基于PDE4D7和DHX9表达的术前风险分层

发明领域本发明涉及前列腺癌对象的术前风险分层的方法。此外，本发明涉及一种诊断试剂盒，涉及所述诊断试剂盒在前列腺癌对象的术前风险分层方法中的应用，及涉及磷酸二酯酶4d变体7(pde4d7)的基因表达谱和dexh-box解旋酶9(dhx9)的基因表达谱在前列腺癌对象的术前风险分层中的应用，以及涉及相应的计算机程序产品。发明背景癌症是其中一组细胞呈现不受控制的生长、侵入和有时转移的一类疾病。癌症的这三种恶性性质使其与良性肿瘤区分开来，良性肿瘤是自限性且不侵入或转移。前列腺癌(pca)是男性中最常见的非皮肤恶性肿瘤，2012年全世界诊断出约110万新病例(参见ferlayj.etal.,globocan2012v1.0,cancerincidenceandmortalityworldwide:iarccancerbaseno.11[internet],lyon,france,internationalagencyforresearchoncancer,2013)。由于人口老龄化，pca的发病率在未来将进一步增加(见quonh.etal.,“dramaticincreaseinprostatecancercasesby2021”,bjuinternational,vol.108,no.11,pages1734to1738,2011)。通过确定前列腺特异性抗原(psa)的血液水平、直肠指检(dre)和经直肠超声分析(trus)的常规诊断导致非癌性、良性前列腺状况的显著一线过度诊断(见bangmac.h.etal.,“overdiagnosisandovertreatmentofearlydetectedprostatecancer”,worldjournalofurology,vol.25,no.1,pages3to9,2007，及f.h.etal.,“screeningandprostate-cancermortalityinarandomizedeuropeanstudy”,thenewenglandjournalofmedicine,vol.360,no.13,pages1320to1328,2009)：仅在美国每年进行的大约100万前列腺活组织检查中发现大约250,000新病例，大约75％是不必要进行的，导致患者出现许多并发症(尿脓毒症、出血和尿潴留)和超过20亿美元(每次活检过程约2100美元)的总成本。每100名活检阴性的男性中至少有4名有可能由于副作用而住院，而每10,000名活检患者中有9名处于死于目前使用的程序的风险(见namr.k.etal.,“increasinghospitaladmissionratesforurologicalcomplicationsaftertransrectalultrasoundguidedbiopsy”,journalofurology,vol.183,no.3,pages963to968,2010)。在美国每年大约250,000新检测的pca病例中，大约200,000最初被定性为局部疾病(见snyderc.f.etal.,“howdoesinitialtreatmentchoiceaffectshort-termandlong-termcostsforclinicallylocalizedprostatecancer？”,cancer,vol.116,no.23,pages5391to5399,2010及cooperbergm.r.etal.,“contemporarytrendsinlowriskprostatecancer:riskassessmentandtreatment”,journalofurology,vol.173,no.3,pt.2,pages14to19,2007)，即癌症局限于前列腺器官。这种状况在一定程度上可通过一级治疗(primarytreatment)方法治愈，例如放射治疗或特别是通过手术(前列腺切除术)部分或完全切除前列腺。然而，这些干预通常伴有严重副作用，特别是尿失禁和/或勃起功能障碍，这是前列腺切除术的非常常见后果。接受根治性前列腺切除术的男性中多达50％会出现尿失禁。研究表明，在手术后一年仍有15％-50％的男性报告这种问题。勃起问题同样是根治性前列腺切除术(rp)的严重副作用。只有大约一半的手术男子能够恢复一些勃起的能力。而且，所有常规应用的局部pca治疗都很昂贵(通常约为20-30,000美元级别)，每年在美国产生的直接总费用为50亿美元。在美国经诊断为临床局部疾病的大约200,000名男性中，高达50％的人患有极低风险或低风险的癌症(见bangmac.h.androobolm.j.,“definingandpredictingindolentandlowprostatecancer”,criticalreviewsinoncology/hematology,vol.83,no.2,pages235to241,2012)。因此，nccn(国家综合癌症网)最近修订了其pca治疗指南，扩大主动监测(as)作为用于这种低风险疾病患者的温和及便利治疗选择(见www.nccn.org)。通过将适当的患者转诊至as，这些患者的生活质量与经历一级治疗的男性相比显著提高，且据报道每位患者as的5年费用低于10,000美元(见snyderc.f.etal.)。此外，在选择手术(相对于as)作为指定患者的治疗选项的情况中，根据患者肿瘤的潜在进展性对手术范围进行分层具有显著优势。例如，神经保护(nerve-sparing)手术技术可以更普遍地应用于具有预测低风险疾病的男性，以使根治性前列腺切除术的性能力相关副作用最小化。同样，根据欧洲泌尿科学会(eau)最新的前列腺癌指南，尽管与更有限的方法相比扩大淋巴结清扫术手术过程复杂、耗时且与更高的并发症发生率相关，但仍建议在预测高风险癌症的情况下实施(见heidenreicha.etal.,“guidelinesonprostatecancer”,europeanassociationofurology,2012)。因此，虽然较少限制的淋巴结清扫显示错过大约50％的淋巴结转移(见heidenreicha.etal.,“extendedpelviclymphadenectomyinpatientsundergoingradicalprostatectomy:highincidenceoflymphnodemetastasis”,journalofurology,vol.167,no.4,pages1681to1686,2002及baderp.etal,“isalimitedlymphnodedissectionandadequatestagingprocedureforprostatecancer？”,journalofurology,vo.168,no.2,pages514to518,2002)，但局部前列腺癌患者的治疗方案需要个体肿瘤的进展性潜力的高度准确的术前预测，以为每名患者提供最佳护理。wo2014/028884a2公开了用于诊断、预后和确定对象中癌症进展的方法、系统和试剂盒。进一步公开了用于确定对象中癌症的治疗方式的方法、系统和试剂盒。所述方法、系统和试剂盒包含基于表达的生物标志物分析。还公开了用于评估对象的癌症状态的探针组。发明概述本发明的目的是提供一种前列腺癌对象的术前风险分层的方法，其可以对个体肿瘤的侵袭性潜力进行更好的术前预测。本发明的另一个目的是提供一种诊断试剂盒、所述诊断试剂盒在前列腺癌对象的术前风险分层的方法中的应用、磷酸二酯酶4d变体7(pde4d7)的基因表达谱和dexh-box解旋酶9(dhx9)的基因表达谱在前列腺癌对象的术前风险分层中的应用，以及相应的计算机程序产品。