一种用于从含内毒素源或潜在含内毒素源中去掉或去除内毒素的方法与流程
本发明涉及用于从含内毒素的源和可采用本发明方法的各个领域中去掉或去除内毒素的方法，以及可通过本发明的方法获得的级分。
背景技术：
脂多糖(lipopolysaccahrides，lps)是革兰氏阴性细菌的细胞壁成分。当这类细菌死亡并降解时，lps，也称为内毒素，就会脱落到周围环境中。内毒素是稳定的，即使在恶劣的条件下也能长期存在。内毒素是生物制药行业关注的问题，因为它们毒性很大。即使是低至百万分之几的量也会引起发烧反应。较大剂量会导致器官衰竭和死亡。
生物加工领域内毒素的潜在来源包括以下几种：
-部分产品生长在革兰氏阴性菌中。因此，它们受到大量内毒素的污染。
-用于生产生物制药、蛋白质溶液、缓冲液和其它工艺溶液的细胞培养物会被革兰氏阴性细菌污染(感染)，这些细菌会将内毒素释放到溶液中。
-即使在没有活的革兰氏阴性细菌存在或最近才存在的情况下，也可以存在内毒素。例如，用于配制工艺溶液的干化学成分可被内毒素污染。
-由于工艺卫生的不充分，与污染源的偶然接触也会使工艺溶液受到污染。同样，不需要实际感染活细菌。内毒素的来源远比活菌的来源更多样，分布更广泛。
世界各地的监管当局都意识到内毒素污染可能对接受治疗的人产生严重的不良后果，因此他们对允许的内毒素水平制定了严格的限制。例如，最近的出版物表明，特别是美国食品和药物管理局常常对充分控制生物制药成品中的内毒素水平[1,2]的制造方法的充分性不满意。
这给生物制药工业领域的制造商带来了压力，要求他们设计出有效去除内毒素的工艺。更有效的过程需要更有效的工具。
目前有多种方法可用于降低生物制药产品中的内毒素水平。阴离子交换色谱法是最古老和最广泛使用的方法之一。阴离子交换剂具有正电荷，它们主要通过电荷相互作用来结合生物分子。具体地说，具有足够负电荷的生物分子与阴离子交换器上的正电荷结合。内毒素带负电，与阴离子交换剂强力结合。大多数情况下，内毒素与阴离子交换剂的结合比感兴趣的生物制药产品更强。这使得有可能选择性地洗脱感兴趣的产物，基本上不含内毒素。四元阴离子交换剂(q、qa、qae、tmae)的内毒素去除性能是其它内毒素去除方法比较的基准[3-7]。
阴离子交换色谱的许多变型也起作用，包括所谓的多模态或混合模态色谱介质。术语“多模态”是指它们利用一种以上的化学机制来结合生物分子，如正电荷和负电荷的结合、芳香和脂肪族疏水基团的结合、氢供体和氢受体的结合等。几乎所有用于结合内毒素的多模态介质都带正电荷[3-5]。实例包括固定化氨基酸，如组氨酸或组胺。在其它情况下，合成化学结构结合至少一个正电荷和至少一个疏水残基。在某些情况下，带正电荷和疏水性残基的组合与介导氢键的残基进一步结合。在另一些情况下，对内毒素具有高亲和力的复杂生物蛋白被固定在色谱表面以选择性地捕集内毒素。然而，这些配体仍然被它们的正电荷和它们的疏水性的效应所支配[8]。
金属亲和色谱代表了另一类去除内毒素的工具。已知可用固定在螯合配体亚氨基二乙酸(ida)上的铁或钙去除内毒素[9,10]。然而，该方法在实际应用中存在不足。ida的净电荷为2-。钙的净电荷为2+，铁的净电荷为2+或3+。这就使配体：金属配合物的净电荷要么是0，要么是弱的+1。实际的结果是许多蛋白质和其它生物体不能结合。它们在处理过程中变得稀释，需要后续的方法来浓缩它们。另一个缺点是许多非内毒素污染物也无法与未结合部分中的目标产品结合并保留在其中。这是很重要的，因为治疗应用需要宿主蛋白与内毒素一起降低到很低的水平。实际结果是需要额外的净化步骤。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种用于去掉或去除含内毒素源或潜在含内毒素源中的内毒素的改进方法。本发明的另一个目的是提供一种商业上适用的用于去掉或去除内毒素的方法，该方法可用于制药或食品工业。本发明的另一个目的是提供内毒素含量比先前生产的产品低的产品，所述产品可通过包含内毒素污染风险产品的的处理步骤的方法获得。
技术实现要素：
本发明的目的通过一种在基本上是水体系中通过固相材料从含有内毒素的源中去掉或去除内毒素的方法来实现，该方法包括以下步骤：
-提供已知或疑似含内毒素的源，
-使所述已知或疑似含内毒素的源与带正电荷的固相材料接触，所述固相材料的表面固定有三价铁，其中所述固相萃取材料已通过(2-氨基乙基)胺(tren)配体固定了三价铁；
-孵育所述已知或疑似含内毒素的源一段时间，所述时间足以将内毒素结合到多孔固相材料上，
-将所述固相材料与所述水体系分开，
-任选地分离所述水体系，该体系不含或去掉了内毒素。
该方法使用包含负载有fe3+的固定化配体tren的固相。
术语“内毒素”包括来自革兰氏阴性菌的化合物，它们被称为脂多糖(lps)。根据本发明的一个实施方式，内毒素被理解为具有致病性的内毒素或内毒素片段。术语脂多糖、内毒素或内毒素片段可以互换使用。
术语“含内毒素”的源是指任何被或可能被内毒素或内毒素片段污染的源。源可以是适合于固相萃取的基本上是水的溶液或分散体。通常，但不限于，含内毒素的源或潜在含内毒素的源可以是天然存在的生物流体，其包含至少一种被或可能被内毒素污染的感兴趣组分，例如发酵液或已在重组生产方法中使用的培养基。
术语“具有固定有三价铁的表面的固相萃取材料”描述了一种固相萃取材料，其使用包含通过螯合键合的三价铁作为主要机制的固相。术语“由(2-氨基乙基)胺(tren)固定的三价铁离子”描述了包含通过螯合键合的三价铁离子的作为主要机制的固相，并且使用三价铁离子结合配体的正电荷作为次级增强机制。
术语“固相萃取”特别是指一种样品制备过程，通过该过程，溶解或悬浮在液体混合物中的化合物根据其物理和化学性质与混合物中的其它化合物分离。固相萃取可用于从多种基质中分离感兴趣的分析物，包括尿液、血液、细胞培养物、水、饮料、土壤和动物组织。固相萃取通常利用溶解或悬浮在液体(称为流动相)中的溶质对样品进入的固体(称为固定相)的亲和力，将混合物分离成所需和不需的组分。结果是样品中所需的目标化合物或不需要的杂质保留在固定相上。通过固定相的部分被收集或丢弃，这取决于它是否含有所需的化合物或不需要的杂质。如果保留在固定相上的部分包括所需的化合物，则可将它们从固定相中移除以在附加步骤中收集，在附加步骤中用适当的洗脱液冲洗固定相。
