基本相似的”和“基本上对应的”在本文中可以互换地使用。所述术语可以指核酸片段，其中一或多个核苷酸碱基的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还可以指本公开的核酸片段的修饰，诸如相对于初始的、未修饰的片段基本上不改变所得核酸片段的功能性质的一或多个核苷酸的缺失或插入。因此，应当理解，如本领域技术人员将理解的，本公开涵盖除所述特定示例性序列之外的序列。这些术语描述了在一种物种、亚种、品种、栽培品种或品系中发现的基因与在另一种物种、亚种、品种、栽培品种或品系中发现的相应或等效基因之间的关系。为了本公开的目的，比较同源序列。“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”被认为、相信或已知在功能上是相关的。功能关系可以用多种方式中的任何一种来表示，包含但不限于：(a)序列同一性的程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，指示(a)和(b)两者。氨基酸序列或核酸序列之间的序列同源性可以根据共同的祖先来定义。由于物种形成事件(直系同源物)或重复事件(旁系同源物)，核酸的两个片段可能具有共同的祖先。氨基酸序列或核酸序列之间的同源性可以从它们的序列相似性来推断，使得氨基酸序列或核酸序列被认为是同源的，即所述氨基酸序列或所述核酸序列共享显著的相似性。显著的相似性可以是两个序列通过从共同祖先的不同进化而相关的有力证据。多个序列的比对可以用于发现同源区域。同源性可以使用本领域中容易获得的软件程序来确定，诸如在分子生物学实验室指南(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.奥斯贝(f.m.ausubel)等人编,1987)副刊30,第7.718章,表7.71中讨论的那些软件程序。一些比对程序为blast(ncbi),macvector(牛津分子有限公司(oxfordmolecularltd)，英国牛津(oxford,u.k.)),alignplus(科学和教育软件(scientificandeducationalsoftware)，宾夕法尼亚州(pennsylvania))和alignx(vectornti，英杰公司(invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca))。另一个比对程序是使用默认参数的sequencher(基因代码(genecodes)，密歇根州安娜堡(annarbor,michigan))。如本文中所使用的，术语“内源性”或“内源性基因”可以指天然存在的基因，在其所处位置发现其天然地存在于宿主细胞基因组内。在本公开的上下文中，将异源启动子可操作地连接到内源基因意指在该基因天然存在的位置将异源启动子序列通过遗传方式插入到现有基因的前面。如本文所述的内源基因可以包含根据本公开的任何方法已经突变的天然存在的基因的等位基因。如本文中所使用的，术语“外源的”与术语“异源的”可互换地使用，并且是指来自除其天然来源之外的一些来源的物质。例如，术语“外源蛋白质”或“外源基因”是指来自非天然来源或位置并且已经被人工提供给生物系统的蛋白质或基因。如本文中所使用的，术语“核苷酸变化”是指例如核苷酸替代、缺失和/或插入，如本领域中所熟知的。例如，突变可以含有产生沉默替代、添加或缺失的改变，但不改变编码的蛋白质的性质或活性或蛋白质的制备方式。可替代地，突变可以是非同义替代或改变，其可以改变编码的蛋白质的氨基酸序列并且可以导致蛋白质的性质或活性的改变。如本文中所使用的，术语“蛋白质修饰”可以指如本领域中所熟知的氨基酸替代、氨基酸修饰、缺失和/或插入。如本文中所使用的，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”可以指具有此类序列的最小尺寸特征的部分，或全长分子的任何较大片段，直至并包含全长分子。本公开的多核苷酸的片段可以编码基因调节元件的生物活性部分。基因调节元件的生物活性部分可以通过分离本公开的多核苷酸之一的包括基因调节元件的一部分并评估如本文所述的活性来制备。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸等，直至全长多肽。待使用的部分的长度将取决于特定应用。用作杂交探针的核酸的一部分可以短至12个核苷酸；在一些实施例中，它是20个核苷酸。用作表位的多肽的一部分可以短至4个氨基酸。发挥全长多肽的功能的多肽的一部分通常将比4个氨基酸长。变体多核苷酸还可以涵盖来源于诱变和重组程序诸如dna改组(shuffling)的序列。用于此类dna改组的策略在本领域中是已知的。参见，例如，施特默尔(stemmer)(1994)美国国家科学院院刊(pnas)91:10747-10751；施特默尔(1994)自然(nature)370:389-391；凯默瑞(crameri)等人(1997)自然生物技术(naturebiotech.)15:436-438；穆尔(moore)等人(1997)分子生物学杂志(j.mol.biol.)272:336-347；张(zhang)等人(1997)美国国家科学院院刊94:4504-4509；凯默瑞等人(1998)自然391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。对于本文公开的pcr扩增，可以设计用于pcr反应的寡核苷酸引物，以从由任何感兴趣的生物体提取的cdna或基因组dna中扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物和pcr克隆的方法在本领域中是公知的，并且公开在萨布鲁克(sambrook)等人(2001)分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)(第3版，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，纽约普莱恩维尤(plainview,newyork))中。还参见英尼斯(innis)等人编(1990)pcr方案：方法和应用指南(pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications)(纽约学术出版社(academicpress,newyork))；英尼斯和盖尔范德(gelfand)编(1995)pcr策略(pcrstrategies)(纽约学术出版社)；以及英尼斯和盖尔范德编(1999)pcr方法手册(pcrmethodsmanual)(纽约学术出版社)。已知的pcr方法包含但不限于使用配对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。如本文中所使用的术语“引物”可以指寡核苷酸，其当置于其中诱导引物延伸产物的合成的条件下时(即在核苷酸和用于聚合的药剂诸如dna聚合酶的存在下和在合适的温度和ph下)，能够退火至扩增靶，允许dna聚合酶附着，从而用作dna合成的起点。(扩增)引物可以是单链的以获得最大的扩增效率。引物可以是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在用于聚合的药剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包含引物的温度和组成(a/t相对于g/c含量)。一对双向引物由一个正向引物和一个反向引物组成，如在dna扩增(诸如在pcr扩增中)领域中常用的。如本文中所使用的，“启动子”可以指能够控制编码序列或功能性rna的表达的dna序列。在一些实施例中，启动子序列由近端和更远端上游元件组成，后者元件通常被称为增强子。因此，“增强子”可以是可以刺激启动子活性的dna序列，并且可以是启动子的先天元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部来源于天然基因，或者可以由来源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的dna片段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中或在不同发育阶段或响应于不同环境条件的表达。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此一些变异的dna片段可能具有相同的启动子活性。如本文中所使用的，短语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组dna构建体”在本文中可互换地使用。重组构建体可以包括核酸片段的人工组合，例如在自然界中未一同发现的调节序列和编码序列。例如，嵌合构建体可以包括来自不同来源的调节序列和编码序列，或来自相同来源但以不同于在自然界中发现的方式排列的调节序列和编码序列。此类构建体可以单独使用，或者可以与载体联合使用。如果使用载体，那么载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法，如本领域技术人员所熟知的。例如，可以使用质粒载体。技术人员熟知在载体上必须存在的遗传元件，以便成功地转化、选择和繁殖包括本公开的任何分离的核酸片段的宿主细胞。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(琼斯(jones)等人(1985)欧洲分子生物学组织杂志(emboj.)4:2411-2418；德·阿尔梅达(dealmeida)等人(1989)分子基因遗传学(mol.gen.genetics)218:78-86)，并且因此必须筛选多个事件，以便获得显示所需表达水平和模式的细胞系。此类筛选可以通过直接测序、dna的southern分析、mrna表达的northern分析、蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来完成。载体可以是质粒、病毒、细菌噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等，其自主地复制或者可以整合到宿主细胞的染色体中。载体也可以是非自主复制的裸rna多核苷酸、裸dna多核苷酸、由同一条链内的dna和rna组成的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的dna或rna、肽缀合的dna或rna、脂质体缀合的dna等。如本文中所使用的，术语“表达”是指功能性最终产物例如mrna或蛋白质(前体或成熟物)的产生。“可操作地连接的”或“功能性连接的”可以意指根据本公开的任何功能性有效负载(例如，启动子、终止子、降解决定子、溶解度标签等)与另外的寡核苷酸或多核苷酸的顺序排列。在一些情况下，顺序排列可以导致所述另外的多核苷酸的转录。在一些情况下，顺序排列可以导致所述另外的多核苷酸的翻译。功能性有效负载可以存在于另外的寡核苷酸或多核苷酸的上游或下游。在一个实例中，“可操作地连接的”或“功能性连接的”可以意指启动子控制与所述启动子相邻或其下游或3'的基因的转录。在另一个实例中，“可操作地连接的”或“功能性连接的”可以意指终止子控制与所述终止子相邻或其上游或5'的基因的转录的终止。如本文中所使用的术语“感兴趣的产物”或“生物分子”可以指由来自原料的微生物产生的任何产物。在一些情况下，感兴趣的产物可以是小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、醇等。例如，感兴趣的产物或生物分子可以是任何初级或次级细胞外代谢物。初级代谢物尤其可以是乙醇、柠檬酸、乳酸、谷氨酸、谷氨酸盐、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和其他氨基酸、维生素、多糖等。次级代谢物尤其可以是抗生素化合物如青霉素、或免疫抑制剂如环孢菌素a(cyclosporina)、植物激素如赤霉素(gibberellin)、他汀类药物(statindrug)如洛伐他汀(lovastatin)、杀真菌剂如灰黄霉素(griseofulvin)等。感兴趣的产物或生物分子也可以是由微生物产生的任何细胞内组分，诸如：微生物酶，包含：过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖异构酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、乳糖酶、链激酶和许多其他酶。细胞内组分还可以包含重组蛋白质，诸如胰岛素、乙肝疫苗、扰动素、粒细胞集落刺激因子、链激酶等。如本文中所使用的，术语“htp遗传设计文库”或“文库”是指根据本公开的遗传扰动的集合。在一些实施例中，本公开的文库可以表现为i)数据库或其他计算机文件中的序列信息的集合，ii)编码上述一系列遗传元件的遗传构建体的集合，或iii)包括所述遗传元件的宿主细胞菌株。在一些实施例中，本公开的文库可以指单个元件的集合(例如，pro交换文库的启动子的集合，用于stop交换文库的终止子的集合，溶解度标签交换文库的蛋白质溶解度标签的集合，或降解标签交换文库的蛋白质降解标签的集合)。在其他实施例中，本公开的文库还可以指遗传元件的组合，诸如启动子:基因、基因:终止子、或者甚至启动子:基因:终止子的组合。在一些实施例中，本公开的文库还可以指启动子、终止子、蛋白质溶解度标签和/或蛋白质降解标签的组合。在一些实施例中，本公开的文库进一步包括与在宿主生物体中应用文库的每个成员的效果相关的元数据。例如，如本文中所使用的文库可以包含启动子::基因序列组合的集合，以及那些组合对特定物种中的一或多种表型的所得效果，因此提高了在未来启动子交换中使用所述组合的未来预测价值。如本文中所使用的，术语“snp”是指小核多态性。在一些实施例中，本公开的snp应当被广义地解释，并且包含单核苷酸多态性、序列插入、缺失、倒位和其他序列替换。如本文中所使用的，术语“非同义的”或非同义的snp"是指导致宿主细胞蛋白质中的编码变化的突变。基因组工程改造的“高通量(htp)”方法可以涉及利用至少一件自动化设备(例如液体处理机或板处理机)来实施所述方法的至少一个步骤。如本文中所使用的术语“多核苷酸”涵盖寡核苷酸，并且指任何长度的核酸。多核苷酸可以是dna或rna。除非另有说明，否则多核苷酸可以是单链的(ss)或双链的(ds)。多核苷酸可以是合成的，例如在dna合成器中合成的，或天然存在的，例如从天然来源提取的，或衍生自克隆的或扩增的材料。本文所提及的多核苷酸可以含有修饰的碱基或核苷酸。如本文中所使用的术语“池”可以指至少2种多核苷酸的集合。在一些实施例中，一组多核苷酸可以包括至少5个、至少10个、至少12个或至少15个或更多个多核苷酸。如本文中所使用的术语“重叠序列”，或“重叠组装序列”或“组装重叠序列”可以指在两个多核苷酸中互补的序列，并且其中重叠序列是一个多核苷酸上的ss，使得它可以与另一个多核苷酸上的另一个重叠互补ss区杂交。重叠序列可以在两种不同的多核苷酸的末端处或接近末端(例如，在约5、10、20个核苷酸之内)。例如，如果两种不同的多核苷酸是单链的，则组装重叠序列将存在于每种单链多核苷酸的3'末端。可替代地，如果两种不同的多核苷酸是双链的，则一种多核苷酸的组装重叠序列可以存在于所述多核苷酸的3'末端(即，相对于ds多核苷酸的顶部链的3'端)，而另一种多核苷酸上的互补组装重叠序列可以存在于所述多核苷酸的5'端(即，相对于ds多核苷酸的顶部链的5'端)。根据需要，可以通过去除任何非重叠序列来获得任何ds多核苷酸上的组装重叠序列。去除可以是酶促的，诸如通过通过使用聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性。如本文中所使用的，术语“组装”可以指其中两个或更多、四个或更多、六个或更多、八个或更多、十个或更多、12个或更多、15个或更多的多核苷酸，例如四个或更多的多核苷酸彼此连接以形成更长的多核苷酸的反应。如本文中所使用的，术语“在合适的反应条件下孵育”可以指将反应维持在合适的温度和时间以获得期望的结果，即多核苷酸组装。适合于在本方法中使用的酶和试剂的反应条件是已知的(例如，如在本文实例中所述)，并且因此可以容易地确定用于本方法的合适的反应条件。这些反应条件可以取决于所使用的酶(例如，取决于它们的最佳温度等)而变化。如本文中所使用的，术语“连接”可以指两个序列之间共价键的产生。如本文中所使用的，术语“组合物”可以指除了列出的试剂之外还可以含有其他试剂的试剂的组合，例如甘油、盐、dntp等。组合物可以是任何形式，例如含水的或冻干的，并且可以是任何状态(例如，冷冻的或液体形式)。如本文中所使用的，“载体”是合适的dna，片段或dna组装体可以被整合到其中，使得工程改造的载体可以在宿主细胞中复制。线性化的载体可以通过环状载体的限制性核酸内切酶消化或通过pcr产生。片段和/或线性化的载体的浓度可以通过凝胶电泳或其他方法来确定。概述本文提供了促进以确定性而非组合方式在单个反应中产生多个组装体的方法和组合物。本文提供的方法和组合物赋予了多重组装的时间、成本和通量益处，同时仍然能够创建文库，其中所有输出组装体都是预先确定的。本文提供的方法和组合物允许在单个组装反应中产生许多质粒或构建体，减少了产生数千个质粒或构建体的文库所需的总反应数。本文提供的方法和组合物还允许从大量可能组合的更大集合中组装所需的质粒或构建体的限定子集。在一些情况下，本文提供的方法和组合物通过不包含任何有效负载或插入序列特异性组装重叠，使需要从基因组扩增(或合成)的独特部分(“同源性臂”)的数目最小化。这可以消除扩增被设计用于与多个有效负载或插入序列组合的同一同源性臂对的多个拷贝的需要。此外，由有效负载/插入序列和同源性臂对的组合产生的多样性由有效负载/插入序列本身上的序列指定。大量所得的有效负载序列可以合成和廉价地产生。使用本文提供的方法和组合物生成的文库可以适合于任何数量的应用，诸如例如任何基因组编辑方法或任何混合的途径组装。本领域中已知的基因组编辑方法可以是那些不需要用于rcme(重组酶盒介导的交换)的定制位点以在多个任意位置编辑细胞的基因组的方法，诸如例如无疤痕的基因组编辑。本文提供了一种组合物，其包括用于以确定性方式组装核酸构建体的文库的多核苷酸的混合物。混合物可以包括多核苷酸部分(例如，第一多核苷酸和第二多核苷酸)的n个池。n个池可以是至多、至少或恰好是多核苷酸的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个池。n个池可以各自包括相同数量的多核苷酸部分，或者它们可以包括不同数量的多核苷酸部分(例如，第一多核苷酸和第二多核苷酸)。在一个实施例中，混合物包括2个池，使得两个池中的一个包括第一多核苷酸，并且两个池中的另一个包括第二多核苷酸。第一多核苷酸的每个池可以在第二多核苷酸的单独池中包括配对的第二多核苷酸。除了任何上述实施例之外，混合物可以进一步包括插入或桥接多核苷酸的n-1个池。每个插入或桥接多核苷酸可以包括与其5'端的多核苷酸部分的n个池之一(例如第一多核苷酸)的元件和与其3'端的多核苷酸部分的其他池之一(例如第二多核苷酸)的元件互补的序列。可以设计插入序列，使得组装产生多核苷酸的文库，其中每个多核苷酸包括来自多核苷酸部分的n个池中的每一个的特定元件，散布有来自插入多核苷酸的n-1个池中的每一个的特定元件。多核苷酸的混合物可以包括：含有成对的多核苷酸的第一池，其中第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸；和插入多核苷酸的第二池，其中第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列。在一个实施例中，所述组合物可以进一步包括克隆载体，其中，对于第一池中的每对，第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端包括与克隆载体互补的序列。克隆载体可以是本领域中已知的适合于在宿主细胞诸如例如大肠杆菌(e.coli)或酿酒酵母(s.cerevisiae)中繁殖的任何克隆载体。在另一个实施例中，组合物还包括聚合酶、核酸外切酶、连接酶或其任意组合。聚合酶可以是链置换的或非链置换的。核酸外切酶可以是5'-3'核酸外切酶。第一池中的成对的多核苷酸可以是双链的、单链的或其组合。第二池中的插入多核苷酸可以是双链的、单链的或其组合。在一个实施例中，聚合酶是非链置换的，并且组合物进一步包括拥挤剂。拥挤剂可以选自聚乙二醇(peg)、聚蔗糖或葡聚糖。在一个实施例中，拥挤剂是peg。peg可以以约3％至约7％(重量/体积)的浓度使用。peg可以选自peg-200、peg-4000、peg-6000、peg-8000或peg-20,000。在另一个实施例中，聚合酶是链置换的，并且组合物进一步包括单链结合蛋白质。单链dna结合蛋白质可以是极端耐热的单链dna结合蛋白质(etssb)、大肠杆菌reca、t7基因2.5产物、噬菌体λredb或rac前噬菌体rect。在一个实施例中，本文提供的组合物是以下多核苷酸的混合物：(1)一或多种第一多核苷酸，(2)一或多种插入多核苷酸，其中插入多核苷酸包括在其5'端的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的第二组装重叠序列，和(3)一或多种第二多核苷酸。在另一个实施例中，组合物是以下多核苷酸的混合物：(1)一或多种第一多核苷酸，(2)一或多种插入多核苷酸，其中插入多核苷酸包括在其5'端的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的第二组装重叠序列，(3)一或多种第二多核苷酸和(4)克隆载体。一或多种第一多核苷酸中的每一种可以包括在其3'端或远端的与存在于来自一或多种插入多核苷酸的插入多核苷酸的5'端或近端的第一组装重叠序列互补的序列。一或多种第二多核苷酸中的每一种可以包括在其5'端或近端的与存在于来自一或多种插入多核苷酸的插入多核苷酸的3'端或远端的第二组装重叠序列互补的序列。一或多种第一多核苷酸中的每一个可以与一或多种第二多核苷酸中的至少一个配对，从而形成一对或多对第一多核苷酸和第二多核苷酸。每对第一多核苷酸和第二多核苷酸可以包括在第一多核苷酸的远端的与来自一或多个插入多核苷酸的插入多核苷酸的近端上的第一组装重叠序列互补的序列；以及在第二多核苷酸的近端的与来自一或多个插入多核苷酸的插入多核苷酸的远端互补的序列。本文提供了一种用于生成多核苷酸的文库的方法，该方法包括：a.组合多核苷酸部分的n个池(例如第一多核苷酸和第二多核苷酸)和插入或桥接多核苷酸的n-1个池；以及b.将多核苷酸部分的n个池和插入多核苷酸的n-1个池组装到多核苷酸的文库中，其中文库中的每个多核苷酸包括来自多核苷酸部分的n个池中的每一个的单个元件和桥接多核苷酸的限定组合。插入或桥接多核苷酸的n-1个池中的每个插入或桥接多核苷酸包括在其5'端的与第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第一多核苷酸和第二多核苷酸的n个池中的第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列。