在本发明的第一方面，提出了一种前列腺癌对象的术前风险分层的方法，其包含：-确定得自所述对象的生物学样品中磷酸二酯酶4d变体7(pde4d7)的基因表达谱，-确定得自所述对象的相同或另一生物学样品中dexh-box解旋酶9(dhx9)的基因表达谱，和-基于pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱确定所述对象的术前预后风险评分。已知camp信号传导通路在前列腺癌的发生和发展中均起重要作用(见merkled.andhoffmannr.,“rolesofcampandcamp-dependentproteinkinaseintheprogressionofprostatecancer:cross-talkwiththeandrogenreceptor”,cellularsignalling,vol.23,no.3,pages507-515,2011)。虽然腺苷酸环化酶家族负责camp的合成，但环状核苷酸磷酸二酯酶(pde)似乎代表了其破坏的唯一细胞机制。pde既提供信号终止功能，更重要的是提供camp信号传导在细胞3d基质内的区室化。这是通过局部性锚定蛋白/信号转导体(signalosomes)隔离的不同pde同种型的亚群对camp的空间离散破坏而实现的(见例如contim.andbeavoj.,“biochemistryandphysiologyofcyclicnucleotidephosphodiesterases:essentialcomponentsincyclicnucleotidesignaling”,annualreviewofbiochemistry,vol.76,pages481-511,2007)。因此，不同pde同种型的表达和/或活性的变化可以改变疾病发生和进展期间下游信号传导通路，为新生物标志物和靶向治疗干预提供潜在靶。事实上，降解camp的pde4家族成员的表达的改变似乎与许多不同疾病有关，包括卒中、肢端骨发育不全、精神分裂症和copd。近年来，显示特定pde4同种型(pde4d7)的下调对前列腺癌可能有影响(见例如r.etal.,“humanphosphodiesterase4d7(pde4d7)expressionisincreasedintmprss2-ergpositiveprimaryprostatecancerandindependentlyaddstoareducedriskofpost-surgicaldiseaseprogression”,britishjournalofcancer,vol.113,no.10,pages1502-1511,2015)。pde4d7同种型是所谓的长同种型，因为其含ucr1和ucr2调节结构域二者。ucr1见于长而不是短的pde4同种型中，可以通过各种蛋白激酶包括pka和mk2调节，还可以确定erk催化单元磷酸化的功能结果。在功能上，其为camp提供了细胞脱敏系统的一部分并实现了导致例如erk和ampk激活的信号传导通路之间的串扰。新兴证据表明，人解旋酶如dhx9可以充当细胞网络中的枢纽，以协调细胞应激反应，维持细胞稳态以生存或触发细胞死亡。有趣的是，最近已显示出一系列人癌细胞系在体外和体内都易于抑制dhx9解旋酶的活性。dhx9抑制后肿瘤细胞的基因表达谱分析揭示了参与肿瘤发生或发展的一系列通路的脱调节。此外，dhx9近来已被描述为是解决r环相关dna损伤的主要参与者，其支持维持基因组稳定性。由于基因组水平上的重排，这个过程的破坏可能导致癌症发生和进展，这一现象已在许多癌症中得到证实。这些新近的发现得到本发明人产生的数据的有力支持，示出dhx9基因表达与在纵向随访中临床前列腺癌患者队列中前列腺癌复发时间显著相关(未公开的数据)。本发明人鉴别并证实了前列腺癌细胞中pde4d7和解旋酶dhx9之间的相互作用。另外，可以示出dhx9的n-末端结构域在体外通过camp依赖性蛋白激酶a(pka)磷酸化。这就提出了一个问题，即这种通过pka的翻译后修饰是否对dhx9的活性或细胞定位有任何调节作用，以及与pde4d7的相互作用是否通过调节环amp影响dhx9的微结构域中的磷酸化。有鉴于此，作为新鉴别的dhx9的相互作用因子，pde4d7可能在直接或间接控制dhx9在前列腺癌发生中的功能中起关键作用。通过基于pde4d7和dhx9二者的基因表达谱确定前列腺癌对象的术前预后风险评分，获得了代表疾病生物学的额外分子学信息。通过基于pde4d7和dhx9二者的基因表达谱确定术前预后风险评分，pde4d7和dhx9的预后能力可用于术前患者风险评估。这样可以在术前设置中改良对象的分层，可以获得更好的一级治疗决策。例如，对于前列腺癌患者的某些亚群，术前预后风险评分可以就是否选择主动监测还是主动干预例如根治性前列腺切除术提出更好建议。术语“磷酸二酯酶4d7”或“pde4d7”是指人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体7，即人磷酸二酯酶pde4d7基因，例如ncbi参考序列：nm_001165899.1中所定义的序列，特别是seqidno：19所示的核苷酸序列，其对应于上述pde4d7转录物的ncbi参考序列的序列，以及还涉及相应的氨基酸序列，例如seqidno：20所示，其对应于编码pde4d7多肽的ncbi蛋白质登录参考序列np_001159371.1中定义的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d7”或“pde4d7”还涉及可由引物对pde4d7_正向(seqidno：21)和pde4d7_反向(seqidno：22)生成并可由探针seqidno：23检测的扩增子。pde4d7多肽也可以用引物对pde4d7-2_正向(seqidno：24)和pde4d7_反向(seqidno：25)检测并可以用探针seqidno：26检测。术语“pde4d7”还包含与pde4d7具有高度同源性的核苷酸序列，例如与seqidno：19所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，或者与seqidno：20所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，或者编码与seqidno：20所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，或者由与seqidno：19所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列编码的氨基酸序列。术语“dexh-box解旋酶9”或“dhx9”是指人dexh-box解旋酶9基因，例如ncbi参考序列：nm_001357.4(ensembl：ensg00000135829)中定义的序列，特别是seqidno：74所示核苷酸序列，其对应于上述dhx9转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno：75所示相应氨基酸序列，其对应于编码dhx9多肽的ncbi蛋白质登录参考序列np_001348.2中定义的蛋白质序列。术语“dhx9”还包含与dhx9具有高度同源性的核苷酸序列，例如与seqidno：74所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，或者与seqidno：75所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，或者编码与seqidno：75所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，或者由与seqidno：74所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列编码的氨基酸序列。