术语“任选地将浓缩产物从不含或去掉了内毒素、宿主细胞蛋白和宿主细胞dna的基本上是水的体系中分离”是指这样一个步骤，其中浓缩在固相表面上的产物通过增加盐的浓度而选择性地释放，以破坏其与配体正电荷的相互作用，同时内毒素和dna仍因对螯合的三价铁的亲和力而结合。
“疑似含内毒素的源”是指尚不知道是否含有内毒素，但有可能含有内毒素的源。
根据本发明，内毒素与固定在固相材料(固定相)表面上的三价铁通过螯合而相互作用。因此，流过固相萃取材料的流动相被去掉或不含内毒素。同样根据本发明，带负电的内毒素与固相的表面相互作用，因为该表面被正电螯合配体三(2-氨基乙基)胺(也称为tren)共价包被而带正电荷。这两种相互作用模式之间的协作性被理解为本发明的扩展功用的基础。
根据本发明，具有tren-fe3+的固相材料的表面带正电荷，优选每个配体带至少+1或+2或+3。
“螯合”是指金属离子的稳定化学截留。它涉及在多齿螯合配体与单个中心金属原子之间形成或存在两个或多个单独的配位键。通常这些配体是有机化合物，被称为螯合剂、络合剂、螯合试剂或络合试剂。在大多数情况下，螯合力比简单的离子相互作用强很多倍，例如强15至60倍，并且使得金属离子即使在宽范围的ph值和高浓度的盐存在下也能保持被螯合配体截留。
根据本发明，固相材料通过带正电荷的螯合配体三(2-氨基乙基)胺(tren)固定三价铁。
根据本发明的一个实施方式，与固定在带负电的螯合配体上的金属相比，螯合配体tren的固有正电荷是改善本发明性能的重要因素。可以理解的是，tren的唯一正电荷对带负电荷的内毒素具有亲和力，甚至与螯合的三价铁离子介导的亲和力是独立地。已知仅通过电荷相互作用起作用的带正电荷阴离子交换色谱介质与内毒素具有这种相互作用。同样可以理解，tren的正电性将赋予其对可能存在于样品中的污染dna和rna的强亲和力。在缺乏金属亲和力的情况下，带负电的配体倾向于排斥带负电的生物分子，如内毒素、dna和rna。与带负电荷的螯合配体如ida和nta相比，带正电荷的tren的另一个实际和重要的好处是，可能希望从中去除内毒素的大多数生物制品通过静电相互作用结合，从而可以从稀源进料流中浓缩。对三价铁离子固定在带负电荷的螯合配体上的原始描述表明，大多数产物不能结合，这最终导致这些产物与施加于它们的样品相比被稀释[9,10]。
在一个实施方式中，将内毒素污染的产品与固相表面接触，所述固相表面包括负载有铁的带负电荷的螯合配体(例如ida-fe或nta-fe)。这减少了含有目标产物的液相的内毒素含量。然后将所述液相与带正电荷的螯合固相(如tren-fe)接触，该固相具有浓缩目标产物的作用，使其从上一步骤之后的稀态浓缩出来。从tren-fe中选择性洗脱产物，使内毒素仍然结合在一起。人们将认识到，这种方法在所需产品被内毒素大量污染的情况下可能是有用的；以至达到任何一种方法都不能在一次运行中达到所需的低内毒素水平的程度。
根据本发明的另一个实施方式，固相材料可以通过以下带多正电荷的螯合配体固定三价铁：二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙基五胺、n'-[5-(乙酰基-羟基-氨基)戊基]-n-[5-[3-(5-氨基戊基-羟基-氨基甲酰基)丙酰基氨基戊基]-n-羟基-丁烷二酰胺(去铁胺)、3-羟基-1，2-二甲基吡啶-4(1h)-酮(去铁酮)、4-[(3z，5e)-3，5-双(6-氧代-1-环己-2，4-二烯亚基)-1，2，4-三唑烷-1-基]苯甲酸(去铁斯若(deferasirox)),耦合到所述固相材料的表面。这些配体带正电荷。
根据本发明的另一个实施方式，所述固相材料可包括色谱材料，所述色谱材料通过三价铁螯合和/或互补静电相互作用从已知或疑似含内毒素的源中去掉或去除内毒素。
根据本发明的实施方式，固相萃取特别是选自下组的方法：色谱、色谱材料过滤、共沉淀法，及其组合。共沉淀可以包括这样的情况，其中将包含三价铁的带正电荷的固相萃取材料的颗粒添加到含内毒素的源或潜在含内毒素的源中。含有三价铁的带正电荷固相萃取材料与内毒素结合，与内毒素共沉淀的颗粒随后可被滤出或沉淀，包括借助离心或超声沉淀。
根据本发明，术语“色谱材料”包括其表面为吸附生物分子而进行化学改性的任何固相。这包括多孔颗粒(包括多孔色谱颗粒)、非多孔颗粒(包括非多孔色谱颗粒)、膜(包括多孔和非多孔膜)、大网状(三维骨架)材料(包括但不限于整体柱和水凝胶)、以无定形方式填充在柱中的单个纤维或编织材料(包括片、卷片、褶片)或其它物理构型的固相材料，流体可通过这些材料并与含内毒素或潜在含内毒素的水溶液接触。
在本发明的又一个实施方式中，固相萃取材料有利地从含内毒素的源或潜在含内毒素的源去除病毒负载。
在一些实施方式中，整体柱色谱形式将特别有利，因为其内部分散性低，缺乏湍流剪切力，以及其对大溶质如内毒素、dna和病毒的高容量。相对于其它色谱形式，它们对大溶质的高容量是特别重要的，因为已知内毒素存在于非常大的聚集体中。更高的容量转化为更高的信心，即容量不会成为内毒素去除效率的限制因素。当所需产品本身较大时，如病毒，特别是包括噬菌体时，由于噬菌体和内毒素都需要高容量，这也增加了整体柱的功用。
在本发明的另一个实施例中，可以通过生理上可接受的酸或碱调节ph值和/或通过生理上可接受的缓冲盐调节离子强度。生理上可接受的缓冲盐可选自下组：乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris(三羟氨基甲烷)、咪唑、组氨酸、组胺、三乙胺和两性离子盐(同时带正电和负电)缓冲成分，例如hepes(羟乙基哌嗪乙烷磺酸)和mes(吗啉基乙烷磺酸)等。