组装可以经由体外或体内重叠组装方法进行。在一些情况下，经由体外克隆方法进行组装，其中将多核苷酸部分的n个池和插入或桥接多核苷酸的n-1个池的混合物加热，以使存在的任何双链多核苷酸部分部分或完全变性，然后在进行体外克隆方法之前以低速冷却至室温。本文还提供了一种用于生成多核苷酸的文库的方法，该方法包括：(a)组合多核苷酸的第一池和多核苷酸的第二池，其中第一池含有成对的多核苷酸，其中第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第二池含有插入多核苷酸，其中第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；(b)将第一池和第二池组装成多核苷酸的文库，其中文库中的每一多核苷酸包括来自第二池的插入多核苷酸和来自第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸。组装可以经由体外或体内重叠组装方法进行。在一些情况下，经由体外克隆方法进行组装，其中加热第一池和第二池的混合物以使存在于第一池和第二池中的多核苷酸部分或完全变性，然后在进行体外克隆方法之前以低速冷却至室温。在一些情况下，该方法进一步包括在步骤(a)期间将克隆载体与第一池和第二池组合，其中对于第一池中的每对，克隆载体的相对端包括与第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端互补的序列。在一些情况下，该方法进一步包括在步骤(a)之前将克隆载体与第一池组合，其中对于第一池中的每对，克隆载体的相对端包括与第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端互补的序列。在一些情况下，克隆载体和来自第一池的每对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。在一些情况下，所述方法进一步包括通过添加用于一或多个识别序列的一或多种位点特异性核酸酶，在克隆载体的相对端与来自第一池的每对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端之间生成单链互补突出物。在一些情况下，所述方法进一步包括连接克隆载体的相对端与来自第一池的每对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端之间的单链互补突出物。可以使用dna连接酶进行连接。在一些情况下，步骤(b)产生环状产物，所述环状产物包括来自第二池的插入多核苷酸、来自第一池的一对的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及克隆载体。在一个方面中，本文提供了一种用于生成多核苷酸的文库的方法，该方法包括：(a)通过聚合酶链反应(pcr)扩增多核苷酸的第一池，其中第一池含有成对的多核苷酸，其中第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中一对中的每个第一多核苷酸和每个第二多核苷酸包括5'端和3'端，其中该扩增在来自第一池的一对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上引入共同重叠序列，该共同重叠序列包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列；(b)通过利用共同重叠序列将来自第一池的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸组装成单个核酸片段，其中每对的单个核酸片段包括由共同重叠序列从第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端分离的第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中每对的单个核酸片段中第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端位于单个核酸片段的相对末端上，远离一或多个位点特异性核酸酶识别序列；(c)将每对的单个核酸片段与含有插入多核苷酸的第二池组合，其中第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与单个核酸片段中存在的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与单个核酸片段中存在的第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；(d)将第一池和第二池组装成环化的产物的第三池，其中所述组装经由体外或体内重叠组装方法进行，并且其中第三池中的每种环化的产物包括来自第二池的插入序列和来自第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸；(e)经由一或多种位点特异性核酸酶的消化使第三池中的每种环化的产物线性化，所述位点特异性核酸酶识别位于第三池中的每个环状产物中的第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列；以及(f)经由体外或体内克隆方法将线性化的产物组装到克隆载体中。在一些情况下，共同重叠序列包括至少1个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。在一些情况下，共同重叠序列包括10-25个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。在一些情况下，基于重叠的dna组装方法选自soe-pcr或体外重叠组装方法(例如，使用hifi构建器的hifi组装)。在一些情况下，存在于第一多核苷酸的5'端的共同重叠序列中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列与存在于每对中的第二多核苷酸的3'端上的共同重叠序列中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列互补，并且其中在步骤(b)中利用每对中的第一多核苷酸和第二多核苷酸的共同重叠序列需要进行soe-pcr。在一些情况下，在步骤(b)中利用每对中的第一多核苷酸和第二多核苷酸的共同重叠序列需要用一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上的共同重叠序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在每对中第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上生成包括互补序列的单链突出物；以及连接在每对中第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上的单链突出物上存在的互补序列。步骤(d)中的组装可以经由体外或体内重叠组装方法进行。步骤(d)的组装可以使用基于重叠的dna组装方法进行。基于重叠的dna组装可以选自soe-pcr和体外重叠组装方法(例如，使用hifi构建器的hifi组装)。在一些情况下，每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端包括一组附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，并且第二池中的每个插入多核苷酸中的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。在一些情况下，步骤(d)中的组装需要用每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端上的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列以及来自第二池的每个插入多核苷酸中的第一组装序列和第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端上存在的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列和来自第二池的每个插入多核苷酸中的第一组装序列和第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在第一多核苷酸的3'端上生成单链突出物(其包括与来自第二池的插入多核苷酸的第一组装序列的5'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列)和在第二多核苷酸的5'端上生成单链突出物(其包括与来自第二池的相同插入多核苷酸的第二组装序列的3'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列)；以及连接单链突出物上存在的互补序列。在一些情况下，步骤(d)的组装经由体外克隆方法进行，其中将第一池和第二池的混合物加热以使存在于第一池和第二池中的多核苷酸部分或完全变性，然后在进行体外克隆方法之前以低速冷却至室温。步骤(f)中的组装可以经由体外克隆方法或体内克隆方法进行。在一些情况下，步骤(f)的克隆载体包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。在一些情况下，步骤(f)中的组装需要用克隆载体中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化克隆载体中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，其中消化在克隆载体的相对端生成单链突出物，其中克隆载体的相对端的一个上的单链突出物包括与步骤(e)中生成的线性化的产物的末端互补的序列，并且克隆载体的相对端的另一个上的单链突出物包括与步骤(e)中生成的线性化的产物的相对端互补的序列；以及连接克隆载体的单链突出物上存在的互补序列和来自步骤(e)的线性化的产物。用于本文提供的任何方法或组合物中的位点特异性核酸酶可以选自限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen和切口酶或其任意组合。位于第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列可以是一或多个归巢核酸酶识别序列。位于第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶可以是归巢核酸内切酶。在另一个方面中，本文提供了一种用于生成多核苷酸的文库的方法，该方法包括：(a)经由聚合酶链反应(pcr)扩增多核苷酸的第一池，其中第一池含有成对的多核苷酸，其中第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中一对中的每一个第一多核苷酸和每一个第二多核苷酸包括第一5'末端和相对的第二3'末端，其中该扩增将用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列引入到来自第一池的一对中的第一多核苷酸的第一5'末端和第二多核苷酸的3'端上，其中第一多核苷酸的第一5'末端上的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列与该对中的第二多核苷酸的第一3'末端上的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列互补；(b)通过利用每对中第一多核苷酸的第一5'末端和第二多核苷酸的3'端上的一或多个互补位点特异性核酸酶识别序列进行剪接和重叠延伸聚合酶链反应(soe-pcr)将来自第一池的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸组装成单个核酸片段，其中每对的单个核酸片段包括由一或多个位点特异性核酸酶识别序列从第一多核苷酸的第一5'末端和第二多核苷酸的3'端分离的第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中每对的单个核酸片段中的第一多核苷酸的相对的第二3'末端和第二多核苷酸的5'端位于单个核酸片段的相对末端上，远离一或多个位点特异性核酸酶识别序列；(c)将每对的单个核酸片段与含有插入多核苷酸的第二池组合，其中第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与单个核酸片段中存在的第一多核苷酸的相对3'末端之一的相对末端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与单个核酸片段中存在的第二多核苷酸的相对的5'末端中的另一个互补的第二组装重叠序列；(d)将第一池和第二池组装成环化的产物的第三池，其中该组装经由体外或体内重叠组装方法进行，并且其中第三池中的每种环化的产物包括来自第二池的插入序列和来自第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸；(e)经由添加一或多种位点特异性核酸酶使第三池中的每种环化的产物线性化，该位点特异性核酸酶识别位于第三池中的每种环化的产物中的第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列；以及(f)通过体外或体内克隆方法将线性化的产物组装到克隆载体中。步骤(d)中的组装可以经由体外或体内重叠组装方法进行。在一些情况下，使用基于重叠的dna组装方法进行步骤(d)的组装。基于重叠的dna组装可以选自soe-pcr和体外重叠组装方法(例如，使用hifi构建器的hifi组装)。在一些情况下，每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端包括一组附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，并且第二池中的每个插入多核苷酸中的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。在一些情况下，步骤(d)中的组装需要用每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端上的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列以及来自第二池的每个插入多核苷酸中的第一组装序列和第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中的单个核酸片段中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端上存在的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列和来自第二池的每个插入多核苷酸中的第一组装序列和第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在第一多核苷酸的3'端上生成单链突出物(其包括与来自第二池的插入多核苷酸的第一组装序列的5'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列)和在第二多核苷酸的5'端上生成单链突出物(其包括与来自第二池的相同插入多核苷酸的第二组装序列的3'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列)；以及连接单链突出物上存在的互补序列。在一些情况下，步骤(d)的组装经由体外克隆方法进行，其中将第一池和第二池的混合物加热以使存在于第一池和第二池中的多核苷酸部分或完全变性，然后在进行体外克隆方法之前以低速冷却至室温。步骤(f)中的组装可以经由体外克隆方法或体内克隆方法进行。在一些情况下，步骤(f)的克隆载体包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。在一些情况下，步骤(f)中的组装需要用克隆载体中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化克隆载体中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，其中消化在克隆载体的相对端生成单链突出物，其中克隆载体的相对端的一个上的单链突出物包括与步骤(e)中生成的线性化的产物的末端互补的序列，并且克隆载体的相对端的另一个上的单链突出物包括与步骤(e)中生成的线性化的产物的相对端互补的序列；以及连接克隆载体的单链突出物上存在的互补序列和来自步骤(e)的线性化的产物。用于本文提供的任何方法或组合物中的位点特异性核酸酶可以选自限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen和切口酶或其任意组合。在一个实施例中，本文提供的方法和组合物中的第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与宿主细胞中的靶基因组基因座互补或对应的序列。与第一多核苷酸和第二多核苷酸中存在的靶基因组基因座互补或对应的序列可以位于所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的与所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的末端相对的末端上，其包括与插入多核苷酸上存在的组装重叠序列互补的序列。当包括与宿主细胞中的靶基因组基因座互补或对应的序列时，第一多核苷酸和第二多核苷酸可以被称为同源性臂。特别地，每个第一多核苷酸可以被称为左同源性臂，而每个第二多核苷酸可以被称为右同源性臂。当包括与宿主细胞中的靶基因组基因座互补或对应的序列时，通过使用本文提供的组合物和方法组装成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸和插入多核苷酸而生成核酸构建体的文库可以随后用于修饰宿主细胞的基因组的基因组编辑技术。宿主细胞可以是原核细胞或真核宿主细胞。多核苷酸对如本文所述，本文提供的组合物和方法可以包括或利用第一多核苷酸和第二多核苷酸，使得每个第一多核苷酸与第二多核苷酸配对。可以使用本领域已知的用于合成核酸的任何方法来化学合成(例如，阵列合成或柱合成)第一多核苷酸和第二多核苷酸。第一多核苷酸和第二多核苷酸可以经由延伸反应(例如pcr)从现有的dna(诸如例如基因组dna)扩增。第一多核苷酸和第二多核苷酸中的每一种可以包括功能性序列和非功能性序列或其组合。功能性序列可以指代表基因或其部分或结构域或调节元件或其部分的序列。如本文进一步所述，基因或其部分可以编码作为代谢或生物化学途径的一部分的蛋白质。此外，如本文进一步所述，调节元件可以是启动子、终止子、溶解度标签、降解标签或降解决定子。非功能性序列可以指不代表基因或其部分或调节元件或其部分的序列。非功能性序列可以是有助于或用于所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸与如本文提供的插入多核苷酸组装的序列。在一个实施例中，第一多核苷酸和第二多核苷酸中的每一种包括功能性序列和非功能性序列的混合物。在另一个实施例中，第一多核苷酸和第二多核苷酸中的每一种包括功能性序列或非功能序列中的一个或另一个。在其中第一多核苷酸和第二多核苷酸仅包括功能性序列的实施例中，功能性序列或功能性序列的一部分可以用于所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸与如本文提供的插入多核苷酸的组装。第一多核苷酸和/或第二多核苷酸各自可以在长度上变化，并且在一些情况下长度可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、950或1000个核苷酸碱基和/或长度可以大于1kb或2kb。可替代地，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸的长度可以是2kb或更大，或1kb或更大或大于900个碱基、800个碱基、700个碱基、600个碱基、500个碱基、400个碱基、300个碱基、200个碱基或100个碱基。第一多核苷酸和/或第二多核苷酸的长度可以在100个核苷酸至2kb的范围内，例如高达100、高达150、高达200、高达250、高达300、高达350、高达400、高达450、高达500、高达550、高达600、高达650、高达700、高达750或高达800、高达850、高达900、高达950、高达1000、高达1500或高达2000个核苷酸。第一多核苷酸和/或第二多核苷酸的最小长度可以由经验确定的优选的tm来定义。如本文所述，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列中的每一个可以包括有助于所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸与插入多核苷酸的组装的序列。为了帮助所述组装，所述序列可以与插入多核苷酸上存在的组装重叠序列互补。与插入多核苷酸上存在的组装重叠序列互补的序列也可以被称为组装重叠序列。在一个实施例中，组装重叠序列代表整个第一多核苷酸和/或第二多核苷酸。在另一个实施例中，组装重叠序列仅代表第一多核苷酸和/或第二多核苷酸的一部分，并且第一多核苷酸和/或第二多核苷酸进一步包括除了组装重叠序列之外的附加序列。在一个实施例中，如本文提供的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸中的第一多核苷酸包括在其远端或3'端的与存在于插入多核苷酸的5'端或近端的第一组装重叠序列互补的组装重叠序列，而所述一对中的第二多核苷酸包括在其近端或5'端的与存在于所述插入多核苷酸的3'端或远端的第二组装重叠序列互补的重叠组装重叠序列。除了该实施例之外，第一多核苷酸和第二多核苷酸可以各自包括除了组装重叠序列之外的附加序列。第一多核苷酸和/或第二多核苷酸的附加序列可以使所述第一多核苷酸和/或第二多核苷酸适应具体的应用。具体的应用可以是利用本领域中已知的核酸文库的任何应用，特别是那些将受益于混合的确定性组装的应用。示例性用途可以包含但不限于基因组编辑和途径组装。存在于第一多核苷酸和/或第二多核苷酸上的组装重叠序列可以在长度上变化，并且在一些情况下，长度可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸和/或长度可以是至多100个核苷酸(例如，长度高达50、高达30、高达25、高达20或高达15个核苷酸)。组装重叠序列的长度可以在15个核苷酸至100个核苷酸的范围内，例如高达20个、高达25个、高达30个、高达35个、高达40个、高达45个、高达50个、高达55个、高达60个、高达65个、高达70个、高达75个、高达80个核苷酸、高达85个核苷酸、高达90个核苷酸、高达95个核苷酸或高达100个核苷酸。