术语“生物学样品”或“得自对象的样品”是指通过本领域技术人员已知的合适方法从对象例如前列腺癌患者获得的任何生物学材料。可以以临床上可接受的方式例如以保存核酸(特别是rna)或蛋白质的方式来收集所使用的生物学样品。所述生物学样品可以包括机体组织和/或体液，例如但不限于血液、汗液和尿液。此外，生物学样品可以包含来源于上皮细胞的细胞提取物或包括上皮细胞的细胞群，例如癌上皮细胞或来源于怀疑是癌性组织的上皮细胞。所述生物学样品可以包含源自腺组织的细胞群，例如所述样品可以源自男性对象的前列腺。另外，如果需要，可以从获得的机体组织和体液中纯化细胞，然后用作生物学样品。在一些实例中，所述样品可以是组织样品、尿液样品、尿沉渣样品、血液样品、唾液样品、精液样品、包括循环肿瘤细胞的样品、细胞外囊泡、包含前列腺分泌的外泌体的样品，或者细胞系或癌细胞系。在一特定实例中，可以获取和/或使用活检或切除术样品。这种样品可以包括细胞或细胞裂解物。还可以想到的是，将生物学样品的内容物进行富集步骤。例如，可以将样品与特异于某些细胞类型例如前列腺细胞的细胞膜或细胞器的配体接触，所述配体例如被磁性颗粒功能化。被磁性颗粒浓缩的材料可随后用于如上文或下文所述的检测和分析步骤。此外，可以通过流体或液体样品例如血液、尿液等的过滤方法来富集细胞例如肿瘤细胞。这种过滤方法还可以与如上所述基于配体特异性相互作用的富集步骤组合。术语“前列腺癌”是指男性生殖系统前列腺的癌症，其在前列腺细胞突变并开始失控增殖时发生。通常，前列腺癌与升高水平的前列腺特异性抗原(psa)相关。在本发明的一个实施方案中，术语“前列腺癌”涉及示出psa水平高于4.0的癌症。在另一个实施方案中，该术语涉及示出psa水平高于2.0的癌症。术语“psa水平”是指血液中psa浓度，单位为ng/ml。术语“非进行性前列腺癌状态”是指个体样品未示出指示“生化复发”和/或“临床复发”的参数值。术语“进行性前列腺癌状态”是指个体样品示出指示“生化复发”和/或“临床复发”的参数值。术语“生化复发”通常是指增加的psa复发生物学值，表明样品中存在前列腺癌细胞。然而，也可以使用可用于检测存在或疑似这种存在的其它标记物。术语“临床复发”是指存在指示肿瘤细胞存在的临床迹象，例如使用体内成像测量。如本文所用，术语“预后前列腺癌”是指例如在一段时间内、在治疗期间或治疗后，预测经诊断或检测的前列腺癌的进程或结局。该术语还指确定对象从疾病中存活或恢复的机会，以及预测对象的预期存活时间。具体地，预后可包括确定对象在未来一段时间例如6个月、1年、2年、3年、5年、10年或任何其它时间段内存活的可能性。优选将pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱与得自一群前列腺癌对象的回归函数组合。回归分析帮助人们理解，当任意一个自变量发生变化而其它自变量保持固定时，因变量(或“标准变量”)的典型值将如何变化。在回归函数中记录了因变量和自变量之间的这种关系，可用于在给定自变量值的情况下预测因变量。因变量可以是例如二元变量，例如手术后5年内的生化复发。在这种情况下，回归是基于自变量(在此包括pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱或由pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱组成)的对数函数的对数回归。借助回归函数，可以改良预测例如手术后5年生化复发风险。优选所述方法进一步包含：-基于术前预后风险评分，为对象建议一级治疗，其中所述一级治疗选自：(i)至少部分前列腺切除术；(ii)选自放射治疗、激素治疗、化学疗法及其组合的主动治疗；和(iii)主动监测。各种国家和国际指南根据未来疾病进展的风险和预期寿命，建议对前列腺癌对象采用不同治疗。例如，通常建议对患有极低和低风险前列腺癌的男性进行主动监测(as)，而对于高风险癌症则可能指示根治性前列腺切除术。然而，已知的临床风险描述符不能有效地描述疾病的程度或其对所有患者的侵袭性。例如，已经发现，在国家综合癌症网络(nccn)极低风险和低风险组中，存在一个明显的患者群亚组，其在一级治疗后有10％-25％癌症复发风险。同样，已知在中等风险组中，存在一个亚群，具有低生化进展风险。通过根据术前预后风险评分为对象建议一级治疗，在以下方面提供更好的建议：对于前列腺癌患者的某些亚群，可以决定是否选择主动监测还是主动干预如根治性前列腺切除术。进一步优选所述方法包含：-相对于选自以下的一或多个参考基因，将pde4d7的基因表达谱和/或dhx9的基因表达谱标准化：智人次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hprt1)，微管蛋白-α-1b(tuba1b)，智人pumiliorna结合家族成员(pum1)和智人tata盒结合蛋白(tbp)，其中基于标准化的基因表达谱确定术前预后风险评分。通过针对一或多个参考基因对基因表达谱进行标准化及基于标准化的基因表达谱确定术前预后风险评分，可以降低确定术前预后风险评分中的可变性。这使得可以区分基因表达谱的实际变化和由于测量方法所致变化。在这方面，已经发现hprt1、tuba1b、pum1和tbp特别适合用作标准化pde4d7和/或dhx9基因表达谱的参考基因。可以通过使用一或多个引物和/或探针和/或一或多组引物和/或探针检测mrna表达来确定基因表达谱。此外，可以通过基于扩增的方法和/或微阵列分析和/或rna测序确定基因表达谱。基因表达谱的确定可以包括对从生物学样品中提取的rna进行实时定量聚合酶链反应(rt-qpcr)。在其它实施方案中，通过rna测序、常规pcr(使用例如通过凝胶电泳的终点分析)或多重pcr确定基因表达谱。在rt-qpcr的情况中，基因表达谱的确定可以包括确定pde4d7和/或dhx9以及所述一或多个参考基因中每一个的阈值循环(ct)值。可以用至少一个引物和/或探针进行pcr以测量选自hprt1、tuba1b、pum1和tbp的参考基因。优选所述一或多个参考基因包括hprt1、tuba1b、pum1和tbp中的至少两个、或至少三个、或所有。可以另外地或替代地用于标准化pde4d7和/或dhx9基因表达谱的其它参考基因包括：智人肌动蛋白βmrna(actb)；智人60s酸性核糖体磷蛋白p0mrna(rplp0)；聚合酶(rna)ii(dna定向)多肽a，220kda(polr2a)；β-2-微球蛋白(b2m)；及氨基乙酰丙酸-δ-合酶(alas-1)。在一些优选的实施方案中，使用合适的转换函数，将标准化的pde4d7和/或dhx9的基因表达谱转换为预定值范围，例如1-5的范围。转换函数优选得自对应的标准化的基因表达谱，例如对于源自一群前列腺癌对象(其有力地可以与用于获得回归函数的群体相同)的生物学样品，相对于hprt1、tuba1b、pum1和tbp所有对pde4d7和/dhx9标准化的基因表达谱。在一个优选的实例中，转换函数可以是线性转换，其将标准化的基因表达谱转换为预定的值范围。这种转换可以通过考虑对于前列腺癌对象群体的生物学样品针对例如pde4d7(或dhx9)的标准化的基因表达谱值的频率分布以及通过确定将频率分布转换为期望范围的转换而确定。通过利用这种转换函数，可以以用户直观的方式表示所述基因表达谱，例如小的正值范围。这类似于临床常规中使用的其它类别，例如组织病理学分级(gleason)或多参数mri放射评分(pirads)。