在大多数实施方式中，用于采用本发明方法的推荐操作ph可以在ph7.0±1.5或ph7.0±1.0或ph7.0±0.5的范围内。如有必要，可将ph范围扩大到7.0±2.0，如有必要，可扩大到更宽的ph范围，如果已知目标产品能耐受这些范围。该方法去除内毒素和核酸的能力将在这些范围内持续存在。
在大多数实施方式中，平衡tren-fe3+固相的条件将接近生理条件。这包括ph值在7.0±0.5范围内，氯化钠或氯化钾浓度约为150mm±100mm。如果需要，盐浓度可以更低，例如在0mm至50mm，或0mm至25mm，或0mm至10mm，或0mm至5mm的范围内。该方法去除内毒素和核酸的能力将在这些范围内持续存在。
在一些实施方式中，在平衡期间可能希望使用更高浓度的盐，例如250mm至1000mm，或250mm至750mm，或250mm至500mm。该方法去除内毒素和核酸的能力将在这些范围内持续存在。
应首先尝试用几乎或没有已知的与金属有强烈相互作用倾向的盐(如卤化物盐或乙酸盐)来洗脱感兴趣的生物制品。这种盐将最大限度地减少对固定化fe3+离子与内毒素和核酸的磷脂酸残基之间相互作用的干扰。例如，可以首先用高达2.0mnacl或高达3.0mnacl或高达4.0mnacl的梯度来评价洗脱。
可替代地，通过在单个步骤或多个步骤中施用磷酸盐，包括磷酸钠盐和磷酸钾盐，增加磷酸盐浓度增量或在指定范围内以线性梯度来实现所关注的生物产物的洗脱。例如，洗脱可以在一个步骤中进行到500mm磷酸盐；或以100mm、或50mm、或更小或更大的增量增加磷酸盐浓度，直至磷酸盐的最终浓度为500mm；或由0mm至500mm磷酸盐的线性梯度。作为一般情况，洗脱目标生物制品的最低浓度将提供最有效的内毒素和核酸的减少。很少需要超过500mm的磷酸盐，但如果需要，可以评估更高的增量。当磷酸盐浓度超过500mm时，由于磷酸钠的溶解度在高浓度时受到限制，所以磷酸钾将比磷酸钠更受欢迎。柠檬酸盐可以代替磷酸盐，但内毒素的去除可能会受到影响。洗脱可以用螯合剂如edta(乙二胺四乙酸)来实现，但有很高的风险损害该方法去除内毒素的能力。
本发明的另一实施例采用本发明的方法用于在含有病毒的来源中去除病毒，用于制备低内毒素噬菌体含量的组合物，用于纯化重组产生的蛋白质，特别是用于治疗应用的蛋白质；用于从用于制备重组蛋白的细胞培养成分中去除内毒素和/或病毒，以及从体外诊断分析试剂中去除内毒素，其中内毒素可能以干扰分析的精确和准确结果的能力的方式与样品组分相互作用。
本发明的主题还包括通过本发明的方法获得的包含不含或去掉了内毒素的基本上是水的体系的级分，其内毒素浓度特别小于1eu/109感染性噬菌体颗粒(每十亿噬菌体颗粒1eu)。
在一些实施方式中，样品中内毒素单位的浓度可以通过基于鲎阿米巴细胞裂解物测定的某些形式的测定来确定。简而言之，鲎是马蹄蟹的属名。其血液中含有被称为阿米巴细胞的细胞。当阿米巴细胞裂解并暴露于内毒素时，就会产生凝块。这种分析以多种物理形式产生，允许简单、准确和可重复性的内毒素定量。这样的分析在本领域中是公知的，并且许多自动分析系统可用于在常规可重现的基础上进行这样的测试。一个例子包括查尔斯河(charlesriver)实验室生产的endosafe系统。完整的分析方法见www.criver.com/sites/default/files/resources/
在需要相对于固定数量的感染病毒颗粒(例如噬菌体)表达内毒素量的实施方式中，需要估计这种病毒颗粒的数量。感染性病毒颗粒数的估计通常是通过一系列称为空斑分析的方法来实现的。噬菌体的空斑分析通常在培养皿或多孔板中进行。它们包括首先创建一个凝胶层，该凝胶层浸渍了特定噬菌体种类已知会感染的细菌种类。将噬菌体的稀溶液涂于表面并允许浸入第一凝胶层，然后添加第二凝胶层以防止液体在表面上无节制地扩散。在噬菌体与细菌细胞接触的任何地方，它都会感染该细胞并最终杀死它，释放出数以千计到数以百万计的噬菌体。这些细菌会感染更多的细菌细胞，最终在一个足够大的区域内形成一个可见的斑块，这一区域在视觉上与仍由活的细菌细胞居住的区域是不同的。在不同的噬菌体浓度下进行几个这样的实验，直到可以合理地确定1个空斑对应于1个原始感染性噬菌体的程度。这一原始的感染性噬菌体被称为空斑形成单位(pfu)。原始样品每体积单位的pfu数，例如每ml(ml)，被理解为代表原始样品中感染性噬菌体的浓度。知道pfu/ml的数量，就有可能表达内毒素的相对浓度；例如每百万pfu10个内毒素单位，或每百万感染性噬菌体10个内毒素单位，或10个eu/106pfu。
本发明的主题还包括用于执行本发明的方法的至少一个组件的试剂盒。在本发明试剂盒的一个实施方式中，它包括至少一种组件，所述至少一种组件是本发明固相萃取材料中的至少一种，特别是颗粒材料或整体柱或其组合的形式。
本发明的试剂盒还可以包括执行本发明的方法的说明书。
在密切相关的实施方式中，试剂盒可任选地包括具有一些去除内毒素的能力的其它整体柱，例如以下一种或多种：涂覆有带负电荷的螯合剂的整体柱、涂覆有非金属结合阴离子交换剂的整体柱和/或涂有用于高盐应用的羟基的整体柱。
本发明的试剂盒可用作内毒素去除试剂盒，包含固定化的三价铁离子的固相tren-fe，与氢键固相(例如h-bondadc整体柱)的组合。该试剂盒可用于噬菌体的制备，但也可用于许多其它场合，特别包括抗体。内毒素是包括生物技术在内的许多制药业产品部门的一个问题。
另一种这样的试剂盒，也是噬菌体导向的，可以包含一种或多种固定化的三价铁离子固相tren-fe与羟基化固相(如oh整体柱)的组合，其中羟基化固相用于浓缩噬菌体并减少污染物负载，如蛋白质、核酸和内毒素。
在另一个实施方式中，包含用于执行本发明方法的至少一种组分的试剂盒可包括tren整体柱，并进一步包括羟基涂覆的整体柱，其中两种整体柱用于纯化病毒，特别是包括低内毒素、低dna和低宿主蛋白污染的噬菌体。