组装重叠序列的长度可以与插入多核苷酸上存在的组装重叠序列的长度相同。组装重叠序列的最小长可以由经验确定的优选的tm来定义。在一个实施例中，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸上的组装重叠序列包括与插入多核苷酸的末端互补的1或多个核苷酸。在另一个实施例中，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸上的组装重叠序列包括与插入多核苷酸的末端互补的约25个核苷酸。如图1所示，每对第一多核苷酸和第二多核苷酸可以进一步包括具有克隆载体的载体重叠序列，使得第一多核苷酸(即，图1中的第一dna片段)可以包括在其5'端的克隆载体的载体重叠序列，而第二多核苷酸(即，图1中的第二dna片段)可以包括在其3'端的克隆载体的载体重叠序列。在实施例中，其中一对中的第一多核苷酸和第二多核苷酸中的每一个进一步包含如本文提供的第一dna片段和第二dna片段，所述第一dna片段和所述第二dna片段可以位于第一多核苷酸中克隆载体的载体重叠序列的下游和附近，以及第二多核苷酸中克隆载体的载体重叠序列的上游和附近。载体重叠序列的长度可以变化，并且在一些情况下，长度可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸和/或长度可以是高达100个核苷酸(例如，长度高达50个、高达30个、高达25个、高达20个或高达15个核苷酸)。可替代地，载体重叠序列可以是2kb或更小，或1kb或更小或小于900个碱基、800个碱基、700个碱基、600个碱基、500个碱基、400个碱基、300个碱基、200个碱基或100个碱基。载体重叠序列长度可以在15个核苷酸至80个核苷酸的范围内，例如高达20个、高达25个、高达30个、高达35个、高达40个、高达45个、高达50个、高达55个、高达60个、高达65个、高达70个、高达75个或高达80个核苷酸。载体重叠序列的最小长度可以由经验确定的优选的tm来定义。在一个实施例中，通过从更大的一组此类序列中选择成对的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列来生成含有成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸的池，使得除了如本文所提供的所述池的成对的多核苷酸和插入多核苷酸或其池，或所述池和克隆载体之间的设计的重叠组装序列之外，没有来自所述池的多核苷酸与来自所述池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。指定的阈值至少是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。指定的阈值最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。指定的阈值为0至2、1至3、2至4、3至5、4至6、5至7、6至8、7至9、8至10、9至11、10至12、11至13、12至14、13至15、14至16、15至17、16至18、17至19、18至20或19至21个连续核苷酸。指定的阈值为0至5、0至10、0至15、0至20、5至10、5至15、5至20、10至15或10至20个连续核苷酸。在一个实施例中，指定的阈值是12个连续的核苷酸。超过指定的阈值的共享的共同序列的确定可以使用计算机程序来完成，该计算机程序使用blast分析或简单的子串搜索来确定组分是否与其他组分共享序列。如果发现共享的序列超出指定的阈值，则不会将组分一起放入池中。在一个实施例中，如本文所述的插入多核苷酸与所需的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸的配对可以通过使用如图2所示的“由内而外的组装”方法预组装所需的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸来促进。在该方法中，可以通过pcr来扩增第一多核苷酸和第二多核苷酸，使得第一多核苷酸的载体近端各自含有一或多个独特的位点特异性核酸酶位点或识别序列。位点特异性核酸酶识别序列可以是选自限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen和切口酶及其任意组合的位点特异性核酸酶。在一个实施例中，第一多核苷酸的载体近端各自含有单一独特的核酸酶位点或识别序列。在一个实施例中，独特的核酸酶识别序列是独特的限制性核酸内切酶位点，使得所述限制性核酸内切酶位点不存在于本文提供的组合物中存在的任何多核苷酸中。在一个实施例中，独特的核酸酶位点是归巢核酸内切酶序列，诸如例如对i-scei或i-ceui特异的归巢核酸内切酶序列。将单对第一多核苷酸和第二多核苷酸组合，并进行剪接和重叠延伸聚合酶链反应(soe-pcr)，以在添加的独特核酸酶位点(例如，在载体近端)组装两个多核苷酸，使与插入多核苷酸连接的末端游离。可替代地，可以使用本领域中已知的多种dna合成方法中的任一种来直接合成包括连接的第一多核苷酸和第二多核苷酸的整个序列。使用本领域中已知和/或本文提供的体外或体内重叠组装方法，诸如例如酵母(例如酿酒酵母)或基于大肠杆菌同源重组的组装、gibson组装或hifi构建体，将连接的第一多核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸组装。第一多核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸的环化的产物可以通过添加对独特的核酸酶序列特异的核酸酶(例如，对特异性归巢核酸内切酶序列特异的归巢核酸内切酶)而线性化，导致插入多核苷酸被第一多核苷酸和第二多核苷酸侧翼包围，然后可以使用gibson组装或其他类似方法将第一多核苷酸和第二多核苷酸组装到载体中。插入多核苷酸/有效负载序列在一个实施例中，用于本文提供的组合物、试剂盒或方法中的插入多核苷酸包括：(1)所述插入多核苷酸的5'端或近端上的第一组装重叠序列，和(2)所述插入多核苷酸的相对的3'端或远端上的第二组装重叠序列。除了该实施例之外，第一组装重叠序列可以包括与来自一对第一多核苷酸和第二多核苷酸的第一多核苷酸的3'端或远端处的序列(例如组装重叠序列)互补的序列，而第二组装重叠序列可以包括与来自该对第一多核苷酸和第二多核苷酸的第二多核苷酸的5'端或近端处的序列(例如组装重叠序列)互补的序列。本文提供的插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列的长度可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸，和/或长度可以为高达100个核苷酸(例如，长度高达50个、高达30个、高达25个、高达20个或高达15个核苷酸)，它们分别与如本文提供的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补。组装重叠序列的长度可以在15个核苷酸至100个核苷酸的范围内，例如高达20个、高达25个、高达30个、高达35个、高达40个、高达45个、高达50个、高达55个、高达60个、高达65个、高达70个、高达75个、高达80个核苷酸、高达85个核苷酸、高达90个核苷酸、高达95个核苷酸或高达100个核苷酸。在一个实施例中，本文提供的插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括分别与本文提供的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的1或多个核苷酸。在另一个实施例中，本文提供的插入多核苷酸上的第一组装重叠序列和第二组装重叠序列包括分别与本文提供的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的约25个核苷酸。在另一个实施例中，插入多核苷酸进一步包括一或多个有效负载序列，使得所述一或多个有效负载序列位于第一组装重叠序列与第二组装重叠序列之间。有效负载序列可以是随机序列。有效负载序列可以是标记序列。标记序列可以是本领域中已知的任何标记序列。有效负载序列可以是基因或其一部分。该基因或其部分可以是代谢或生物化学途径的一部分。该基因或其部分可以编码蛋白质或其结构域。有效负载序列可以选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、编码降解标签的核酸序列、终止子、条形码、调节序列或其部分。在一些情况下，在用于本文提供的组装方法之前，插入多核苷酸的三个组分(即，第一组装重叠序列、第二组装重叠序列和有效负载序列)被合成或以其他方式组合成连续的dna片段。在一个实施例中，第一组装重叠和第二组装重叠不是随机的，而是被设计成与第一多核苷酸和第二多核苷酸的特定对匹配。在其中成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸包括如本文所述的靶向序列的实施例中，存在于插入多核苷酸内的有效负载序列可以导致相对于由成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸上的靶向序列靶向的原始基因座的插入，相对于由成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸上的靶向序列靶向的原始基因座的序列的缺失，或一个序列被另一个序列替换。在插入或修饰的情况下，“有效负载”可以是预期的最终序列。在缺失的情况下，“有效负载”可以是标记序列，或者可以不是序列。在一个实施例中，插入多核苷酸以混合的方式使用。除了该实施例之外，插入多核苷酸的池中的每个插入多核苷酸可以包括第一组装重叠序列和第二组装重叠序列，该第一组装重叠序列包括与来自一对第一多核苷酸和第二多核苷酸的第一多核苷酸的3'端或远端处的序列(例如组装重叠序列)互补的序列，该第二组装重叠序列包括与来自该对第一多核苷酸和第二多核苷酸的第二多核苷酸的5'端或近端处的序列(例如组装重叠序列)互补的序列。插入多核苷酸的池可以含有任何数目的独特的插入多核苷酸序列。插入多核苷酸的数目可以是至少、至多或约1、5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000或250,000个具有或不具有有效负载序列的独特的插入多核苷酸。有效负载序列的长度可以是至多或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000个核苷酸。在一些情况下，有效负载序列的长度可以是0个核苷酸。有效负载序列的长度可以使得当被并入插入多核苷酸时，整个插入多核苷酸可以被化学合成。合成可以是如本领域中已知的基于阵列或基于柱的合成方法。在一个实施例中，有效负载序列的长度使得其可以与第一组装重叠和第二组装重叠一起直接被包含或合成在插入寡核苷酸中。可以被合成的插入多核苷酸的长度可以高达约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、250、300、350、400个或更多个核苷酸。在另一个实施例中，可以使用图3中描述的方法在单个池中生成插入多核苷酸。如图3所示，有效负载序列(例如，图3中的启动子序列)可以经由pcr从三个组分生成：混合的正向引物、共同的反向引物和有效负载模板序列(例如，图3中的启动子)。有效负载序列模板可以是合成的dna片段、pcr产物或其他单链或双链dna片段。正向引物的池可以使用本领域中已知的基于阵列或基于柱的合成方法来合成。池中的每个正向引物可以包括(从5'到3')：1)与有效负载模板序列的远端或3'端互补的序列，2)包括与来自一对第一多核苷酸和第二多核苷酸的第二多核苷酸互补的序列的第二组装重叠序列，3)用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列(例如，归巢核酸内切酶位点或识别序列)，4)包括与来自一对第一多核苷酸和第二多核苷酸的第一多核苷酸互补的序列的第一组装重叠序列，和5)结合至有效负载模板序列的近端或5'端的启动序列。共同的反向引物可以结合至有效负载模板序列的远端或3'端或结合至有效负载序列下游的其他序列。可以使用混合的正向引物和共同的反向引物对有效负载模板序列(例如，图3中的启动子)进行pcr。在扩增后，可以使用本领域中已知的重叠组装方法，诸如例如gibson组装、hifi组装或类似方法，将pcr产物环化以生成环状排列的有效负载(插入物)，并且然后使用识别一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶(例如，归巢核酸内切酶，图3中的i-scei)将其线性化。核酸酶消化可以产生适合用作插入多核苷酸的片段(例如，图1中描述的“有效负载”部分)，其中大的有效负载侧接第一组装重叠序列和第二组装重叠序列(例如，图3中启动子序列侧翼的同源性臂或区域)。如图3所示，在有效负载序列的末端可以是小的部分核酸酶识别序列(例如，图3中的i-scei)，其可以通过所使用的重叠组装方法(例如，gibson组装试剂、hifi组装试剂或等效混合物的3'和5'核酸外切酶活性)切除。可以任选地在环化之后和在线性化之前对产物进行扩增(例如，rca)。在一个实施例中，每个插入多核苷酸包括有效负载序列，使得插入多核苷酸的池中的每个插入多核苷酸包括与所述池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列不同的有效负载序列。在另一个实施例中，每个插入多核苷酸包括有效负载序列，使得插入多核苷酸的池中的每个插入多核苷酸包括与所述池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同的有效负载序列。克隆方法如本文所述，可以将包括成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及插入多核苷酸的组合物组装到包括第一多核苷酸和第二多核苷酸且其间具有插入多核苷酸的核酸的文库中。如本文提供的成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸的组装可以通过体外或体内克隆方法进行。对于大dna分子的组装，组装的最后步骤可以在体内(诸如，在酵母宿主细胞中)进行。体外和体内组装步骤的使用之间的平衡可以通过该方法在待组装的核酸分子的性质方面的实用性来确定。在一个实施例中，使用体外克隆方法进行成对的第一核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸的组装。体外克隆方法可以是采用本领域中已知的重叠组装的任何体外克隆方法。在本文提供的方法中使用的体外克隆方法可以选自输注克隆goldengate组装、网关组装、gibson组装和hifi组装或本领域中已知的任何其他合适的体外克隆方法。输注克隆可能需要将如本文提供的成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸的第一池和如本文描述的插入多核苷酸的第二池与输注克隆试剂混合，并且然后将所得的组装体转化到大肠杆菌克隆宿主细胞中。体外克隆方法可以是在us8,968,999(其通过引用以其整体并入本文)中描述的任何重叠组装方法。体外克隆方法可以是在us20160060671(其通过引用以其整体并入本文)中描述的任何重叠组装方法。体外克隆方法可以是在浦野淳(junurano)博士和克里斯汀·陈(christinechen)博士,gibson“引物-桥末端连接(pbnj)克隆(gibsonprimer-bridgeendjoining(pbnj)cloning)”,合成基因组学应用说明(syntheticgenomicsapplicationnote)(其通过引用以其整体并入本文)中描述的gibson组装方法。在一个实施例中，包括成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸、插入多核苷酸和克隆载体的组合物使用5'-3'核酸外切酶和也存在于组合物中的链置换聚合酶连接。该组合物还可以包括含有钾盐诸如氯化钾的缓冲液，其浓度范围为7mm至150mm，例如20mm至50mm。除钾盐外，还可以使用在10mm至100mm的范围内诸如20mm的钠盐(例如，氯化钠)。在一些实施例中，组合物不含有拥挤剂，诸如聚乙二醇(peg)、聚蔗糖或葡聚糖。在一些实施例中，组合物包括单链(ss)结合蛋白质。用于组合物中的ssdna结合蛋白质可以是大肠杆菌reca、t7基因2.5产物、redb(来自噬菌体λ)或rect(来自rac前噬菌体)、etssb(极端热稳定的单链dna结合蛋白质)，或者本领域中已知的任何其他ssdna结合蛋白质可以用于组合物中。与在不存在ss结合蛋白质的情况下将以其他方式发生的相比，包含ss结合蛋白质可以提高组装的效率，特别是对于具有较长的重叠序列(例如，至少20个核苷酸)的核酸片段，如通过菌落数所测量的。在一些实施方案中，组合物不含有非链置换聚合酶。在另一个实施例中，使用缺乏3'核酸外切酶活性的分离的非热稳定的5'至3'核酸外切酶、拥挤剂、具有3'核酸外切酶活性的非链置换dna聚合酶、或所述dna聚合酶与缺乏3'核酸外切酶活性的第二dna聚合酶的混合物和连接酶，将包括成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸、插入多核苷酸和克隆载体的组合物连接。在有效地连接多核苷酸和克隆载体的条件下，该组合物可以进一步包括dntp和合适的缓冲液的混合物。在一些实施例中，组合物可以进一步包括拥挤剂。拥挤剂可以选自聚乙二醇(peg)、葡聚糖或聚蔗糖。在一个实施例中，拥挤剂是peg。peg可以以约3％至约7％(重量/体积)的浓度使用。peg可以选自peg-200、peg-4000、peg-6000、peg-8000或peg-20,000。在一些实施例中，核酸外切酶是t5核酸外切酶，并且接触是在等温条件下进行的，并且/或者拥挤剂是peg，并且/或者非链置换的dna聚合酶是dna聚合酶或dna聚合酶，和/或taq连接酶。在一个实施例中，使用体内克隆方法进行成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸的组装。体内克隆方法可以是本领域中已知的任何体内克隆方法。体内克隆方法可以是同源重组介导的克隆方法。在本文提供的方法中使用的体内克隆方法可以选自大肠杆菌(reca依赖性的、reca非依赖性的或red/et依赖性的)同源重组、重叠延伸pcr和重组(oepr)克隆、酵母同源重组以及芽孢杆菌中的转化相关的重组(tar)克隆和基因组装，如在津下健治(tsuge,kenji)等人的枯草芽孢杆菌质粒中具有设计的顺序和取向的多个dna片段的一步组装(onestepassemblyofmultiplednafragmentswithadesignedorderandorientationinbacillussubtilisplasmid)核酸研究(nucleicacidsresearch)中，第31,21卷(2003):e133(其通过引用并入本文)中描述的。应用本文提供的组合物和组装方法可以用于构建任何所需的组装体，诸如质粒、载体、基因、代谢途径、最小基因组、部分基因组、基因组、染色体、染色体外核酸，例如细胞质细胞器，诸如线粒体(动物)和叶绿体和质体(植物)中的细胞器等。本文提供的组合物和组装方法可以用于生成核酸分子的文库，以及使用如由其生成的经修饰的全部或部分核酸分子的方法。文库可以含有2个或更多个变体，并且所述多个变体可以针对具有期望的特性的成员进行筛选，该期望的特性诸如期望的感兴趣产品的高生产水平、感兴趣产品的增强的功能性或降低的功能性(如果这是有利的)。此类筛选可以通过高通量方法进行，该高通量方法可以是如本文提供的机器人/自动化方法。本公开还进一步包含通过本文提供的组合物和组装方法制备的产品，例如，所得的组装的合成基因或基因组(合成的或天然存在的)和修饰的优化的基因和基因组，及其用途。本文提供的组合物和组装方法可以具有多种应用，允许例如设计用于合成感兴趣的所需产物的途径或者优化其基因产物在所需产物的合成或表达中起作用的一或多个序列。本文提供的组合物和组装方法还可以用于生成基因或其表达的优化的序列，或组合由基因编码的蛋白质的一或多个功能结构域或基序。该基因可以是生物化学或代谢途径的一部分。生物化学或代谢途径可以产生感兴趣的所需产物。感兴趣的所需产物可以是任何可以在细胞培养物、真核或原核表达系统或转基因动物或植物中组装的分子。因此，由本文提供的确定性组装方法产生的核酸分子或其文库可以用于多种环境中以产生感兴趣的所需产物。在一些情况下，感兴趣的产物可以是小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、醇等。例如，感兴趣的产物或生物分子可以是任何初级或次级细胞外代谢物。初级代谢物尤其可以是乙醇、柠檬酸、乳酸、谷氨酸、谷氨酸盐、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和其他氨基酸、维生素、多糖等。次级代谢物尤其可以是抗生素化合物如青霉素，或免疫抑制剂如环孢菌素a，植物激素如赤霉素，他汀类药物如洛伐他汀，杀真菌剂如灰黄霉素等。感兴趣的产物或生物分子也可以是由宿主细胞产生的任何细胞内组分，诸如：微生物酶，包含：过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖异构酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、乳糖酶、链激酶和许多其他酶。细胞内组合还可以包含重组蛋白质，诸如：胰岛素、乙肝疫苗、扰动素、粒细胞集落刺激因子、链激酶等。感兴趣的产物也可以指感兴趣的蛋白质。途径组装在一个实施例中，本文提供的组合物和方法用于组装基因或其变体。该基因或其变体可以编码作为代谢或生物化学途径的一部分的蛋白质。变体可以是所述基因的密码子优化版本或突变版本。代谢或生物化学途径可以产生如本文提供的感兴趣的产物。在一个实施例中，基因序列或其变体可以作为有效负载序列存在于如本文提供的插入多核苷酸中。成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以包括这样的序列，使得当与所述插入多核苷酸组装时，所述序列可以使用如本文提供的基因编辑方法来促进靶向并插入宿主细胞内的遗传元件(例如，基因组、质粒等)中的基因座。基因座可以是特定基因座或随机基因座。可替代地，成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以包括这样的序列，当与所述插入多核苷酸组装时，所述序列可以用于促进所得的组装体与使用本文提供的方法生成的其他组装体的进一步组装。其他组装体可以包括存在于相同代谢或生物化学途径中的一或多个另外的基因，并且以这种方式促进所述代谢或生物化学途径的组装。