在一个特定实例中，转化的标准化的基因表达谱如下确定：tngep＝(((gene_norm+a)*b)+1)，(1)其中“tngep”是转换的标准化的基因表达谱，“gene_norm”是标准化的pde4d7或dhx9基因表达谱值，a和b是变量并适当地选择以将“gene_norm”映射为期望的值范围。特别优选地，确定pde4d7的基因表达谱和/或dhx9的基因表达谱包括对从生物学样品中提取的rna进行rt-qpcr，其中确定pde4d7和/或dhx9和/或所述一或多个参考基因中每一个的cq值，其中确定术前风险评分包括使用所述一或多个参考基因中每一个的cq值标准化pde4d7和/或dhx9的cq值及基于标准化的cq值计算术前风险评分。例如，可以通过应用下式产生pde4d7的标准化的cq值：n(cqpde4d7)＝mean(cqref_genes)–(cqpde4d7)，(2)其中n(cqpde4d7)是pde4d7的标准化的基因表达谱值(量化周期，cq)，mean(cqref_genes)是所述一或多个参考基因的pcrcq值的算术平均值，cqpde4d7是pde4d7的pcrcq值。同样，可以通过应用下式产生dhx9的标准化的cq值：n(cqdhx9)＝mean(cqref_genes)–(cqdhx9)，(3)其中n(cqdhx9)是dhx9的标准化的基因表达谱值(量化周期，cq)，mean(cqref_genes)是所述一或多个参考基因的pcrcq值的算术平均值，cqdhx9是dhx9的pcrcq值。在本发明的另一方面，提出了一种诊断试剂盒，其包含：至少一个引物和/或探针，用于确定得自前列腺癌对象的生物学样品中磷酸二酯酶4d变体7(pde4d7)的基因表达谱；至少一个引物和/或探针，用于确定得自所述对象的相同或另一生物学样品中dexh-box解旋酶9(dhx9)的基因表达谱；和任选地，用于确定一或多个参考基因的基因表达谱的至少一个引物和/或探针，所述参考基因选自：智人次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hprt1)，微管蛋白α-1b(tuba1b)，智人pumiliorna结合家族成员(pum1)和智人tata盒结合蛋白(tbp)；其中所述诊断试剂盒进一步包含用于基于pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱计算术前预后风险评分的指令，所述指令存储在计算机程序产品上，当计算机执行时，其执行一种方法，所述方法包含：-基于pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱确定所述对象的术前预后风险评分，任选地，其中所述方法包含：-相对于所述一或多个参考基因标准化pde4d7的基因表达谱和/或dhx9的基因表达谱，其中，基于标准化的基因表达谱确定术前预后风险评分。优选地，用于计算术前预后风险评分的指令包含将pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱与得自一群前列腺癌对象的回归函数组合的指令。在本发明的另一方面，提供了如权利要求7或8所述的诊断试剂盒在前列腺癌对象的术前风险分层的方法中的应用。在本发明的另一方面，提供了磷酸二酯酶4d变体7(pde4d7)的基因表达谱和dexh-box解旋酶9(dhx9)的基因表达谱在前列腺癌对象的术前风险分层中的应用，包含：-确定得自所述对象的生物学样品中pde4d7的基因表达谱，-确定得自所述对象的相同或另一生物学样品中dhx9的基因表达谱，和-基于pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱确定所述对象的术前预后风险评分。优选将pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱与得自一群前列腺癌对象的回归函数组合。在本发明的另一方面，提供了一种包含指令的计算机程序产品，当计算机执行程序时，所述指令使计算机执行一种方法，所述方法包含：-基于磷酸二酯酶4d变体7(pde4d7)的基因表达谱和dexh-box解旋酶9(dhx9)的基因表达谱确定前列腺癌对象的术前预后风险评分，其中pde4d7的基因表达谱在得自所述对象的生物学样品中确定，并且dhx9的基因表达谱在得自所述对象的相同或另一生物学样品中确定。优选将pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱与得自一群前列腺癌对象的回归函数组合。在进一步优选的实施方案中，基于术前预后风险评分和术后临床风险评分capra-s确定所述对象的术后预后风险评分。优选将术前预后风险评分和术后临床风险评分capra-s与得自一群前列腺癌对象的回归函数组合。这些进一步优选的实施方案可以通过权利要求1的方法、权利要求7的诊断试剂盒、权利要求9的诊断试剂盒的应用、权利要求10的基因表达谱的应用以及权利要求12的计算机程序来实现。应当理解，权利要求1的方法、权利要求7的诊断试剂盒、权利要求9的诊断试剂盒的应用、权利要求10的基因表达谱的应用和权利要求12的计算机程序具有相似和/或相同的优选实施方案，特别是如所附权利要求书中所定义。应当理解，本发明的优选实施方案也可以是所附权利要求书或以上实施方案和各个独立权利要求的任意组合。参考下文描述的实施方案，本发明的这些和其它方面将变得明显并得到阐明。附图简述在如下图示中：图1图示示例说明对前列腺癌对象的术前风险分层方法实施方案的流程图，图2示出rp患者队列中前列腺癌手术后5年生化复发(bcr)的roc曲线分析的结果，图3示出rp患者队列中前列腺癌手术后10年临床复发(cr)的roc曲线分析的结果，以及图4示出rp患者队列中前列腺癌手术后10年前列腺癌特异性死亡的roc曲线分析的结果。实施方案详述术前风险分层综述图1图示示例说明前列腺癌对象的术前风险分层方法实施方案的流程图。所述方法在步骤s100起始。在步骤s102，从经诊断患有前列腺癌的第一组患者(对象)中每个患者获得一或多个生物学样品。优选地，在获得生物学样品之后，例如至少一年、或至少两年、或大约五年的一段时间，对这些前列腺癌患者进行前列腺癌监测。在步骤s104，例如通过对从每个生物学样品中提取的rna进行rt-qpcr(实时定量pcr)，对从第一组患者中每个患者中获得的相同或不同生物学样品获得pde4d7和dhx9的基因表达谱。示例的基因表达谱包括pde4d7和dhx9的表达水平(例如值)，可以使用一组参考基因例如hprt1、tuba1b、pum1和/或tbp中每个基因的值将其标准化。在一个实例中，相对于选自hprt1、tuba1b、pum1和tbp的一或多个参考基因、例如至少一个或至少两个基因或至少三个或优选所有这些参考基因将pde4d7和dhx9的基因表达谱值标准化。在步骤s106，基于对得自第一组患者的至少一些生物学样品获得的pde4d7和dhx9的基因表达谱和得自所述监测的各个结果，确定赋予术前预后风险评分的回归函数。在一个可能的实例中，首先使用合适的转换函数将pde4d7和/或dhx9的标准化的基因表达谱转换为预定的值范围，例如上述1-5的范围。如上所述，这种转换可以通过考虑例如一群前列腺癌对象(在此为第一组患者)的生物学样品的pde4d7(或dhx9)的标准化的基因表达谱值的频率分布以及通过确定将频率分布转换为期望范围的转换而确定。在一个特定实例中，如上文等式(1)所示确定标准化的转换的基因表达谱值。在步骤s108，从患者(对象或个体)获得一或多个生物学样品。所述患者可以是新患者或第一组中的一个。在步骤s110，例如通过对生物学样品进行pcr而获得pde4d7和dhx9的基因表达谱。