在另一个实施例中，包括用于执行本发明的方法的至少一个部件的试剂盒可仅包括tren整体柱。在一个这样的实施方式中，试剂盒可用于从抗体中去除内毒素的特定应用。它也可用于去除噬菌体制剂中的内毒素，这些噬菌体制剂已通过其它方法部分纯化。
本发明的另一个实施方式是一种在基本上是水的体系中的通过固相材料萃取从含热原源中去掉或去除热原的方法，该方法包括以下步骤：
-提供已知或疑似含有热原的源，
-使已知或疑似含热原的源与表面固定有三价铁的固相材料接触，
-孵育已知或疑似含热原的源一段时间，足以将热原结合到多孔固相材料上，
-从基本上是水的体系中分离固相材料与，
-任选地分离不含或去掉了热原的基本上是水的体系，该系统。
附图简述
图1显示了实施例2色谱图。
图2显示了实施例3色谱图。
图3显示了实施例6色谱图。
图4显示了实施例7色谱图。
图5显示了实施例8色谱图。
发明详述
本发明利用三价铁的结合能力和静电相互作用的能力优先与内毒素或内毒素片段相互作用。在下文中，通过使用本发明的方法从大肠杆菌培养物产生的噬菌体中去除内毒素来详细描述本发明。鉴于本发明的教导，本领域技术人员可以容易地开发类似的方法，用于从任何含有内毒素或怀疑含有内毒素的样品中去除内毒素或内毒素片段。
用于治疗和其它商业应用的噬菌体是通过首先培养它们所针对的细菌来生产的。在适当的细胞培养物中接种所需种类的细菌。当细菌细胞密度接近其最高水平时，细菌依次接种所需纯化的特定种类的噬菌体。一个或多个这样的单个噬菌体颗粒感染细菌细胞。他们将自己的dna注入细菌细胞，然后在细菌细胞内产生数百到数千个甚至更多的噬菌体。细菌细胞裂开并释放噬菌体，然后感染更多的细菌细胞。在某种程度上，几乎所有的细菌细胞都被感染并死亡，现在大量的噬菌体与死亡细菌的碎片一起存在于细胞培养物中。细胞培养过程终止，噬菌体被收获。更具体地说，例如通过过滤或离心去除细菌碎片，并且因此使噬菌体制剂处于可以从可溶性污染物如蛋白质、dna、内毒素和细胞培养组分中纯化噬菌体的状态。
最感兴趣的噬菌体种类通常是那些感染和杀死最危险的细菌种类的噬菌体。这种细菌种类特别包括所谓的革兰氏阴性种类，包括埃希氏菌(escherichiaspp.)、沙门氏菌(salmonellaspp.)、假单胞菌(pseudomonasspp.)、奈瑟菌属(neisseriaspp.)、军团菌属(legionellaspp.)、志贺菌属(shigellaspp.)和克雷伯菌(klebsiellaspp.)等。除了致病潜力外，这些物种还造成了另一种负担。它们的细胞壁含有脂多糖(lps)，也被称为内毒素。内毒素是致病的，甚至独立于其母体细菌。在某些情况下，即使是lps的片段，如分子的脂质a区，也是致病的。高浓度或lps从濒死的细菌释放到细胞培养物中。为了使噬菌体安全地用于人类，必须将内毒素去除到极低的水平。噬菌体收获物中的内毒素水平通常可能超过每毫升50,000个内毒素单位(eu/ml)，通常必须降低到10eu/ml或更低才能安全地供人使用。
非革兰氏阴性细菌产生的噬菌体，如葡萄球菌(staphyloccusspp.)或链球菌属(streptococcusspp.)也可能受到各种来源的内毒素污染。即使通常以低得多的水平被污染，它们也可通过本发明的处理而显著受益。
本发明的核心方法涉及固相，其表面已被化学修饰以包括螯合剂，特别是具有螯合三价铁离子(fe3+)能力的螯合剂，即带正电荷的铁螯合剂，例如三(2-氨基乙基)胺(tren)等等。将带正电荷的螯合固相暴露于三价铁离子的溶液，如100mm氯化铁水溶液，使螯合基团带电，使得固相表面涂覆有螯合的三价铁离子
在不受任何理论束缚的情况下，螯合的三价铁离子被认为对内毒素分子的脂质a和核心多糖区域的磷酸盐相关氧原子具有很强的优先亲和力。氨基和酰胺氮原子，如果存在于这些区域，也被理解为有助于铁亲和力。带正电荷的螯合配体可理解为赋予固相表面带正电荷，其对内毒素具有很强的静电亲和力，并与铁对内毒素的金属亲和力协同作用。当含有内毒素的溶液暴露于固相表面的螯合的三价铁离子时，内毒素结合。这种结合足够强，在盐浓度和ph值的很大范围内都能存在。然而，噬菌体与螯合的三价铁离子的结合很弱或根本不结合。在没有带正电荷的配体的情况下，这导致它们流过固相表面。由电正性螯合配体赋予的固相的正电荷引起噬菌体结合，这具有将它们从稀释的进料流中浓缩的有益效果。该方法不要求固相为柱形式。任何允许内毒素与螯合铁固相直接接触的固体物理形式都将获得所需的结果。
根据本发明，具有tren-fe3+的固相材料的表面带正电荷，优选每个配体带至少+1或+2或+3。
螯合剂的正电荷也可理解为增加固相对内毒素的亲和力，因为脂质a和核心多糖区域的带负电荷的磷酸盐相关氧原子将受到螯合配体上正电荷的强静电吸引。
在本发明方法的许多实施方式中，污染的核酸，包括dna和rna，将随着内毒素的减少或去除而被减少或去除。可以理解，它们与固相的强结合将通过它们的磷酸基团对固定化的铁的亲和力和它们对带正电荷的固相的静电亲和力来介导。
实验数据表明，对于所有实施方式，固定化的三价铁离子是使内毒素能够非常强的结合并进一步使它们能够与较弱结合的噬菌体分离的因素。内毒素结合似乎对所有内毒素都是一致的强。噬菌体与固相上螯合的三价铁离子的结合能力相对较弱，这可以通过观察噬菌体缺乏促进内毒素强结合的磷酸残基来解释。然而，除了缺乏磷酸盐残留物外，噬菌体之间的结构和化学性质也存在差异。许多带有正电荷，介导与带负电荷的固相的相互作用。许多都带有负电荷，介导与带正电荷的固相的相互作用。
螯合剂tren最多有四个正电荷。当它结合一个带三个正电荷的三价铁离子时，它的净电荷假设变成+7。该方法是值得注意的，最主要是因为它具有降低内毒素污染的出色能力，但它还值得注意的是，因为它在操作条件方面是极其宽容的。这赋予了它比替代方法更大的灵活性。例如，阴离子交换色谱要求在样品应用中保持低盐浓度。高盐浓度干扰内毒素结合，从而限制阴离子交换色谱工艺的应用。用于离子交换的盐一般应该是单价的，如氯化钠，其单个离子cl只有1-的电荷，na只有1+的电荷。nacl的负载浓度一般应保持在约50mm以下。使用多价离子如磷酸盐，取决于ph值，带2或3个负电荷，即使在很低的浓度，如约25mm或更低的浓度下，离子交换剂也不能有效地去除内毒素。即使在nacl浓度从约100mm到约1000mm和磷酸盐浓度至少高达500mm的情况下，利用在tren中涂覆有螯合的三价铁离子的带正电的固相也允许去除内毒素。三价铁离子法的操作ph范围也比阴离子交换法宽得多，例如约为ph3-8，而阴离子交换色谱法需要约ph7-8的操作范围。