所有的基因或其变体可以使用本文所述的重叠序列的技术在特定代谢或生物化学途径的单一载体上组装，或者所述途径的每个成员的独立载体可以通过在连续转化混合物中混合每个成员的载体来使用。第一多核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸的组装可以使用本文提供的组装重叠方法经由存在于每一多核苷酸中的组装重叠序列来完成。成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以进一步包括如本文提供的载体重叠序列，以促进组装到合适的载体中。载体可以是复制的质粒。在一些情况下，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸可以进一步包括调节元件或控制元件的序列，该调节元件或控制元件可以控制基因或其变体或由此编码的蛋白质的方面，诸如其转录、翻译、溶解度或降解。调节元件或控制元件可以是启动子、终止子、溶解度标签、降解标签或降解决定子。在另一个实施例中，该基因序列或其变体跨过一对第一多核苷酸和第二多核苷酸和位于其间的插入多核苷酸分布，或跨过第一多核苷酸或第二多核苷酸和位于其间的插入多核苷酸分布。通过在每种多核苷酸上合适的组装重叠片段，含有所有多核苷酸的混合物可以使用如本文提供的重叠组装在单个反应混合物中以正确的顺序组装。所得到的将是该基因或其变体的全长编码序列。成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以进一步包括这样的序列，使得当与所述插入多核苷酸组装时，该序列可以使用如本文提供的基因编辑方法来促进靶向并插入宿主细胞内的遗传元件(例如，基因组、质粒等)中的基因座。基因座可以是特定基因座或随机基因座。可替代地，成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以进一步包括这样的序列，当与所述插入多核苷酸组装时，该序列可以用于促进所得的组装与使用本文提供的方法生成的其他组装体的进一步组装。其他组装体可以包括存在于相同代谢或生物化学途径中的一或多个另外的基因，并且以这种方式促进所述代谢或生物化学途径的组装。所有的基因或其变体可以使用本文所述的重叠序列的技术在特定代谢或生物化学途径的单一载体上组装，或者所述途径的每个成员的独立载体可以通过在连续转化混合物中混合每个成员的载体来使用。成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以进一步包括如本文提供的载体重叠序列，以促进组装到合适的载体中。载体可以是复制的质粒。在一些情况下，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸可以进一步包括调节元件或控制元件的序列，该调节元件或控制元件可以控制基因或其变体或由此编码的蛋白质的方面，诸如其转录、翻译、溶解度或降解。调节元件或控制元件可以是启动子、终止子、溶解度标签、降解标签或降解决定子。在又另一个实施例中，本文提供的组合物和方法用于组装或组合编码靶蛋白质的基序或结构域的核酸序列。编码靶蛋白质的特定基序或结构域的核酸序列可以跨过一对第一多核苷酸和第二多核苷酸和位于其间的插入多核苷酸分布，或跨过第一多核苷酸或第二多核苷酸和位于其间的插入多核苷酸分布。编码靶蛋白质的特定基序或结构域的核酸序列可以存在于第一多核苷酸上，而靶蛋白质的第二基序或结构域可以存在于第二多核苷酸上，并且插入多核苷酸可以用于使用存在于每一多核苷酸上的组装重叠序列和如本文提供的重叠组装方法连接靶蛋白质的所述第一和第二基序或结构域。在一些情况下，插入多核苷酸可以包括第一和/或第二基序或结构域的一部分。在一些情况下，插入多核苷酸可以包括靶蛋白质的第三基序或结构域。成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以进一步包括这样的序列，使得当与所述插入多核苷酸组装时，该序列可以使用如本文提供的基因编辑方法来促进靶向并插入宿主细胞内的遗传元件(例如，基因组、质粒等)中的基因座。基因座可以是特定基因座或随机基因座。成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸可以进一步包括如本文提供的载体重叠序列，以促进组装到合适的载体中。载体可以是复制的质粒。基因编辑如本文所述，可以将包括成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及插入多核苷酸的组合物组装到包括第一多核苷酸和第二多核苷酸且其间具有插入多核苷酸的核酸的文库中，该核酸的文库随后可以用于修饰宿主细胞的遗传内容物。如本文所提供的，核酸的文库可以包括控制元件(例如，启动子、终止子、溶解度标签、降解标签或降解决定子)、修饰形式的基因(例如，具有所需snp的基因)、反义核酸和/或作为代谢或生物化学途径的一部分的一或多种基因。在一个实施例中，修饰需要宿主细胞的基因编辑。基因编辑可以需要编辑宿主细胞的基因组和/或存在于宿主细胞中的分离的遗传元件，诸如例如质粒或粘粒。可以利用使用如本文提供的方法和组合物生成的核酸组装体的基因编辑方法可以是本领域中已知的任何基因编辑方法或系统，并且可以基于希望进行基因编辑的宿主进行选择。基因编辑的非限制性示例包含同源重组、crispr、talens、fok或其他核酸内切酶。同源重组在一个实施例中，基因编辑方法是本领域中已知的基于同源重组的方法。基于同源重组的方法可以选自单交换同源重组、双交换同源重组或λred重组工程。除了该实施例外，一对第一多核苷酸和第二多核苷酸中的第一多核苷酸和第二多核苷酸使得各自包括指向或互补于宿主细胞的核酸元件(例如，基因组、质粒或粘粒)中的所需基因座的序列，并且由此将位于其间的插入多核苷酸指向宿主细胞的遗传元件(例如，基因组、粘粒或质粒)中的所需基因座。因此，指向或互补于该对中存在的所需基因座的序列可以用于确定将被靶向编辑的基因组、粘粒或质粒中的位置。如图1中举例说明的，指向或互补于所需基因座的序列可以位于或朝向第一多核苷酸的近端或5'端，而在第二多核苷酸中，指向或互补于所需基因座的序列可以位于或接近远端或3'端。在第一多核苷酸中，指向或互补于所需基因座的序列可以位于第一多核苷酸中存在的组装重叠序列的上游和载体重叠序列的下游(如果存在的话)。在第二多核苷酸中，指向或互补于所需基因座的序列可以位于第二多核苷酸中存在的组装重叠序列的下游和载体重叠序列的上游(如果存在的话)。在一个实施例中，对于含有成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸的池中的每对，与一对中的所需基因座互补的序列与所述池中的彼此对相比与宿主细胞中的不同靶基因座互补。在另一个实施例中，对于含有成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸的池中的每对，与一对中的所需基因座互补的序列与所述池中的彼此对相比与宿主细胞中的相同靶基因座互补。环入/环出(loop-in/loop-out)在一些实施例中，本公开教导了从宿主生物体中环出dna的所选区域的方法。环出方法可以如在中岛(nakashima)等人.2014“通过基因组编辑和基因沉默的细菌细胞工程改造(bacterialcellularengineeringbygenomeeditingandgenesilencing).”国际分子科学杂志(int.j.mol.sci.)15(2),2773-2793中所描述的。环出缺失技术在本领域中是已知的，并在(蒂尔(tear)等人.2014“切除不稳定的人工基因特异性反向重复序列介导大肠杆菌的无瘢痕基因缺失(excisionofunstableartificialgene-specificinvertedrepeatsmediatesscar-freegenedeletionsinescherichiacoli.)”应用生物化学与生物技术(appl.biochem.biotech.)175:1858-1867)中描述。在本文提供的方法中使用的环出方法可以使用单交换同源重组或双交换同源重组进行。在一个实施例中，环出所选区域可能需要使用单交换同源重组。在一个实施例中，本文提供的组合物包括成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸(例如，左/右同源性臂)、插入多核苷酸和载体，使得使用如本文提供的体外或体内组装方法将成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸和载体组装生成环出载体。在一个实施例中，在环出载体与宿主细胞基因组之间使用单交换同源重组以环入所述载体。载体可以包括标记物，该标记物有助于在环入步骤后选择环出的克隆。在另一个实施例中，在环出的载体与宿主细胞基因组之间使用双交换同源重组以便整合所述载体。环出的载体内的插入序列可以用这样的序列来设计，该序列是现有的或引入的邻近宿主序列的同向重复，使得该同向重复位于预定进行循环和缺失的dna区域的侧面。插入序列可以进一步包括有助于选择环出克隆的标记物。一旦插入，含有环出质粒或载体的细胞可以被反向选择以缺失选择区域。在本文提供的一个方面中，使用本文提供的组合物和/或方法生成的多核苷酸或多核苷酸文库可以用于可能需要使用来自一或多个重组系统的蛋白质的集合的基因编辑方法。所述重组系统对于微生物宿主细胞可以是内源的或者可以被异源引入。一或多个异源重组系统的蛋白质的集合可以作为核酸(例如，作为质粒、线性dna或rna、或整合子)被引入，并被整合到宿主细胞的基因组中或从染色体外元件被稳定表达。一或多个异源重组系统的蛋白质的集合可以作为rna被引入并被宿主细胞翻译。一或多个异源重组系统的蛋白质的集合可以作为蛋白质被引入到宿主细胞中。一或多个重组系统的蛋白质的集合可以来自λred重组系统、recet重组系统、red/et重组系统、来自λred重组系统、recet重组系统或red/et重组系统的蛋白质的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。来自recet重组系统的重组方法和/或蛋白质的集合可以是如在张·y(zhangy.),布赫霍尔茨·f(buchholzf.),穆尔·j.p.p.(muyrersj.p.p.)和斯蒂沃特·a.f.(stewarta.f.)“利用大肠杆菌中的重组进行dna工程改造的新逻辑(anewlogicfordnaengineeringusingrecombinationine.coli.)”自然遗传学(naturegenetics)20(1998)123-128；穆尔·j.p.p.,张·y.,泰斯塔·g(testa,g.),斯蒂沃特·a.f.“通过et重组快速修饰细菌人工染色体(rapidmodificationofbacterialartificialchromosomesbyet-recombination)”核酸研究27(1999)1555-1557；张·y.,穆尔·j.p.p.,泰斯塔·g和斯蒂沃特·a.f.“在大肠杆菌中通过同源重组进行dna克隆(dnacloningbyhomologousrecombinationine.coli.)”自然生物技术18(2000)1314-1317和穆尔·jp等人,“技术：重组工程——用于克隆和操作dna的新选择(techniques:recombinogenicengineering--newoptionsforcloningandmanipulatingdna)”趋势生物化学科学(trendsbiochemsci.)2001年5月；26(5):325-31(其通过引用并入本文)中描述的那些中的任何一种。来自red/et重组系统的蛋白质的集合可以是如在里韦罗·穆勒·阿道夫(rivero-müller,adolfo)等人“通过red/et重组的辅助大片段插入(alfire)——用于大片段重组工程的替代和增强的方法(assistedlargefragmentinsertionbyred/et-recombination(alfire)--analternativeandenhancedmethodforlargefragmentrecombineering)”,核酸研究,第35卷,10(2007):e78(其通过引用并入本文)中描述的任何蛋白质。λred介导的基因编辑如本文所提供的，如本文所述的基因编辑可以使用λred介导的同源重组进行，如达岑科(datsenko)和万纳(wanner),美国国家科学院院刊97:6640-6645(2000)(其内容通过引用以其整体并入本文)所述。为了使用λred重组工程系统修饰靶dna，可以将线性供体dna底物(dsdna或ssdna)电穿孔到表达来自λred重组系统的蛋白质的集合的大肠杆菌中。来自λred重组系统的蛋白质的集合可以包括exo蛋白质、β蛋白质或gam蛋白质或其任意组合。gam可以防止内源性recbcd和sbccd核酸酶两者消化被引入到微生物宿主细胞中的线性供体dna(dsdna或ssdna)，而exo是一种5'→3'dsdna依赖性核酸外切酶，其可以从5'端开始降解线性dsdna并生成2种可能的产物(即具有单链3'突出物的部分dsdna双链体或其整个互补链被降解的ssdna)，并且β可以保护由exo产生的ssdna并促进其退火至细胞中的互补ssdna靶。如在https://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering(其内容通过引用并入本文)所述，对于基于λred的与ssdna寡底物的重组可能需要β表达。线性供体dna底物(dsdna或ssdna)可以是使用本文提供的方法和组合物生成的包括一对第一多核苷酸和第二多核苷酸以及位于其间的插入多核苷酸的组装体。该对第一多核苷酸和第二多核苷酸可以包括基因组靶向序列，其将所述供体dna底物靶向到宿主细胞的基因组中的特定基因座。然后，这些酶催化底物与靶dna序列的同源重组。与其中遗传变化在试管中发生的限制性酶克隆相比，这意味着克隆在体内发生。供体dna底物仅需要与用于重组的靶位点有约50个核苷酸的同源性。如在https://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering所描述的，是否使用线性dsdna底物或ssdna底物可以取决于实验的目标。dsdna底物对于大于大约20个核苷酸的插入或缺失可能是最佳的，而ssdna底物对于仅几个碱基对的点突变或改变可能是最佳的。可以使用本文提供的组合物和方法来制备dsdna底物，使得成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与相对末端上的靶向的插入位点约50个碱基对的同源性。底物中存在的dsdna插入多核苷酸可以包含：大的插入或缺失，包含可选择的dna片段，诸如抗生素抗性基因，以及非选择性的dna片段，诸如基因替换和标签。还可以使用本文提供的组合物和方法来制备ssdna底物，使得成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与相对末端上的靶向的插入位点约50个碱基对的同源性，并且可以具有位于序列的中心(即插入多核苷酸内)的所需改变。ssdna底物可以比dsdna更有效，其中重组频率在0.1％至1％之间，并且可以通过设计避免或甲基导向的错配修复(mmr)系统的底物而使该ssdna底物增加至高达25-50％。mmr的工作是纠正在dna复制期间出现的dna错配。可以通过以下来避免mmr的活化：1)使用具有被敲除的关键mmr蛋白质的细菌的菌株，或2)特殊设计的ssdna底物以避免mmr：1)具有失活的mmr的大肠杆菌：使用具有失活的mmr的大肠杆菌肯定是两种选择中较容易的一种，但这些细胞易于突变，并且其基因组可能具有更多非预期的变化。2)设计避免mmr活化的ssdna底物：在一个实施例中，引入了编辑位点的6个碱基对处或6个碱基对之内的c/c错配。在另一个实施例中，所需改变的两侧是摆动密码子中的4-5个沉默改变，即改变相邻的4-5个密码子的第三个碱基对，这改变了核苷酸序列，但不改变翻译的蛋白质的氨基酸序列。这些变化可以是所需变化的5'或3'。在一个实施例中，使用本文提供的组合物和/或方法生成的多核苷酸或多核苷酸文库可以用于基因编辑方法，该方法在已经稳定地表达λred重组基因的微生物宿主细胞中实施，诸如在https://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering(其内容通过引用并入本文)描述的dy380菌株。包括λred重组系统的组分并且可以用于生成使用本文提供的富集方法进行基因分型的生物体的其他细菌菌株(例如，cs-seq或sg-seq)可以在托马森(thomason)等人(重组工程：使用同源重组的细菌中的基因工程(recombineering:geneticengineeringinbacteriausinghomologousrecombination),分子生物学实验室指南，106:v:1.16:1.16.1–1.16.39)和莎兰(sharan)等人(重组工程：一种基于同源重组的基因工程方法(recombineering:ahomologousrecombination-basedmethodofgeneticengineering).自然协议(natureprotocols).2009；4(2):206-223)(其每一个的内容通过引用并入本文)中找到。如本文所提供的，可以在实施本领域中已知的和/或本文提供的任何编辑方法之前将λred重组系统的蛋白质的集合引入到微生物宿主细胞中。λred重组系统的每种蛋白质的基因可以被引入到核酸(例如，作为质粒、线性dna或rna、mini-λ、λred前噬菌体或整合子)上，并且被整合到宿主细胞的基因组中或从染色体外元件表达。在一些情况下，λred重组系统的每种组分(即，exo、β、gam或其组合)都可以作为rna被引入并被宿主细胞翻译。在一些情况下，λred重组系统的每种组分(即，exo、β、gam或其组合)可以作为蛋白质被引入到宿主细胞中。在一个实施例中，用于λred重组系统的蛋白质的集合的基因被引入到质粒上。质粒上λred重组系统的蛋白质的集合可以在启动子(诸如例如，内源性噬菌体pl启动子)的控制下。在一个实施例中，质粒上λred重组系统的蛋白质的集合在诱导型启动子的控制下。诱导型启动子可以通过添加或耗尽试剂或通过改变温度来诱导。在一个实施例中，质粒上λred重组系统的蛋白质的集合在诱导型启动子诸如iptg诱导型lac启动子或阿拉伯糖诱导型pbad启动子的控制下。表达用于λred重组系统的蛋白质的集合的基因的质粒也可以表达与特定启动子相关联的阻遏物，诸如例如，分别与iptg诱导型lac启动子、阿拉伯糖诱导型pbad启动子和内源性噬菌体pl启动子相关联的laci、arac或ci857阻遏物。在一个实施例中，用于λred重组系统的蛋白质的集合的基因被引入到mini-λ上，该mini-λ是噬菌体dna的有缺陷的非复制的圆形片段，当被引入到微生物宿主细胞中时，其被整合到基因组中，如在https://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering(其内容通过引用并入本文)所述。在一个实施例中，用于λred重组系统的蛋白质的集合的基因被引入到λred前噬菌体上，这可以允许λred重组系统稳定整合到微生物宿主细胞中，诸如在https://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering(其内容通过引用并入本文)所述。crispr介导的基因编辑在本文提供的一个方面中，宿主细胞的遗传元件(例如，基因组、粘粒或质粒)可以通过crispr修饰。crispr/cas系统是一种原核免疫系统，其赋予对外源遗传元件(诸如在质粒和噬菌体中存在的遗传元件)的抗性，并提供一种获得性免疫形式。crispr代表成簇的规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)，并且cas代表crispr相关联系统，并且指与crispr复合物相关联的小cas基因。crispr-cas系统被最广泛地表征为1类系统或2类系统。这两个系统之间的主要区别特征是cas-效应子模块的性质。1类系统需要在复合物(被称为“级联复合物”)中组装多种cas蛋白质来介导扰动，而2类系统使用大的单一cas酶来介导扰动。根据特定cas蛋白质的存在，将1类系统和2类系统各自进一步分为多种crispr-cas类型。例如，1类系统被分为以下三种类型：i型系统，其含有cas3蛋白质；iii型系统，其含有cas10蛋白质；和推定的iv型系统，其含有csf1蛋白质(一种cas8样蛋白质)。2类系统通常不如1类系统常见，并且被进一步分为以下三种类型：ii型系统，其含有cas9蛋白质；v型系统，其含有cas12a蛋白质(以前被称为cpf1，并且本文中被称为cpf1)、cas12b(以前被称为c2c1)、cas12c(以前被称为c2c3)、cas12d(以前被称为casy)和cas12e(以前被称为casx)；和vi型系统，其含有cas13a(以前被称为c2c2)、cas13b和cas13c。毕佐查(pyzocha)等人,acs化学生物学(acschemicalbiology)，第13(2)卷，第347-356页。在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的crispr-cas系统是2类系统。在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的crispr-cas系统是ii型系统、v型系统或vi型2类系统。在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的crispr-cas系统选自cas9、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas13a、cas13b、cas13c或其同源物、直系同源物或旁系同源物。在本文公开的方法中使用的crispr系统包括cas效应子模块，该cas效应子模块包括一或多种核酸导向的crispr相关联(cas)核酸酶，在本文中被称为cas效应子蛋白质。在一些实施例中，cas蛋白质可以包括一或多个核酸酶结构域。cas效应子蛋白质可以靶向单链或双链核酸分子(例如，dna或rna核酸)，并且可以生成双链或单链断裂。在一些实施例中，cas效应子蛋白质是野生型或天然存在的cas蛋白质。在一些实施例中，cas效应子蛋白质是突变体cas蛋白质，其中在wt或天然存在的cas蛋白质(例如，亲本cas蛋白质)中进行一或多个突变、插入或缺失，以产生与亲本cas蛋白质相比具有一或多个改变的特性的cas蛋白质。在一些情况下，cas蛋白质是野生型(wt)核酸酶。