在一个实例中，相对于选自hprt1、tuba1b、pum1和tbp的一或多个参考基因、例如至少一个或至少两个或至少三个或优选所有这些参考基因，将pde4d7和dhx9的基因表达谱值标准化。这与步骤s104基本相同。此外，pde4d7和/或dhx9的标准化的基因表达谱可以如关于步骤s106所述进行预转换。可以在步骤s104和s110中另外或替代地使用的其它参考基因包括：智人肌动蛋白βmrna(actb)；智人60s酸性核糖体磷蛋白p0mrna(rplp0)；聚合酶(rna)ii(dna定向)多肽a，220kda(polr2a)；β-2-微球蛋白(b2m)；以及氨基乙酰丙酸-δ-合酶(alas-1)。在步骤s112，基于pde4d7和dhx9的基因表达谱，使用回归函数确定患者的术前预后风险评分。稍后将在说明书中对此进行更详细地描述。为了使术前预后评分对于用户直观，还可以确定其值在预定义的数值范围内，例如1-5的范围。这可以通过回归函数本身实现，也可以通过随后将回归函数的输出值转换为期望的值范围的合适转换实现。同样，这类似于临床常规中使用的其它类别，例如组织病理学分级(gleason)或多参数mri放射评分(pirads)。在步骤s114，可以基于术前预后风险评分为例如患者或其监护人、医生或其它医护人员提供治疗建议。为此，可以基于术前预后风险评分的值将术前预后风险评分分类为预定风险组之一。提供治疗建议可包括以下一或多项：a)基于指派的风险组为患者提出治疗方案，其中至少两个风险组与不同治疗相关；b)计算在前列腺手术之前或之后患者的疾病进展风险预测；和c)计算在前列腺手术之前或之后患者的治疗反应预测。示例治疗包括至少部分前列腺切除术，选自放射治疗、化学治疗及其组合的主动治疗，以及单独观察，即不进行前列腺切除术或主动治疗(即主动监测)。所述方法在步骤s116结束。每个风险组都可能与各自的提议治疗相关，其侵袭性有所不同。每种提议的治疗可以基于指派给该风险组的第一组患者的结果，而且是被预测为提供不超过发生前列腺癌的阈值临床风险的最小侵袭性治疗。在某些情况下，与使用其它风险分析方法例如使用gleason评分、nccn风险类别或术前capra评分的情况相比，这可以将新患者指派至与低侵袭性提议治疗相关的风险组中。在一个实施方案中，通过使用一或多个引物和/或探针和/或一或多组引物和/或探针检测mrna表达来确定在步骤s104和s110的基因表达谱。表1示出pde4d7、dhx9和所述一或多个参考基因的详细说明，包括其转录物id(ncbirefseq)以及引物对和探针的相应氨基酸序列。这个表还示出了每个基因的有义引物和反义引物，以及与扩增子特异性结合的探针序列。表1：示例引物和探针核酸序列代替使用rt-qpcr，在其它实施方案中，步骤s104和s110的pde4d7和/或dhx9的基因表达谱可以通过其它方式例如通过根据标准方法(illumina，inc.)进行rna下一代测序(ngsrnaseq)来确定。在这种情况下，也可以对ngsrnaseq提供的基因表达谱如上述转换为预定的数值范围。为探讨pde4d7和dhx9在术前患者风险评估中的预后能力，研究了其与疾病复发的相关性。在外科手术队列中开发了基于pde4d7和dhx9基因表达谱的组合模型，并针对不同纵向临床结果对该模型进行验证。结果表明，pde4d7和dhx9的基因表达谱的组合在改善的术前预后风险评分中可以允许更好的患者分层以优化一级治疗决策。实施例患者队列与样品使用根治性前列腺切除术(rp)患者队列，其人口统计数据示于表2。对于rp患者队列，从575名患者切除的前列腺的代表性肿瘤区域收集小的活检穿孔组织(约1mm×2mm)，所述患者已在2000年至2004年之间相继在德国一个大型临床中心进行手术。表2：根治性前列腺切除术(rp)患者队列的人口统计学数据表中示出了队列中患者年龄、术前psa、活检中肿瘤百分比、前列腺体积和psa密度的最小值和最大值，而中位数值在括号中示出。对于capra-s风险类别，示出了每个风险组的患者人数和百分比。术后病理学以病理学gleason评分和gleason分级组、病理阶段、前列腺切除术后的手术切缘状态、精囊和盆腔淋巴结的肿瘤浸润状态示出(按患者数量和百分比)。在这方面，要注意的是囊外延伸不是作为主要参数提供，而是从病理学阶段pt3a得出的。随访表明所有患者术后数月的平均和中位随访期。结果类别示例了手术一级治疗后的累积5年和10年生化复发(bcr)以及临床复发至转移(cr)。治疗类别列出了手术后累积5年和10年开始至抢救性放射治疗(srt)或抢救性雄激素剥夺治疗(sadt)。死亡率以前列腺癌特异生存期(pcss)以及总体生存期(os)示出。对于所有结果，示出了各自5年或10年随访的经历所述结果的男性人数/总男性人数，其中事件的百分比在括号中给出。实验室方法所有使用的实验室方法，包括用于rt-qpcr(定量实时pcr)的寡核苷酸引物和探针、rna提取以及在统计分析中包括/放弃样品的质量控制和过程，均如之前r.等人所述，或者在dhx9的情况中则基于根据标准方法(illumina，inc.)的rna下一代测序(ngsrnaseq)。表1还列出了用于rt-qpcr以测量感兴趣基因以及参考基因的引物和探针。在ngsrnaseq的情况中，将所得fastq文件与人基因组进行比对并根据标准方法处理。对于每个基因，获得其tpm形式的基因表达值(transcriptperkilobasemillion；见http://www.rna-seqblog.com/rpkm-fpkm-and-tpm-clear-explained(于2018年10月7日检索))。结果pde4d7和dhx9表达的逻辑回归建模在逻辑回归建模中使用pde4d7和dhx9的表达值来创建组合模型。如下表1所示，在完整5年结果历史的rp患者队列的481例rp患者亚队列中(169个事件，35.14％)，以前列腺癌手术后的5年生化复发(bcr)作为因变量。将logit(p)回归函数转换为p＝1/(1+e^(-logit(p))，以计算每个患者在手术后5年内经历生化复发的概率p。表2-6示出组合pde4d7和dhx9的表达值的逻辑回归建模结果。表1以队列大小(#481)和5年生化复发(bcr)阳性病例数和无5年bcr的阴性病例数描述了逻辑回归建模的输入。表2提供了有关模型拟合的信息，表3概述了回归模型的系数(或权重)以及相应的统计数据。表4概述了pde4d7和dhx9的比值比，而表5和表6概述了“pde4d7&dhx9”回归模型的分类表和roc曲线分析数据。表1：逻辑回归建模的输入因变量y5年生化复发(bcr)方法enter样本大小481阳性病例a169(35.14％)阴性病例b312(64.86％)a5-年bcr＝1b5-年bcr＝0表2：整体模式拟合表3：系数和标准误差变量系数标准误差waldppde4d7-0.987990.1715833.1574<0.0001dhx9-0.758910.1709519.7082<0.0001常数7.960321.3827733.1409<0.0001表4：比值比和95％置信区间变量比值比95％cipde4d70.37230.2660-0.5212dhx90.46820.3349-0.6545表5：分类表(截断值p＝0.5).表6：roc曲线分析roc曲线下面积(auc)0.713标准误差0.024195％置信区间0.670-0.753验证不同纵向临床结果的组合模型对所述组合模型进行测试，预测手术后的各种临床相关终点，例如生化复发(bcr)、临床复发(进展为局部和/或远端转移)(cr)和前列腺癌特异性死亡。对于相同的各种临床相关终点，比较组合模型的预后能力与仅pde4d7或dhx9的预后能力。