在带正电荷的表面上螯合的三价铁离子在宽范围的条件下将噬菌体与内毒素分离的能力是本发明令人惊讶的方面之一，并且通过使其能够以不同的形式实施而扩展了本发明的功用。在一些实施方式中，缓冲条件允许噬菌体与固相弱结合。相应地，它们聚集在固相的表面上。当它们随后从固相中分离时，它们以高浓度洗脱，这可能是有利的，特别是当原始源具有大体积的低浓度噬菌体。
噬菌体对固相表面的铁基团没有已知的亲和力。但它们对固定化螯合剂上的正电荷有很强的静电吸引力。这使得噬菌体与内毒素结合在固相表面。这具有实际意义，因为它允许噬菌体从大量稀释样品中快速浓缩。由于噬菌体对固定化的铁没有显著的亲和力，它们可以被缓冲液选择性地洗脱，使内毒素强力结合，从而将噬菌体与内毒素分离。
可以理解，核酸(如dna和rna)上带负电的磷酸盐相关氧原子也会被固定的三价铁离子强力结合。同样，它们的负电荷将增强它们对带正电荷的螯合剂的亲和力。这说明了带正电荷的铁螯合剂如tren的扩展应用，因为它能增强dna和rna以及内毒素的去除。
具有带正电荷的螯合剂，而又具有固定化的三价铁离子的固相的独特的用途通过其被盐梯度洗脱的能力得到进一步扩展，因为这使得能够更有效地去除宿主细胞蛋白质。对于缺乏对三价铁离子的亲和力的污染物，固相表面在功能上相当于阴离子交换剂，因此可以利用。
实验数据表明，对于所有实施方式，固定化的三价铁离子是非常强的内毒素结合的必要因素。
在一些实施方式中，可以开发条件以使噬菌体结合固相上的螯合的三价铁离子。这可以通过避免过量盐的存在来实现，特别是包括避免过量的磷酸盐。许多噬菌体将与tren结合，这将起到浓缩它们的作用。随后可以通过增加盐的导电性来回收它们。在能够使噬菌体回收的条件下，内毒素将保持与固相结合。这种色谱模式在本领域中被公知为结合-洗脱模式，其中感兴趣的产物从粗进料物流中结合，同时一些污染物流过，然后感兴趣的产物以浓缩形式洗脱，而另一组污染物仍保持结合。在这种情况下，保持结合的污染物特别包括内毒素、dna和rna。
在一些这样的实施方式中，用于平衡样品和固相的缓冲条件可以通过在缓冲化合物存在之外不存在盐来限定，例如含有约20mm至约50mm的乙酸酯、或mes、或磷酸盐、或tris、或其它缓冲剂，同时不含另外的盐，例如氯化钠、或氯化钾、或磷酸钠、或磷酸钾、或硫酸铵、或硫酸钠、或硫酸钾。在其它的实施方式中，超过约20mm至约50mm缓冲剂浓度的盐的浓度可以将任何上述盐或其它盐限制为浓度小于约50mm、或小于约100mm、或小于约100mm。在上述所有情况下，目的是允许噬菌体结合。
在一些实施方式中，噬菌体可以在增加盐浓度的单个步骤中洗脱。在类似的实施方式中，可以包括预洗脱步骤，该预洗脱步骤在用更高浓度的盐洗脱噬菌体之前去除弱结合污染物。在一些这样的实施方式中，可以应用第三步，其中更高浓度的盐从固相中去除比噬菌体结合得更强的污染物。在一些实施方式中，代替盐浓度的离散步骤，盐浓度可以逐渐地和连续地改变以执行所谓的线性梯度洗脱。在一些实施方式中，还可以改变ph以调节实现噬菌体洗脱所需的结合条件和盐的量。一般来说，噬菌体及内毒素的结合会随着ph值的降低而增强，这意味着在低ph值下结合对盐的耐受性更强，但可能需要更多的盐来洗脱噬菌体。这种关系以及如何管理它们在本领域中是公知的。
尽管本发明实施的条件和操作形式范围很广，但重要的是认识到本发明实现了其去除或减少噬菌体制剂中内毒素的量的目的，而不管这些如何变化。在规定范围内条件的变化不是本发明是否有效的决定因素。本发明实现其所要求的内毒素的减少或去除的能力由固相表面上螯合的三价铁离子的存在确定。这是很重要的，因为它使有利于感染性噬菌体的高回收的条件得以使用。这种区别对于理解是进一步重要的，因为它与其它内毒素去除方法的要求和能力形成对比，例如阴离子交换色谱法，后者需要非常窄的ph和盐条件范围。本发明在宽范围的条件下获得良好结果的能力突出了其功用的一个重要方面。
在一些实施方式中，可能希望使用本发明的方法从与带正电荷的螯合剂-三价铁离子复合物结合不好的生物体中去除内毒素。igg抗体代表一个例子。大多数与带正电荷的介质结合不良，因为它们的正电荷产生的静电排斥阻止了有效的结合。在这种情况下，生物制品将在样品应用期间流过柱，而内毒素和核酸将被移除。
在一些实施方式中，内毒素结合所需的接触时间将根据螯合的三价铁离子结合的固相类型而变化。如果固相是以流通的形式使用的膜、纤维、片、水凝胶或整体柱的形式，例如色谱装置，则所需接触时间可小于约10秒，或小于约5秒，或小于约1秒。出于实际目的，由于包括泵流量和/或能容忍的压力在内的仪器限制，通常不可能获得如此低的接触时间。如果固相由填充在柱中的无孔颗粒组成，则所需接触时间可小于约10秒，或小于约30秒，或小于约1分钟，或小于约2分钟。如果固相由填充在柱中的多孔颗粒组成，则所需的接触时间可为约2分钟至约5分钟或更长，更长的接触时间如约10分钟至约20分钟可支持更有效的内毒素去除。如果固相由松散分布在开放容器中多孔颗粒组成，则所需接触时间可超过约30分钟，或可超过约60分钟，或可超过约120分钟，并可继续受益于进一步暴露，例如持续接触约4小时，或约8小时，或约16小时。接触时间的参数在本领域中是公知的，以及不同材料或操作形式可能需要的不同接触时间，并且在普通技术人员无需过度实验即可优化的能力范围内。
在一些实施方式中，内毒素可在使用后通过用约1mnaoh处理至少约60分钟从固相中去除。可任选地包括氯化钠，在一个实施例中产生1mnaoh加2mnacl的化合物配方。如果需要，在下一个处理周期平衡之前，通过将约1柱体积的约100mm氯化铁流过其上，可以使铁涂层再生。