在本公开中使用的合适的cas蛋白质的非限制性示例包含c2cl、c2c2、c2c3、cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也被称为csn1和csx12)、cas10、cpfl、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm1、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx100、csx16、csax、csx3、csxl、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、mad1-20、smcsm1、其同源物、其直系同源物、其变体、其突变体或其修饰形式。合适的核酸导向的核酸酶(例如cas9)可以来自源自以下属的生物体，该属包含但不限于：硫微螺菌属(thiomicrospira)、琥珀酸弧菌属(succinivibrio)、暂定属(candidatus)、卟啉单胞菌属(porphyromonas)、酸单球菌(acidomonococcus)、普氏菌属(prevotella)、史密斯氏菌属(smithella)、莫拉氏菌属(moraxella)、互养菌属(synergistes)、弗朗西斯氏菌属(francisella)、钩端螺旋体属(leptospira)、链型杆菌属(catenibacterium)、坎德勒氏菌属(kandleria)、梭菌属(clostridium)、多尔氏菌属(dorea)、粪球菌属(coprococcus)、肠球菌属(enterococcus)、嗜果糖乳酸菌属(fructobacillus)、魏斯氏菌属(weissella)、片球菌属(pediococcus)、棒杆菌属(corynebacter)、萨特氏菌属(sutterella)、军团菌属(legionella)、密螺旋体属(treponema)、罗斯氏菌属(roseburia)、产线菌属(filifactor)、真杆菌属(eubacterium)、链球菌属(streptococcus)、乳酸杆菌属(lactobacillus)、支原体属、拟杆菌属(bacteroides)、弗维菌属(flaviivola)、黄杆菌属(flavobacterium)、单丝壳属(sphaerochaeta)、固氮螺菌属(azospirillum)、葡糖醋杆菌属(gluconacetobacter)、奈瑟氏菌属(neisseria)、罗斯氏菌属(roseburia)、细小棒菌属(parvibaculum)、葡萄球菌属(staphylococcus)、硝酸盐破坏菌(nitratifractor)、支原体属、脂环酸芽孢杆菌属(alicyclobacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacilus)、芽孢杆菌属(bacillus)、拟杆菌门(bacteroidetes)、短芽孢杆菌属、肉杆菌属(carnobacterium)、clostridiaridium、梭菌属、脱硫弯曲杆菌(desulfonatronum)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、创伤球菌属(helcococcus)、纤毛菌属(leptotrichia)、李斯特菌属(listeria)、methanomethyophilus、甲基杆菌属(methylobacterium)、丰祐菌科(opitutaceae)、沼泽杆菌属(paludibacter)、红杆菌属(rhodobacter)、sphaerochaeta、肿块芽孢杆菌属(tuberibacillus)和弯曲菌属(campylobacter)。此类属的生物体的物种可以是如本文中以其他方式所讨论的。合适的核酸导向的核酸酶(例如，cas9)可以来自源自以下门的生物体，该门包含但不限于厚壁菌门(firmicute)、放线菌门(actinobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、变形菌门(proteobacteria)、螺旋体门(spirochates)和软壁菌门(tenericutes)。合适的核酸导向的核酸酶可以来自源自以下纲的生物体，该纲包含但不限于丹毒丝菌纲(erysipelotrichia)、梭菌纲(clostridia)、芽孢杆菌纲(bacilli)、放线菌纲(actinobacteria)、拟杆菌纲(bacteroidetes)、黄杆菌纲(flavobacteria)、α变形杆菌纲(alphaproteobacteria)、β变形杆菌纲(betaproteobacteria)、γ变形杆菌纲(gammaproteobacteria)、δ变形杆菌纲(deltaproteobacteria)、ε变形杆菌纲(epsilonproteobacteria)、螺旋体纲(spirochaetes)和柔膜菌纲(mollicutes)。合适的核酸导向的核酸酶可以来自源自以下目的生物体，该目包含但不限于梭菌目(clostridiales)、乳杆菌目(lactobacillales)、放线菌目(actinomycetales)、拟杆菌目(bacteroidales)、黄杆菌目(flavobacteriales)、根瘤菌目(rhizobiales)、红螺菌目(rhodospirillales)、伯克氏菌目(burkholderiales)、奈瑟菌目(neisseriales)、军团菌目(legionellales)、鹦鹉螺菌目(nautiliales)、弯曲菌目(campylobacterales)、螺旋体目(spirochaetales)、支原体目(mycoplasmatales)和硫发菌目(thiotrichales)。合适的核酸导向的核酸酶可以来自源自以下科的生物体，该科包含但不限于毛螺菌科(lachnospiraceae)、肠球菌科(enterococcaceae)、明串珠菌科(leuconostocaceae)、乳杆菌科(lactobacillaceae)、链球菌科(streptococcaceae)、消化链球菌科(peptostreptococcaceae)、葡萄球菌科(staphylococcaceae)、真杆菌科(eubacteriaceae)、棒杆菌科(corynebacterineae)、拟杆菌科(bacteroidaceae)、黄杆菌属(flavobacterium)、cryomoorphaceae、红菌科(rhodobiaceae)、红螺菌科(rhodospirillaceae)、醋杆菌科(acetobacteraceae)、梭菌科(sutterellaceae)、奈瑟氏菌科(neisseriaceae)、军团菌科(legionellaceae)、鹦鹉螺菌科(nautiliaceae)、弯曲菌科(campylobacteraceae)、螺旋体科(spirochaetaceae)、支原体科(mycoplasmataceae)和弗朗西斯氏菌科(francisellaceae)。适用于本公开的方法、系统和组合物的其他核酸导向的核酸酶(例如，cas9)包含源自以下生物体的核酸导向的核酸酶，该生物体诸如但不限于：硫微螺菌的种xs5(thiomicrospirasp.xs5)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、溶糊精琥珀酸弧菌(succinivibriodextrinosolvens)、候选白蚁甲烷枝原体(candidatusmethanoplasmatermitum)、candidatusmethanomethylophilusalvus、狗口腔卟啉单胞菌(porphyromonascrevioricanis)、嗜鳃黄杆菌(flavobacteriumbranchiophilum)、酸单球菌种(acidomonococcussp.)、毛螺菌科细菌coe1(lachnospiraceaebacteriumcoe1)、短普雷沃氏菌(prevotellabrevis)atcc19188、史密斯氏菌属的种scadc、牛眼莫拉氏菌(moraxellabovoculi)、琼斯氏共生菌(synergistesjonesii)、拟杆菌口腔分类群(bacteroidetesoraltaxon)274、土拉热弗朗西斯氏菌(francisellatularensis)、稻田氏钩端螺旋体莱姆血清变型(leptospirainadaiserovarlymestr.)10、酸单球菌种的晶体结构(5b43)、变异链球菌(s.mutans)、无乳链球菌(s.agalactiae)、类马链球菌(s.equisimilis)、血链球菌(s.sanguinis)、肺炎链球菌(s.pneumonia)；空肠弯曲杆菌(c.jejuni)、大肠弯曲杆菌(c.coli)、盐水硝酸盐破坏菌(n.salsuginis)、弧后硝酸盐破坏菌(n.tergarcus)；耳葡萄球菌(s.auricularis)、肉葡萄球菌(s.carnosus)；脑膜炎奈瑟氏菌(n.meningitides)、淋病奈瑟氏菌(n.gonorrhoeae)；单核细胞增多性李斯特菌(l.monocytogenes)、伊氏李斯特菌(l.ivanovii)；肉毒梭菌(c.botulinum)、艰难梭菌(c.difficile)、破伤风梭菌(c.tetani)、索氏梭菌(c.sordellii)；土拉热弗朗西斯氏菌1、易北普雷沃氏菌(prevotellaalbensis)、毛螺旋菌科细菌(lachnospiraceaebacterium)mc20171、瘤胃产氢丁酸弧菌(butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门细菌(peregrinibacteriabacterium)gw2011_gwa2_33_10、俭菌总门细菌(parcubacteriabacterium)gw2011_gwc2_44_17、史密斯氏菌属的种scadc、小基因组菌总门(microgenomates)、氨基酸球菌属的种(acidaminococcussp.)bv3l6、毛螺旋菌科细菌(lachnospiraceaebacterium)ma2020、候选白蚁甲烷枝原体、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、牛眼莫拉氏菌237、稻田钩端螺旋体(leptospirainadai)、毛螺旋菌科细菌(lachnospiraceaebacterium)nd2006、狗口腔卟啉单胞菌3、解糖胨普雷沃氏菌(prevotelladisiens)、猕猴卟啉单胞菌(porphyromonasmacacae)、链型杆菌属(catenibacteriumsp.)cag:290、犊坎德勒氏菌(kandleriavitulina)、梭菌目细菌(clostridialesbacterium)ka00274、毛螺菌科细菌(lachnospiraceaebacterium)3-2、长链多尔氏菌(dorealongicatena)、灵巧粪球菌(coprococcuscatus)gd/7、哥伦比亚肠球菌(enterococcuscolumbae)dsm7374、果聚糖芽孢杆菌属的种(fructobacillussp.)efb-n1、耐盐魏斯氏菌(weissellahalotolerans)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、弯曲乳杆菌(lactobacilluscurvatus)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、费斯莫尔德乳杆菌(lactobacillusversmoldensis)和龈沟产线菌(filifactoralocis)atcc35896。参见，美国专利号8,697,359；8,771,945；8,795,965；8,865,406；8,871,445；8,889,356；8,895,308；8,906,616；8,932,814；8,945,839；8,993,233；8,999,641；9,822,372；9,840,713；美国专利申请号13/842,859(us2014/0068797a1)；9,260,723；9,023,649；9,834,791；9,637,739；美国专利申请号14/683,443(us2015/0240261a1)；美国专利申请号14/743,764(us2015/0291961a1)；9,790,490；9,688,972；9,580,701；9,745,562；9,816,081；9,677,090；9,738,687；美国申请号15/632,222(us2017/0369879a1)；美国专利申请号15/631,989；美国专利申请号15/632,001和美国专利号9,896,696，其每一个通过引用并入本文。在一些实施例中，cas效应子蛋白质包含一或多种以下活性：切口酶活性，即切割核酸分子的单链的能力；双链核酸酶活性，即切割双链核酸的两条链并产生双链断裂的能力；核酸内切酶活性；核酸外切酶活性；和/或解旋酶活性，即解开双链核酸的螺旋结构的能力。在本公开的方面中，术语“导向核酸”是指这样的多核苷酸，其包括1)能够与靶序列杂交的导向序列(在本文中被称为“靶向片段”)和2)能够与如本文所述的核酸导向的核酸酶相互作用(单独或与tracrrna分子组合)的支架序列(在本文中被称为“支架片段”)。导向核酸可以是dna。导向核酸可以是rna。导向核酸可以包括dna和rna两者。导向核酸可以包括修饰的非天然存在的核苷酸。在其中导向核酸包括rna的情况下，rna导向核酸可以由多核苷酸分子(诸如使用本文提供的方法和组合物生成的质粒、线性构建体)上的dna序列编码。在一些实施例中，本文所述的导向核酸是rna导向核酸(“导向rna”或“grna”)，并且包括靶向片段和支架片段。在一些实施例中，grna的支架片段被包括在一个rna分子中，并且靶向片段被包括在另一个单独的rna分子中。此类实施例在本文中被称为“双分子grna”或“两分子grna”或“双grna”。在一些实施例中，grna是单个rna分子，并且在本文中被称为“单导向rna”或“sgrna”。术语“导向rna”或“grna”包括在内，指两分子导向rna和sgrna两者。在一个实施例中，使用本文提供的方法和组合物生成的包括一对第一多核苷酸和第二多核苷酸以及位于其间的插入多核苷酸的组合物是导向rna(grna)。在一些情况下，本文提供的方法用于生成grna的文库。grna的dna靶向片段包括与靶核酸序列中的序列互补的核苷酸序列。因此，grna的靶向片段经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性的方式与靶核酸相互作用，并且靶向片段的核苷酸序列决定grna将结合的靶dna内的位置。当使用合适的比对算法进行最佳比对时，导向序列与其相应的靶序列之间的互补程度为约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多或者大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。可以使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对。在一些实施例中，导向序列的长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、75或更多个核苷酸或者大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、75或更多个核苷酸。在一些实施例中，导向序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20个核苷酸。在各个方面中，导向序列是10-30个核苷酸长。导向序列的长度可以是15-20个核苷酸。导向序列的长度可以是15个核苷酸。导向序列的长度可以是16个核苷酸。导向序列的长度可以是17个核苷酸。导向序列的长度可以是18个核苷酸。导向序列的长度可以是19个核苷酸。导向序列的长度可以是20个核苷酸。使导向rna的支架片段与一或多种cas效应子蛋白质相互作用，以形成核糖核蛋白质复合物(在本文中被称为crispr-rnp或rnp复合物)。导向rna经由上述靶向片段将结合的多肽导向靶核酸序列内的特定核苷酸序列。导向rna的支架片段包括核苷酸的两个段，它们彼此互补并形成双链rna双链体。支架序列内的足以促进可靶向核酸酶复合物的形成的序列可以包含沿支架序列内的两个序列区域(诸如参与形成二级结构的一或两个序列区域)的长度的互补程度。在一些情况下，一或两个序列区域被包括在同一多核苷酸上或被编码在同一多核苷酸上。在一些情况下，一或两个序列区域被包括在单独的多核苷酸上或被编码在单独的多核苷酸上。最佳比对可以通过任何合适的比对算法来确定，并且可以进一步考虑二级结构，诸如一或两个序列区域内的自互补。在一些实施例中，当最佳对比时，在一或两个序列区域之间沿两个序列区域中较短者的长度的互补程度为约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高或者大于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施例中，两个序列区中的至少一个的长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多个核苷酸或者大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多个核苷酸。本主题的grna的支架序列可以包括二级结构。二级结构可以包括假结区域或茎环结构。在一些实例中，导向核酸和核酸导向的核酸酶的相容性至少部分地由导向rna的二级结构区域内或二级结构区域附近的序列确定。在一些情况下，导向核酸与核酸导向的核酸酶的结合动力学部分由支架序列内的二级结构确定。在一些情况下，导向核酸与核酸导向的核酸酶的结合动力学部分地由具有支架序列的核酸序列确定。可以通过扫描与天然cas核酸酶基因座相邻的序列来找到用于grna-cas效应子蛋白质组合的相容性支架序列。换句话说，天然cas核酸酶可以被编码在基因组上相应的相容性导向核酸或支架序列的附近处。核酸导向的核酸酶可以与在核酸酶的内源性宿主内没有发现的导向核酸相容。此类正交导向核酸可以通过经验测试来确定。正交导向核酸可以来自不同的细菌物种，或者可以是合成的或以其他方式被工程改造为非天然存在的。与常见的核酸导向的核酸酶相容的正交导向核酸可以包括一或多个共同特征。共同特征可以包含假结区域外的序列。共同特征可以包含假结区域。共同特征可以包含一级序列或二级结构。通过改变导向序列使得导向序列与靶序列互补，从而允许导向序列与靶序列之间的杂交，可以将导向核酸工程改造以靶向所需的靶序列。具有工程改造的导向序列的导向核酸可以被称为工程改造的导向核酸。工程改造的导向核酸通常是非天然存在的，并且在自然界中未找到。在一些实施例中，本公开提供了一种编码使用本文提供的组合物和方法生成的grna的多核苷酸。在一些实施例中，包括一对第一多核苷酸和第二多核苷酸以及插入多核苷酸的组合物进一步包括表达载体，使得该对第一多核苷酸和第二多核苷酸与插入多核苷酸和表达载体的组装生成包括编码grna的核酸的表达载体。在另一个实施例中，使用本文提供的方法和组合物生成的包括一对第一多核苷酸和第二多核苷酸以及位于其间的插入多核苷酸的组装体是供体dna序列。在一些情况下，本文提供的方法用于生成供体dna序列的文库。在使用同源定向修复(hdr)的crispr基因编辑方法中，供体dna序列可以与导向rna(grna)结合使用。crispr复合物可以导致靶基因内的链断裂，其可以通过使用同源定向修复(hdr)进行修复。可以通过用使用本文提供的方法和组合物生成的供体dna序列共转化宿主细胞来促进hdr介导的修复。供体dna序列可以包括所需的遗传扰动(例如，缺失、插入和/或单核苷酸多态性)以及源自第一多核苷酸和第二多核苷酸的靶向序列。在本实施例中，crispr复合物切割由一或多个grna指定的靶基因。然后，供体dna序列可以用作同源重组机制的模板，以将所需的遗传扰动并入宿主细胞中。供体dna可以是单链的、双链的或双链质粒。供体dna可能缺少pam序列，或包括加扰的、改变或非功能性的pam，以便防止再切割。在一些情况下，供体dna可以含有功能性或未改变的pam位点。供体dna中的突变的或编辑的序列(也位于同源性区域的两侧)防止在突变已经被并入基因组之后被crispr-复合物再次切割。宿主细胞如本文所提供的，使用本文提供的组合物和/或方法生成的核酸构建体的文库可以用于编辑或修饰宿主细胞的遗传元件(例如，基因组、粘粒或质粒)，或者经由将一或多种遗传元件(例如，质粒或粘粒)引入(例如，转化或转导)到所述宿主细胞来工程改造该宿主细胞。基因组工程改造或编辑方法可以适用于其中可以在遗传突变体的群体中鉴定出所需性状的任何生物体。生物体可以是微生物或高等真核生物。因此，如本文中所使用的，术语“微生物”应被广义地理解。它包含但不限于两个原核域细菌和古细菌，以及某些真核真菌和原生生物。然而，在某些方面，“高等”真核生物诸如昆虫、植物和动物可以用于本文教导的方法中。合适的宿主细胞包含但不限于：细菌细胞、藻类细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一个说明性的实施例中，合适的宿主细胞包含大肠杆菌(例如，可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰biolabs获得的shuffletm感受态大肠杆菌)。本公开的其他合适的宿主生物体包含棒状杆菌(corynebacterium)属的微生物。在一些实施例中，优选的棒状杆菌菌株/种包括：高效棒状杆菌(c.efficiens)，其中保存型菌株为dsm44549；谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)，其中保存型菌株为atcc13032；以及产氨棒状杆菌(c.ammoniagenes)，其中保存型菌株为atcc6871。在一些实施例中，本公开的优选的宿主是谷氨酸棒状杆菌。棒状杆菌属的合适的宿主菌株，特别是谷氨酸棒状杆菌种的合适的宿主菌株特别是已知的野生型菌株：谷氨酸棒状杆菌atcc13032、醋麸酸棒状杆菌(corynebacteriumacetoglutamicum)atcc15806、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(corynebacteriumacetoacidophilum)atcc13870、栖糖蜜棒杆菌(corynebacteriummelassecola)atcc17965、热产氨棒状杆菌(corynebacteriumthermoaminogenes)fermbp-1539、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)atcc14067、乳酸发酵短杆菌(brevibacteriumlactofermentum)atcc13869和双歧短杆菌(brevibacteriumdivaricatum)atcc14020；以及由其制备的产生l-氨基酸的突变体或菌株，诸如例如产生l-赖氨酸的菌株：谷氨酸棒状杆菌ferm-p1709、黄色短杆菌ferm-p1708、乳酸发酵短杆菌ferm-p1712、谷氨酸棒状杆菌ferm-p6463、谷氨酸棒状杆菌ferm-p6464、谷氨酸棒状杆菌dm58-1、谷氨酸棒状杆菌dg52-5、谷氨酸棒状杆菌dsm5714和谷氨酸棒状杆菌dsm12866。