图2示出具有完整5年随访的rp患者队列的患者亚队列(#481)在前列腺癌手术后5年生化复发(bcr)的roc曲线分析结果(也见表7)。如表8详细说明，计算的5年auc(曲线下面积)对于单独的pde4d7为0.659，对于单独的dhx9为0.624，对于组合模型为0.713(在图2和表8中表示为“pde4d7&dhx9”)。标准误差分别为0.0254(pde4d7)、0.0280(dhx9)和0.0242(pde4d7和dhx9)，95％置信区间分别为0.615-0.702(pde4d7)，0.579-0.667(dhx9)和0.670-0.753(pde4d7&dhx9)。表9示出roc曲线的成对比较。可以看出，单独的pde4d7以及pde4d7&dhx9组合模型的auc经检验是显著差异的(p＝0.0022)。即使对于单独的dhx9以及pde4d7&dhx9组合模型的auc，也是如此，甚至略微更为显著(p＝0.0008)。表7：亚队列a5年bcr＝1b5年bcr＝0表8：roc曲线分析变量auc标准误差c95％cidpde4d70.6590.02540.615-0.702dhx90.6240.02800.579-0.667pde4d7&dhx90.7130.02420.670-0.753cdelonge.r.etal.,“comparingtheareasundertwoormorecorrelatedreceiveroperatingcharacteristiccurves:anonparametericapproach”,biometrics,vol.44,no.3,pages837to845,1988.b二项分布精确(binomialexact)表9：roc曲线的成对比较cdelonge.r.etal.图3示出对具有完整10年随访的rp患者队列的患者亚队列(#335)在前列腺癌手术后10年临床复发(cr)的roc曲线分析结果(也见表10)。如表11详细说明，计算的10年auc(曲线下的面积)对于单独的pde4d7为0.666，对于单独的dhx9为0.691，对于组合模型为0.748(在图3和表11中表示为“pde4d7&dhx9”)。标准误差分别为0.0364(pde4d7)、0.0384(dhx9)和0.0314(pde4d7&dhx9)，95％置信区间分别为0.613-0.717(pde4d7)、0.639-0.740(dhx9)和0.698-0.794(pde4d7&dhx9)。表12示出roc曲线的成对比较。可以看出，单独的pde4d7以及pde4d7&dhx9组合模型的auc经检验是显著差异的(p＝0.0039)。表10：亚队列变量1pde4d7变量2dhx9变量3pde4d7&dhx9分类变量10年临床复发(cr)样本大小335阳性病例a61(18.21％)阴性病例b274(81.79％)a10年cr＝1b10年cr＝0表11：roc曲线分析变量auc标准误差c95％cidpde4d70.6660.03640.613-0.717dhx90.6910.03840.639-0.740pde4d7&dhx90.7480.03140.698-0.794cdelonge.r.etal.d二项分布精确表12：roc曲线的成对比较cdelonge.r.etal.图4示出具有完整10年随访的rp患者队列的患者亚队列(#302)在前列腺癌手术后10年前列腺癌特异性死亡的roc曲线分析结果(也见表13)。如表14详细说明，计算的10年auc(曲线下的面积)对于单独的pde4d7为0.729，对于单独的dhx9为0.622，对于组合模型为0.754(在图4和表14中表示为“pde4d7&dhx9”)。标准误差分别为0.0588(pde4d7)、0.0593(dhx9)和0.0481(pde4d7&dhx9)，95％置信区间分别为0.676-0.779(pde4d7)、0.564-0.676(dhx9)和0.702-0.802(pde4d7&dhx9)。表15示出roc曲线的成对比较。可以看出，单独的dhx9以及pde4d7&dhx9组合模型的auc经检验是显著差异的(p＝0.0403)。表13：亚队列变量1pde4d7变量2dhx9变量3pde4d7&dhx9分类变量10年前列腺癌特异性死亡样本大小302阳性病例a25(8.28％)阴性病例b277(91.72％)a10-年pcss＝1b10-年pcss＝0表14：roc曲线分析变量auc标准误差c95％cidpde4d70.7290.05880.676-0.779dhx90.6220.05930.564-0.676pde4d7&dhx90.7540.04810.702-0.802cdelonge.r.etal.d二项分布精确表15：roc曲线的成对比较cdelonge.r.etal.提供的结果表明，使用pde4d7和dhx9基因表达值的组合逻辑回归模型预测手术后5年生化复发改良了roc分析中的曲线下面积(auc)，与单独使用pde4d7作为预后指标相比改良2.5％(对于前列腺癌特异性死亡作为终点)至8％(对于临床复发作为终点)。在自变量数据集中对组合模型预测前列腺癌手术后的转移进行自变量测试图5示出在自变量数据集中对组合模型(表16中表示为“pde4d7&dhx9”)预测前列腺癌手术后的转移进行自变量测试(数据来自taylorb.s.etal.,“integrativegenomicprofilingofhumanprostatecancer”,cancercell,vol.18,no.1,pages11to22,2010)。如表16中详述，计算的转移类别auc(曲线下面积)对于pde4d7&dhx9为0.736。标准误差为0.0777，95％置信区间为0.651-0.809。表16：自变量数据集变量pde4d7&dhx9分类变量转移类别样本大小129阳性病例a8(6.20％)阴性病例b121(93.8％)疾病流行(％)未知a转移类别＝1b转移类别＝0表17：roc曲线分析auc0.736标准误差c0.077795％置信区间d0.651-0.809z统计量3.029显著性水平p＝0.024cdelonge.r.etal.d二项分布精确表18：youden指数youden指数j0.4194相关标准>-1.16敏感性75.00特异性66.94pde4d7&dhx9组合模型与手术后临床风险评分capra-s的逻辑回归建模以预测手术后转移将pde4d7&dhx9组合模型以及手术后临床风险评分capra-s用于其它逻辑回归建模中，产生进一步的组合模型(在下文中表示为“pde4d7&dhx9&capra-s”)。如下表19所示，在来自taylerb.s.等的自变量数据中，将因变量作为前列腺癌手术后的转移类别(见上)。将logit(p)回归函数转换为p＝1/(1+e^(-logit(p))以计算每个患者术后出现转移的概率p。表20-26示出组合pde4d7&dhx9与capra-s评分的逻辑回归建模的结果。表19描述了根据样本大小(#129)以及有转移的阳性病例和无转移的阴性病例数目的逻辑回归建模的输入。表20提供了有关模型拟合的信息，表21概述了具有相应统计信息的回归模型的系数(或权重)。表22概述了pde4d7&dhx9与capra-s评分的比值比，而表23和24示出回归模型的校准测试结果(根据hosmer&lemeshow测试)。最后，表25和26概述了“pde4d7&dhx9&capra-s”回归模型的分类表的数据以及roc曲线分析。