在所有实施方式中，内毒素结合能力和去除效率的优化应与保持噬菌体感染其细菌靶的能力的需要相平衡。在一些这样的实施方式中，一种或多种稳定化合物可包含在缓冲液中以帮助保护病毒感染性。在一个这样的实施方式中，缓冲液可包含约10％的甘油作为稳定剂以保存病毒感染性，或约5％至约15％的甘油，或约2％至约20％的甘油，或约1％至约25％的甘油，或高达约50％的更高浓度的甘油。应认识到甘油等添加剂会增加粘度。这可能会使某些固相(如填充在柱中的颗粒)不合格，因为剪切应力与粘度成正比地增加。由于色谱床的流动是层流的，因此这种限制在整体柱上是不成立的。这有助于得出一个结论，即整体柱是固相的优选物理形式，特别是在可能需要加入粘度增加的添加剂(如甘油)以稳定噬菌体的情况下。
在一些实施方式中，缓冲液可以含有在生理条件下带正电荷的氨基酸作为稳定剂。缓冲液可特别包含约100mm至约700mm精氨酸，或约200mm至约600mm精氨酸，或约300mm至约500mm精氨酸，或约400mm至约500mm精氨酸。在一些这样的实施方式中，缓冲液可含有约100mm至200mm的组氨酸作为稳定剂，或约50mm至约250mm，或约75mm至约150mm，或约25mm至约225mm。
在其它实施方式中，缓冲液可包含约50mm至约250mm山梨醇、木糖作或甘露醇为稳定剂，或约100mm至约200mm，或约150mm至约200mm山梨醇、木糖或甘露醇。在一些实施方式中，缓冲剂可包含约1％至约15％的蔗糖，或约5％至约10％的蔗糖。在一些实施方式中，缓冲液可包含约50mm至约2.0m，或约100mm至约1.0m，或约200mm至约800mm，或约400mm至约700mm，或约500至约600mm的甘氨酸、牛磺酸或甜菜碱作为稳定剂。
具体地，在本发明的方法中将使用整体柱固相。与其它固相构型相比，整体柱支持更快的结合动力学和更高的内毒素容量。对此的一种解释--尽管不受这一理论的约束--可以在分子设计中找到，特别是内毒素的大尺寸。在有金属离子存在和无洗涤剂的情况下，即使是纯净的内毒素也会形成大的聚集体，但细菌细胞培养物中的内毒素并不纯净。它们可以与一系列其它组分共聚集，例如细胞碎片，包括细胞壁和细胞膜碎片、蛋白质、核酸、脂质和碳水化合物等。这些异质聚集体在某些情况下的尺寸可能超过几百纳米。这影响了多孔颗粒色谱介质的去除性能，因为其中一些聚集体太大，无法进入孔中，而大多数结合底物存在于孔中。即使那些小到足以进入孔的物质仍然具有缓慢的扩散常数，从而阻碍了孔的进入。
用于实践本发明的任何固相可任选地使用一次然后丢弃，或可多次使用。
所有用于去除内毒素的固相方法的一个限制是它们的容量。即使是非常有效的去除方法也会被大量过量的样品所淹没。由于这个原因，去除内毒素，特别是从高内毒素来源如噬菌体制剂中去除内毒素，通常包括一个初步步骤，使内毒素水平进入最后精制方法的范围。在预期容量为100万个内毒素单位的固相上负载1000万个内毒素单位将超出其容量并导致处理后的制剂仍受内毒素污染。
在一些实施方式中，螯合-三价铁离子固相的容量限制(如果显著的话)可以通过用替代方法预先处理样品而解决，该替代方法充分降低内毒素含量，以使内毒素含量进入一个范围，在该范围内，内毒素含量可以通过本发明的方法进一步降低，以满足纯化噬菌体适合人类使用的要求。
用于表面结合三价铁的固相萃取材料用带正电荷的螯合配体，即三(2-氨基乙基)胺(tren)进行化学修饰。
或者，带正电荷的铁螯合配体可以是二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙基五胺、n'-[5-(乙酰基-羟基-氨基)戊基]-n-[5-[3-(5-氨基戊基-羟基-氨基甲酰基)丙酰基氨基-戊基]-n-羟基-丁烷二酰胺(去铁胺)、3-羟基-1，2-二甲基吡啶-4(1h)-酮(去铁酮)或4-[(3z，5e)-3，5-双(6-氧代-1-环己-2，4-二烯亚基)-1，2，4-三唑烷-1-基]苯甲酸(去铁斯若)。一种含有固定化tren配体的固相材料在商业上以bioworksworkbeadstm40tren的名称出售。它不能以实施本发明的方法所必需的铁负载形式在商业上获得。可以合成多种其它固相材料，其上可以固定tren本身，随后三价铁离子被tren配体或另一个带正电荷的铁螯合配体捕获。这样的固相材料潜在地包括但不限于整块柱、水凝胶、过滤器、纤维、松散颗粒，它们中的任何一种都可以以即用色谱装置的形式提供。在进一步的实施方式中，使用由带正电的tren固定在固相上的三价铁离子的本发明的方法可以与另外的纯化方法组合以实现更高程度的纯化，例如更高程度的污染蛋白去除、更高程度的污染dna去除和/或更高程度的内毒素去除。在一些这样的实施方式中，使用由带正电的tren固定在固相上的三价铁离子的本发明的方法组合的可以是沉淀步骤，其中通过已知的盐沉淀技术，例如用硫酸铵或磷酸钾沉淀，或peg沉淀，例如用分子量为4-10kda的聚乙二醇沉淀，使目标产物沉淀。在其它这样的实施方式中，使用由带正电的tren固定在固相上的三价铁离子的本发明的方法组合的可以是色谱方法，例如离子交换色谱、或疏水相互作用色谱、或氢键色谱、或亲和色谱、或空间排阻色谱，或某些其它色谱方法。在一些这样的实施方式中，使用由带正电的tren固定在固相上的三价铁离子的本发明的方法可以与柱形式操作组合。在其它这样的实施方式中，使用由带正电的tren固定在固相上的三价铁离子的本发明的方法可以以分批式操作组合。在一些这样的实施方式中，使用由带正电的tren固定在固相上的三价铁离子的本发明的方法和附加的纯化方法都可以以分批方式进行。