术语“谷氨酸微球菌(micrococcusglutamicus)”也被用于谷氨酸棒状杆菌。在现有技术中，高效棒状杆菌物种的一些代表也已经被称为热产氨棒状杆菌，例如诸如菌株fermbp-1539。在一些实施例中，本公开的宿主细胞是真核细胞。合适的真核宿主细胞包含但不限于：真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞。合适的真菌宿主细胞包含但不限于：子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、半知菌门(deuteromycota)、接合菌门(zygomycota)、不完全菌类(fungiimperfecti)。某些优选的真菌宿主细胞包含酵母细胞和丝状真菌细胞。合适的丝状真菌宿主细胞包含例如真菌亚门和卵菌亚门的任何丝状形式。(参见，例如，霍克索斯(hawksworth)等人，于恩索斯(ainsworth)和毕丝巴(bisby)的真菌词典，第8版，1995年，cab国际，大学出版社，英国剑桥(inainsworthandbisby'sdictionaryofthefungi,8thedition,1995,cabinternational,universitypress,cambridge,uk)，其通过引用并入本文)。丝状真菌的特征在于营养菌丝体，其细胞壁由几丁质、纤维素和其他复杂的多糖组成。丝状真菌宿主细胞在形态上不同于酵母。在某些说明性的但非限制性的实施例中，丝状真菌宿主细胞可以是下述物种的细胞：绵霉属(achlya)、支顶孢属(acremonium)、曲霉属(aspergillus)、短梗霉属(aureobasidium)、烟管霉属(bjerkandera)、拟蜡菌属(ceriporiopsis)、头孢霉属(cephalosporium)、金孢属(chrysosporium)、旋孢腔菌属(cochliobolus)、棒囊壳属(corynascus)、隐丛赤壳属(cryphonectria)、隐球菌属(cryptococcus)、鬼伞属(coprinus)、革盖菌属(coriolus)、色二孢属(diplodia)、恩多蒂斯属(endothis)、镰刀菌属(fusarium)、赤霉菌属(gibberella)、粘帚霉属(gliocladium)、腐质霉属(humicola)、肉座菌属(hypocrea)、毁丝霉属(myceliophthora)(例如，嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila))、毛霉菌属(mucor)、脉孢菌属(neurospora)、青霉菌属(penicillium)、柄孢壳菌属(podospora)、射脉菌属(phlebia)、瘤胃壶菌属(piromyces)、梨孢属(pyricularia)、根毛霉属(rhizomucor)、根霉属(rhizopus)、裂褶菌属(schizophyllum)、柱顶孢霉属(scytalidium)、孢子丝菌属(sporotrichum)、踝节菌属(talaromyces)、热子囊菌属(thermoascus)、梭孢壳属(thielavia)、栓菌属(tramates)、弯颈霉属(tolypocladium)、木霉属(trichoderma)、轮枝孢属(verticillium)、草菇属(volvariella)，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。合适的酵母宿主细胞包含但不限于：假丝酵母属(candida)、汉逊酵母属(hansenula)、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(pichia)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)和耶氏酵母属(yarrowia)。在一些实施例中，该酵母细胞是多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、卡尔斯伯酵母(saccaromycescarlsbergensis)、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)、诺地酵母(saccharomycesnorbensis)、克鲁维酵母(saccharomyceskluyveri)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(pichiafinlandica)、嗜海藻糖毕赤酵母(pichiatrehalophila)、考达毕赤酵母(pichiakodamae)、膜醭毕赤酵母(pichiamembranaefaciens)、幸运毕赤酵母(pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(pichiathermotolerans)、萨利毕赤酵母(pichiasalictaria)、松栎毕赤酵母(pichiaquercuum)、皮杰普氏毕赤酵母(pichiapijperi)、树干毕赤酵母(pichiastipitis)、嗜甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、安格斯毕赤酵母(pichiaangusta)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(candidaalbicans)或解脂耶罗威亚酵母(yarrowialipolytica)。在某些实施例中，宿主细胞是藻类细胞，诸如衣藻属(chlamydomonas)(例如，莱茵衣藻(c.reinhardtii))和席藻属(phormidium)(席藻种atcc29409)。在其它实施例中，宿主细胞是原核细胞。合适的原核细胞包含革兰氏阳性、革兰氏阴性和革兰氏变异性细菌细胞。宿主细胞可以是(但不限于)以下物种：农杆菌属(agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌属、鱼腥藻属(anabaena)、倒囊藻属(anacystis)、不动杆菌属(acinetobacter)、酸热菌属(acidothermus)、节杆菌属(arthrobacter)、固氮菌属(azobacter)、芽孢杆菌属(bacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、丁酸弧菌属(butyrivibrio)、布赫纳氏菌属(buchnera)、野油菜(campestris)、弯曲杆菌属(camplyobacter)、梭菌属(clostridium)、棒状杆菌属(corynebacterium)、红硫菌属(chromatium)、粪球菌属(coprococcus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、肠球菌属(enterococcus)、肠杆菌属(enterobacter)、欧文菌属(erwinia)、梭杆菌属(fusobacterium)、栖粪杆菌属(faecalibacterium)、弗朗西斯氏菌属(francisella)、黄杆菌属(flavobacterium)、土芽孢杆菌属(geobacillus)、嗜血杆菌属(haemophilus)、螺旋杆菌属(helicobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、泥杆菌属(ilyobacter)、微球菌属(micrococcus)、微杆菌属(microbacterium)、中间根瘤菌属(mesorhizobium)、甲基杆菌属、甲基杆菌属、分枝杆菌属(mycobacterium)、奈瑟菌属(neisseria)、泛菌属(pantoea)、假单胞菌属(pseudomonas)、原绿球藻属(prochlorococcus)、红细菌属(rhodobacter)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、罗斯氏菌属(roseburia)、红螺菌属(rhodospirillum)、红球菌属(rhodococcus)、栅列藻属(scenedesmus)、链霉菌属(streptomyces)、链球菌属(streptococcus)、聚球藻属(synecoccus)、糖单孢菌属(saccharomonospora)、葡萄球菌属(staphylococcus)、沙雷氏菌属(serratia)、沙门氏菌属(salmonella)、志贺氏菌属(shigella)、嗜热厌氧杆菌属(thermoanaerobacterium)、养障体(tropheryma)、土拉热菌属(tularensis)、蒂梅丘拉(temecula)、嗜热聚球藻属(thermosynechococcus)、热球菌属(thermococcus)、脲原体属(ureaplasma)、黄单胞菌属(xanthomonas)、木杆菌属(xylella)、耶尔森氏菌属(yersinia)和发酵单胞菌属(zymomonas)。在一些实施例中，宿主细胞是谷氨酸棒状杆菌。在一些实施例中，细菌宿主菌株是工业菌株。多种细菌工业菌株是已知的并且适用于本文所述的方法和组合物中。在一些实施例中，细菌宿主细胞是农杆菌种(例如，放射形土壤杆菌(a.radiobacter)、发根农杆菌(a.rhizogenes)、悬钩子农杆菌(a.rubi))、节杆菌种(arthrobacterspecies)(例如，金黄节杆菌(a.aurescens)、柠檬节杆菌(a.citreus)、球形节杆菌(a.globformis)、裂烃谷氨酸节杆菌(a.hydrocarboglutamicus)、迈索尔节杆菌(a.mysorens)、烟草节杆菌(a.nicotianae)、石蜡节杆菌(a.paraffineus)、畏光节杆菌(a.protophonniae)、玫瑰色石蜡节杆菌(a.roseoparaffinus)、硫磺色节杆菌(a.sulfureus)、产脲节杆菌(a.ureafaciens))、芽孢杆菌种(例如，苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)、炭疽芽孢杆菌(b.anthracis)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、枯草杆菌(b.subtilis)、迟缓芽胞杆菌(b.lentus)、环状芽孢杆菌(b.circulars)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(b.lautus)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、短小芽孢杆菌(b.brevis)、坚强芽胞杆菌(b.firmus)、嗜碱芽孢杆菌(b.alkaophius)、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)和解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)。在特定实施例中，宿主细胞将是工业芽孢杆菌属菌株，包含但不限于枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施例中，宿主细胞将是工业梭菌属菌种(例如，丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)、破伤风梭菌e88(c.tetanie88)、象牙海岸梭菌(c.lituseburense)、糖丁酸梭菌(c.saccharobutylicum)、产气荚膜梭菌(c.perfringens)、拜氏梭菌(c.beijerinckii))。在一些实施例中，宿主细胞将是工业棒状杆菌属物种(例如，谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒状杆菌)。在一些实施例中，宿主细胞将是工业埃希氏杆菌属物种(例如，大肠杆菌)。在一些实施例中，宿主细胞将是工业欧文菌属物种(例如，噬夏孢欧文菌(e.uredovora)、胡萝卜软腐欧文菌(e.carotovora)、菠萝欧文氏菌(e.ananas)、草生欧文菌(e.herbicola)、点状欧文菌(e.punctata)、土生欧文菌(e.terreus))。在一些实施例中，宿主细胞是工业泛菌属物种(例如，柠檬泛菌(p.citrea)、成团泛菌(p.agglomerans))。在一些实施例中，宿主细胞将是工业假单胞菌属物种(例如，恶臭假单胞菌(p.putida)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、迈氏假单胞菌(p.mevalonii))。在一些实施例中，宿主细胞将是工业链球菌属物种(例如，类马链球菌、酿脓链球菌(s.pyogenes)、乳房链球菌(s.uberis))。在一些实施例中，宿主细胞将是工业链霉菌属物种(例如，产二素链霉菌(s.ambofaciens)、不产色链霉菌(s.achromogenes)、除虫链霉菌(s.avermitilis)、天蓝色链霉菌(s.coelicolor)、金霉素链霉菌(s.aureofaciens)、金色链霉菌(s.aureus)、杀真菌素链霉菌(s.fungicidicus)、灰色链霉菌(s.griseus)、变铅青链霉菌(s.lividans))。在一些实施例中，宿主细胞将是工业发酵单胞菌属物种(例如，运动发酵单胞菌(z.mobilis)、解脂发酵单胞菌(z.lipolytica))等。在一些实施例中，宿主细胞将是工业埃希氏杆菌属物种(例如，大肠杆菌)。大肠杆菌种的合适的宿主菌株包括：产肠毒素大肠杆菌(etec)、肠致病性大肠杆菌(epec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、尿致病性大肠杆菌(upec)、产生维罗毒素的大肠杆菌、大肠杆菌o157:h7、大肠杆菌o104:h4、大肠杆菌o121、大肠杆菌o104:h21、大肠杆菌k1和大肠杆菌nc101。在一些实施例中，本公开教导了大肠杆菌k12、大肠杆菌b和大肠杆菌c的基因组工程改造。在一些实施例中，宿主细胞可以是大肠杆菌菌株nctc12757、nctc12779、nctc12790、nctc12796、nctc12811、atcc11229、atcc25922、atcc8739、dsm30083、bc5849、bc8265、bc8267、bc8268、bc8270、bc8271、bc8272、bc8273、bc8276、bc8277、bc8278、bc8279、bc8312、bc8317、bc8319、bc8320、bc8321、bc8322、bc8326、bc8327、bc8331、bc8335、bc8338、bc8341、bc8344、bc8345、bc8346、bc8347、bc8348、bc8863和bc8864。在一些实施例中，本公开教导了可以是产生维罗毒素的大肠杆菌(vtec)的宿主细胞，诸如菌株bc4734(o26:h11)、bc4735(o157:h-)、bc4736、bc4737(n.d.)、bc4738(o157:h7)、bc4945(o26:h-)、bc4946(o157:h7)、bc4947(o111:h-)、bc4948(o157:h)、bc4949(o5)、bc5579(o157:h7)、bc5580(o157:h7)、bc5582(o3:h)、bc5643(o2:h5)、bc5644(o128)、bc5645(o55:h-)、bc5646(o69:h-)、bc5647(o101:h9)、bc5648(o103:h2)、bc5850(o22:h8)、bc5851(o55:h-)、bc5852(o48:h21)、bc5853(o26:h11)、bc5854(o157:h7)、bc5855(o157:h-)、bc5856(o26:h-)、bc5857(o103:h2)、bc5858(o26:h11)、bc7832、bc7833(o原始形式：h-)、bc7834(ont:h-)、bc7835(o103:h2)、bc7836(o57:h-)、bc7837(ont:h-)、bc7838、bc7839(o128:h2)、bc7840(o157:h-)、bc7841(o23:h-)、bc7842(o157:h-)、bc7843、bc7844(o157:h-)、bc7845(o103:h2)、bc7846(o26:h11)、bc7847(o145:h-)、bc7848(o157:h-)、bc7849(o156:h47)、bc7850、bc7851(o157:h-)、bc7852(o157:h-)、bc7853(o5:h-)、bc7854(o157:h7)、bc7855(o157:h7)、bc7856(o26:h-)、bc7857、bc7858、bc7859(ont:h-)、bc7860(o129:h-)、bc7861、bc7862(o103:h2)、bc7863、bc7864(o原始形式：h-)、bc7865、bc7866(o26:h-)、bc7867(o原始形式：h-)、bc7868、bc7869(ont:h-)、bc7870(o113:h-)、bc7871(ont:h-)、bc7872(ont:h-)、bc7873、bc7874(o原始形式：h-)、bc7875(o157:h-)、bc7876(o111:h-)、bc7877(o146:h21)、bc7878(o145:h-)、bc7879(o22:h8)、bc7880(o原始形式：h-)、bc7881(o145:h-)、bc8275(o157:h7)、bc8318(o55:k-:h-)、bc8325(o157:h7)和bc8332(ont)、bc8333。在一些实施例中，本公开教导了可以是肠侵袭性大肠杆菌(eiec)的宿主细胞，诸如菌株bc8246(o152:k-:h-)、bc8247(o124:k(72):h3)、bc8248(o124)、bc8249(o112)、bc8250(o136:k(78):h-)、bc8251(o124:h-)、bc8252(o144:k-:h-)、bc8253(o143:k:h-)、bc8254(o143)、bc8255(o112)、bc8256(o28a.e)、bc8257(o124:h-)、bc8258(o143)、bc8259(o167:k-:h5)、bc8260(o128a.c.:h35)、bc8261(o164)、bc8262(o164:k-:h-)、bc8263(o164)和bc8264(o124)。在一些实施例中，本公开教导了可以是产肠毒素大肠杆菌(etec)的宿主细胞，诸如菌株bc5581(o78:h11)、bc5583(o2:k1)、bc8221(o118)、bc8222(o148:h-)、bc8223(o111)、bc8224(o110:h-)、bc8225(o148)、bc8226(o118)、bc8227(o25:h42)、bc8229(o6)、bc8231(o153:h45)、bc8232(o9)、bc8233(o148)、bc8234(o128)、bc8235(o118)、bc8237(o111)、bc8238(o110:h17)、bc8240(o148)、bc8241(o6h16)、bc8243(o153)、bc8244(o15:h-)、bc8245(o20)、bc8269(o125a.c:h-)、bc8313(o6:h6)、bc8315(o153:h-)、bc8329、bc8334(o118:h12)和bc8339。在一些实施例中，本公开教导了可以是肠致病性大肠杆菌(epec)的宿主细胞，诸如菌株bc7567(o86)、bc7568(o128)、bc7571(o114)、bc7572(o119)、bc7573(o125)、bc7574(o124)、bc7576(o127a)、bc7577(o126)、bc7578(o142)、bc7579(o26)、bc7580(ok26)、bc7581(o142)、bc7582(o55)、bc7583(o158)、bc7584(o-)、bc7585(o-)、bc7586(o-)、bc8330、bc8550(o26)、bc8551(o55)、bc8552(o158)、bc8553(o26)、bc8554(o158)、bc8555(o86)、bc8556(o128)、bc8557(ok26)、bc8558(o55)、bc8560(o158)、bc8561(o158)、bc8562(o114)、bc8563(o86)、bc8564(o128)、bc8565(o158)、bc8566(o158)、bc8567(o158)、bc8568(o111)、bc8569(o128)、bc8570(o114)、bc8571(o128)、bc8572(o128)、bc8573(o158)、bc8574(o158)、bc8575(o158)、bc8576(o158)、bc8577(o158)、bc8578(o158)、bc8581(o158)、bc8583(o128)、bc8584(o158)、bc8585(o128)、bc8586(o158)、bc8588(o26)、bc8589(o86)、bc8590(o127)、bc8591(o128)、bc8592(o114)、bc8593(o114)、bc8594(o114)、bc8595(o125)、bc8596(o158)、bc8597(o26)、bc8598(o26)、bc8599(o158)、bc8605(o158)、bc8606(o158)、bc8607(o158)、bc8608(o128)、bc8609(o55)、bc8610(o114)、bc8615(o158)、bc8616(o128)、bc8617(o26)、bc8618(o86)、bc8619、bc8620、bc8621、bc8622、bc8623、bc8624(o158)和bc8625(o158)。在一些实施例中，本公开还教导了可以是志贺氏菌属生物体的宿主细胞，包含福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)、鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii)和宋内志贺氏菌(shigellasonnei)。本公开还适用于多种动物细胞类型，包含哺乳动物细胞，例如人(包含293、wi38、per.c6和鲍氏黑色素瘤细胞)、小鼠(包含3t3、ns0、ns1、sp2/0)、仓鼠(cho、bhk)、猴(cos、frhl、vero)和杂交瘤细胞系。