表19：逻辑回归建模的输入因变量y转移类别方法enter样本大小129阳性病例a8(6.20％)阴性病例b121(93.8％)a转移类别＝1b转移类别＝0表20：整体模型拟合空模型–2log似然性59.979全模型–2log似然性49.989卡方9.990df2显著性水平p＝0.0068cox&snellr20.0745nagelkerter20.2004表21：系数和标准误差变量系数标准误差waldppde4d7&dhx90.772520.423923.32080.0684capra-s评分0.253750.124884.12900.0422常量-2.808800.8716510.38370.0013表22：比值比和95％置信区间变量比值比95％cipde4d7&dhx92.16520.9433-4.9699capra-s评分1.28881.0090-1.6463表23：hosmer&lemeshow检验卡方2.9654df8显著性水平p＝0.9365表24：hosmer&lemeshow检验的列联表表25：分类表(截断值p＝0.5)表26：roc曲线分析auc0.713标准误差c0.024195％置信区间d0.670-0.753图6示出了pde4d7&dhx9以及pde4d7&dhx9&capra-s组合模型预测前列腺癌手术后转移的roc分析(数据得自taylorb.s.etal.,“integrativegenomicprofilingofhumanprostatecancer”,cancercell,vol.18,no.1,pages11to22,2010)。如表28详细说明，经计算的转移类别auc(曲线下的面积)对于单独的pde4d7&dhx9为0.736，对于pde4d7&dhx9&capra-s为0.840。标准误差分别为0.0777(pde4d7&dhx9)和0.0636(pde4d7&dhx9&capra-s)，95％置信区间分别为0.651-0.809(pde4d7&dhx9)和0.765-0.899(pde4d7&dhx9&capra-s)。表29示出roc曲线的成对比较。可以看出，单独的pde4d7&dhx9与pde4d7&dhx9&capra-s组合模型的auc经检验是显著差异的(p＝0.0323)，auc差异为0.104(或10.4％)。表27：自变量数据集变量1pde4d7&dhx9变量2pde4d7&dhx9&capra-s分类变量转移类别样本大小129阳性病例a8(6.20％)阴性病例b121(93.8％)疾病流行(％)未知a转移类别＝1b转移类别＝0表28：roc曲线分析变量auc标准误差c95％cidpde4d7&dhx90.7360.07770.651-0.809pde4d7&dhx9&capra-s0.8400.06360.765-0.899cdelonge.r.etal.d二项分布精确表29：roc曲线的成对比较cdelonge.r.etal.讨论原发性局限性前列腺癌的治疗决策在很大程度上取决于未来疾病进展的风险和预期寿命的组合。提供的数据表明，与单独使用pde4d7作为预后标志物相比，在术前风险评分中使用pde4d7和dhx9组合可增加价值。因此，dhx9在临床预测模型中可以为pde4d7增加对疾病特定结果的预后价值，例如手术后进展为生化复发或临床复发至转移以及预测癌症特异生存率以支持治疗决策确定。通过研究附图、公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践请求保护的发明时可以理解和实现所公开的实施方案的其它变型。在权利要求术中，单词“包含”不排除其它元素或步骤，不定冠词“a”或“an”不排除多个。图1所示方法的一或多个步骤可以在可在计算机上执行的计算机程序产品中执行。所述计算机程序产品可以包含其上记录(存储)有控制程序的永久性计算机可读记录介质，例如磁盘、硬盘驱动器等。永久性计算机可读介质的常见形式包括例如软盘(floppydisks)、软盘(flexibledisks)、硬盘、磁带或任何其它磁性存储介质、cd-rom、dvd或任何其它光学介质、ram、prom、eprom、flash-eprom或其它存储芯片或盒式磁带，或者计算机可读和使用的任何其它永久性介质。或者，所述方法的一或多个吧步骤可以在暂时性介质中实施，例如可传输的载波，其中控制程序使用如声波或光波之类的传输介质作为数据信号呈现，例如在无线电波和红外数据通信期间产生的那些。示例方法可以在一或多个通用计算机、专用计算机、编程微处理器或微控制器和外围集成电路元件、asic或其它集成电路、数字信号处理器、硬连线电子或逻辑电路例如独立元件电路、可编程逻辑装置如pld、pla、fpga，图形卡cpu(gpu)或pal上执行。通常，能执行有限状态机且能执行图1所示流程图的任何设备都可用于执行风险分层方法的一或多个步骤，用于前列腺患者的治疗选择。如将理解的，虽然所述方法的步骤可全部是计算机执行的，在一些实施方案中一或多个步骤可至少部分手动执行。计算机程序指令也可以加载到计算机、其它可编程数据处理装置或其它设备上，以使得在所述计算机、其它可编程装置或其它设备上执行一系列操作步骤，产生计算机执行过程，由此使得在计算机或其它可编程装置上执行的指令提供执行在此指定的函数/行为的程序。尽管到目前为止本发明已经基于pde4d7的基因表达谱进行了描述，其可以包括pde4d7的表达水平(例如值)，所述表达水平可以使用一组参考基因的每个基因的值进行标准化，所述基因表达谱可以进一步包括来自其它pde4d变体的表达信息。例如，其它pde4d变体可以包括pde4d1、pde4d2、pde4d3、pde4d4、pde4d5、pde4d6、pde4d8和pde4d9中的一或多个。然后，诊断试剂盒可以另外包含至少一个引物和/或探针，用于确定得自前列腺癌对象的生物学样品中其它pde4d变体每一个的基因表达谱。然而，优选仅使用pde4d7的基因表达谱，特别是可以使用一组参考基因的每个基因的值进行标准化的pde4d7的表达水平(例如值)。术语“磷酸二酯酶4d1”或“pde4d1”涉及人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体1，即人磷酸二酯酶pde4d1基因，例如ncbi参考序列：nm_001197222.1中所定义的序列，特别是seqidno:1所示核苷酸序列，其对应于上述pde4d1转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:2所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_001184151.1中定义的编码pde4d1多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d1”或“pde4d1”还涉及可以由引物对pde1d1d2_正向(seqidno:3)和pde1d1d2_反向(seqidno:4)产生且可以通过探针seqidno:5检测的扩增子。