在一个实施方式中，使用由带正电的tren固定在固相上的三价铁离子的本发明方法与另一种色谱方法相结合，另一种色谱方法涉及使用表面具有羟基(-oh)基团的固相萃取材料。在一个这样的实施方式中，该方法被用于纯化病毒的目的，例如脂包膜病毒、或非脂包膜病毒、或噬菌体。在一个这样的实施方式中，羟基化固相萃取材料可以在一种或一种沉淀盐的存在下与病毒结合，所述沉淀盐例如硫酸铵、磷酸钾、硫酸钠或硫酸钾、或柠檬酸钠或柠檬酸钾等，其中沉淀盐以足够的浓度存在，使得病毒被挤出溶液并积聚在固相表面上，同时较小的污染物不能积聚并因此被消除。随后通过降低沉淀盐的浓度来回收病毒，从而使病毒洗脱。然后，含有病毒的洗脱级分可通过本发明的方法，使用由带正电荷的tren固定在固相上的三价铁离子进行处理。
本发明的试剂盒以合适的形式包括至少一种固相萃取材料，所述固相萃取材料可用于实施本发明的方法。这是一种颗粒材料或整体柱，或其组合。所述固相萃取材料可以布置在筒、柱中或以松散形式包装。它还可以以纤维和/或纤维材料或一种或多种膜的形式提供。
在一个实施例中，用于实施本发明的方法的部件将是tren整体柱。在一个这样的实施方式中，试剂盒可任选地包括具有一些去除内毒素的能力的其它整体柱，例如以下一种或多种：涂覆有带负电荷的螯合剂的整体柱、涂覆有非金属结合阴离子交换剂的整体柱和/或涂有用于高盐应用的羟基的整体柱。
在另一个实施方式中，包含用于执行本发明方法的至少一种组分的试剂盒可包括、tren整体柱，并进一步包括羟基包被的整体柱，其中两种整体柱用于纯化病毒，特别是包括低内毒素、低dna和低宿主蛋白污染的噬菌体。
在另一个实施方式中，本发明的试剂盒还可以包括至少一种用于制备本发明方法中使用的缓冲剂的成分。这些成分可以是用于调节在实施本发明方法过程中使用的溶液的离子强度或ph值的物质。本发明的试剂盒可以包括用于进行测定内毒素含量或测定待分离产品的质量的测定的材料，例如测定纯化后的噬菌体的感染性。本发明的试剂盒还可以包括执行本发明的方法的说明书。
本发明的试剂盒可用作内毒素去除试剂盒，包含一种或多种固定化的三价铁离子的固相tren-fe与氢键固相(例如h-bondadc整体柱)的组合。该试剂盒可用于噬菌体的制备，但也可用于许多其它场合，特别包括抗体。
另一种这样的试剂盒，也是噬菌体导向的，可以包含一种或多种固定化的三价铁离子固相tren-fe与羟基化固相(如oh整体柱)的组合，其中羟基化固相用于浓缩噬菌体并减少污染物负载，如蛋白质、核酸和内毒素。该试剂盒还可以包括一个或多个固定化三价铁离子固相。
本文引用的所有参考文献通过引用结合到与本文的明确教导不矛盾的全部范围内。
通过以下非限制性示例进一步解释本发明。
实施例1
制备实验对照以提供基线以记录本发明的相对有效性。
10ml含有噬菌体t4的大肠杆菌细胞培养物的澄清收获物经疏水相互作用色谱(hic)部分纯化。用50mmtris、1mmcacl2、0.5mmmgcl2、20mmnacl、10％甘油，ph7.7，最终电导率为7.42ms/cm洗脱hic得到噬菌体洗脱峰。将100μlcimmacqa(强阴离子交换)整体柱(monolith)(biaseparations)用50mmtris、1mmcacl2、0.5mmmgcl2、20mmnacl、10％甘油、ph7.7平衡。将稀释的噬菌体上样到qa整体柱上。用60个床体积的平衡缓冲液洗涤整体柱，然后用50个床体积(5ml)线性梯度洗脱至50mmtris、1mmcacl2、0.5mmmgcl2、2mnacl、10％甘油，ph7.7。柱用1m氢氧化钠、2m氯化钠清洗消毒。在整个运行过程中收集级分以供后续分析。噬菌体以单峰洗脱，电导率值约为25ms/cm(在峰中心测量)。55％的感染性噬菌体在主峰处被洗脱。通过endosafe对该峰的测试显示浓度为141个内毒素单位/毫升(eu/ml)，对应于每十亿噬菌体11eu。
实施例2(对比)
最初用疏水性相互作用色谱(hic)，接着用ida-fe(一种带负电荷的螯合配体)(cimida,biaseparations)进行内毒素减少实验。如实施例1所述在t4噬菌体收获物上进行hic，但规模更大，将160ml裂解物上样到8mlhic整体柱上。31ml洗脱级分内毒素含量为138,167eu/ml。将该级分用20nmkh2po4、10％甘油、ph7.0稀释到最终电导率为6.7ms/cm。通过用20cv去离子水；然后20cv100mm醋酸，ph3.0；20cv200mm氯化铁，然后20cv50mm乙酸，2.0m氯化钠，ph4.5；20cv去离子水洗涤制备340μlida整体柱。然后将柱平衡到20mm磷酸钾、10％甘油，ph7.0。用40ml流动相a稀释2(2)ml的来自hic的级分，至电导率为6.7ms/cm。将样品上样到ida整体柱上，然后用20cv的20mm磷酸钾、10％甘油、ph7.0洗涤柱，以置换任何剩余的未结合材料。柱用20cv线性梯度洗脱，终点为500mm磷酸钾，ph7.0。在整个运行过程中收集级分以供后续分析。色谱图如图1所示。在从0.0ml标记到约45ml的流通的级分中发现100％的感染性噬菌体，表示从hic柱洗脱的体积中约50％的稀释度。内毒素浓度测定为315eu/ml，对应于每十亿噬菌体5.75eu。
实施例3
实验表明，与强阴离子交换剂(cimmultusqa，biaseparations)相比，biaseparations生产的三价铁离子固定在三(2-氨基乙基)胺(tren)固相表面上的实验整体柱实现了更好的内毒素减少。
如实施例2所述，在t4噬菌体收获物上进行hic。内毒素检测显示噬菌体级分的内毒素含量为138167eu/ml。用40ml流动相a稀释2ml来自hic的级分，使最终电导率为9.3ms/cm。如实施例2所述，通过在其上以5cv/min的流速运行试剂，制备1mltren整体柱。柱用20mm磷酸钾(ph7.0)平衡。上样40ml稀释样品，然后用15cv的20mm磷酸钾(ph7.0)洗涤柱。柱用20cv线性梯度洗脱，终点为500mm磷酸钾，ph7.0。在整个运行过程中收集级分以供后续分析。色谱图如图2所示。在与上样阶段相对应的柱洗脱液中未发现感染性噬菌体。在电导率为16ms/cm的峰洗脱中发现125％的噬菌体。通过lal分析(endosafe)的测试显示，在洗脱峰中的浓度小于10个内毒素单位/毫升(eu/ml)。这被理解为代表接近但不超过10eu/ml的值，对应于每十亿噬菌体小于0.4eu；比使用强阴离子交换剂的工业标准方法要好约25倍。