在各种实施例中，可以用于实施本公开的菌株(包含原核菌株和真核菌株两者)容易公开获自多个培养物保藏中心，诸如美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc)、德国微生物菌种保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenandzellkulturengmbh)(dsm))、荷兰微生物菌种保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures)(cbs))以及美国农业研究菌种保藏中心，北部区域研究中心(agriculturalresearchservicepatentculturecollection,northernregionalresearchcenter(nrrl))。在一些实施例中，本公开的方法还可适用于多细胞生物体。例如，该平台可以用于改善农作物的性能。生物体可以包括多种植物，诸如禾本科(gramineae)、非突亚科(fetucoideae)、颇考亚科(poacoideae)、剪股颖属(agrostis)、梯牧草属(phleum)、鸭茅属(dactylis)、高粱属(sorgum)、狗尾草属(setaria)、玉蜀黍属(zea)、稻属(oryza)、小麦属(triticum)、黑麦属(secale)、燕麦属(avena)、大麦属(hordeum)、甘蔗属(saccharum)、早熟禾属(poa)、羊茅属(festuca)、钝叶草属(stenotaphrum)、狗牙根属(cynodon)、薏苡属(coix)、莪利竹族(olyreae)、原禾族(phareae)、菊科(compositae)或豆科(leguminosae)。例如，植物可以是玉米、稻米、大豆、棉花、小麦、黑麦、燕麦、大麦、豌豆、菜豆、小扁豆、花生、地瓜、豇豆、绒毛豆、三叶草、苜蓿、羽扇豆、野豌豆、莲藕、草木樨、紫藤、香豌豆、高粱、小米、葵花、芥花等。类似地，生物体可以包含多种动物，诸如非人类哺乳动物、鱼、昆虫等。宿主细胞的转化在一些实施例中，可以使用多种技术中的任一种将通过本公开的方法生成的构建体引入到宿主细胞中，该技术包含转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或ti介导的基因转移。具体的方法包含磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔(戴维斯·l(davis,l.),迪布纳·m(dibner,m.),巴格利·i(battey,i.),1986“分子生物学的基本方法(basicmethodsinmolecularbiology)”)。其他转化方法包含例如乙酸锂转化和电穿孔。参见，例如，吉茨(gietz)等人,核酸研究27:69-74(1992)；伊托(ito)等人,细菌学杂志(j.bacterol.)153:163-168(1983)；贝克尔(becker)和瓜伦特(guarente),酶学方法(methodsinenzymology)194:182-187(1991)。在一些实施例中，转化的宿主细胞被称为重组宿主菌株。自动化在一个实施例中，将本文提供的组合物和方法并入到用于宿主细胞的基因工程改造的高通量(htp)方法中。在另一个实施例中，本文提供的方法可以是分子工具，其是在pct/us18/36360、pct/us18/36333或wo2017/100377(其每一个出于所有目的通过引用并入本文)中描述的htp分子工具组的一部分，以产生htp遗传设计文库，其尤其源自科学见解和迭代模式识别。本文提供的组合物和方法可以用于生成用于高通量方法的文库，诸如在pct/us18/36360、pct/us18/36333或wo2017/100377中描述的那些。可以使用本文提供的方法生成的文库的示例可以包含但不限于启动子梯、终止子梯、溶解度标签梯或降解标签梯。可以利用本文提供的组合物和方法的高通量基因组工程改造方法的示例可以包含但不限于如在pct/us18/36360、pct/us18/36333或wo2017/100377中所述的启动子交换、终止子(终止)交换、溶解度标签交换、降解标签交换或snp交换。高通量方法可以是自动化的和/或利用机器人和液体处理平台(例如，本领域中已知的板机器人平台和液体处理机器)。高通量方法可以利用多孔板，诸如例如微量滴定板。在一些实施例中，本公开的自动化方法包括机器人系统。本文概述的系统通常涉及96孔微量滴定板或384孔微量滴定板的使用，但如本领域技术人员将理解的，可以使用任何数量的不同板或配置。此外，本文概述的任何或所有步骤可以是自动化的；因此，例如，系统可以是完全或部分自动化的。与本文提供的方法和组合物相容的机器人系统可以是在pct/us18/36360、pct/us18/36333或wo2017/100377中描述的那些机器人系统。试剂盒本公开还提供了用于实施用于生成如上所述的核酸组装体或由其衍生的文库的方法的试剂盒。试剂盒可以包括含有用于组装ssdna分子(例如寡核苷酸)或dsdna分子所需的所有试剂的混合物。在某些实施例中，本主题的试剂盒可以含有：i.含有成对的第一多核苷酸和第二多核苷酸的第一多核苷酸的池，ii.插入多核苷酸的第二池，和(iii)任选地，用于在合适的宿主细胞中繁殖所生成的组装体的合适的克隆载体。在一些情况下，试剂盒包含阳性对照。在一个实施例中，本文提供的试剂盒进一步包括5'-3'核酸外切酶和链置换聚合酶。在另一个实施例中，本文提供的试剂盒进一步包括5'-3'核酸外切酶、连接酶和链置换聚合酶。在又一个实施例中，本文提供的试剂盒包括单链(ss)结合蛋白质。ss结合蛋白质可以是极端热稳定的单链dna结合蛋白质(etssb)、大肠杆菌reca、t7基因2.5产物、噬菌体λredb或rac前噬菌体rect。在一个单独的实施例中，本文提供的试剂盒进一步包括适当量的缺乏3'核酸外切酶活性的5'至3'核酸外切酶、拥挤剂、具有3'核酸外切酶活性的热稳定的非链置换dna聚合酶、或所述dna聚合酶与缺乏3'核酸外切酶活性的第二dna聚合酶的混合物，以及分离的热稳定连接酶。拥挤剂可以是peg、葡聚糖或聚蔗糖。例如，试剂盒可以含有t5核酸外切酶、peg、dna聚合酶和taq连接酶。在另一个示例中，试剂盒包括：核酸外切酶iii、peg、amplitaqdna聚合酶和taq连接酶。本文提供的任何试剂盒还可以含有可以用于本方法的上文和下文所述的其他试剂，例如错配修复酶诸如muthls、cel-1核酸酶、t7endo1、uvrd、t4endovii、大肠杆菌endov、缓冲液、dntp、插入合成子的质粒和/或接受质粒的感受态细胞、对照等，这取决于该方法的实现方式。试剂盒的组分可以在一个容器中组合，或者每种组分可以在其自己的容器中。例如，试剂盒的组分可以在单个反应管中或者在一或多个不同的反应管中组合。除了上述组分之外，本主题的试剂盒进一步包含使用试剂盒的组分来实施本主题的方法的说明书。用于实施本主题的方法的说明书通常被记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以被印刷在基底(诸如纸或塑料等)上。因此，说明书可以作为包装插入物存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或分包装相关联)等。在其他实施例中，在试剂盒中不存在实际的说明书，但是提供了用于例如经由互联网从远程来源获得说明书的手段。该实施例的示例是包含网址的试剂盒，在该网址中可以查看说明书和/或可以从该网址下载说明书。如本文所述的用于组装第一池中成对的多核苷酸和第二池中的插入多核苷酸的组合物、试剂盒和方法产生作为dsdna的产物，其可以用作pcr、rca或多种其他分子生物学应用的模板，包含直接转化或转染感受态原核或真核宿主细胞。实例通过参考以下实例进一步说明本公开。然而，应当注意，与上述实施例类似，这些实例是说明性的并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。实例1——用于将dna片段多重组装到质粒的确定性文库中的方法原理证明。目的本实例描述了使用如图1中示意性示出的体外组装反应来确定性地连接包括精确设计的dna部分(其包括4种组分)的池，以生成所需质粒的文库。方法/结果插入序列(即，有效负载)在柱或阵列上合成，以生成柱合成的有效负载池和阵列合成的有效负载池，每个池含有下面所示的7个有效负载序列的混合物。>pmb070_启动子accgtgcgtgttgacaattttacctctggcggtgatactggttgcatgtactaaggaggttgt(seqidno.1)>b2405_启动子atgtcggatatctggtggtgaaatactttatgccatgataatttaatacgatgtatttattatatggagcacttaatt(seqidno.2)>b0605_启动子taatggaaacgcattagccgaatcggcaaaaattggttaccttacatctcatcgaaaacacggaggaagtatag(seqidno.3)>pmb043_启动子accgtgcgtgttgactattttacctctggcggttagagttaacatcctacaaggagaacaaaagc(seqidno.4)>pmb071_启动子accgtgcgtgttgacttaaataccactggcggtgataatggttgcatgtactaaggaggttgt(seqidno.5)>b0159_启动子ctctcccgcgtgagaaatacgcttccccgtaagcgcatggtaaactatgccttcaaatcgggcttatcgcgagtaaatct(seqidno.6)>pmb090_启动子accgtgcgtgtttacaattttacctctggcggtgataattaacatcctacaaggagaacaaaagc(seqidno.7)分别地，生成了6个包括成对的左同源性臂和右同源性臂的池(即，图4中引用的基因座池编号)。每个基因座池含有多个同源性臂，每个同源性臂包括与大肠杆菌宿主细胞的基因组中的单独的基因座互补的序列；独特基因座的数目(即成对的同源性臂的数目)在图4中每个池的图下面给出(即，图下面的表中的“池中的基因座”)。来自每个池的每对中每个同源性臂的序列是seqidno.8至seqidno.179。柱合成的有效负载池和阵列合成的有效负载池分别与图4中指定的特定基因座池混合。应当注意，每种混合物含有的左同源性臂:有效负载:右同源性臂的摩尔比为大约1:10:1。存在过量的有效负载，因为有效负载池含有对应于100-500个独特的左同源性臂和右同源性臂的寡核苷酸，而在给定的反应中仅组装了10-19个同源性臂，假定一定比例的插入寡核苷酸在反应中将是惰性的。该混合物进一步包括nebhifidna组装主混合物和用于在大肠杆菌克隆菌株中繁殖的克隆载体。每种混合物含有约0.05pmol的相应基因座池、0.2-1pmol的相应有效负载池和0.0125pmol的克隆载体，理论上得到0.0125pmol的最终组装产物。一旦组装，使每种混合物经历用于体外重叠组装的nebhifidna组装方案，并在大肠杆菌克隆菌株中繁殖。在图4中的表中给出了每个文库中的独特基因座(同源性臂对)、有效负载和总的可能构建体的数目。在繁殖后，将每个组装体至少100个菌落分别挑入液体培养物中并生长过夜。使用液体培养物作为模板，用于对整个克隆的质粒进行滚环扩增(rca)。使用tn5转座酶片段化和衔接子连接试剂盒(次世代(nextera),依诺米那(illumina))对rca产物进行片段化。然后经由pcr添加样品特异性的索引条形码，并将来自文库的质粒混合并进行柱纯化。使用tapestation仪器评估文库摩尔浓度，并将来自文库的质粒加载到miseq仪器(300个循环试剂盒)上以用于测序。在图4中示出了对每个组装体测序的质粒的数目。为了确定在组装体的池中生成了什么组装体，使用算法以在原始测序读段中搜索每个唯一组装体中各部分之间的每个连接处的唯一20-mer序列，以便确定哪个dna序列被组装。然后将读段映射至每个样品的相应参考序列，以便确定所生成的全长产物。在图4的图中，“序列完美”表示所有四个部分(载体主链、左同源性臂和右同源性臂和有效负载)被组装在一起，并且在质粒中没有突变。“带有突变的正确组装”表示所有四个部分都以正确的排列存在，但在质粒中具有一或多个点突变。“错组装”表示具有错配的同源性臂或部分(part)或部分的部分(portion)不存在的质粒。结论图4中所示的结果表明，图1中描述的工艺可以成功地用于生成dna组装体的确定性文库。实例2——使用环状排列的有效负载的大有效负载进行多路复用确定性组装的方法的原理证明。目的该实例描述了使用如图1中示意性示出的体外组装反应来确定性地连接包括精确设计的dna部分的池，该dna部分包含环状排列的有效负载(插入物)，其制备在图3中描述。方法/结果通过使用混合的正向引物扩增包括有效负载序列(约2670bp)的模板来制备插入物，该正向引物从5'至3'端包括有效负载右侧的组装重叠、hom2的53bp、i-scei限制性核酸内切酶识别位点、hom1的53bp和有效负载左侧的引物结合位点。使用凯杰(qiagen)凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶上切下扩增产物。切除的产物在nebhifi组装反应中环化，经由axyprepmag珠清除法纯化，并使用i-scei进行线性化(“环状排列”)。分别地，从基因组dna扩增各自包括与酿酒酵母宿主细胞的基因组中的单独基因座互补的序列的左同源性臂和右同源性臂。将环状排列的混合的有效负载和一组左同源性臂和右同源性臂与克隆载体组合，并使用nebhifi反应进行组装。混合物含有的左同源性臂:混合的插入物:右同源性臂的摩尔比为大约1:5:1。使用过量的插入物，因为与组装中使用的十对左/右同源性臂相比，混合的插入物含有54个独特的序列。该混合物含有约16fmol的同源性臂池、80fmol的有效负载池和2.5fmol的克隆载体，理论上得到2.5fmol的最终组装产品。一旦组装，就使混合物经历用于体外重叠组装的nebhifidna组装方案，并在大肠杆菌克隆菌株中繁殖。在繁殖后，将若干个菌落分别挑入液体培养物中并生长过夜。使用液体培养物作为模板，用于对整个克隆的质粒进行滚环扩增(rca)。使用两条引物(一条正向引物和一条反向引物)通过sanger测序对rca产物进行测序。引物被设计成与克隆载体结合并读入同源性臂和有效负载。为了确定在组装体的池中生成了什么组装体，使用算法以在测序读取的每个独特组装体中搜索唯一的20-mer序列。然后将读段与每个样品的相应参考序列进行比对，以验证预期的连接被建立，表明质粒已被正确组装。在图5中，顶部的长条表示要在池中组装的质粒的结构，并且下面的较短条表示与来自组装体的池的三个单独样品的相应参考序列对齐的sanger序列。读段内端的细垂直线表示sanger读段尾端的预期测序伪影。数据表明，所有预期的连接都被组装。结论图5中所示的结果表明，图1和图3中描述的工艺可以被成功地用于生成并入长的有效负载(例如>200bp)的dna组装体的确定性文库。实例3——使用pcr扩增的有效负载的大有效负载进行多路复用确定性组装的方法的原理证明。方法/结果图6示出了混合的组装体的总成功率，其中含有有效负载的部分是经由pcr使用附加了来自源自宿主基因组的模板的组装重叠的引物来创建的。扩增的有效负载长度在182-213bp的范围内。在使用neb的hifi组装主混合物进行组装之前，经由基于磁珠的方案纯化具有附加的25bp组装重叠的pcr扩增的部分，并且随后与含有同源性臂的左侧和右侧部分一起分别标准化至有效负载、左侧和右侧部分的总计.25皮摩尔，和.05皮摩尔的载体主链，并且随后被电穿孔到电感应态细胞中。成功率根据被回收并通过ngs-qc的质粒相对于尝试创建的质粒的百分比来计算。成功率是基于对每个池中下列数量的独特质粒进行回收和测序：池1：(48/70个质粒)，池2：(47/70个质粒)，池3：(46/70个质粒)，池4(56/70个质粒)，池5：(37/49个质粒)。对于池1:4，7个启动子有效负载靶向10个基因座，并且对于池5，7个启动子有效负载靶向7个基因座。在所有五个池中，我们总共创建了234/329或71.12％的质粒，并经ngs证实。结论图6中所示的结果表明，图1中描述的工艺可以成功地用于pcr扩增的插入片段，以生成并入长的有效负载(例如>200bp)的dna组装体的确定性文库。具有seqidno识别符的本公开的序列本公开的编号的实施例由本公开预期的其他主题在以下编号的实施例中阐述：1.一种包括多核苷酸的混合物的组合物，所述混合物包括：含有成对的多核苷酸的第一池，其中所述第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸；和插入多核苷酸的第二池，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列。2.根据实施例1所述的组合物，进一步包括克隆载体，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端包括与所述克隆载体互补的序列。3.根据实施例2所述的组合物，其中选择来自所述第一池的每一多核苷酸，使得除了所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述第二池的所述插入成对的多核苷酸之间、或所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自所述第一池的多核苷酸与来自所述第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。4.根据实施例3所述的组合物，其中所述指定的阈值为5至15个连续核苷酸。5.根据实施例1至4中任一个所述的组合物，进一步包括聚合酶。6.根据实施例5所述的组合物，其中所述聚合酶是链置换的或非链置换的。7.根据实施例6所述的组合物，其中所述聚合酶是非链置换的，并且所述组合物进一步包括拥挤剂。8.根据实施例7所述的组合物，其中所述拥挤剂是聚乙二醇(peg)。9.根据实施例8所述的组合物，其中所述peg以约3％至约7％(重量/体积)的浓度使用。10.根据实施例8或9所述的组合物，其中所述peg选自peg-200、peg-4000、peg-6000、peg-8000或peg-20,000。11.根据实施例6所述的组合物，其中所述聚合酶是链置换的，并且所述组合物进一步包括单链结合蛋白质。12.根据实施例11所述的组合物，其中所述单链dna结合蛋白质是极端热稳定的单链dna结合蛋白质(etssb)、大肠杆菌reca、t7基因2.5产物、噬菌体λredb或rac前噬菌体rect。13.根据上述实施例中任一个所述的组合物，进一步包括5'-3'核酸外切酶。14.根据上述实施例中任一个所述的组合物，进一步包括连接酶。15.根据上述实施例中任一个所述的组合物，其中所述第一池中的每对是双链dna(dsdna)或单链(ssdna)。16.根据上述实施例中任一个所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸是dsdna或ssdna。17.根据上述实施例中任一个所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中的靶基因组基因座的序列。18.根据实施例1至16中任一个所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于作为代谢途径的一部分的基因的编码序列。19.根据实施例1至18中任一个所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于功能结构域或一或多种蛋白质的编码序列。20.根据上述实施例中任一个所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个构建体中连接在一起，其中所述单个构建体包括用于所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸之间的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。21.根据实施例20所述的组合物，其中用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列包括归巢核酸内切酶识别序列。22.根据上述实施例中任一个所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的1或多个核苷酸。23.根据上述实施例中任一个所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的约25个核苷酸。24.根据上述实施例中任一个所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括位于所述第一组装重叠序列与所述第二组装重叠序列之间的一或多个有效负载序列。25.根据实施例24所述的组合物，其中所述一或多个有效负载序列选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、终止子、唯一标识符序列或其部分。26.根据实施例17所述的组合物，其中所述第一池中的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与所述第一池中的每个其他对相比对应于宿主细胞中不同的靶基因组基因座的序列。27.根据实施例17所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中相同靶基因组基因座的序列。28.根据实施例24至27中任一个所述的组合物，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列不同于所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列。29.根据实施例24至27中任一个所述的组合物，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列与所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同。30.一种用于生成多核苷酸的文库的方法，所述方法包括：(a)组合多核苷酸的第一池和多核苷酸的第二池，其中所述第一池含有成对的多核苷酸，其中所述第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第二池含有插入多核苷酸，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；以及(b)将所述第一池和所述第二池组装成多核苷酸的文库，其中所述文库中的每一多核苷酸包括来自所述第二池的插入多核苷酸和来自所述第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述组装通过体外克隆方法或体内克隆方法进行。31.根据实施例30所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的1或多个核苷酸。32.