术语“磷酸二酯酶4d2”或“pde4d2”是指人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体2，即人磷酸二酯酶pde4d2基因，例如ncbi参考序列：nm_001197221.1中所定义的序列，特别是seqidno:6所示核苷酸序列，其对应于上述pde4d2转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:7所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_001184150.1中定义的编码pde4d2多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d3”或“pde4d3”是指人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体3，即人磷酸二酯酶pde4d3基因，例如ncbi参考序列：nm_006203.4中所定义的序列，特别是seqidno:8所示核苷酸0序列，其对应于上述pde4d3转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:9所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_006194.2中定义的编码pde4d3多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d4”或“pde4d4”是指人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体4，即人磷酸二酯酶pde4d4基因，例如ncbi参考序列：nm_001104631.1中所定义的序列，特别是seqidno:10所示核苷酸序列，其对应于上述pde4d4转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:11所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_001098101.1中定义的编码pde4d4多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d5”或“pde4d5”是指人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体5，即人磷酸二酯酶pde4d5基因，例如ncbi参考序列：nm_001197218.1中所定义的序列，特别是seqidno:12所示核苷酸序列，其对应于上述pde4d5转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:13所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_001184147.1中定义的编码pde4d5多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d5”或“pde4d5”还涉及可由引物对pde4d5_正向(seqidno:14)和pde4d5_反向(seqidno:15)产生且可由探针seqidno:16检测的扩增子。术语“磷酸二酯酶4d6”或“pde4d6”是指人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体6，即人磷酸二酯酶pde4d6基因，例如ncbi参考序列：nm_001197223.1中所定义的序列，特别是seqidno:17所示核苷酸序列，其对应于上述pde4d6转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:18所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_001184152.1中定义的编码pde4d6多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d8”或“pde4d8”涉及人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体8，即人磷酸二酯酶pde4d8基因，例如ncbi参考序列：nm_001197219.1中所定义的序列，特别是seqidno:27所示核苷酸序列，其对应于上述pde4d8转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:28所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_001184148.1中定义的编码pde4d8多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d9”或“pde4d9”涉及人磷酸二酯酶pde4d的剪接变体9，即人磷酸二酯酶pde4d9基因，例如ncbi参考序列：nm_001197220.1中所定义的序列，特别是seqidno:29所示核苷酸序列，其对应于上述pde4d9转录物的ncbi参考序列的序列，还涉及例如seqidno:30所示的相应氨基酸序列，其对应于ncbi蛋白质登录参考序列np_001184149.1中定义的编码pde4d9多肽的蛋白质序列。术语“磷酸二酯酶4d9”或“pde4d9”还涉及可由引物对pde4d9_正向(seqidno:31)和pde4d9_反向(seqidno:32)产生且可由探针seqidno:33检测的扩增子。术语“pde4d1”、“pde4d2”、“pde4d3”、“pde4d4”、“pde4d5”、“pde4d6”、“pde4d8”和“pde4d9”也包含分别与pde4d1、pde4d2、pde4d3、pde4d4、pde4d5、pde4d6、pde4d8和pde4d9示出高度同源性的核苷酸序列，例如分别与seqidno:1、6、8、10、12、17、27或29所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，或者分别与seqidno:2、7、9、11、13、18、28或30所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，或者编码与seqidno:2、7、9、11、13、13、18、28或30所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，或者或由与seqidno:1、6、8、10、12、17、27或29所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列编码的氨基酸序列。权利要求书中的任何参考标记都不应被解释为限制范围。本发明涉及前列腺癌对象的术前风险分层的方法，包含确定得自所述对象的生物学样品中磷酸二酯酶4d变体7(pde4d7)的基因表达谱，确定得自所述对象的相同或另一生物学样品中dexh-box解旋酶9(dhx9)的基因表达谱，及基于pde4d7的基因表达谱和dhx9的基因表达谱确定所述对象的术前预后风险评分。这可以在术前设置中改善对象的分层，可以导致更好的一级治疗决策。例如，对于前列腺癌患者的某些亚群，术前预后风险评分可以就是选择主动监测还是主动干预例如根治性前列腺切除术提出更好建议。所附标题为2018pf00399_序列表_st25的序列表以其全文并入本文参考。序列表<110>皇家飞利浦有限公司格拉斯哥大学委员会<120>基于pde4d7和dhx9表达的术前风险分层<130>2018pf00399<160>75<170>patentinversion3.5<210>1<211>7801<212>dna<213>智人<400>1gtggtggccgcgcacccggccgcggctgattcattcacttcaagtgccgtgcagaaggct60cggcaggcggggcgggcgtggggccgcggctccgggttggggaccgaggagatccggctg120tggaccagacgctcctctgcggggcgggcacccaagcgcgctcgccaccccctcgccatc18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