实施例4(对比)
制备实验对照，以提供本发明方法的对比例。
含有噬菌体t4的大肠杆菌细胞培养物的澄清收获物经硫酸铵沉淀进行部分纯化。将1ml收获物与1.5ml3m硫酸铵、50mmmes缓冲液、ph6.5混合。将混合物以9000xg离心10分钟，丢弃上清液。沉淀物用0.8ml500mm磷酸钾(ph7.0)重新悬浮。通过用20ml去离子水洗涤两次，离心100×g5分钟，然后丢弃上清液；然后用同样的方法用20ml100mm乙酸钠(ph3.0)洗涤；然后用20ml200mm氯化铁处理；然后用50mm乙酸盐、2m氯化钠、ph4.5洗涤；然后用20ml去离子水洗涤，制备表面具有亚氨基二乙酸的松散的(未填充的)多孔颗粒(亚氨基二乙酸sepharose，sigma-aldrich)。然后用50mmmes，ph6.5平衡颗粒。用这些颗粒的50％浆料进行实验。将0.2ml50％浆料加入0.8ml再悬浮的硫酸铵沉淀中，在2-8℃中孵育，每天混合3次，以结合内毒素。颗粒通过离心沉淀并去除。含噬菌体的剩余液体内毒素含量为15.8eu/ml。
实施例5
实验表明，固定在三(2-氨基乙基)胺(tren)固相表面的三价铁离子实现了更好的内毒素减少，独立于它结合的纯化方法，并且独立于固相的物理形式。
含有噬菌体t4的大肠杆菌细胞培养物的澄清收获物经疏水相互作用色谱(hic)部分纯化。将含有5876eu的1ml洗脱级分用50mmmesph6.0稀释100倍用于下一步。表面有tren的松散(未填充的)多孔颗粒(workbeadstren40,bioworks)带有三价铁离子。将1(1)ml50％的tren颗粒加入到0.25ml稀释的hic级分中，孵育120分钟，偶尔混合以结合内毒素。颗粒通过离心沉淀并去除。含噬菌体的剩余液体内毒素含量为9.73eu/ml。
实施例6
制备实验对照以提供基线以记录本发明的相对有效性。先通过排阻色谱初步纯化噬菌体t4，然后通过阴离子交换色谱精制。
强阴离子交换剂上的阴离子交换色谱被认为是去除内毒素的工业标准。在1mlcimmultusoh整体柱上通过排阻色谱部分纯化10ml含有噬菌体t4的大肠杆菌细胞培养物的澄清收获物。噬菌体洗脱峰用50mmtris、1mmcacl2、0.5mmmgcl2、20mmnacl、10％甘油、ph7.7稀释至最终电导率为7.42ms/cm。将100μlcimmacqa(强阴离子交换)整体柱(monolith)(biaseparations)用50mmtris、1mmcacl2，0.5mmmgcl2,20mmnacl,10％甘油,ph7.7平衡。将稀释的噬菌体上样到qa整体柱上。用60床体积的平衡缓冲液洗涤整体柱，然后用50床体积(5ml)线性梯度洗脱至50mmtris、1mmcacl2，0.5mmmgcl2、2mnacl、10％甘油，ph7.7。柱用1m氢氧化钠、2m氯化钠清洗消毒。在整个运行过程中收集级分以供后续分析。内毒素从收获物中的每1e+10噬菌体177524eu，到排阻步骤后的每1e+10噬菌体12054eu，再到阴离子交换后的每1e+10噬菌体78eu。宿主蛋白从收获物中的每1e+10噬菌体6059纳克，到优先排阻步骤后的每1e+10噬菌体153纳克，再到阴离子交换后的每1e+10噬菌体115纳克。结果如图3所示。
实施例7
先用排阻色谱纯化噬菌体t4，然后用氢键色谱精制。
对氢键色谱可能比阴离子交换更有效的内毒素去除的假设进行了检验，从而为本发明的方法提供了更具竞争力的参考。用氢键色谱代替阴离子交换色谱对实施例6中排阻色谱步骤洗脱的噬菌体等分样进行精制。用50mmtris、1mmcacl2、0.5mmmgcl2、20mmnacl、10％甘油、ph7.7平衡100μlcimmach-键整体柱。将稀释的噬菌体上样到qa整体柱上。用60床体积的平衡缓冲液洗涤整体柱，然后用50床体积(5ml)线性梯度洗脱至50mmtris，1mmcacl2、0.5mmmgcl2、2mnacl、10％甘油，ph7.7。柱用1m氢氧化钠、2m氯化钠清洗消毒。在整个运行过程中收集级分以供后续分析。内毒素从收获物中的每1e+10噬菌体177524eu，到排阻步骤后的每1e+10噬菌体12054eu，再到氢键色谱后的每1e+10噬菌体19eu。宿主蛋白从收获物中的每1e+10噬菌体6059ng，到排阻步骤后的每1e+10噬菌体153ng，再到氢键色谱后的每1e+10噬菌体26ng。结果如图4所示。总体而言，氢键色谱法去除内毒素的效果比阴离子交换法好约4倍，而宿主细胞蛋白质的去除效果比阴离子交换法好约5倍。
实施例8
本发明的方法与阴离子交换色谱和氢键色谱的纯化性能的实验比较。
将实施例6中优排阻色谱步骤洗脱的噬菌体等分样在100μltren整体柱上精制。用20mm磷酸钾(ph7.0)平衡。上样40ml稀释样品，然后用15cv的20mm磷酸钾(ph7.0)洗涤柱。柱用20cv线性梯度洗脱，终点为500mm磷酸钾，ph7.0。在整个运行过程中收集级分以供后续分析。内毒素从收获物中的每1e+10噬菌体177,524eu，到排阻步骤后的每1e+10噬菌体12054eu，再到本发明方法后的每1e+10噬菌体小于eu(低于测定的灵敏度)。宿主蛋白从收获物中的每1e+10噬菌体6059ng，到优先排阻步骤后的每1e+10噬菌体153ng，再到本发明方法后的每1e+10噬菌体小于1ng(低于测定的灵敏度)。结果如图5所示。总体而言，本发明方法对内毒素的去除比阴离子交换法好约80倍，比氢键色谱法好约20倍，而宿主细胞蛋白质的去除比阴离子交换法好约100倍，比氢键色谱法好约25倍。
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