根据实施例30或31所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的约25个核苷酸。33.根据实施例30至32中任一个所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个构建体中连接在一起，其中所述单个构建体包括用于所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸之间的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。34.根据实施例33所述的方法，其中用于一或多种位点特异性核酸酶的所述一或多个识别序列包括归巢核酸内切酶识别序列。35.根据实施例33所述的方法，其中通过经由剪接和重叠延伸pcr(soe-pcr)、限制连接、钝端连接、基于重叠的组装方法、基于重组的方法或连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的任何其他酶促或化学方法连接各个第一多核苷酸和第二多核苷酸，或通过直接合成所述单个构建体来产生连接的单个构建体。36.根据实施例30至32中任一个所述的方法，进一步包括在步骤(a)期间将克隆载体与所述第一池和所述第二池组合，其中，对于所述第一池中的每对，所述克隆载体的相对端包括与所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端互补的序列。37.根据实施例30至32中任一个所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前将克隆载体与所述第一池组合，其中，对于所述第一池中的每对，所述克隆载体的相对端包括与所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端互补的序列。38.根据实施例36或37所述的方法，其中所述克隆载体和来自所述第一池的每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。39.根据实施例38所述的方法，进一步包括通过添加所述一或多个识别序列的一或多种位点特异性核酸酶，在所述克隆载体的相对端与来自所述第一池的每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端之间生成单链互补突出物。40.根据实施例39所述的方法，进一步包括连接所述克隆载体的所述相对端与来自所述第一池的每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端之间的所述单链互补突出物。41.根据实施例36至40中任一个所述的方法，其中步骤(b)产生环状产物，所述环状产物包括来自所述第二池的插入多核苷酸、来自所述第一池的一对的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及所述克隆载体。42.根据实施例36至41中任一个所述的方法，其中所述第一池通过从更大组的此类序列中选择成对的多核苷酸序列来生成，使得除了所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述第二池的所述插入多核苷酸之间、或所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自所述第一池的多核苷酸与来自所述第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。43.根据实施例42所述的方法，其中所述指定的阈值为5至15个连续核苷酸。44.根据实施例30至43中任一个所述的方法，其中所述组装是体外克隆方法，其中将所述第一池和所述第二池的混合物加热以使存在于所述第一池和所述第二池中的多核苷酸部分或完全变性，然后在组装之前被冷却至室温。45.一种用于生成多核苷酸的文库的方法，所述方法包括：(a)经由聚合酶链反应(pcr)扩增多核苷酸的第一池，其中所述第一池含有成对的多核苷酸，其中所述第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中一对中的每一个第一多核苷酸和每一个第二多核苷酸包括5'端和3'端，其中所述扩增将包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列的共同重叠序列引入到来自所述第一池的一对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上；(b)通过利用共同重叠序列将来自所述第一池的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸组装成单个核酸片段，其中每对的所述单个核酸片段包括由所述共同重叠序列从所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端分离的第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中每对的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端位于所述单个核酸片段的相对末端上，远离一或多个位点特异性核酸酶识别序列；(c)将每对的所述单个核酸片段与含有插入多核苷酸的第二池组合，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与所述单个核酸片段中存在的所述第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与所述单个核酸片段中存在的所述第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；(d)将所述第一池和所述第二池组装成环化的产物的第三池，其中所述组装经由体外或体内重叠组装方法进行，并且其中所述第三池中的每种环化的产物包括来自所述第二池的插入序列和来自所述第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸；(e)经由一或多种位点特异性核酸酶的消化使所述第三池中的每种环化的产物线性化，所述位点特异性核酸酶识别位于所述第三池中的每种环化的产物中的所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列；以及(f)通过体外或体内克隆方法将线性化的产物组装到克隆载体中。46.根据实施例45所述的方法，其中位于所述第一多核苷酸序列与所述第二多核苷酸序列之间的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列是归巢核酸酶识别序列。47.根据实施例45或46所述的方法，其中位于所述第一多核苷酸序列与所述第二多核苷酸序列之间的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列的所述一或多种位点特异性核酸酶是归巢核酸内切酶。48.根据实施例45至47中任一个所述的方法，其中所述共同重叠序列包括至少1个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。49.根据实施例45至47中任一个所述的方法，其中所述共同重叠序列包括10-25个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。50.根据实施例48或49所述的方法，其中所述基于重叠的dna组装方法选自soe-pcr或体外重叠组装方法。51.根据实施例50所述的方法，其中存在于所述第一多核苷酸的5'端的共同重叠序列中的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列与存在于每对中的所述第二多核苷酸的3'端的共同重叠序列中的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列互补，并且其中在步骤(b)中利用每对中的所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述共同重叠序列需要进行soe-pcr。52.根据实施例45至47中任一个所述的方法，其中在步骤(b)中利用每对中的所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述共同重叠序列需要用一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中的所述第一多核苷酸5'端和所述第二多核苷酸3'端上的所述共同重叠序列中存在的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端生成包括互补序列的单链突出物；以及连接在每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端上的所述单链突出物上存在的互补序列。53.根据实施例45至52中任一个所述的方法，其中步骤(d)的所述组装使用基于重叠的dna组装方法进行。54.根据实施例53所述的方法，其中所述基于重叠的dna组装选自soe-pcr和体外重叠组装方法。55.根据实施例45至52中任一个所述的方法，其中每对中的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端包括一组附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，并且所述第二池中的每个插入多核苷酸中的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。56.根据实施例55所述的方法，其中步骤(d)中的组装需要用每对中的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端上的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列以及来自所述第二池的每个插入多核苷酸中的所述第一组装序列和所述第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端上存在的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列和来自所述第二池的每个插入多核苷酸中的所述第一组装序列和所述第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在所述第一多核苷酸的3'端上生成包括与来自所述第二池的插入多核苷酸的所述第一组装序列的5'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列的单链突出物和在所述第二多核苷酸的5'端上生成包括与来自所述第二池的相同插入多核苷酸的所述第二组装序列的3'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列的单链突出物；以及连接所述单链突出物上存在的互补序列。57.根据实施例45至56中任一个所述的方法，其中步骤(f)的所述克隆载体包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。58.根据实施例57所述的方法，其中步骤(f)中的组装需要用所述克隆载体中存在的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列的所述一或多种位点特异性核酸酶消化所述克隆载体中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，其中所述消化在所述克隆载体的相对端上生成单链突出物，其中所述克隆载体的所述相对端的一个上的所述单链突出物包括与步骤(e)中生成的所述线性化的产物的端互补的序列，并且所述克隆载体的所述相对端的另一个上的所述单链突出物包括与步骤(e)中生成的所述线性化的产物的相对端互补的序列；以及连接所述克隆载体的所述单链突出物上存在的互补序列和来自步骤(e)的所述线性化的产物。59.根据实施例45至58中任一个所述的方法，其中所述第一池通过从更大组的此类序列中选择成对的多核苷酸序列来生成，使得除了所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述第二池的所述插入多核苷酸之间、或所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自所述第一池的多核苷酸与来自所述第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。60.根据实施例59所述的方法，其中所述指定的阈值为5至15个连续核苷酸。61.根据实施例45至60中任一个所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括与所述单个核酸片段的所述相对末端互补的1或多个核苷酸。62.根据实施例45至61中任一个所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括与所述单个核酸片段的所述相对末端互补的约25个核苷酸。63.根据实施例30至62中任一个所述的方法，其中，在步骤(a)之前，通过将含有来自成对的多核苷酸的每一个第一多核苷酸的混合物与含有来自成对的多核苷酸的每一个第二多核苷酸的混合物组合来生成多核苷酸的所述第一池。64.根据实施例30至63中任一个所述的方法，其中所述第一池中的每对是双链dna(dsdna)或单链dna(ssdna)。65.根据实施例30至43中任一个所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸是dsdna或ssdna。66.根据实施例30至65中任一个所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中的靶基因组基因座的序列。67.根据实施例30至65中任一个所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于作为代谢途径的一部分的基因的编码序列。68.根据实施例30至65中任一个所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于功能结构域或一或多种蛋白质的编码序列。69.根据实施例30至68中任一个所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括位于所述第一组装重叠序列与所述第二组装重叠序列之间的一或多个有效负载序列。70.根据实施例69所述的方法，其中所述一或多个有效负载序列选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、终止子、唯一标识符序列或其部分。71.根据实施例66所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括与所述第一池中的每对相比对应于宿主细胞中不同的靶基因组基因座的序列。72.根据实施例66所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中相同靶基因组基因座的序列。73.根据实施例69至72中任一个所述的方法，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列不同于所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列。74.根据实施例69至72中任一个所述的方法，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列与所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同。75.根据实施例30或69至74中任一个所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸通过以下生成：(i)对包括所述有效负载序列、正向引物和反向引物的混合物进行聚合酶链反应(pcr)，其中所述正向引物包括5'至3'、与所述有效负载序列互补的一或多个核苷酸的短段、所述第一组装重叠序列、用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列、所述第二组装重叠序列和与所述有效负载序列互补的一或多个核苷酸的第二段，并且其中所述反向引物包括与所述有效负载序列或与所述有效负载序列下游的其他序列互补的序列，其中所述pcr生成pcr产物，所述pcr产物包括5'至3'、与所述有效负载序列互补的核酸的短段、所述第一组装重叠序列、所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列、所述第二组装重叠序列和所述有效负载序列；(ii)经由选自由剪接和重叠延伸pcr(soe-pcr)、限制性连接、钝端连接、基于重叠的组装方法和基于重组的方法组成的群组的组装方法，或连接两个dna分子的任何其他酶促或化学方法，使所述pcr产物环化；以及(iii)用识别所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶使所述环化的pcr产物线性化，从而生成多核苷酸的所述第二池。76.根据上述实施例中任一个所述的组合物或方法，其中所述位点特异性核酸酶是限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen或切口酶中的一或多种。*******上述各种实施例可以被组合以提供另外的实施例。本说明书中提及的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用以其整体并入本文。如果需要，可以修改实施例的方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供又另外的实施例。根据以上详细描述，可以对实施例进行这些和其他改变。一般而言，在所附的权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的特定实施例，而应被解释为包含所有可能的实施例以及这些权利要求有权得到的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。通过引用并入本文所引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请均通过引用以其整体并入用于所有目的。然而，本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为，并且不应被视为承认或以任何形式暗示它们构成有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分。序列表<110>齐默尔根公司(zymergeninc.)<120>dna文库的多重确定性组装<130>zymr-029/01wo327574-2164<150>us62/753,254<151>2018-10-31<160>179<170>patentin版本3.5<210>1<211>63<212>dna<213>人工序列<220><223>pmb070_启动子<400>1accgtgcgtgttgacaattttacctctggcggtgatactggttgcatgtactaaggaggt60tgt63<210>2<211>78<212>dna<213>人工序列<220><223>b2405_启动子<400>2atgtcggatatctggtggtgaaatactttatgccatgataatttaatacgatgtatttat60tatatggagcacttaatt78<210>3<211>74<212>dna<213>人工序列<220><223>b0605_启动子<400>3taatggaaacgcattagccgaatcggcaaaaattggttaccttacatctcatcgaaaaca60cggaggaagtatag74<210>4<211>65<212>dna<213>人工序列<220><223>pmb043_启动子<400>4accgtgcgtgttgactattttacctctggcggttagagttaacatcctacaaggagaaca60aaagc65<210>5<211>63<212>dna<213>人工序列<220><223>pmb071_启动子<400>5accgtgcgtgttgacttaaataccactggcggtgataatggttgcatgtactaaggaggt60tgt63<210>6<211>80<212>dna<213>人工序列<220><223>b0159_启动子<400>6ctctcccgcgtgagaaatacgcttccccgtaagcgcatggtaaactatgccttcaaatcg60ggcttatcgcgagtaaatct80<210>7<211>65<212>dna<213>人工序列<220><223>pmb090_启动子<400>7accgtgcgtgtttacaattttacctctggcggtgataattaacatcctacaaggagaaca60aaagc65<210>8<211>1050<212>dna<213>人工序列<220><223>基因编辑同源性臂池_1_b3748_左<400>8caaatctcgaagatttctttcatgcggtgggagatatagacaataccgcggccttgcgat60ttcagctcgcggatgacgcggaacagggattcggtttcggtatcggtcagcgcatcggtc120ggttcatccataatgatgactttcgactcaaagctcagcactttggcgatttcaaccatt180tgctggtcaccgatggaaagatcgcccaccagcttgtcgcttttaaagcgcaggttaagt240ttagccagcaatttatccgcttcggcatacatggttttccagtcaattttgccaaagcga300ttaacaaactcacgaccgaggaaaatgttttcggcaatggtcaactgcgggatcaggttc360agttcctgatggataatcccaatcccggcttcctgggaagattttggcccggtaaatgtc420gtttctttccccagccataaaagcgtaccggcatcgcgagtatagatgccagtaagcact480ttcatcatggtggatttacccgcgccgttttcgcccaccagcgccatcacgcggcccgga540tagacattta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